NO177312B - Fremgangsmåte for fremstilling av hirudinderivater med forsinket virkning - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av hirudinderivater med forsinket virkning Download PDFInfo
- Publication number
- NO177312B NO177312B NO892267A NO892267A NO177312B NO 177312 B NO177312 B NO 177312B NO 892267 A NO892267 A NO 892267A NO 892267 A NO892267 A NO 892267A NO 177312 B NO177312 B NO 177312B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hirudin
- lys
- gly
- glu
- asn
- Prior art date
Links
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 title description 3
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims abstract description 48
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 4
- -1 dextran (MW 20 Chemical class 0.000 claims description 3
- OELQSSWXRGADDE-UHFFFAOYSA-N 2-methylprop-2-eneperoxoic acid Chemical compound CC(=C)C(=O)OO OELQSSWXRGADDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 claims description 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 abstract description 2
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007395 thrombosis prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 101100313763 Arabidopsis thaliana TIM22-2 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 239000002473 artificial blood Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M periodate Chemical compound [O-]I(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av hirudinderivater som oppviser forsinket virkning.
Hirudiner er f.eks. kjent fra EP-A 142.860, EP-A 158.564, EP-A 158.986, EP-A 168.342, EP-A 171.024, EP-A 193.175, EP-A 200.655, EP-A 209.061, EP-A 227.938, DE 34 45 517 Al, DE 38 05 540.6 og Chang, FEBS, Bd. 164 (1983) 307. Chang viste bl.a. at C-terminalforkorting påvirker sterkt den anti-trombotiske virkning av hirudin. Også betydningen av hirudin for anti-koagulasjonsterapi blir beskrevet (f.eks. P. Walsmann og F. Markwardt; Pharmazie, 36 (1981) 653). Følgelig inhiberer den spesifikt trombin, men er ellers farmakologisk inert, dvs. uønskede bivirkninger er til nå ikke blitt fastslått.
Den relativt korte oppholdstid av hirudin i dyre- eller menneskekropper kan ansees som uheldig når det gjelder den medisinske anvendelsen som tromboseprofylaktikum (Richter et al., Haematol. 115 (1988) 64; Markwardt et al., Pharmazie 43
(1988) 202).
Til grunn for oppfinnelsen liggerdet å finne en fremgangsmåte for å fremstille et hirudinderivat som oppviser en lengre halveringstid eller som har ubetydligere eliminering.
Denne oppgave blir overraskende løst gjennom et hirudin-derivat, dannet av hirudin eller dets fysiologiske anvende-lige salt og en bærer.
Som hirudiner er eksempelvis de forbindelsene som er beskrevet i de siterte litteraturhenvisningene spesielt de i EP-A 171.024, EP-A 158.986, EP-A 209.061 og DE 38 05 540.6 beskrevne forbindelsene som f.eks.
0 1 10
Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-
20
Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-
30 40 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-
50
Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-
60
Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.
Disse hirudinene kan fremstilles av en fagmann etter allment kjente metoder innenfor peptidkjemi, se f.eks. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, bind 15/2, fortrinnsvis ved hjelp av fastfasesyntese som beskrevet i f.eks. B. Merifield, J.Am.Chem.Soc. 85, 2149 (1963) eller R.C. Sheppard, Int. J. Peptide Protein Res. 21, 118 (1983) eller gjennom likeverdige kjente metoder. Alternativt er de nevnte hirudiner også tilgjengelige innenfor fagområdet gjennom gentekniske metoder.
Videre kommer følgende forandrede hirudiner i betraktning ved hjelp av genteknologiske metoder. Slike er fordelaktige hvorved f.eks. to eller tre naturlig i sekvensen forekommende lysin blir erstattet med en naturlig aminosyre, fortrinnsvis Asg og Asn. Videre også slike hirudiner som er målrettet forandret i henholdsvis N- (fortrinnsvis Lys) og C-terminale (fortrinnsvis Met) forlengelser. Ved en N-terminalforlengelse er i forløpet av sekvensen en forekommende lysin erstattet med en annen naturlig aminosyre, fortrinnsvis Asn og Arg.
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et hirudin-derivat, laget av hirudin eller dens fysiologisk anvendbare salt og en bærer, kjennetegnet ved at hirudin blir omsatt med en aktivert bærer valgt blant oppløselige bærere i form av polysakkarider f.eks. dekstran (MW 20 000-75 000 dt), fortrinnsvis dekstran (MW 70 000 dt), laevane, heparin (MW 6000-20 000 dt) eller "low molecular weight" heparin (MW <6000 dt) , polyetylenglykol (MW 1500-15 000 dt) eller gelatinpartialhydrolysat for eksempel med diisocyanat tverrbundet gelatinpartialhydrolysat eller uoppløselige bærere, som f.eks. sefaroser, agaroser, celluloser eller hydroksymetakrylat, ved en temperatur fra 0°C til 25°C, slik at bæreren blir kovalent bundet til hirudin, hvorved hydroksymetylert polystyrol-harpiks og CNBr-aktivert sefarose er unntatt som bærer.
Forholdet hirudin til bærer kan variere meget sterkt i hirudinderivatene. Det er avhengig av typen bærere og reaksjonsbetingelsene.
Fremgangsmåten til fremstilling av hirudinderivater er kjennetegnet ved at hirudin blir omsatt med en aktiv bærer ved en temperatur fra 0°C til 25°C, fortrinnsvis ved 4°C.
Hirudinderivatene som blir fremstilt ifølge oppfinnelsen er verdifulle trombin-inhibitorer, som særlig utmerker seg gjennom en forlenget halveringstid, hvilket igjen muliggjør en omfattende anvendelse f.eks. i tromboseprofylaksen.
Således kan hirudin og hirudinderivater eksempelvis fordelaktig bli anvendt ved overflatebelegging av hjerteklaffer, (f.eks. av kunststoff), kunstige blodkar, katetere av bioforlikelige medisinske instrumenter eller av filtre, membraner og f.eks. keramiske materialer, alminnelige hemodialyseapparatur.
Ved bestemmelse og påvisning av relevante blodbestanddeler opptrer problemet at det blodet som skal undersøkes må forbehandles. Dette kan medfører problemer for resultatene av slike tester. Testrør som er belagt med hirudin åpner nye muligheter for den praktiserende lege.
Videre finner hirudiner og hirudinderivater anvendelse i implantasjoner, som blant annet også kan bli anvendt for forsinket frigivelse av virkestoffene, f.eks. osmotiske minipumper, biologisk nedbrytbare mikrokapsler, staver, liposompreparater.
Hirudinderivatene som blir fremstilt ifølge oppfinnelsen viser at hirudin lar seg omsette med høymolekylaere bærer-materialer, hvorved hirudinaktiviteten blir overraskende opprettholdt. Den farmakokinetiske opptreden av hirudin endrer seg fordelaktig. Injiserer man hirudin og dekstran-hirudin i et sammenlignende eksperiment i rotter og måler plasmakonsentrasjonen ved hjelp av en trombinhemmetest, så er en trombinhemming målbar etter en time med ca. 10-ganger lavere mengde av dekstran-hirudin. En ytterligere fordel ligger overraskende i forlengelsen av halveringstiden. Dette utgjør for dekstran-hirudin 6 til 7 timer, mens det for hirudin utgjør 1 til 2 timer (Markwardt et al. Pharmazie 43
(1988) 202).
De etterfølgende eksemplene der isohirudin ('Leu-Thr-' hirudin') som er beskrevet i den tyske patentsøknad 38 05 5406 blir anvendt, vil oppfinnelsen bli belyst nærmere. Det er kjent innenfor fagområdet at alle kjente hirudin-ekvivalenter til det anvendte hirudin kan bli omsatt med en bærer og også de hirudinene som er beskrevet på side 2. Med det kan betingelsene for den enkelte reaksjon endres.
Eksempel 1
Fremstilling av hirudin
Syntese av hirudin foregår eksempelvis i gjærceller, der hirudin blir uttrykt ifølge den tyske patentsøknad P 38 05 540.6 (HOE 88/F 043). Hirudin blir deretter anriket ved HP20-søylekromatografi (tysk patentsøknad P 37 38 541.0; HOE 87/F 337). Etter dialyse og deretter affinitetskromatografi på trombin-sefarose (Walsmann, P.: Pharmazie 36 (1981) 860-861) foregår den endelige rensingen i "reversed phase" HPLC. Syntesen kan også foregå ved hjelp av andre kjente gentekniske eller peptidkjemiske metoder.
Eksempel 2
Anvendelse av hirudin og deretter trombinhemmingstest
Hunnlige og hannlige Wistar-rotter med en kroppsvekt på ca. 300 g blir bedøvet med etyluretan (1,5 g/kg i.p.). Rottene blir i. v. applisert med 1000 AT-U/kg av en hirudinderivat henholdsvis autentisk 'Leu-Thr-hirudin', som var oppløst i fysiologisk koksaltoppløsning. Til blodprøvetaking blir dyrene implantert med et kateter i karotis. Til bestemmelse av anti-trombinaktivitet blir blod fra dyrene tatt ut og behandlet med citrat. 0,1 ml av det behandlede blod blir blandet med 0,2 ml Tris/HCl-buf f er (0,1 mol(l; pH 7,4) og forinkubert ved 37°C. Etter tilsats av 0,1 ml av en trombin-løsning (10 NIH-U/ml) blir koaguleringstiden bestemt ved hjelp av et koagulometer etter Schnitger og Gross. Parallelt med eksperimentet blir det benyttet en kalibreringskurve med referanseplasma, og fra den blir den aktuelle plasma-hirudin—, henholdsvis plasma-hirudinderivatkonsentrasjon avlest.
Eksempel 3
Dekstran- hirudin
'Koblingen' av 'Leu-Thr-hirudin' til dekstran (MW 70 000 dt) foregår etter metoden til Parikh, J. et al. Meth. Enzymol 34
(1974) 77. Til den blir dekstranet aktivert gjennom behand-ling med meta-perjodat ved 4°C og deretter dialysert og lyofilisert. 2 g av det aktiverte dekstran blir deretter oppløst i 285 ml 0,1 mol/l natriumfosfatbuffer (pH 8,8) ved romtemperatur, løsningen blir avkjølt til 4°C, 20 mg hirudin blir tilsatt og inkubert i 14 timer ved 4°C. Deretter blir 75 ml fraskilt og lyofilisert. Etter at det lavmolekylaere buffersaltet blir fjernet ved gelfiltrering (Sephadex G-25, 1 cm x 100 cm) blir løsningen på nytt lyofilisert. Reaksjonen finner sted mellom minst en av de tre lysinene og den aktiverte dekstranen.
Til reduksjon av den dannede Schif f -basen blir 75 mg NaBH4 tilsatt den 75 ml inkuberte løsningen, omrørt i 40 minutter ved 4°C og deretter dialysert mot vann i 24 timer ved 4°C (Membran; Servapor Dialysis Lubing; diameter 10 mm, Serva Feinbiochemica GmbH Heidelberg). Så en gelfiltrering med Sephadex G-25 og en lyofilisering.
Dekstran-hirudin blir renset ved hjelp av trombin-sefarose-affinitetskromatografi tilsvarende eksempel 1. Bestemmelsen av dekstran-hirudin-aktivitet foregår ifølge fremgangsmåten til Griesbach et al. (Thromb. Res. 37 (1985) 347-350). Med den blir hemming av trombin-katalysert spalting av kromozym TH målt. Avhengig av den molare basis tilsvarer de målte aktivitetene den av hirudin. Dekstran-hirudin renset på denne måten blir i.v. applisert i Wistar-rotter ifølge eksempel 2. Etter 1 time er det funnet en målbar konsentrasjon i plasma til rottene. Dette kan i sammenligningseksperimentene bare bli beskrevet med den ca. 10-ganger høyere dose av hirudin. Følger man hirudinkonsentrasjonen i plasma videre, finner man en halveringstid av eliminering til substansen på 6-7 timer. Dette er en tydelig forlengelse i forhold til hirudiner (1-3 timer).
De anvendte forsøksdyrene viste ingen påvirkning i deres tilstand.
Eksempel 4
Sefarose- hirudin
8 mg hirudin blir løst i 2 ml 0,1 M NaHC03 og 0,5 M NaCl med pH = 8,0. 400 mg aktivert CH-sefarose 4 B (Pharmacia) blir svellet etter forskriftene fra fabrikanten. Deretter blir proteinløsningen tilsatt til bæreren og får stå i 1,5 timer ved 23°C. Deretter blir det suget av og immobilisatet får stå 1 time til inaktivering av de gjenværende bindingsgrupper i 0,1 M TRIS, pH = 8,0. Deretter blir bæreren vasket etter forskriftene fra fabrikanten.
Protein-koblingsutbytte utgjør 5$. Den biologiske aktiviteten blir bestemt in vitro etter eksempel 2. Fra det behandlede plasma blir sefarose-hirudin isolert, vasket med en 1 til 1,5 M NaCl-løsning og på nytt anvendt i hemmingstesten. De målte aktivitetene ligger innenfor feilgrensen til første måling.
Claims (5)
1.
Fremgangsmåte til fremstilling av et hirudin-derivat, laget av hirudin eller dens fysiologisk anvendbare salt og en bærer, karakterisert ved at hirudin blir omsatt med en aktivert bærer valgt blant oppløselige bærere i form av polysakkarider f.eks. dekstran (MW 20 000-75 000 dt), fortrinnsvis dekstran (MW 70 000 dt), laevane, heparin (MW 6000-20 000 dt) eller "low molecular weight" heparin (MW <6000 dt), polyetylenglykol (MW 1500-15 000 dt) eller gelatinpartialhydrolysat for eksempel med diisocyanat tverrbundet gelatinpartialhydrolysat eller uoppløselige bærere, som f.eks. sefaroser, agaroser, celluloser eller hydroksymetakrylat, ved en temperatur fra 0°C til 25"C, slik at bæreren blir kovalent bundet til hirudin, hvorved hydroksymetylert polystyrol-harpiks og CNBr-aktivert sefarose er unntatt som bærer.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hirudinet er
0 1 10
Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-20
Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-30 40 Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-50
Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-60
Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.
3.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 2, karakterisert ved at Lys 26 og Lys 35 eller Lys 35 og Lys 46 eller Lys 26 og Lys 46 blir hver sin gang erstattet i hirudin med en naturlig aminosyre.
4.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 3, karakterisert ved at Lys 26 til Asn og Lys 35 eller Lys 46 til Arg blir erstattet i hirudinet.
5.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 4, karakterisert ved at hirudinet blir forlenget N-terminalt med en naturlig aminosyre og Lys 26, Lys 35 og Lys 46 blir erstattet med en annen naturlig aminosyre.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3819079A DE3819079A1 (de) | 1988-06-04 | 1988-06-04 | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO892267D0 NO892267D0 (no) | 1989-06-02 |
| NO892267L NO892267L (no) | 1989-12-05 |
| NO177312B true NO177312B (no) | 1995-05-15 |
| NO177312C NO177312C (no) | 1995-08-23 |
Family
ID=6355879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO892267A NO177312C (no) | 1988-06-04 | 1989-06-02 | Fremgangsmåte for fremstilling av hirudinderivater med forsinket virkning |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5538946A (no) |
| EP (1) | EP0345616B1 (no) |
| JP (1) | JP2804514B2 (no) |
| KR (1) | KR0140884B1 (no) |
| AT (1) | ATE130315T1 (no) |
| AU (1) | AU625215B2 (no) |
| CA (1) | CA1340197C (no) |
| CY (1) | CY2025A (no) |
| DE (2) | DE3819079A1 (no) |
| DK (1) | DK175103B1 (no) |
| ES (1) | ES2080732T3 (no) |
| FI (1) | FI98703C (no) |
| GR (1) | GR3018364T3 (no) |
| HK (1) | HK1006024A1 (no) |
| HU (1) | HU204851B (no) |
| IE (1) | IE72201B1 (no) |
| IL (1) | IL90507A0 (no) |
| NO (1) | NO177312C (no) |
| NZ (1) | NZ229402A (no) |
| PT (1) | PT90743B (no) |
| ZA (1) | ZA894180B (no) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2000887A1 (en) * | 1988-11-01 | 1990-05-01 | Cecilia S.L. Ku | Thromboresistant materials and methods for making same |
| US5663141A (en) * | 1989-12-01 | 1997-09-02 | Basf Aktiengesellschaft | Hirudin/polyalkylene glycol conjugates and hirudin muteins |
| JP2975632B2 (ja) * | 1990-03-30 | 1999-11-10 | 生化学工業株式会社 | グリコサミノグリカン修飾プロテイン |
| GB2247239A (en) * | 1990-08-22 | 1992-02-26 | Ciba Geigy Ag | Hirudin conjugates with polyoxyethylene |
| DE4041185A1 (de) * | 1990-12-21 | 1992-06-25 | Knoll Ag | Verwendung von hirudin und dessen muteinen zur kombinationsbehandlung von tumoren |
| DE4437502A1 (de) * | 1993-12-02 | 1995-06-08 | Basf Ag | Hirudin-Konjugate aus Hirudin und lipophilen Verbindungen |
| DE4342154A1 (de) * | 1993-12-10 | 1995-06-14 | Behringwerke Ag | Amidinophenylalaninderivate, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel als Antikoagulantien |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19533817C2 (de) * | 1995-09-13 | 1999-12-09 | Max Planck Gesellschaft | Komplex-gebundene Hemmstoffe aktivierbarer Stoffwechselenzyme als molekulare Marker zur Diagnostik und Therapieüberwachung |
| US6562781B1 (en) | 1995-11-30 | 2003-05-13 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates |
| US6491965B1 (en) | 1995-11-30 | 2002-12-10 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Medical device comprising glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates |
| US7045585B2 (en) | 1995-11-30 | 2006-05-16 | Hamilton Civic Hospital Research Development Inc. | Methods of coating a device using anti-thrombin heparin |
| US5856452A (en) | 1996-12-16 | 1999-01-05 | Sembiosys Genetics Inc. | Oil bodies and associated proteins as affinity matrices |
| DE19915862A1 (de) * | 1999-04-08 | 2000-10-12 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von molekulargewichtserweitertem Hirudin als Antikoagulans bei der extrakorporalen Nierenersatztherapie |
| US6809076B2 (en) * | 2000-03-20 | 2004-10-26 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Use of anticoagulant agents in the extracorporeal treatment of blood |
| US6818392B2 (en) | 2000-12-06 | 2004-11-16 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus and uses thereof |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1979000638A1 (en) * | 1978-02-17 | 1979-09-06 | Thin Conductive Coating Oester | A method of producing thrombosis-resistant surfaces |
| DE2930542A1 (de) * | 1979-07-27 | 1981-02-12 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate und verfahren zu ihrer herstellung |
| EP0158564B1 (fr) * | 1984-03-27 | 1992-07-15 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformées et procédé de préparation de l'hirudine |
| US4666884A (en) * | 1984-04-10 | 1987-05-19 | New England Deaconess Hospital | Method of inhibiting binding of von Willebrand factor to human platelets and inducing interaction of platelets with vessel walls |
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| DE3583361D1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-08-08 | Ucp Gen Pharma Ag | Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3500268A1 (de) * | 1985-01-05 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Praeparate mit verzoegerter wirkung, verfahren zu deren herstellung sowie entsprechende mittel zur human- bzw. veterinaermedizinischen anwendung |
| DE3506992A1 (de) * | 1985-02-27 | 1986-08-28 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Modifizierte hirudine, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| EP0209061B1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-01-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
-
1988
- 1988-06-04 DE DE3819079A patent/DE3819079A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-05-30 AT AT89109772T patent/ATE130315T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-30 ES ES89109772T patent/ES2080732T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-30 DE DE58909493T patent/DE58909493D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-30 EP EP89109772A patent/EP0345616B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-01 FI FI892686A patent/FI98703C/fi active IP Right Grant
- 1989-06-01 AU AU35955/89A patent/AU625215B2/en not_active Expired
- 1989-06-01 HU HU892808A patent/HU204851B/hu unknown
- 1989-06-02 NZ NZ229402A patent/NZ229402A/en unknown
- 1989-06-02 JP JP1139378A patent/JP2804514B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 PT PT90743A patent/PT90743B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 CA CA000601593A patent/CA1340197C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 ZA ZA894180A patent/ZA894180B/xx unknown
- 1989-06-02 DK DK198902707A patent/DK175103B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 NO NO892267A patent/NO177312C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 IL IL90507A patent/IL90507A0/xx unknown
- 1989-06-02 KR KR1019890007560A patent/KR0140884B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-06-12 IE IE181589A patent/IE72201B1/en not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-05 US US07/895,436 patent/US5538946A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-12-12 GR GR950403492T patent/GR3018364T3/el unknown
-
1998
- 1998-02-20 CY CY202598A patent/CY2025A/xx unknown
- 1998-06-11 HK HK98105201A patent/HK1006024A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO177312B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av hirudinderivater med forsinket virkning | |
| AU767172B2 (en) | Protein for blocking platelet adhesion | |
| US5880092A (en) | Conformationally stabilized cell adhesion peptides | |
| AU623882B2 (en) | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation | |
| US5981468A (en) | Conformationally stabilized cell adhesion peptides | |
| CA2220497A1 (en) | Kunitz type protease inhibitors | |
| CA2232240C (en) | Peptide for inhibiting growth of smooth muscle cells | |
| NO301985B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av 3-des-hydroksy-cystatin C eller en homolog derav, plasmid samt mikroorganisme for anvendelse ved utförelse av fremgangsmåten | |
| Markwardt | The comeback of hirudin as an antithrombotic agent | |
| US5807982A (en) | Affinity purified heparin | |
| US6239101B1 (en) | Thrombin binding polypeptides | |
| FI104232B (fi) | Hirudiinijohdannaisten käyttö trombiini-inhibiittoreina | |
| EP3333177B1 (en) | Multi-target compound with anticoagulation and antiplatelet activity, preparation method therefor, and use thereof | |
| JPH04305532A (ja) | 血小板のコラーゲンへの付着をブロックする方法 | |
| US5262521A (en) | Isolated atrial peptide-degrading enzyme and novel compounds useful as inhibitors thereof | |
| CN117447584A (zh) | 一种具有抗凝抗血栓抗炎活性的水蛭肽及其用途 | |
| GB2431655A (en) | Antagonisation of anticoagulants | |
| JP2011527991A (ja) | ポリペプチド系物質、その製造方法及び用途 | |
| ZA200108535B (en) | Protein for blocking platelet adhesion. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |