CN117257915A - 一种红细胞搭便车偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体的说是一种红细胞搭便车型(SS31‑Rapa)偶联物及其制备方法和在药物递送领域和治疗氧化应激损伤相关疾病中的应用。偶联物结构为S‑C‑L‑R，其中，S为抗氧化功能的多肽，C为敏感型连接臂，L为Linker，R为能够与红细胞的结合蛋白靶点结合的物质；或，偶联物的盐。相比与传统的红细胞搭便车类制剂，本发明中的SS31‑Rapa偶联物无需后续处理，可直接增溶后注射，在血液内蓄积于红细胞中，完成红细胞搭便车的过程。无需纳米制剂的制备和引入其他辅料。

Description

一种红细胞搭便车偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体的说是一种红细胞搭便车型(SS31-Rapa)偶联物及其制备方法和在药物递送领域和治疗氧化应激损伤相关疾病中的应用。
背景技术
活性氧(Reactive oxygen species,简称ROS)是一系列氧气未完全还原形式的总成，在细胞内线粒体中通过三羧酸循环和脂肪酸氧化等过程产生，主要包括超氧阴离子(O2 ·-)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)和羟基自由基(·OH)。在正常机体中，ROS可以调节氧化还原平衡，对维持机体的各项生理功能起着十分重要的作用。过量产生的ROS会造成线粒体内膜上特有的心磷脂过氧化并干扰线粒体内膜上微域的稳定性进而引起线粒体内膜的破损。这会导致位于线粒体内膜上的呼吸超复合物破损和细胞色素C从线粒体内膜上分离，大幅度降低线粒体内ATP合成的速度，并且增加在呼吸链中电子的遗失，进一步促进ROS的产生。除此之外，这一过程还会导致线粒体内膜的通透性发生改变，导致细胞色素C和线粒体DNA等促凋亡和促炎性细胞因子进入细胞内，并导致细胞死亡。目前，大量研究表明，ROS过量产生所引起氧化应激损伤在急性肾损伤、神经退行性疾病、手术后的缺血再灌注损伤、休克和炎症反应的发生中均扮演着十分重要的角色。因此，清除ROS，保护线粒体的结构与功能成为了治疗氧化应激损伤导致的疾病的重要治疗方法。目前，SS抗氧化肽、CoQ10和Mito-TEMPO等线粒体靶向ROS清除剂以及没食子素、胆红素、姜黄素、槲皮素、奥替拉普和依达拉奉等抗氧化剂已经广泛应用于治疗ROS过量产生而引起的氧化应激损伤相关疾病。
在这其中，SS31(Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)，作为一种抗氧化四肽，目前已经在临床试验中用于治疗多种线粒体相关的疾病，包括原发性线粒体肌病、巴氏综合征、心力衰竭和肾动脉血管手术后的缺血再灌注损伤等。SS31可以通过静电力和疏水作用力特异性结合线粒体内膜上特有的心磷脂，维持线粒体内膜的內脊和微域的稳定，进而保护线粒体的结构与功能，防止氧化应激引起的细胞损伤。然而，作为一种合成类多肽，SS31较差的药动学性质使得其并未获得理想的临床试验结果。目前，研究人员尝试改变SS抗氧化肽的氨基酸序列来改善其药动学性质，以获得更好的治疗效果。
发明内容
本发明为改善抗氧化肽SS31的药动学特性和提高其在氧化应激引起的相关疾病治疗效果提供了新的策略和更多的选择，满足临床中对高效治疗急性氧化应激引起的相关疾病的迫切需求；进而提供一种红细胞搭便车型(SS31-Rapa)偶联物及其制备方法和在药物递送领域和治疗氧化应激损伤相关疾病中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种红细胞搭便车型偶联物，偶联物结构为S-C-L-R，其中，S为抗氧化功能的多肽，C为敏感型连接臂，L为Linker，R为能够与红细胞的结合蛋白靶点结合的物质；
或，偶联物的盐。
所述抗氧化功能的多肽为SS31(Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)、SBT-20(Phe-Arg-Phe-Lys-NH2)、SBT-68(Arg-Dmt-Ala-Phe-NH2)、SBT-100(Arg-Dmt-His-Phe-NH2)或SBT-131(Orn-Dmt-Lys-Phe-NH2)。
所述敏感型连接臂为二硫醚衍生物、基质金属蛋白酶或组织蛋白酶响应肽；其中，二硫醚衍生物为酮缩硫醇；基质金属蛋白酶响应肽为GPLGLAGC肽段；组织蛋白酶响应肽为DVED肽段。
所述Linker的结构中一端含与自裂解结构相连的活性位点，另一端含能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质结合的活性位点，且，循环长度为PEG4-PEG10。
所述敏感型连接臂为二硫醚衍生物时，Linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位可以与红细胞内结合物质连接(R)，且，循环长度为PEG4-PEG10；敏感型连接臂为基质金属蛋白酶敏感肽时Linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位点可以与红细胞内结合物质连接，且，循环长度为PEG4-PEG10；敏感型连接臂为组织蛋白酶响应肽时Linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位点可以与红细胞内结合物质连接，且，循环长度为PEG4-PEG10。
所述能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质为雷帕霉素、他克莫司(FK506)、吡美莫司或依维莫司等。
所述抗氧化功能的多肽为SS31、SBT-20或SBT68，优选SS31；所述敏感型连接臂为酮缩硫醇、GPLGLAGC肽段或DVED肽段，优选DVED肽；所述Linker为PEG6、PEG8或PEG10，优选PEG6；所述能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质为雷帕霉素或他克莫司，优选雷帕霉素。
上述红细胞搭便车型偶联物的制备方法，以SS31为抗氧化肽，caspase-3响应断裂的DVED肽段作为敏感键，PEG6作为Linker所构成的SS31-Rapa偶联物(SS31-DVED-Rapa)的结构。其具体结构如下：
方法如下：
(1)将丙炔醇乙氧基化合物三氟甲磺酸化得到三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯。再将其与Rapa在DIPEA的催化下反应生成Alkynyl-Rapa。
(2)将Ramage Amide AM resin树脂溶胀活化，采用固相肽合成的方法依次合成SS31和DVED敏感肽。在固相合成柱中，使用DIPEA催化，将N3-PEG6-CH2CH2COOH与肽段连接。最后将产物整体从树脂上切割下来，经制备液相分离纯化得到SS31-DVED-PEG6-N3。
(3)将Alkynyl-Rapa与SS31-DVED-PEG6-N3溶于甲醇，在CuSO4和抗坏血酸钠的催化下使炔基和叠氮发生click反应，后经纯化得到终产物。
更具体为：
(1)合成2-丙炔基氧基乙基化修饰的Rapa(Alkynyl-Rapa)：将1倍量的丙炔醇乙氧基化合物溶于二氯甲烷中，在-50℃下加入1～2倍量的2,6-二甲基吡啶和1～2倍量的三氟甲磺酸酐，在-10℃下反应1～2h，反应结束后用乙酸乙酯和正己烷的混合液与饱和NaCl萃取，有机层用饱和NaCl洗涤三次后用无水Na2SO4干燥过夜再通过减压旋转蒸发法除去有机溶剂，得到粗产物，通过硅胶柱层析法，以正己烷和乙酸乙酯(9:1)为洗脱剂进行纯化，得到产物三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯。将1倍量的Rapa溶于氯仿中，在-10℃，N2保护的条件下加入2～8倍量的三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯和2-8倍量的DIPEA，然后升温至50～80℃，继续搅拌反应1～2h，反应后使用乙酸乙酯和H2O萃取，收集有机层并用饱和NaCl溶液洗涤3次后，使用无水Na2SO4干燥过夜后，通过硅胶柱层析法进行分离，以正己烷和乙酸乙酯(2:1)为洗脱剂进行纯化，得到产物Alkynyl-Rapa。
(2)合成SS31-DVED-PEG6-N3：将Ramage Amide AM resin树脂溶胀活化，使用20％吡啶的DMF溶液脱去树脂上的Fmoc，将1倍量的Fmoc-Phe-OH与1～2倍量的PyBop和2～5倍量的DIPEA溶于DMF后加入固相反应柱中，于室温下反应1-2h。待反应完成后，除去溶剂，向固相反应柱中加入含20％吡啶的DMF于室温下处理5-15min以脱去Fmoc-Phe-OH上的Fmoc并用DMF和二氯甲烷多次洗涤。重复以上步骤，按照所设计好的序列连接氨基酸形成肽链。待肽链连接完毕后，使用20％吡啶的DMF脱去末端氨基上的Fmoc保护基团，然后将1～2倍量的N3-PEG6-CH2CH2COOH、1～2倍量的PyBop和2～5倍量DIPEA溶于DMF后在冰浴环境下加入固相反应柱中，继续反应1-2h。待反应结束后，使用DMF和甲醇多次洗涤，最后用裂解液将产物从固相反应树脂上切割下来并脱去所有保护基团，通过制备液相进行纯化，得到产物SS31-DVED-PEG6-N3。
(3)将1倍量合成的Alkynyl-Rapa和1倍量的SS31-DVED-PEG6-N3共同溶于甲醇中，加入1～5倍量的CuSO4和1～5倍量的抗坏血酸钠，于室温下超声反应1-2h，反应结束后使用0.45μm的滤膜过滤除去不溶物，最后纯化，得到终产物SS31-DVED-Rapa。
上述SS31-Rapa偶联物(SS31-DVED-Rapa)的合成方法，其中
所述步骤(1)中，在三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯的合成中，优选1～2倍量的2,6-二甲基吡啶和1～2倍量的三氟甲磺酸酐，反应2h；在Alkynyl-Rapa的合成中，优选3～5倍量的三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯和5倍量的DIPEA，在60℃下反应2h。
所述步骤(2)中，在合成酰胺键的反应中，优选1倍量的PyBop和4倍量DIPEA，反应2h；使用含有20％吡啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基团的过程中，优选反应5min。
所述步骤(3)中，click反应中，优选加入4倍量的CuSO4和4倍量的抗坏血酸钠，超声反应2h。
一种所述的红细胞搭便车型偶联物的应用，所述偶联物或其盐在制备药物递送载体中的应用。
一种所述的红细胞搭便车型偶联物的应用，所述偶联物或其盐在制备预防或治疗氧化应激相关疾病药物中的应用。
本发明的优势在于：
(1)使用的SS31-Rapa偶联物的合成过程采用成熟的反应技术，操作过程明确，易于制备。
(2)相比与传统的红细胞搭便车类制剂，本发明中的SS31-Rapa偶联物无需后续处理，可直接增溶后注射，在血液内蓄积于红细胞中，完成红细胞搭便车的过程。无需纳米制剂的制备和引入其他辅料。
(3)偶联物结构中的Rapa结构不仅仅可以用来结合红细胞内部的FKBP靶点，还可以抑制mTOR通路刺激自噬过程，清除细胞内受损的细胞器，尤其是受损的线粒体这一ROS最主要的来源，与SS31发挥协同治疗作用。增强其在治疗氧化应激损伤相关疾病中的疗效。
(4)本发明中的SS31-Rapa偶联物具有在红细胞中的蓄积能力，同时该偶联物可以与红细胞发生动态结合从而实现红细胞搭便车，在包载到红细胞内以后可以释放出来。此外，本发明所述的SS31-Rapa偶联物具有智能释放、长循环、低毒性和高效治疗氧化应激损伤的效果为开发氧化应激损伤微环境智能响应型药物递送系统提供了新的策略和更多的选择。满足了临床中对于急性氧化应激损伤相关疾病高效治疗制剂的迫切需求。
附图说明
图1为本发明实施例1的SS31-DVED-Rapa偶联物的质谱图和1H-NMR谱图。
图2为本发明实施例2的全血血浆比(B/P)检测结果图。
图3为本发明实施例3的SS31-DVED-Rapa偶联物与红细胞动态结合试验结果图。
图4为本发明实施例4的SS31-DVED-Rapa偶联物红细胞载药后释放试验结果图。
图5为本发明实施例5的SS31-DVED-Rapa偶联物在caspase-3刺激下释放SS31试验结果图。
图6为本发明实施例6的SS31-DVED-Rapa偶联物生物相容性试验结果图。
图7为本发明实施例7的SS31-DVED-Rapa偶联物促进自噬过程试验的结果图。
图8为本发明实施例8的SS31-DVED-Rapa偶联物的体内血药浓度-时间曲线。
图9为本发明实施例9的SS31-DVED-Rapa偶联物治疗顺铂诱导的急性肾损伤实验图。
图10为本发明实施例9的SS31-DVED-Rapa偶联物治疗缺血-再灌注诱导的急性肾损伤实验图。
图11为本发明实施例10的SS31-DVED-Rapa偶联物治疗脑缺血再灌注损伤实验结果图。
具体实施方法
下面通过实施例的方法进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围中。
本发明偶联物是将药动学性质较差的抗氧化肽与Rapa连接成为偶联物可以使这些药动学性质较差的药物具备“红细胞搭便车”的能力，蓄积于红细胞这个“庇护所”中，有效地避免其被血浆代谢酶降解和被免疫细胞清除。除此之外，偶联物中的Rapa结构域还可以通过抑制mTOR通路达到促进自噬作用的目的，促进降解细胞内异常的蛋白和受损的细胞器，尤其是受损的线粒体，这一亚细胞器为ROS主要的来源，防止有害物质的积累；与偶联物中释放出来的抗氧化肽起到协同作用，降低由ROS引起的氧化应激损伤。
进一步的说，本发明利用偶联物中Rapa结构域和红细胞中高表达的FKBP形成稳定的二元复合物，使结构中半衰期较短的抗氧化肽SS31蓄积于红细胞内进而避免其被血液内的代谢酶降解或被吞噬细胞清除，以此来改善其药动学特性，同时在偶联物结构中引入氧化应激损伤中因发生细胞凋亡而表达升高的半胱天冬氨酸酶caspase-3敏感键实现智能响应性释放。此外，偶联物中的Rapa结构域可以刺激机体内的自噬作用，清除受损的细胞器，尤其是受损的线粒体这一ROS的主要来源，与偶联物中释放出的SS31发挥协同抗氧化作用，提高其对氧化应激引起的相关疾病的治疗效果。
下述实施例中倍量以化学反应投料时计算投料比时使用的计量单位，均为摩尔比。
实施例1：Caspase-3敏感型SS31-Rapa偶联物(SS31-DVED-Rapa)的合成.
首先合成2-丙炔基氧基乙基化修饰的Rapa(Alkynyl-Rapa)：
将1倍量丙炔醇乙氧基化合物溶于适量二氯甲烷中，在-50℃下逐滴加入2倍量的2,6-二甲基吡啶和2倍量的三氟甲磺酸酐，并在-10℃下反应2h。反应结束后，依次用乙酸乙酯和正己烷1：1(v/v)的有机溶剂和饱和NaCl萃取反应液，收集有机层，并用饱和NaCl洗涤3次，使用无水Na2SO4干燥有机层过夜，然后通过旋转蒸发法除去有机溶剂，通过硅胶柱层析法分离，洗脱剂为正己烷：乙酸乙酯(9:1(v/v))，得到产物三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯。
接下来合成Alkynyl-Rapa：
将1倍量的Rapa溶于氯仿中，在-10℃下加入5倍量的三氟甲磺酸-2-丙炔基氧基乙酯和5倍量的DIPEA，在N2保护中以60℃的反应温度反应2h。反应结束后，用乙酸乙酯和水萃取反应液，收集有机层，并用饱和NaCl洗涤3次，使用无水Na2SO4干燥有机层过夜，然后通过旋转蒸发法除去有机溶剂，通过硅胶柱层析法分离，洗脱剂为正己烷：乙酸乙酯(2:1(v/v))，得到Alkynyl-Rapa。
SS31-DVED-PEG6-N3的合成：
首先将适量Ramage Amide AM resin树脂溶胀后用含20％哌啶的DMF溶液浸泡5min脱除树脂上的Fmoc保护基。称取1倍量的Fmoc-Phe-OH溶于80mL的DMF中，在冰浴中加入1倍量的PyBop和4倍量的DIPEA，待完全溶解后，加入到固相反应柱中室温反应1h，通过茚三酮法检测是否为阴性来检测反应是否完成。反应结束后使用旋转蒸发法除去反应溶剂，用100mL的DMF洗涤并加入含20％哌啶的DMF溶液100mL，反应5min，脱去氨基上的Fomc保护基团，待反应结束后分别用适量DMF洗涤3次，二氯甲烷洗涤两次。接下来，按照多肽序列依次从C端到N端进行连接，直至Fmoc-Asp(OtBu)-OH；其中Asp、Glu、dimethylTyr、D-Arg、Lys的侧链保护基分别是OtBu、OtBu、tBu、Pbf、Boc；所有的氨基酸都用Fmoc保护α位氨基。肽链连接完成后加入含有20％哌啶的DMF溶液反应5min除去肽链的Fmoc保护基，将1倍量的N3-PEG6-CH2CH2COOH溶于适量DMF中，加入固相反应柱中，并向反应中加入1倍量的PyBop，在冰浴条件下缓慢加入4倍量的DIPEA，并在冰浴条件下持续搅拌15min后撤去冰浴，继续在室温下反应2h。通过茚三酮检测法是否为阴性来判断反应是否完全。反应结束后，抽干反应液，用100mL的DMF洗涤3次，然后用甲醇再洗涤3次。待固相合成结束后，通过裂解液(TFA：三异丙基硅烷：水＝95：2.5：2.5)与直链肽树脂反应，得到脱出所有侧链保护基的多肽粗产物，并通过制备液相纯化得到SS31-DVED-PEG6-N3。
SS31-DVED-Rapa的合成：
将1倍量的Alkynyl-Rapa和1倍量的SS31-DVED-PEG6-N3溶于适量甲醇中，加入2倍量的CuSO4和2倍量的抗坏血酸钠，充分混合均匀，避光超声2h，待反应结束，使用0.45μm的滤膜过滤反应液除去不溶物，并使用制备液相分离提纯得到SS31-DVED-Rapa。
采用质谱法和核磁工作氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示。核磁共振测试选用的溶剂为DMSO-d6，波谱解析结果如下：
(A)HR-ESI-MS:m/z[M+2H]2+calculated for C121H189N17O36:1228.173509,found1228.175501.(B)1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.24(dd,J＝16.9,7.6Hz,2H),8.10(d,J＝8.7Hz,1H),8.03(s,1H),7.99(d,J＝7.7Hz,1H),7.91(d,J＝7.9Hz,1H),7.8(d,J＝8.1Hz,1H),7.73(t,J＝8.8Hz,1H),7.39(m,2H),7.17-7.26(m,5H),7.08(s,1H),6.40(dd,J＝14.6,11.2Hz,1H),6.31(s,2H),6.20-6.24(m,1H),6.10-6.15(m,2H),5.44(dd,J＝14.9,9.6Hz,1H),5.09(d,J＝10.1Hz,1H),4.96-4.99(m,1H),4.94(d,J＝9.3Hz,1H),4.50-4.57(m,8H),4.43(td,J＝8.4Hz,1H),4.28-4.31(m,3H),4.20(q,J＝7.5Hz 1H),4.14(dd,J＝8.5,6.4Hz,1H),4.01-4.02(m,2H),3.96(d,J＝4.5Hz,1H),3.81(t,J＝5.3Hz,2H),3.48-3.66(m,30H),3.32(s,3H),3.24-3.28(m,1H),3.15(s,3H),3.05(s,3H),2.63-3.02(m,14H),2.34-2.41(m,4H),2.18-2.24(m,2H),2.15(s,6H),1.82-1.96(m,6H),1.74(s,3H),1.04-1.72(m,35H),0.97(d,J＝6.5Hz,3H),0.85(d,J＝6.5Hz,3H),0.82(d,J＝6.5Hz,3H),0.79(d,J＝6.7Hz,3H),0.77(dd,J＝6.8,2.9Hz,6H),0.73(d,J＝6.7Hz,3H).
实施例2：SS31-DVED-Rapa的全血血浆比测定试验
精密称取2.5mg上述获得偶联物SS31-DVED-Rapa，加入到200μL的DMSO中充分溶解制成5mM的储备液，然后加入到适量的全血中，使血液中的SS31-DVED-Rapa终浓度为50μM，37.5μM和25μM。同时配制含有50μM，37.5μM和25μMSS31的全血样品作为对照。在37℃下孵育1h后采用离心法获得全血样品中的血浆，使用ZnSO4溶液将红细胞破碎，将全血和血浆样品除去蛋白后使用高效液相色谱法检测全血及血浆中SS31-DVED-Rapa和SS31的含量，计算全血血浆比(B/P)。
如图2所示，相比与游离的SS31，SS31-DVED-Rapa偶联物的全血血浆比的显著提高，在浓度为50μM，37.5μM和25μM时，偶联物的B/P分别为7.24、9.50和10.52，相比与游离SS31分别提高了5.6、6.9和7.4倍。这表明，相比与游离的抗氧化剂SS31，与Rapa偶联后的SS31-DVED-Rapa会更多地分布在红细胞中，进而避免被代谢酶降解。
实施例3：SS31-DVED-Rapa与红细胞的动态结合验证试验
首先使用红细胞提取试剂盒以梯度离心法分离全血中的红细胞，得到红细胞悬液。精密称取2.5mg上述获得偶联物SS31-DVED-Rapa，加入到200μL的DMSO中充分溶解制成5mM的储备液。使用血细胞计数板对分离的红细胞悬液计数，并用PBS(pH＝7.4)将红细胞悬液稀释到1×108个红细胞/mL。将5mM的SS31-DVED-Rapa储备液加入到1mL红细胞悬液中，使得SS31-DVED-Rapa的终浓度为50μM。在37℃下孵育1h，孵育结束后以2500rpm的转速在室温下离心5min弃去上清，以新鲜PBS缓冲液将红细胞清洗3次，并使用ZnSO4溶液将红细胞破碎，除去蛋白后通过高效液相色谱法检测红细胞中SS31-DVED-Rapa的含量。
首先将红细胞与100μM的Rapa共孵育2h来预先结合红细胞内的FKBP结合位点，然后再与SS31-DVED-Rapa进行共孵育，作为对照。
除此之外，还将包载过SS31-DVED-Rapa的红细胞与含有100μM的Rapa共孵育2h来考察SS31-DVED-Rapa通过与红细胞内的FKBP结合来实现红细胞搭便车这一过程是否为动态可逆。
如图3所示，经过Rapa预处理后，红细胞内的FKBP结合位点被Rapa部分占据。再与SS31-DVED-Rapa偶联物共孵育后红细胞包载的偶联物的量显著低于未经处理的红细胞。这表明SS31-DVED-Rapa偶联物的红细胞搭便车作用中，偶联物结构中的Rapa基团与红细胞中的FKBP结合起着关键作用。此外，在红细胞包载了SS31-DVED-Rapa偶联物后，再次与Rapa进行共孵育，从结果中可以看出红细胞中偶联物的含量明显下降，这表明，在结合了偶联物再结合了红细胞内的FKBP受体后可以被后来的Rapa竞争替代，进而说明偶联物与红细胞的搭便车结合为动态可逆过程。
实施例4：SS31-DVED-Rapa包载入红细胞后的释放试验。
首先使用红细胞提取试剂盒以梯度离心法分离全血中的红细胞，得到红细胞悬液。精密称取2.5mg SS31-DVED-Rapa，加入到200μL的DMSO中充分溶解制成5mM的储备液。使用血细胞计数板对分离的红细胞悬液计数，并用PBS(pH＝7.4)将红细胞悬液稀释到4×108个红细胞/mL。将5mM的SS31-DVED-Rapa储备液加入到1mL红细胞悬液中，使得SS31-DVED-Rapa的终浓度为50μM。在37℃下孵育1h，孵育结束后以2500rpm的转速在室温下离心5min弃去上清，以新鲜PBS缓冲液将红细胞清洗3次。将洗涤好的载有偶联物的红细胞重悬于1mLPBS(pH＝7.4)缓冲液中，于37℃下孵育，在4h、8h和12h将红细胞悬液以2500rpm的转速在室温下离心，取上清液，并用高效液相色谱法检测上清液中的SS31-DVED-Rapa偶联物含量。
如图4所示，包载过SS31-DVED-Rapa偶联物的红细胞在12h内可以释放出其内部包载的约23.2％的偶联物，这表明，偶联物可以从红细胞中释放出来，发挥治疗作用。
实施例5：SS31-DVED-Rapa的体外SS31释放试验
以PBS(pH＝7.4)溶液为释放介质，并在释放介质中加入1μg/mL的caspase-3考察其在细胞凋亡条件下释放SS31的情况。精密称取2.5mg SS31-DVED-Rapa，加入100μL的DMSO充分溶解制成10mM的储备液，然后加入到含有caspase-3的PBS(pH＝7.4)溶液中，使终浓度为100μM。在37℃下孵育，于2h、4h、6h、8h、10h、和12h取样通过高效液相色谱法测定释放出的SS31的浓度，来考察SS31-DVED-Rapa在caspase-3作用下的SS31释放情况。
如图5所示，在caspase-3的刺激下，经过12h的孵育，约有50％的SS31从SS31-DVED-Rapa偶联物中响应性释放出来。
实施例6：SS31-DVED-Rapa的生物相容性试验
采用MTT法考察SS31-DVED-Rapa对人肾小管上皮(HK-2)细胞的细胞毒性来评价SS31-DVED-Rapa的生物相容性。将状态良好的HK-2细胞消化，用MEM培养基稀释至15000cells/mL的细胞密度，吹打均匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液200μL，置于细胞培养箱中，在37℃，5％CO2的环境下孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后，弃去原有的培养基，重新加入含有5、10、25、50和100μM浓度SS31-DVED-Rapa的MEM培养基。受试溶液每孔加入200μL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药物，单一补加200μL培养基，置于细胞培养箱中孵育48h。孵育结束后，将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，在细胞培养箱中继续孵育4h后甩板，并将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体，每孔中加入200μL的DMSO于振荡器上振荡15min以溶解蓝紫色结晶物。设定调零孔(只含有200μL DMSO)。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
如图6所示，HK-2细胞在与浓度高达100μM的SS31-DVED-Rapa偶联物共同孵育48h后细胞存活率依然高于80％，这表明，SS31-DVED-Rapa具有良好的生物相容性。
实施例7：SS31-DVED-Rapa偶联物促进自噬过程试验
使用MEM培养基将HK-2细胞培养至对数生长状态，使用胰酶消化并用MEM培养基稀释至50000cells/mL的细胞密度，吹打均匀后于6孔板中每孔加入细胞悬液4mL，在37℃，5％CO2的环境下孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后，弃去原有的培养基。然后分别给予空白MEM培养基、含有5μg/mL顺铂的MEM培养基、含有5μg/mL顺铂和20μg/mL SS31的MEM培养基、含有5μg/mL顺铂和28μg/mLRapa的MEM培养基、含有5μg/mL顺铂，20μg/mL SS31和28μg/mLRapa的MEM培养基和含有5μg/mL顺铂和76μg/mL SS31-DVED-Rapa偶联物的MEM培养基(等效SS3120μg/mL和Rapaμg/mL)。继续在37℃，5％ CO2的环境下孵育24h。孵育结束后弃去培养基并加入适量PBS，使用细胞刮刀收集细胞，用Ripa裂解液将细胞裂解后，分别用BCA蛋白定量试剂盒和Elisa试剂盒检测蛋白总量、自噬相关的LC3 II和p62蛋白的含量。
如图7所示，自噬水平提高后，往往伴随着LC3 II表达水平的上升和p62蛋白表达水平的下降。在顺铂诱导氧化应激损伤发生后，HK-2细胞内的自噬保护机制被激活，自噬相关蛋白表达水平高于正常的HK-2细胞。由于Rapa是mTOR抑制剂可以通过抑制mTOR通路来促进自噬过程。因此，当给予含有Rapa及Rapa结构域的SS31-DVED-Rapa偶联物时，进一步升高的LC3 II蛋白水平和进一步降低的p62蛋白水平表明细胞内的自噬水平经过刺激后进一步提高。当自噬过程被激活后，其可以通过形成自噬体来将受损的细胞器和蛋白等废物转移至溶酶体降解，进而减少这些损伤结构中ROS的产生，可以于偶联物中释放的抗氧化肽SS31发挥协同作用，提高其治疗氧化应激损伤的效果。
实施例8：SS31-DVED-Rapa的药代动力学研究
取体重在200-250g之间的雄性Wistar大鼠，随机分为2组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射给予使用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇共同增溶后的SS31-DVED-Rapa和游离的SS31，给予的药物剂量等效为SS31 2mg/kg。于规定的时间点采集全血血样，使用ZnSO4溶液破坏红细胞，并用冷乙腈除去样品中的蛋白，通过高效液相色谱仪测定各个时间点的血药浓度。
结果如图8所示，SS31被迅速地从血液中清除。相比之下，作为Rapa偶联物的SS31-DVED-Rapa由于具有红细胞搭便车的能力，可以蓄积于红细胞中，将红细胞作为药物的庇护所，从而避免药物被血液内的代谢酶降解，这使得SS31-DVED-Rapa相比于SS31循环时间明显延长。经过DAS计算的药动学参数如表1所示，SS31-DVED-Rapa显著延缓了SS31的代谢，其体内循环半衰期(t1/2)达到了SS31的6.9倍。此外，相比于SS31,SS31-DVED-Rapa还具有更高的AUC0-48h和MRT0-48 h以及更低的血浆清除率。综上结果所示，本发明中的雷帕霉素偶联物可以显著改善抗氧化药物SS31的药动学性质，延长其体内循环时间。
表1.SS31和SS31-DVED-Rapa的药动学参数。
实施例9：SS31-DVED-Rapa对于顺铂诱导的急性肾损伤的治疗效果试验
取体重在18-22g的雄性balb/c小鼠，随机分为7组，在给药前禁食12h，自由饮水。称取适量顺铂用生理盐水溶解，配置成浓度为2mg/mL的溶液，按照20mg/kg的剂量腹腔注射到balb/c小鼠体内，称量体重，观察30min后随机分组，每组5只，分别给予生理盐水、SS31、Rapa、SS31与Rapa共同治疗和SS31-DVED-Rapa，按照SS31与Rapa计算，给药剂量分别为2mg/kg和2.8mg/kg。以腹腔注射等量生理盐水并使用静脉注释生理盐水治疗的模型作为对照组。在给药72h后称量模型小鼠的体重并将小鼠处死，获取小鼠血液和双侧肾脏。将血液离心后取血清用于检测血清肌酐(Cre)和尿素氮(BUN)，获得的肾脏标本用检测肾脏内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、IL-6和TNF-α的水平。
如图9中所示的结果，相比于使用SS31、Rapa和SS31与Rapa联合治疗，在给予AKI小鼠模型SS31-DVED-Rapa治疗后小鼠表现出了更轻微的体重下降(图9A)。在改善AKI发生后肾脏功能方面，SS31-DVED-Rapa相比于SS31等其他治疗剂可以更显著地降低CRE和BUN的水平(图9B和9C)。在降低肾脏内氧化应激水平方面，经过SS31-DVED-Rapa治疗的模型小鼠相比于使用SS31、Rapa和SS31与Rapa联合治疗的小鼠表现出更高的肾脏内SOD活性和更低的MDA水平(图9D和9E)。在炎症浸润方面，相比于给予SS31等其他治疗剂的小鼠模型，使用SS31-DVED-Rapa治疗的小鼠肾脏中促炎性相关的细胞因子TNF-α和IL-6的水平下降更加明显(图9F和9G)。综合以上结果，SS31-DVED-Rapa可以显著提高SS31在治疗顺铂诱导的急性肾损伤中的效果。
实施例10：SS31-DVED-Rapa对于缺血-再灌注(I&R)诱导的急性肾损伤的治疗效果试验
在缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型建立过程中，首先将22-25g的雄性KM小鼠置于恒温板上，麻醉并备皮，沿腹中线剪开皮肤暴露出器官，找到双侧肾脏，用消毒后的微型止血夹夹住双侧肾蒂40min造成缺血，然后松开止血夹使血液再灌注。完成造模后，将腹中线伤口缝合，做好消毒后用纱布覆盖伤口。称量体重，观察30min后随机分组，每组5只，分别给予生理盐水、SS31、Rapa、SS31与Rapa共同治疗和SS31-DVED-Rapa，按照SS31与Rapa计算，给药剂量分别为2mg/kg和2.8mg/kg。在对照组中，对目标动物采取仅剪开腹中线并缝合，不夹持两侧肾蒂作为假手术过程并通过尾静脉给予生理盐水。72小时之后，称量小鼠体重，然后将小鼠处死，取小鼠的血液约1mL于促凝采血管中，离心得血清，测量其中的血清肌酐(Cre)和尿素氮(BUN)水平。另取小鼠肾脏，检测其中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醇(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6的水平(IL-6)。
如图10中所示的结果，相比于使用SS31、Rapa和SS31与Rapa联合治疗，在给予AKI小鼠模型SS31-DVED-Rapa治疗后小鼠并未表现出了任何的体重降低现象(图10A)。在改善AKI发生后肾脏功能方面，给予SS31-DVED-Rapa治疗可以最显著地降低CRE和BUN的水平(图10B和10C)。在降低肾脏内氧化应激水平方面，AKI小鼠模型在经过SS31-DVED-Rapa治疗后相比于使用其他方式治疗的小鼠表现出更高的肾脏内SOD活性和更低的MDA水平(图10D和10E)。在降低炎症浸润水平方面，相比于给予SS31等其他治疗方式，使用SS31-DVED-Rapa治疗的小鼠肾脏中TNF-α和IL-6两种促炎性细胞因子的水平下降更加明显(图10F和10G)。综合以上结果，SS31-DVED-Rapa可以显著提高SS31在治疗缺血-再灌注诱导的急性肾损伤中的效果。
实施例11：SS31-DVED-Rapa对于脑缺血再灌注损伤的治疗效果试验
用线栓法建立短暂性大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO/R model)。首先将雄性C57BL/6小鼠(22-25g)用小动物气体麻醉机完全麻醉小鼠，然后用1.5％异氟醚保持麻醉。分离右颈总动脉(RCCA)、右颈外动脉(RECA)和右颈内动脉(RICA)后，用电凝笔结扎RECA的远端，然后将硅涂层尼龙线从RECA插入大脑中动脉，旨在阻断RMCA的血液供应。产生缺血2h后，将尼龙线逐渐抽出进行再灌注并结扎RECA，随后进行给药。分别给予生理盐水SS31与Rapa共同治疗和SS31-DVED-Rapa，按照SS31与Rapa计算，给药剂量分别为2mg/kg和2.8mg/kg。在对照组中，对假手术组采用尾静脉给药的方式给予生理盐水进行处理。在给药处理24h后，对小鼠模型进行改良的神经学评分，然后将小鼠处死，取脑组织进行TTC染色和脑含水量分析。
结果如图11中所示，在神经学评分结果中，MCAO/R组的小鼠明显表现出神经功能缺损，具体表现为出现盘旋运动、自发运动减少和严重的爪弯曲现象，经过SS31-DVED-Rapa治疗后，小鼠神经功能缺陷的得到显著缓解(图11B)。在脑梗死面积方面，经过手术造模后，MCAO组的小鼠的脑梗死面积达到了44.13％，经过SS31-DVED-Rapa治疗后，造模小鼠的梗死面积下降为16.33％，相比于造模组有了显著的降低且明显低于SS31和Rapa共同治疗组(梗死面积约为27.11％)(图11A和11C)。在脑含水量分析试验中，MCAO/R组的小鼠脑部具有较高的含水量，经过SS31-DVED-Rapa治疗后，损伤脑部的含水量显著降低，达到了和假手术对照组相似的水平(图11D)。综合以上结果，SS31-DVED-Rapa可以显著减少脑缺血再灌注引起的脑部损伤。
结果表明，本发明偶联物可以显著提高抗氧化肽SS31在红细胞内的蓄积水平，并且偶联物在红细胞上的搭便车的功能是动态可逆的，在包载进红细胞后，该偶联物可以自动脱离并释放出来以发挥治疗效果。本发明偶联物具有显著的caspase-3敏感释放，可以选择性地在细胞凋亡部位释放抗氧化肽SS31。由于结构中含有Rapa结构域，该偶联物可以有效地促进自噬过程来发挥清除ROS的作用。在生物相容性方面，偶联物具有较低的毒性。由于偶联物具有红细胞搭便车的功能，可以蓄积于红细胞内，进而避免被代谢酶所降解，相比于SS31，该偶联物具有更好的药动学性质。此外，偶联物还可以有效提高SS31在治疗氧化应激损伤中的药效，其可以显著改善急性肾损伤发病时肾脏的功能和肾脏微环境以及降低脑缺血再灌注后的脑部损伤。
综上可见本发明中的偶联物可以用于制备氧化应激损伤微环境智能响应释放型药物递送系统。可以改善SS31等抗氧化性肽的药动学性质，并提高其对于氧化应激损伤相关疾病的治疗效果。

Claims (9)

1.一种红细胞搭便车型偶联物，其特征在于：偶联物结构为S-C-L-R，其中，S为抗氧化功能的多肽，C为敏感型连接臂，L为Linker，R为能够与红细胞的结合蛋白靶点结合的物质；
或，偶联物的盐。
2.根据权利要求1所述的红细胞搭便车型偶联物，其特征在于：所述抗氧化功能的多肽为SS31(Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)、SBT-20(Phe-Arg-Phe-Lys-NH2)、SBT-68(Arg-Dmt-Ala-Phe-NH2)、SBT-100(Arg-Dmt-His-Phe-NH2)或SBT-131(Orn-Dmt-Lys-Phe-NH2)。
3.根据权利要求1所述的红细胞搭便车型偶联物，其特征在于：所述敏感型连接臂为二硫醚衍生物、基质金属蛋白酶或组织蛋白酶响应肽；其中，二硫醚衍生物为酮缩硫醇；基质金属蛋白酶响应肽为GPLGLAGC肽段；组织蛋白酶响应肽为DVED肽段。
4.根据权利要求1所述的红细胞搭便车型偶联物，其特征在于：所述Linker的结构中一端含与自裂解结构相连的活性位点，另一端含能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质结合的活性位点，且，循环长度为PEG4-PEG10。
5.根据权利要求4所述的红细胞搭便车型偶联物，其特征在于：所述敏感型连接臂为二硫醚衍生物时，Linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位可以与红细胞内结合物质连接，且，循环长度为PEG4-PEG10；敏感型连接臂为基质金属蛋白酶敏感肽时Linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位点可以与红细胞内结合物质连接，且，循环长度为PEG4-PEG10；敏感型连接臂为组织蛋白酶响应肽时Linker中与其结合一端的活性位点为氨基或羟基，另一端结合位点可以与红细胞内结合物质连接，且，循环长度为PEG4-PEG10。
6.根据权利要求1所述的红细胞搭便车型偶联物，其特征在于：所述能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质为雷帕霉素、他克莫司(FK506)、吡美莫司或依维莫司。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的红细胞搭便车型偶联物，其特征在于：所述抗氧化功能的多肽为SS31、SBT-20或SBT68；所述敏感型连接臂为酮缩硫醇、GPLGLAGC肽段或DVED肽段；所述Linker为PEG6、PEG8或PEG10；所述能够与红细胞内的结合蛋白靶点结合的物质为雷帕霉素或他克莫司。
8.一种权利要求1所述的红细胞搭便车型偶联物的应用，其特征在于：所述偶联物或其盐在制备药物递送载体中的应用。
9.一种权利要求1所述的红细胞搭便车型偶联物的应用，其特征在于：所述偶联物或其盐在制备预防或治疗氧化应激相关疾病药物中的应用。
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