FI104232B - Hirudiinijohdannaisten käyttö trombiini-inhibiittoreina - Google Patents

Description

104232

Hirudiinijohdannaisten käyttö trombiini-inhibiittoreina

Jakamalla erotettu FI-hakemuksesta 892686 5 Keksintö koskee dekstraaniin, Sepharoseen tai poly- etyleeniglykooliin (MP 1 500 - 15 000 dt) sidotun hirudii-nin käyttöä in vitro trombiini-inhibiittorina. Keksintö koskee myös menetelmää lääketieteellisten välineiden pinnan päällystämiseksi mainituilla hirudiineilla.

10 Hirudiinit ovat esim. tunnettuja julkaisuista EP-A

142 860, EP-A 158 564, EP-A 158 986, EP-A 168 342, EP-A

171 024, EP-A 193 175, EP-A 200 655, EP-A 209 061, EP-A

227 938, DE 3 445 517 AI, DE 3 805 540.6 ja Chang, FEBS,

Bd. 164 (1983) 307. Chang osoitti mm., että C-terminaali-15 set lyhennykset haittaavat voimakkaasti hirudiinin anti-tromboottista vaikutusta. Myös hirudiinien merkitystä an-tikoagulaatioterapiaan kuvattiin riittävästi [esim. P. Walsmann ja F. Markwardt; Pharmazie, 36 (1981) 653] . Siten se inhiboi spesifisesti trombiinia, mutta on muuten far-20 makologisesti tehoton, tämä tarkoittaa, että ei-toivottuja sivuvaikutuksia ei ole tähän mennessä osoitettu.

Haittapuolena lääketieteelliselle käytölle verisuo- • ’·· nitukoksen ennakkotorjunnassa voidaan kuitenkin pitää suh- teellisen lyhyttä hirudiinin pysymistä eläin- tai ihmis-·*·,. 25 kehossa [Richter et ai., Haematol. 115 (1988) 64; : Markwardt et ai., Pharmazie 43 (1988) 202] .

• · · • · · ·

Keksinnön tehtävänä onkin siten löytää uusia hiru-diinijohdannaisia, joilla on pidempi puoliintumisaika tai • · · * joiden eliminaatio on vähäistä.

3 0 Tämä tehtävä ratkaistaan yllättäen hirudiini johdan- • · · *·' ' naisilla, jotka ovat muodostuneet hirudiinistä tai sen • · · *.· * fysiologisesti hyväksyttävästä suolasta ja kantajasta.

.·**. Hirudiineinä tulevat kysymykseen esimerkiksi sivul- • 11 la 1 lainatuissa kirjallisuuskohdissa kuvatut yhdisteet, « ·

35 erityisesti julkaisuissa EP-A 171 024, EP-A 158 986, EP-A

: 209 061 ja De 3 805 540.6 kuvatut yhdisteet, kuten esim.

• « 2 104232 0 1 10 Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cye-Thr-Glu-Ser-Gly-Gin-Asn-Leu-Cys- 20 5 Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gin-Gly-Asn-Lys-Cys- 30 40 lie-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gin-Cys-Val-Thr-Gly- 50

Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gin-Ser-Hie-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-10 60

Glu-Glu-lie-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gin.

Näitä hirudiinejä voidaan valmistaa asiantuntijalle yleisesti tunnettujen peptidikemian menetelmien mukaan, 15 ks. esim. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, nidos 15/2, edullisesti kiinteäfaasisynteesin avulla, kuten esim. B. Merifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963) tai R.C. Sheppard, Int. J. Peptide Protein res. 21, 118 (1983) kuvaavat tai vastaavien tunnettujen menetelmien 20 mukaan. Vaihtoehtoisesti voi asiantuntija lähestyä mainittuja hirudiinejä tunnetuin geeniteknisin menetelmin.

Lisäksi tulevat seuraavat geeniteknologisin mene- ;’.t> telmin muutetut hirudiinit kysymykseen. Edullisesti sei- .···. laiset, jolloin esim. kaksi sekvenssissä luonnollisesti • · 25 olevasta kolmesta lysiinistä on korvattu luonnollisella • »» I . aminohapolla, edullisesti Asg:llä, Asn:llä. Myös sellaiset • · · "Y hirudiinit, jotka on muutettu suunnatulla N- (edullisesti • · « • ·1 Lys) tai C-terminaalisella (edullisesti Met) pidennyksel- f · · * lä. N-terminaalisessa pidennyksessä ovat sekvenssin kulus- 30 sa esiintulevat lysiinit korvattu toisella luonnollisella • · · V 1 aminohapolla, edullisesti Asnrllä, Argrllä.

Y: Kantajina käytetään liukoisia kantajia, erityisesti polysakkarideja, kuten esim. Dextrane (MW 20 000 - 75 000 dt) - edullisesti Dextrane (MW 70 000 dt) - Laevane, 35 Heparine (MW 6 000 - 20 000 dt) tai "pienimolekyylipai- • · • · « • « « (»1 « · 3 104232 noista" hepariinia (MW < 6 000 dt) , polyetyleeniglykolia (MW 1 500 - 15 000 dt) tai gelatiinipartiaalihydrolysaat-tia esimerkiksi di-isosyanaatilla kostutettu gelatiinipar-tiaalihydrolysaatti (Polygeline, RHaemaccel) tai liukene-5 mattomia kantajia, kuten esim. sefaroosit, esimerkiksi CH-Sepharose 4B (Fa. Pharmacia), agaroosit, selluloosa, hyd-roksimetakrylaatti, jotka kaikki on aktivoitu tunnettujen menetelmien mukaan, kuitenkin erityisesti käytetään Dextrane'a, Heparine'a ja pienimolekyylipainoista heparii-10 nia.

Hirudiinin suhde kantajaan voi vaihdella suuresti hirudiinijohdannaisissa. Se riippuu kantajan luonteesta ja reaktio-olosuhteista.

Tässä kuvataan myös menetelmä hirudiini johdannaisen 15 valmistamiseksi, jolloin hirudiini siirretään aktiiviselle kantajalle lämpötilassa 0-25 °C, edullisesti 4 °C:ssa.

Tässä kuvatut hirudiinijohdannaiset ovat arvokkaita trombiini-inhibiittoreita, jotka ovat erityisen hyviä siinä, että niillä on pidentynyt puoliintumisaika, mikä taas 20 puolestaan mahdollistaa laajan käytön esim. verisuonitu koksen ennakkotorjunnassa.

Siten hirudiinejä ja hirudiinijohdannaisia käyte- '·. tään esimerkiksi edullisesti sydänläppien (esim. teko- aine), keinotekoisten suonten, biokompatiibeleiden lääke-25 tieteellisten laitteiden, katetrien tai suodattimien, • : membraanien ja sellaisten materiaalien kuin esim. taval- • · · ^ ··· · listen hemidialyysilaitteiden keramiikan pintakerroksissa.

• · Määritettäessä ja osoitettaessa tärkeitä veren komponent- • · · * teja, on ongelmana, että tutkittava veri täytyy esikäsi- 1 2 3 4 5 6 teliä. Tämä voi tuoda mukanaan ongelmia sellaisten testien 2 • · · 3 *·* ‘ paikkansapitävyydelle. Koeputket, jotka on peitetty hiru- 4 • · · 5 V * diinillä, avaavat asiantuntijalle uusia mahdollisuuksia.

Hirudiinilla ja hirudiini-johdannaisilla on lisäksi käyttöä siirrännäisissä, joita käytetään mm. vaikutusai- 6 neen hidastuneeseen vapauttamiseen, esim. osmoottiset mi- ( I I • « 104232 4 nipumput, biologisesti hajotettavat mikrokapselit, sauvat, liposomivalmisteet.

Tässä kuvatut hirudiini-johdannaiset osoittavat, että hirudiini on mahdollista muuttaa suurimolekulaarisen 5 kantajamateriaalin kanssa, jolloin yllättäen hirudiiniak- tiivisuus säilyy. Hirudiinin farmakokineettinen käyttäytyminen muuttuu edullisesti. Kun injisoidaan hirudiinia ja Dextran-hirudiinia vertailevassa kokeessa rottiin ja mitataan plasmakonsentraatio trombiiniestotestin avulla, niin 10 on tunnin kuluttua mitattavissa n. 10-kertaisesti pienemmällä Dextran-hirudiinimäärällä trombiiniesto. Eräs lisäetu on yllättäen puoliintumisajan pidentymisessä. Se nousee Dextran-hirudiinilla 6-7 tuntiin, kun se hirudiinil-la nousee 1-2 tuntiin (Markwardt et ai. Pharmazie 43 15 (1988) 202) .

Seuraavien esimerkkien, joissa käytetään saksalaisessa patenttihakemuksessa 3 805 540.6 kuvattua isohiru-diinia ("Leu-Thr-Hirudiini"), pitäisi valaista keksintöä, kuitenkin niin ettei sitä rajoiteta. Asiantuntija on täy-20 sin perillä siitä, että kaikki tunnetut hirudiinit voidaan muuntaa samanarvoisiksi käytetyn hirudiinin kanssa kantajan avulla ja myös sivulla 2 kuvatut hirudiinit. Tällöin : voivat olosuhteet yksittäisille reaktioille vaihdella.

:***: Esimerkki 1 •« · 25 Hirudiinin valmistaminen • · t : .·. Hirudiinin synteesi tapahtuu esimerkiksi hiivaso- • · · j‘V luissa, jotka saksalaisen patenttihakemuksen P 3 805 540.6 * · (HOE 88/F 043) mukaan ohjaavat hirudiinia ulos. Sen jäi- • · · keen hirudiini rikastetaan HP20-pylväskromatografiässä 30 (saksalainen patenttihakemus P 3 738 541.0; HOE 87/F 337) .

·.1 ’ Dialyysin jälkeen ja sitä seuraavan af f initeettikromato- • · · ·.· · grafian Trombin-Seharose' ssa jälkeen (Walsmann, P. :

Pharmazie 36 (1981) 860 - 861) tapahtuu lopullinen puhdis-

1 I

* i 4 taminen "käänteisfaasi-" HPLC:ssä.

4 4 4 4 4 4 4« · · 5 104232

Synteesi voi tapahtua myös muiden tunnettujen geeniteknisten tai peptidikemian menetelmien avulla.

Esimerkki 2

Hirudiinin käyttäminen ja sen jälkeinen trombiini-5 estotesti

Naaras- ja koiras-Wistar-rottia, joiden kehonpaino on noin 300 g, tainnutetaan etyyliuretaanilla (1,5 g/kg i.p.). Rottiin laitetaan i.v. 1 000 AT-U/kg hirudiini-johdannaista tai autenttista "Leu-Thr-hirudiinia", joka on 10 liuotettu fysiologiseen keittosuolaliuokseen. Verenottoa varten istutetaan eläimiin katetri päänvaltimoon. Anti-trombi iniaktiivisuuden määrittämiseksi otetaan eläimistä verta ja käsitellään sitraatilla. 0,1 ml siten käsiteltyä verta sekoitetaan 0,2 ml:n kanssa Tris/HCl-puskuria (0,1 15 mol/1; pH 7,4) ja esi-inkuboidaan 37°C:ssa. Sen jälkeen, kun on lisätty 0,1 ml trombiiniliuosta (10 NIH-U/ml) , määritetään hyytymisaika koagulaatiomittarin avulla Schnitgerin ja Grossin mukaan. Kokeen kanssa rinnakkain tehdään kalibrointikäyrä referenssiplasmalla, ja luetaan 20 kulloinenkin plasma-hirudiini- tai plasma-hirudiini-joh- dannainen-konsentraatio käyrältä.

Esimerkki 3

Dextran-hirudiini

: : "Leu-Thr-hirudiinin" yhdistäminen dekstraaniin (MW

25 70 000 dt) tapahtuu Parikh, J. et ai. menetelmän mukaan, • Ϊ Meth. Enzymol 34 (1974) 77. Sitä varten aktivoidaan M» ·

Dextran käsittelemällä meta-perjodaatilla 4 °C:ssa ja sen jälkeen dialysoidaan ja lyofilisoidaan. 2 g aktivoitua • · ·

Dextran'ia liuotetaan sitten 285 ml:aan 0,1 mol/1 natrium-,t. 30 fosfaattipuskuriin (pH 8,8) huoneenlämpötilassa, jäähdy- • t · *·* * tetään liuos 4 °C:een, lisätään 20 mg hirudiinia ja inku- • · · *.· · boidaan 14 tuntia 4 °C:ssa. Sen jälkeen erotetaan 75 ml ja lyofilisoidaan. Sen jälkeen, kun on poistettu pienimole-kulaariset puskurisuolat geelisuodatuksella (RSephadex G-35 25, 1 cm x 100 cm) , lyofilisoidaan liuos uudelleen.

I « 1 « · · • · · · « « · « % • · 6 104232

Reaktio tapahtuu ainakin yhden kolmesta lysiinistä ja aktivoidun Dextran'in välillä.

Muodostuneen Schiffschen emäksen pelkistämiseksi lisätään 75 mg NaBH4:ää 75 ml:aan inkuboitua liuosta, se-5 koitetaan 40 minuuttia 4 °C:ssa ja sen jälkeen dialysoi-daan liuosta vetä vastaan 24 tuntia 4 °C:ssa (membraani: Servapor Dialysis Lubing; läpimitta 10 mm, Fa. Serva Feinbiochemica GmbH Heidelberg). Sitten geelisuodatus RSephadex G-25:ssä ja lyofilisaatio. Dextran-hirudiini puh-10 distetaan Thrombin-Sepharose-affiniteettikromatografiän avulla vastaavasti kuin esimerkissä 1. Dextran-hirudiini-aktiviteetin määritys tapahtuu Griesbach et ai. menetelmän mukaan (Thromb. Res. 37 (1985) 347 - 350) . Tällöin mitataan trombiinin katalysoiman Chromozym TH:n pilkkomisen 15 esto. Sovitettuna molaariselle pohjalle vastaa mitattu aktiivisuus hirudiinin aktiivisuutta. Näin puhdistettu Dextran-hirudiini laitetaan esimerkin 2 mukaan Wistar-rot-tiin i.v. Tunnin kuluttua löydetään rottien plasmasta havaittava konsentraatio. Tätä voidaan kuvata vertailutes-20 tissä vain n. 10-kertaisesti suuremmalla hirudiiniannok-sella. Jos seurataan plasman hirudiinikonsentraatiota edelleen, niin havaitaan aineen poistumiselle 6-7 tunnin puoliintumisaika. Tämä on selvä pidentyminen verrattuna « ,···, hirudiineihin (1-3 tuntia) . Käytetyt koe-eläimet eivät 25 osoita käyttäytymisessään häiriötä.

* · 9 I . Esimerkki 4 • 1 1 ·;1/ Sepharose-hirudiini • · · • ·1 8 mg hirudiinia liuotetaan 2 ml .-aan 0,1 M NaHC03:a « · · V · ja 0,5 M NaCl:a pH = 8,0:ssa. 400 mg aktivoitua CH-Sepha- 30 rose 4 B:tä (Pharmacia) turvotetaan valmistajan ohjeiden :: : mukaan. Sitten lisätään proteiiniliuos kantajan päälle ja annetaan seistä 1,5 tuntia 23 °C:ssa. Sen jälkeen imetään ja annetaan immobilisaatin seistä jäljelle jääneiden sito-misryhmien inaktivoimiseksi 1 tunti 0,1 M TRIS:ssa, pH = 35 8,0. Sen jälkeen pestään kantaja valmistajan ohjeiden mu- « t : : : kaan.

« · « « ♦ · · · • · 7 104232

Proteiini-kytkeytyrnissaanto on 5 %. Biologinen aktiivisuus määritetään nitrossa esimerkin 2 mukaan. Käsitellystä plasmasta eristetään Sepharose-hirudiini, pestään 1 - 1,5 M NaCl-liuoksella ja tehdään estotesti uudelleen. 5 Mitattu aktiivisuus on 1. mittauksen virherajojen sisäpuolella.

i

• · I

< « <

1 I

t « I I I i I • · · • · • · · • » t • · · · ·· · • · · « · • · • · t • · · • · · • · · • · · • · · 1 I ( · · • · · • · ·

• I I

« I

' « « « · I ·

Claims (2)

104232

1. Dekstraaniin, Sepharoseen tai polyetyleenigly-koliin (MW 1 500 - 15 000 dt) sidotun hirudiinin käyttö in 5 vitro trombiini-inhibiittorina.

2. Menetelmä lääketieteellisten välineiden pinnan päällystämiseksi, tunnettu siitä, että ne päällystetään dekstraaniin, Sepharoseen tai polyetyleeniglyko-liin (MW 1 500 - 15 000 dt) sidotulla hirudiinilla. e ( • *·· • · • · · • · · ··· · ·· · • # e • # • · • · · • · · • · · • · · • i · • · · • · · • · · • · · » « f 104232