WO2010006476A1

WO2010006476A1 - 心肌肽、其制备方法及用途

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Publication number: WO2010006476A1
Application number: PCT/CN2008/071647
Authority: WO
Inventors: 陈玉松; 李恕; 王日升; 梁强; 曾峥; 钱小红; 曹东; 梁慧敏
Original assignee: 大连珍奥药业有限公司
Priority date: 2008-07-15
Filing date: 2008-07-15
Publication date: 2010-01-21
Also published as: EP2314600A4; JP2011527991A; JP5373077B2; KR20110045000A; KR101505239B1; US20110160432A1; EP2314600A1; US8940865B2; EP2314600B1

Description

心肌肽、其制备方法及用途技术领域

本发明涉及多肽类物质，具体地说两种活性多肽、其制备方法及其用途。背景技术

"心肌保护"近年来一直是心脏内、外科研究的热点。最近资料表明，缺血缺氧的心肌细胞内会发生许多变化，包括细胞内钙超载，自由基产生，膜损害， ATP (adenosine triphosphate, ATP) 水平下降，氧耗竭等等。

为了干预心肌缺血及保护心肌，近 20年来研究了许多药物，如 β -受体阻滞剂，钙拮抗剂，转换酶抑制剂，各种氧自由基清除剂等，但其对心肌的保护效果临床尚未肯定。现有治疗心肌缺血的药物，还没有一种能绝对减少心肌梗死，对抗心肌缺血。

现有的各类心血管病治疗药物，除转换酶抑制剂具有阻滞生长因子产生，抑制蛋白质合成，减轻心肌肥厚（Hypertrophy) 的作用外，其它药物均无直接调节心肌生长、分化、修复的作用。近年来，国外已开始重视使用药物方法诱导心肌自身的保护能力，如转导基因促进心肌细胞再生等的研究， Cardiotrophin及 Myotrophin的研究。另一方面，通过细胞外信号触发各种传递机制，调控心肌、血管细胞的增殖或重构。但是所有这些研究都处于动物试验或临床前研究阶段。

上述研究清楚地证明：在体外循环心肌保护方法尚未完善的情况下，设计一种对机体无损害，又能于术前、术中及术后保护心肌的药物，对探索心肌缺血及再灌注损伤的防治，提供新的思路和途径，将有重要意义。

ZL94102798公开了一种心肌细胞生长刺激肽及其制备方法，选取健康幼年哺乳动物的心脏，采用机械方式捣碎、 -20°C深冻 -溶解后加热 60-100°C，再 -20 °C深冻 -溶解后离心 3000rpm，经负压截留柱-除菌-分装-冻干-包装，得到分子量小于 20000道尔顿的多肽类活性物质。

ZL94102799公开了一种具有刺激原代培养的心肌细胞的 DNA合成和蛋白质合成的心肌细胞生长刺激肽 (GMGSP), 是从健康幼年哺乳动物的心脏中制备提取，在 pH2-9范围内稳定；在加热 95-100°C 10分钟， 60-70°C30分钟下生物活性不改变；在多种蛋白水解酶， 37°C2 小时条件下生物活性丧失；在水溶液 22 °C-30°C条件下可形成聚合体但生物活性改变不明显；在加入 3%-8%甘露醇冻干密封条件下，室温贮存 1.5年， 4°C贮存 2年， -20°C贮存 3年，生物活性不改变； HPLC分析表明：所述 GMGSP由四个组分组成，各组分相对峰及保留时间分别为： 10.4%(2.88分)， 6.4%(3.93分)， 36.3%(5.09分)， 7.3%(7.41分)，每个组分均具有生物活性；经 SDS-PAGE分析显示的两条带分子量分别为 8500Da，10800 Da, HPLC分析数均分子量 9800Da，重均分子量 10500Da， 2个组分均有生物活性。

在中国发明专利 03141352.8心肌肽及其用途中，该发明公开了心肌肽是从不包括人的健康哺乳动物的心脏中提取的，其中多肽的含量为 75%-90%，游离氨基酸为 6%- 15%，核糖核酸含量为 1%-2%，脱氧核糖核酸含量为 3%-7%，重均分子量为 1000-1000道尔顿。该发明还公开了所述的心肌肽在制备治疗心血管疾病药物以及心肌缺血和再灌注损伤药物方面的用途。而在中国发明专利 03137133.7中公开了一种心肌肽的制备方法，其具体方法为：将不包括人的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎，加灭菌蒸馏水匀浆，匀浆液反复冷冻、解冻 3-4 次，加热至 65-95 °C过滤除渣，用板框滤器过滤得到粗滤液，在用中空纤维柱超滤，得到精滤液，用超滤膜超滤，截留重均分子量小于 lOOOODa的心肌肽溶液，以反渗透浓縮柱浓縮，最后经过滤除菌，冷冻干燥得成品。

但是，上述研究结果表明，心肌肽是从不包括人的健康哺乳动物的心脏中提取的，其中含有多肽、游离氨基酸、脱氧核糖核酸等多种活性成分，

多肽是一类由各种氨基酸，按不同的顺序排列而组成的一种链状的蛋白质类化合物。此类化合物往往具有很强的生理活性和功能的特异性。因此，这些多肽类物质在制备治疗某些疾病药物中的用途很广泛。

然而至今为止，对于心肌肽中所含的多肽的序列以及用途都没有相关专利及文献报道。

发明内容

本发明目的在于提供两种多肽，其中一种多肽的序列为： Trp-Ser-Asn-Val-Leu-Arg-Gly-Met-Gly-Gly-Ala-Phe, 分子量为 1294. 75 (简称心肌肽 X); 在上述多肽的基础上通过在连接有色氨酸的一端依次连接丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸，形成一种新的多肽（简称心肌肽 C)，其氨基酸的排列顺序为： Lys-Gly-Ala-Trp-Ser-Asn-Val-Leu-Arg-Gly-Met-Gly-Gly-Ala-Phe, 分子量为 1550. 91。所述的多肽心肌肽溶液中提取，经测定上述多肽具有活性，而且作为制备治疗组织器官缺血包括心肌缺血、脑缺血、肝缺血、胃缺血、肠缺血、肺缺血、肾缺血药方面用途显著。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种多肽，所述的多肽的氨基酸的排列顺序为： Trp- Ser- Asn- Val- Leu- Arg- Gly- Met- Gly- Gly- Ala- Phe。

在上述多肽连接有色氨酸的一端依次连接丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸，形成一种新的多肽，其氨基酸的排列顺序为：

Lys- Gly- Ala- Trp- Ser- Asn- Val- Leu- Arg- Gly- Met- Gly- Gly- Ala- Phe。

本发明的另一目的在于提供一种心肌肽 C的提取方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种从心肌肽溶液中提取心肌肽 C的方法，所述的方法包括如下步骤：

( 1 ) 在心肌肽溶液加入硫酸铵溶液，放置，离心，分离上清液和沉淀；

( 2) 取上清液，过固相萃取小柱，用有机溶剂洗脱，收集馏分 A;

( 3)将收集到的馏分 A浓縮，然后用反相制备色谱分离，收集有活性的馏分 B;

(4) 将有活性的馏分 B浓縮，然后用分析型反相色谱进行进一步的分离，收集有活性的馏分 C;

( 5) 将有活性的馏分 C进行质谱检测，通过质谱数据分析，鉴定馏分 C中有活性的肽段的氨基酸序列，所述的馏分 C即为所述的多肽。

本发明所述的硫酸铵溶液的质量百分比浓度为 60-80%，优选所述的浓度为

70%。

本发明所述的步骤（2) 中所述的有机溶剂为 60%乙腈和 0. 1%三氟乙酸的混合溶液。

本发明步骤（3) 中将馏分 A浓縮至原体积的 1/8-3/4; 利用反相制备色谱分离的条件为：流动相： A相为 100%H₂O+0.1%TFA， B相为 60%ACN+ 0.1% TFA; 紫外检测器，波长 λ =280ηηι， R=3.0;梯度洗脱： 0-5minO%B, 5-35minO%-100%B, 35-40minl00%B, 40-45minl00%-0%B。

本发明所述的步骤（4) 中将馏分 B浓縮至 1/8-1/2; 所述的用分析型反相色谱进行进一步的分离为在色谱条件如下：流动相： A相为 100%H₂O+0.1%TFA， B相为 95%ACN+0.1%TFA; 紫外检测器，波长 λ =280ηηι， R=3.0; 梯度洗脱： 0-5minO%B, 5-50minO%-100%B, 50-60minl00%B, 60-65min 100%-0%B的条件下进行。

本发明所述的心肌肽溶液包括从不包括人的健康哺乳动物的心脏中提取的多肽溶液，其多肽含量为 75 %〜90%，游离氨基酸含量为 6 %〜15 %，核糖核酸含量小于 2 %，脱氧核糖核酸含量小于 7. 5 %，分子量小于 10000道尔顿，也可为现有的心肌肽素产品。

本发明的再一目的在于提供一种心肌肽 C的化学合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种制备心肌肽 C的化学合成方法，所述的方法包括：

( 1 )分别将色氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的氨基用保护基团进行保护；

( 2)先将固相载体溶胀，再将多肽的氨基酸排列顺序中第一个保护后的氨基酸固定到该固相载体上，然后将所得产物进行洗涤，得到连接有第一个保护后的氨基酸的固相载体；

( 3 )将第二个保护氨基酸加入到结合有第一个氨基酸的固相载体中，在縮合剂存在下进行反应形成肽键，然后将氨基酸的氨基的保护基团脱除、并洗涤所得到的固相载体；

(4) 按照多肽的氨基酸排序，依次加入相应的保护氨基酸，重复上述的氨基的保护基团脱除、洗涤的步骤，使肽链不断延长，直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止；

( 5)取分离液浸泡上述步骤（4)所得的结合有多肽的固相载体，然后经过过滤后取所得滤液进行沉淀，得到多肽粗品；

(6) 将所得的多肽粗品进行分离纯化，获得目标产物。

本发明步骤（1 ) 所述的氨基酸的氨基可以由以下基团进行保护：

( 1 ) 苄酯基（Carbobenzoxyl)

(2) 叔-丁氧羰基（t-Butyloxycarbonyl)

( 3 ) 甲苯磺酰基（Tosyl)

(4) 9-亚基甲酉旨基 (Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl)。

在自然界中每一种多肽或蛋白质都是由游离的氨基酸通过多肽键的形式聚合而成。在蛋白质的翻译过程中，多肽键的延伸总是由氨基端（N-端）向羧基端 ( C-端）进行。在化学合成开始时，往往是先将羧基端的第一个氨基酸固定到活化的树脂上，然后经过氨基基团的去保护，再将羧基端的第二个氨基酸加入到反应器中，二个氨基酸经过相互反应即可形成肽键，然后依照多肽的氨基酸排列序列依次加入第三个、第四个氨基酸等等，直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止。

本发明还有一目的在于提供心肌肽 C在制备预防和 /或治疗组织器官缺血药方面的用途，优选所述多肽在制备预防和 /或治疗心肌缺血、脑缺血、肝缺血、胃缺血、肠缺血、肺缺血或肾缺血药方面的用途，更优选所述多肽在制备预防和 /或治疗心肌缺血药方面的用途。

本发明的有益效果是：本发明公开了两种多肽的提取方法，并且公开了心肌肽溶液中所含的两种多肽及序列，完成了这两种多肽的化学合成、纯化、活性测定和鉴定。活性测定表明这两种多肽具有活性，经过动物实验以及临床研究表明，这两种多肽在作为制备治疗心肌缺血、脑缺血以及肝缺血药方面作用显著。同时这两种具有结构明确、活性高、易生产、成本低和更易于研究阐述其作用机制等特点。

附图说明

图 1 :分子量为 1294.75 (心肌肽 X)质谱图（4700MS/MS Procursor 1294.75 Spec#l MC[BP=1147.4,4886] )

图 2 :分子量为 1550.91 (心肌肽 C )质谱图（4700MS/MS Procursor 1550.91 Spec#l MC[BP=1403.5,3630] )

图 3 :分子量为 1550. 91 (心肌肽 C )的二级谱 denovo序列匹配 KGAWSNVLRGMGGAF 图 4：分子量为 1294. 75 (心肌肽 X) 的二级谱 denovo序列匹配 WSNVLRGMGGAF 图 5 : 馏分 C的色谱图

图 6 : 多肽（心肌肽 C ) 的提取方法具体流程图

图 7 : 心肌肽 C预防性给药对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响，图 7-a，假手术组；图 7-b为模型组；图 7-c为阳性药组；图 7-d为 CMPC组

图 8 : 心肌肽 C治疗性给药对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响，图 8-a，假手术组；图 8-b为模型组；图 8-c为阳性药组；图 8-d 为 CMPC组

具体实施方式

实施例 1

本实施例涉及多肽（心肌肽 C ) 的合成。

所述多肽的序列为 Lys-Gly-Ala-Trp-Ser-Asn-Val-Leu-Arg-Gly-Met-Gly-Gly-Ala-Phe

1、合成：首先将多肽中所含的氨基酸的氨基用氨基保护基团 (9-亚芴基甲酯基)保护起来（用量 20-100克 /克)，将 wang树脂用氯乙醚进行溶胀，所用氯乙醚的用量为 50-100毫升 /克，然后将第一个氨基酸加入到该树脂中，从而使其固定到树脂上。经过二氯甲烷洗涤后，氨基的保护基团可以用六氢吡啶 (用量 10— 80% , 最好 20-40%)脱保护起来。与此同时，将第二个氨基酸的羧基经过 HBTU 【2-(1氢-苯并三唑基) -1， 1， 3， 3-四甲基糖醛-六氟合磷酸酯】活化和二异丙基乙胺中和后，加入到结合有第一个氨基酸的树脂中，二个氨基酸反应后即可形成肽键。然后按照多肽物质的氨基酸排序，依次加入相应的氨基酸，重复上述的洗涤，氨基去保护，氨基酸羧基的活化等步骤以进行 14次接肽反应，从而使多肽链不断延长，直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止。合成后的多肽仍然与树脂结合在一起，利用分离液将多肽物质从树脂上游离下来。分离液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一种或几种的混合物，取 10-80毫升的分离液浸泡上述结合有多肽类物质 (Π)的树脂，在室温下搅拌 1.5小时，然后经过过滤便可得到滤液为多肽物质混合液。游离的多肽物质经过乙醚沉淀后，即可分离出来。将分离出来的多肽物质溶解在水或 10-40%的碱溶液中 (碱可以选用：碳酸氢铵、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸钠)，然后用常规的液相色谱法，即可将完整的多肽物质进行纯化。纯化后的多肽物质，可以通过紫外分光光度法测得其浓度并可通过质谱分析重新核实所合成的多肽类物质的氨基酸序列是否正确。

实施例 2

本实施例涉及心肌肽 X的化学合成方法。

所述心肌肽 C 的氨基酸序列为： Trp- Ser- Asn- Val- Leu- Arg- Gly- Met- Gly- Gly- Ala- Phe。

所用的方法如实施例 1。

实施例 3

本实施例涉及心肌肽 C的化学合成方法。

所述多肽的序列为

Lys- Gly- Ala- Trp- Ser- Asn- Val- Leu- Arg- Gly- Met- Gly- Gly- Ala- Phe。

所述的方法包括以下步骤： ( 1 ) 脱除保护基 Fmoc: 取 Fmoc-Lys(Boc)-CLTR树脂，用二氯甲烷浸泡洗涤 3次，每次 2min，然后抽干，在室温下加入 50%哌啶的二氯甲烷溶液 10mL，反应 5min 后抽干，仍用上述同样量的溶液再反应 30min，再抽干，之后依次以 8mL〜10mL 的二氯甲烷、乙醇和二氯甲烷洗涤，抽干，取少量树脂 (2mg〜10mg) 用水杨醛定量自由基法测定总氨基量。

(2)肽键的形成 (DCC-HOBt縮合法)：在上述去 Fmoc保护基的树脂中加入 Fmoc-Gly(t-B_U)的二氯甲烷溶液和 1-羟基苯并三氮唑的二氯甲烷溶液，且同时加入二甲基甲酰胺溶液助溶 30min后，加入 N， N ' —二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液 2mL，在 20°C下反应过夜，抽干，洗涤，得树脂肽 Fmoc-Gly(t-Bu)-Lys(Boc)-R。取少量树脂干燥至恒重，用水杨醛定量自由氨基法测定残余氨基量，并由此计算縮合率。在反应过程中，用茚三酮显色法监测反应进行程度，当树脂呈无色透明状时，表示縮合反应已完成。

( 3 ) 未縮合氨基的乙酰化：用 10mL含 50%醋酐的吡啶溶液于室温下处理步骤 2)所得的树脂肽 30min，洗涤，抽干，以同样溶液和量再处理一次，使未縮合的氨基乙酰化。

( 4 ) 将步骤（ 1 ) 中的树月旨肽 Fmoc-Lys(Boc)-Wang-R 换为 Fmoc-Gly(t-Bu)-Lys(Boc)-R,将步骤（2)中的 Fmoc-Gly(t-Bu)换为 Fmoc-Ala(Trt), 重复步骤（1 )〜步骤（3 )的操作，以此类推，即将前一步合成的树脂肽作下一步合成的氨基组分，进行 14次接肽反应，至 15个氨基酸之间的肽键全部形成；

( 5 )脱除侧链保护基及肽链上的树脂:在最后形成的 12肽树脂中，加入 30mL 二氯甲烷、三氟乙酸 3.0mL，于 25 °C反应 60min，过滤，滤液保留待用。将含 50%三氟乙酸的二氯甲烷溶液 10mL加入滤液，反应 20min，之后用上述溶液洗涤 3次，洗液与前次滤液归并，经旋转蒸发仪蒸至余液少许，加入大量无水乙醚，析出白色粉末状物，离心分离除去液相，之后用无水乙醚将粉末研磨 5 次，后真空干燥，称重计算产率；

( 6 ) 取少量产物进行电泳检测及 RP-HPLC 分析，色谱条件为： Alltech Platinum C18色谱柱；缓冲液 A为 0.1%的三氟乙酸 (TFA)水溶液；缓冲液 B为 0.1%的 TFA及 90%的乙睛 (以上皆为体积分率)的水溶液;洗脱梯度为 40min内缓冲液 B的体积分数从 10%升至 50%;流动相流速为 1.0ml/min检测波长为 214nm。实施例 4

本实施例涉及多肽（心肌肽 X) 的合成

多肽的序列为 Trp-Ser-Asn-Val-Leu-Arg-Gly-Met-Gly-Gly-Ala-Phe

所用的方法如实施例 3。

实施例 5

本实施例涉及从心肌肽溶液中提取多肽（心肌肽 C) 的方法。

( 1 ) 仪器设备

依利特高压液相色谱 P230系统； PF-2的二维液相色谱分离系统（美国戴安公司）分析型色谱柱； waters, C18, 4.6 X 250mm, SPE 固相萃取小柱（waters 公司）； C18半制备反相色谱柱（美国热电公司）；真空冰冻干燥机（美国热电公司）；离心机等。

(2) 实验条件及方法

①在心肌肽溶液加入 70%硫酸铵溶液，在温度为 4°C的条件下放置过夜，离心，分离上清液和沉淀；

②取上清溶液，过 SPE固相萃取小柱，用 60%乙腈和 0. 1%三氟乙酸的混合溶液洗脱，收集馏分 A;

③将收集到的馏分 A浓縮，然后用反相制备色谱分离，收集有活性的馏分 B; 色谱条件如下：流动相： A相为 100%H₂O+0.1%TFA， B相为 60%ACN+ 0.1%

TFA

紫外检测器，波长 λ =280ηηι， R=3.0

梯度洗脱： 0-5minO%B, 5-35minO%-100%B, 35-40minl00%B, 40-45min 100%-0%B;

④将有活性的馏分 B浓縮，然后用分析型反相色谱进行进一步的分离，收集有活性的馏分 C;

色谱条件如下：

流动相： A相为 100%H₂O+0.1%TFA， B相为 95%ACN+ 0.1% TFA 紫外检测器：波长 λ =280ηηι， R=3.0

梯度洗脱： 0-5minO%B , 5-50minO%-100%B , 50-60minl00%B , 60-65min 100%-0%Β ⑤将有活性的馏分 C进行质谱检测，通过质谱数据分析，如图 2-图 3所示，鉴定有馏分 C中有活性的肽段的氨基酸序列。

实施例 6

本实施例涉及从心肌肽溶液中提取多肽（心肌肽 C)的过程中的结构鉴定以及质量检测。

( 1 ) 质谱检测

利用 MALDI-TOF-TOF质谱仪（美国 AB公司 -4800) 对所得产物进行质谱检测，其中 MALDI-TOF—级质谱采用正离子反射检测模式；二级串联质谱采用正离子反射模式，检测结果如图 2所示。

(2) 活性检测

活性测定采用大连珍奥药业公司提供的 "心肌细胞培养活性测定试验"方法进行。该方法在体外培养心肌细胞阿霉素中毒试验基础上，用 2， 4-二苯基溴化四唑（MTT) 作为反应指示剂，以观察心肌肽使受损心肌细胞线粒体脱氢酶活力增强的作用，以判定心肌保护作用。

活性测定的结果如下表所示

实施例 7

本实施例涉及心肌肽 C (CMPC)在制备和 /或治疗心肌缺血药方面的用途。一、实验材料

1. 试验动物

SD大鼠乳鼠， 2-4日龄，由沈阳药科大学动物中心提供。

SD大鼠，体重 200〜300 g，雌雄各半，由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心提供。动物合格证编号： SCXK (军) 2002-001。

2. 供试药物与试剂

心肌肽 C (CMPC), 由大连珍奥药业有限公司提供，批号： C1586102; 维拉帕米注射液（Ver): 上海禾丰制药有限公司，规格： 2ml:5mg，批号： 070701；注射用多柔比星（阿霉素）：广东汕头特区明治医药有限公司，规格： 10mg/ 瓶，批号： 070202;

DMEM培养基 (高糖）: Gibco, 批号： 1290007；

DMEM培养基 (低糖）: Gibco, 批号： 1348529；

II型胶原酶： Gibco; 胎牛血清：天津市灏洋生物制品科技责任有限公司，批号： 04700701-3100

四甲基偶氮唑蓝（MTT ) : Amresco; NBT: Amresco, 规格： lOOmg 乌拉坦：天津基准化学试剂有限公司，批号： 20060218 ;

超氧化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)、肌酸激酶（CK) 和乳酸脱氢酶 ( LDH ) 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号： 20080122;

冰乙酸：天津市百世化工有限公司，规格： 500ml, 批号： 20070712；无水乙醇：天津市百世化工有限公司，规格： 500ml，批号： 20070410 二、实验方法

1 . 体外试验

1. 1 心肌细胞原代培养

取大鼠乳鼠心室， D-Hank's 清洗后剪碎，用 II型胶原酶消化，得到心肌细胞及成纤维细胞，用含 15%胎牛血清的高糖 DMEM ( DMEM-H-15 )培养。通过差速贴壁及化学方法去除成纤维细胞，将心肌细胞接种到 96孔板中。

1.2. CMPC抗原代培养心肌细胞阿霉素损伤作用

细胞培养方法同 1. 1。

模型制备：实验设空白对照组：心肌细胞用 DMEM-H-15培养；模型组：加入 1 mg/L阿霉素，培养 lh后，以 DMEM-H-15洗板 2次，加入 DMEM-H-15培养；阳性对照组（维拉帕米 2、 0.4、 0.08 mg/L ) 及不同浓度受试药物组（CMPC 50、 10、 2、 0.4、 0.08、 0.016、 0.0032、 0.00064 mg/L ) : 将阿霉素损伤 lh的心肌细胞以 DMEM-H-15洗板 2次后分别加入各浓度维拉帕米注射液（Ver)以及 CMPC (上述各组培养体系总容积均为 100 μΐ/孔，药物浓度均指终浓度）。继续培养 24h后用 MTT法测定心肌细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活力，并计算保护率，求算出 EC_5Q 值。保护率 = (A_x - A_modei) I (A_controi - A_modei) * 100%； A_x、 A_model、 A_c。_ntr。^、别表示各给药组、模型组以及空白对照组的吸光度值。在阿霉素损伤模型中， CMPC能显著提高心肌细胞的存活率，药物浓度为 0.016-2 mg/L时其保护效果较好，与模型组相比有显著性差异。阿霉素损伤模型中培养板 1、2、3中 CMPC的 EC₅Q分别为 0.15、 0.13、 0.27 mg/L。结果见表 1 ( CMPC 对心肌细胞的保护率以 "％"表示）。

表 1 心肌肽 C对阿霉素损伤的心肌细胞存活率的影响

P < 0.01, * P < 0.05 与模型组对比 ** P < 0.01, # P < 0.05与空白对照组对比

1.3. CMPC抗原代培养心肌细胞缺氧-再给氧损伤作用

心肌细胞培养方法同 1. 1。

模型制备：取培养 48-72h的心肌细胞制备模型，将培养板内各孔细胞分为对照组、模型组、维拉帕米组（2、 0.4、 0.08 mg/L终浓度）以及 CMPC组（终浓度为 50、 10、 2、 0.4、 0.08、 0.016、 0.0032 mg/L) , 各组为 3个复孔。除对照组外，其余细胞按以下方法制备模型：将培养板中心肌细胞单层换用低糖培养基（内含相应浓度的维拉帕米或 CMPC )后，将培养板置于真空干燥器中，充入氮气，然后密闭培养；缺氧 15h造成心肌细胞损伤；缺氧后换用高糖 DMEM 培养液（95% 空气 +5%C0₂) 培养 lh，造成再给氧损伤。用 MTT法测定 540nm处的吸光度值，同上计算保护率，求算出 EC₅₍₎值。

在缺氧复氧损伤模型中， CMPC能显著提高心肌细胞的存活率，药物浓度为 0.08-2 mg/L时其保护效果较好，与模型组相比有显著性差异，培养板 1、 2、 3 中 CMPC的 EC₅。分别为 0.66、 0.14、 0.82 mg/L。结果见表 2 (CMPC对心肌细胞的保护率以 "％"表示）。

表 2 心肌肽 C对缺氧 -复氧损伤心肌细胞存活率的影响

** P < 0.01, * P < 0.05 与模型组对比 ## P < 0.01, # P < 0.05 与空白对照组对比

2. 体内实验

2. 1. CMPC预防性给药对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用

取 250-300g SD大鼠 70只，将其中的 60只按体重均衡随机分为 6组，每组 10 只，剩余 10只以备补充各组死亡动物。正常对照组：行假手术，即冠脉左前降支 (LAD) 处穿一丝线，但不予结扎；模型组：结扎前 30min经静脉推注生理盐水 5 ml/kg, 缺血-再灌注操作详见模型制备。阳性药组：结扎前 30min经静脉推注维拉帕米 1.0 mg/kg, 缺血-再灌注操作同模型组； CMPC高、中、低剂量组：结扎前 30min经静脉推注相应浓度 CMPC ( 1.8、 0.6、 0.2 mg/kg), 缺血 -再灌注操作同模型组。

模型制备：以 6%乌拉坦溶液按 20 ml/kg腹腔注射麻醉动物后，将动物仰卧位固定在手术台上；连接心电图机，测肢体 II导联心电图；气管插管，接动物人工呼吸机，按 6ml/200g潮气量、 55次 /min的频率给与呼气末持续正压通气，呼吸比为 2:1。于胸骨左缘第四 /五肋间隙行开胸术，分离肋骨去除心包后，以左心耳下缘为标志，用 6/0丝线在冠状动脉左前降支结扎，在结扎线与血管之间放一小段直径为 lmm的聚乙烯管；结扎丝线，使聚乙烯管压迫冠状动脉左前降支造成心肌缺血。以局部心肌变苍白和心电图 S-T段抬高表示冠状动脉左前降支结扎成功。 30min后小心取出聚乙烯管造成复灌。通过缺血区反应性充血和抬高的 S-T段下降 1/2以上证实复灌成功。复灌 30min，腹主动脉取血，制备血清，用于测定生化指标（按试剂盒说明书测定 CK、 LDH、 MDA、 SOD含量）。

取血后剖取大鼠心脏，用生理盐水洗净心腔内积血，称全心重，去掉脂肪，将心肌横切 4-5片置于试管中， 37°C下行 NBT染色（正常组织染色，缺血组织不染色），拍照。切下缺血心肌称重，用缺血心肌重量与全心湿重的百分比计算心肌梗死面积（MIS)。

模型组大鼠血清 CK、 LDH显著升高（PO.01 ); 阳性药组显著降低血清 CK、 LDH活性（P<0.05 ); CMPC高剂量组、 CMPC中剂量组与模型组相比较，能显著的降低大鼠血清 LDH活性（P<0.05 ); CMPC高剂量组、 CMPC中剂量组能显著降低 CK活性（P<0.05 ); CMPC低剂量组可以降低 LDH、 CK的活性，但无显著性差异（P>0.05 )。结果见表 3。

表 3 心肌肽 C预防性给药对缺血再灌注大鼠血清 CK、 LDH的影响（JC±SD )

<0,05,**P<0,01 与模型组对比； ^##Ρ<0.01与假手术组对比

模型组大鼠血清 SOD活性显著降低（P<0.01)， MDA值显著升高（PO.01); 阳性药 Ver可以显著升高血清 SOD活性（P<0.01)，降低 MDA活性（PO.05); CMPC-H、 M、 L剂量组与模型组比较，均能显著提高冠脉结扎大鼠血清 SOD活力（P<0.01， P<0.05)，降低 MDA含量（P<0.01， P<0.05)。结果见表 4。

表 4 心肌肽 C预防给药对缺血再灌注大鼠血清 SOD、 MDA的影响（JC±SD)

<0.05 <0.01 与模型组对比； ^##P<0.01_ 与假手术组对比

模型组大鼠心肌梗死面积显著升高（P<0.01)，阳性药组、 CMPC各预防性给药组与模型组比较，均能非常显著降低大鼠心肌梗死面积（P<0.01)，结果见表 5、图 7。表 5 心肌肽 C预防性给药对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响（^： ±SD)

<0.05 <0.01 与模型组对比； ^##P<0.01 与假手术组对比

2.2 CMPC治疗性给药对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用结扎 LAD后 5min于尾静脉注射给药，结扎 LAD30 min后复灌 30 min，腹主动脉采血后剖取心脏，同上法测定生化指标和心肌梗死面积。

模型组大鼠血清 CK、 LDH显著升高（PO.01); 阳性药 Ver显著降低血清 CK、 LDH活性（P<0.05， P<0.01); CMPC-H、 M剂量组与模型组相比较，能显著的降低大鼠血清 CK、 LDH活性（P<0.01， P<0.05); CMPC-L可以降低 LDH、 CK的活性，但无显著性差异（P>0.05)。结果见表 6。

表 6 心肌肽 C治疗性给药对缺血再灌注大鼠血清 CK、 LDH的影响（JC±SD)

<0.05； <0.01 与模型组比较； ^##P<0..01_ 与假手术组比较

模型组大鼠血清 SOD活性显著降低（P<0.05)， MDA值显著升高（PO.01); 阳性药 Ver可以显著升高血清 SOD活性（P<0.05)，降低 MDA含量（PO.05); CMPC-H、 M与模型组比较，均能显著提高大鼠血清 SOD活力（P<0.05， P<0.01)， CMPC-L有升高 SOD活性趋势，但与模型组比较无显著差异（P>0.05); CMPC-H、 M、 L各剂量组均可以降低 MDA含量（P<0.05)，结果见表 7。表 7 心肌肽 C治疗性给药对缺血再灌注大鼠血清 SOD、 MDA的影响（^： ±SD)

<0.05 <0.01 与模型组进行比较； ^##P<0.01 与假手术组进行比较

模型组大鼠心肌梗死面积显著升高（P<0.01 )，阳性药 Ver、 CMPC治疗性给药组与模型组比较，均能非常显著降低大鼠心肌梗死面积（P<0.05 )。结果见表 8、图 8。表 8 心肌肽 C治疗性给药对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响（^： ±SD )

*?<0.05； <0.01 与模型组进行比较； ^Ρ^Ο.ΟΙ 与假手术组进行比较

三、结论

在体外原代培养乳鼠心肌细胞阿霉素损伤以及缺氧 -复氧损伤模型中，心肌肽 C可以升高损伤的心肌细胞线粒体脱氢酶的活性，对损伤的心肌细胞具有一定的保护作用；体内心肌肽 c预防性以及治疗性给药均能显著降低缺血再灌注大鼠血清 CK、 LDH、 MDA含量，显著升高 SOD含量，且有一定的剂量依赖性，并能降低大鼠心肌梗死面积，表明心肌肽 C治疗性和预防性给药对缺血再灌注损伤的大鼠心肌均具有保护作用。

Claims

权利要求书

1、一种多肽，其特征在于所述的多肽的氨基酸的排列顺序为： Trp- Ser- Asn- Val- Leu- Arg- Gly- Met- Gly- Gly- Ala- Phe。

2、根据权利要求 1所述的多肽，其特征在于在所述多肽连接有色氨酸的一端依次连接丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸，其氨基酸的排列顺序为：

Lys- Gly- Ala- Trp- Ser- Asn- Val- Leu- Arg- Gly- Met- Gly- Gly- Ala- Phe。

3、一种从心肌肽溶液中提取权利要求 2所述的多肽的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

( 2 ) 取上清液，过固相萃取小柱，用有机溶剂洗脱，收集馏分 A;

( 3 )将收集到的馏分 A浓縮，然后用反相制备色谱分离，收集有活性的馏分 B;

( 4) 将有活性的馏分 B浓縮，然后用分析型反相色谱进行进一步的分离，收集有活性的馏分 C;

( 5 ) 将有活性的馏分 C进行质谱检测，通过质谱数据分析，鉴定馏分 C中有活性的肽段的氨基酸序列，所述的馏分 C即为所述的多肽。

4、根据权利要求 3所述的方法，其特征在于所述硫酸铵溶液的质量百分比浓度为 60-80%，优选所述的浓度为 70%。

5、根据权利要求 3所述的方法，其特征在于步骤（2 ) 中所述的有机溶剂为 60% 乙腈和 0. 1%三氟乙酸的混合溶液。

6、根据权利要求 3所述的方法，其特征在于步骤（3 ) 中将馏分 A浓縮至原体积的 1/8-3/4；利用反相制备色谱分离的条件为：流动相： A相为 100 H₂O+0.1 TFA, B相为 60%ACN+ 0.1% TFA; 紫外检测器，波长 λ =280nm， R=3.0；梯度洗脱： 0-5minO%B， 5-35minO -100 B， 35-40minl00 B， 40-45minl00%-0%B。

7、根据权利要求 3所述的方法，其特征在于步骤（4)中将馏分 B浓縮至 1/8-1/2; 所述的用分析型反相色谱进行进一步的分离为在色谱条件如下：流动相： A相为 100 H₂O+0.1 TFA, B相为 95%ACN+0.1%TFA; 紫外检测器，波长 λ =280nm， R=3.0; 梯度洗脱： 0-5minO%B， 5-50minO -100 B, 50-60minl00 B , 60-65min 100%-0%B的条件下进行。

8、一种制备权利要求 2所述多肽的化学合成方法，其特征在于所述的方法包括:

( 1 ) 分别将色氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的氨基用保护基团进行保护；

( 2 ) 先将固相载体溶胀，再将多肽的氨基酸排列顺序中第一个保护后的氨基酸固定到该固相载体上，然后将所得产物进行洗涤，得到连接有第一个保护后的氨基酸的固相载体；

( 3 ) 将第二个保护氨基酸加入到结合有第一个氨基酸的固相载体中，在縮合剂存在下进行反应形成肽键，然后将氨基酸的氨基的保护基团脱除、并洗涤所得到的固相载体；

( 4) 按照多肽的氨基酸排序，依次加入相应的保护氨基酸，重复上述的氨基的保护基团脱除、洗涤的步骤，使肽链不断延长，直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止；

( 5 )取分离液浸泡上述步骤（4)所得的结合有多肽的固相载体，然后经过过滤后取所得滤液进行沉淀，得到多肽粗品；

( 6 ) 将所得的多肽粗品进行分离纯化，获得目标产物。

9、根据权利要求 8所述的化学合成方法，其特征在于步骤（1 )所述的氨基酸的氨基可以由以下基团进行保护

( 1 ) 苄酯基（Carbobenzoxyl)

(2) 叔-丁氧羰基（t-Butyloxycarbonyl)

( 3 ) 甲苯磺酰基 (Tosyl)

(4) 9-亚基甲酉旨基 (Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl)。

10、权利要求 2所述的多肽在制备预防和 /或治疗组织器官缺血药方面的用途，优选所述多肽在制备预防和 /或治疗心肌缺血、脑缺血、肝缺血、胃缺血、肠缺血、肺缺血或肾缺血药方面的用途，更优选所述多肽在制备预防和 /或治疗心肌缺血药方面的用途。