CN103450341A - 次血红素六肽衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一系列新的含次血红素辅基的六肽过氧化物酶DhHP-6氮甲基化衍生物及这些衍生物的制备方法。该类异构体具有抗酶解的稳定性。为开发长效和口服DhHP-6药物提供结构基础。

Description

次血红素六肽衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及次血红素六肽（Deuterohemin-His-Peptide，DhHP-6，次血红素代表符号Dh）衍生物及其制备方法和用途。具体地，本发明涉及经氮甲基化修饰的DhHP-6衍生物及其制备方法和活性测定。 
背景技术
肽类化合物是各类蛋白酶水解的底物，它们易被血液及组织中的多种蛋白酶降解。如氨基酸肽酶、羧基肽酶、二肽裂解酶、内切酶等。多肽这种被酶降解的特性是其作为药物开发的致命弱点。多肽类药物的生物利用度大都极低，其原因就是肽类物质体内半衰期很短，已经用于临床治疗的肽类药物的半衰期有些也仅仅为几十秒。它们被注射到体内，在到达作用靶点之前绝大部分已被各种蛋白酶水解成各种碎片。因此，将生物活性肽直接开发成用于临床治疗的肽类药物的受到很大限制。 
DhHP-6是含有次血红素和组氨酸残基的合成六肽化合物。是根据抗坏血酸过氧化物酶的结构，微过氧化物酶MP-9结构，以及以次血红素为靶分子筛选噬菌体展示肽库所得到的保守序列，是化学合成的过氧化物酶的模拟酶。与天然的过氧化物酶蛋白相比，短肽过氧化物模拟酶DhHP-6的化学稳定性强，但生物稳定性相对较差，该酶中与底物的结合部位---六肽序列极易被蛋白酶裂解成各种氨基酸残片，造成酶的生物利用度低。 
DhHP-6潜在的药物应用前景已见报道。中国专利CN200710056312.4报道了次血红素短肽化合物及在抗白内障药物制备中的用途。中国专利CN200910066991.2报道了次血红素短肽化合物在抗脑缺血药物制备中的用途。中国专利CN200610131682.5报道了三价铁卟啉短肽化合物在抗冠心病药物制备中的用途。吉林大学2008年王迪硕士论文对DhHP-6抗2型糖尿病作用及机理做了研究。 
为将DhHP-6开发成临床应用的高效抗氧化药物，需要延长该短肽过氧化物模拟酶的体内半衰期，增强抗酶解的稳定性，降低免疫原性和抗原性。采用化学修饰和改变剂型等方法能在不同程度上解决这些问题。DhHP-6与聚乙二醇（PEG）共价连接修饰和制备DhHP-6载药微球剂型是目前解决DhHP-6体内半衰期，延长生物利用度的两种途径（参见例如中国专利CN200810050307.7和CN200810051452.7）。PEG化学修饰方法一方面高分子量的聚合物聚乙二醇（分子量5000-5000道尔顿）的连接，减少了药物的肾排出，延长了体内代谢时间，另一方面大分子聚乙二醇对体内蛋白酶具有一定的遮挡和屏蔽作用，降低了蛋白酶对肽链的降解作用。但是，PEG屏蔽蛋白酶的同时也降低了肽链的活性部位与受体的结合机会，造成PEG修饰的药物与原药相比活性大幅度降低。一般仅为原药的百分之几到百分之十几。而载药微球则对制备工艺要求严格。 
发明内容
本发明人采用肽类分子位点变构的修饰方法，用N-甲基氨基酸替换多肽序列中某些位点的普通氨基酸。即把连接氨基酸的肽键-CONH-中的H以CH3取代，从而形成部分位置氮甲基化的分子。氮甲基化修饰后的位点处，肽键的氮原子上的氢原子被甲基取代，阻断了蛋白酶对该处肽键的裂解，该分子可强有效地抵抗各类蛋白质水解酶的水解，如血清中以及胃肠道中的各种酶类。这样就提高了多肽的生物稳定性，并延长了体内半衰期。对多肽分子位点变构的氮甲基化修饰是开发肽类药物的口服制剂和长效制剂的理想途径。本发明制备了一系列氮甲基化的DhHP-6衍生物。酶学实验测定结果表明，这些氮甲基化的短肽具有显著的抗酶解稳定性，因此具有潜在的药物开发前景。 
在第一方面，本发明提供了一种次血红素六肽（DhHP-6）氮甲基化衍生物，其特征在于氨基酸序列为：Dh-βAHTVEK-X 
其中Dh为次血红素，βA为β丙氨酸，H为α组氨酸，T为α苏氨酸，V为α缬氨酸，E为α谷氨酸，K为α赖氨酸，X为游离羧基或酰胺基。 
并且其中：第2位的H与第3位的T之间键可为-CONH-或-CONCH- 3-; 
第3位的T与第4位的V之间键可为-CONH-或-CONCH3-; 
第4位的V与第5位的E之间键可为-CONH-或-CONCH3-;并且 
第5位的E与第6位的K之间键可为-CONH-或-CONCH3-。 
在一个优选实施方案中，所述DhHP-6氮甲基化衍生物。其特征在于其结构为： 
Dh-βAH(-Me-)TVEK-X，结构代号1000； 
Dh-βAHT(-Me-)VEK-X，结构代号0100； 
Dh-βAHTV(-Me-)EK-X，结构代号0010； 
Dh-βAHTVE(-Me-)K-X，结构代号0001； 
Dh-βAH(-Me-)T(-Me-)VEK-X，结构代号1100； 
Dh-βAHT(-Me-)V(-Me-)EK-X，结构代号0110； 
Dh-βAHTV(-Me-)E(-Me-)K-X，结构代号0011； 
Dh-βAH(-Me-)TV(-Me-)EK-X，结构代号1010； 
Dh-βAH(-Me-)TVE(-Me-)K-X，结构代号1001； 
Dh-βAHT(-Me-)VE(-Me-)K-X，结构代号0101； 
Dh-βAH(-Me-)T(-Me-)V(-Me-)EK-X，结构代号1110； 
Dh-βAH(-Me-)T(-Me-)VE(-Me-)K-X，结构代号1101； 
Dh-βAH(-Me-)TV(-Me-)E(-Me-)K-X，结构代号1011； 
Dh-βAHT(-Me-)V(-Me-)E(-Me-)K-X，结构代号0111；或 
Dh-βAH(-Me-)T(-Me-)V(-Me-)E(-Me-)K-X，结构代号1111； 
其中Dh为次血红素，βA为β丙氨酸，H为α组氨酸，T为α苏氨酸，V为α缬氨酸，E为α谷氨酸，K为α赖氨酸，X为游离羧基或酰胺基。 
在第二方面中，本发明提供了一种制备如第一方面所述的氮甲基化衍生物的制备方法，包括以下步骤： 
1）树脂溶胀：将Rink Amide MBHA树脂与DMF加入反应瓶中，室温下振摇，树脂溶胀后抽干，DMF洗涤，抽干； 
2）脱除Fmoc保护基：加入脱保护试剂如20%哌啶/DMF溶液，室温下振摇，DMF洗涤，抽干； 
3）生成-CONH-键的偶联方法：向反应瓶中加入Fmoc-氨基酸、 PyBOP、HOBT、NMM，再加入DMF，室温振摇反应，抽干，DMF洗涤，抽干； 
4）重复步骤2）和3）：依次将其他Fmoc-氨基酸及Fmoc-N-Me-氨基酸连接到序列上，再脱除N末端Fmoc保护基，得到NH-Me-氨基酸-RinkAmide MBHA Resin； 
5）生成-CON-Me-键的偶联方法：向反应瓶中加入Fmoc-氨基酸、HATU、HOAT、NMM，再加入NMP，室温振摇反应，抽干，NMP洗涤，抽干； 
6）重复步骤2）和3）：依次将其他Fmoc-氨基酸连接到序列上，再脱除N末端Fmoc保护基，得到βAHTVEK-X-Rink Amide MBHA Resin， 
其中βA为β丙氨酸，H为α组氨酸，T为α苏氨酸，V为α缬氨酸，E为α谷氨酸，K为α赖氨酸，X为游离羧基或酰胺基， 
并且其中：第2位的H与第3位的T之间键可为-CONH-或-CONMe-，第3位的T与第4位的V之间键可为-CONH-或-CONMe-，第4位的V与第5位的E之间键可为-CONH-或-CONMe-，并且第5位的E与第6位的K之间键可为-CONH-或-CONMe-； 
8）向反应瓶中加入氨基酸衍生物1.2倍摩尔数的次血红素次血红素及各缩合剂，室温振摇反应，抽干，DMF洗涤，抽干，得到Dh-βAHTVEK-X-Rink Amide MBHA Resin，其中Dh-βAHTVEK-X为权利要求1所述的次血红素六肽； 
9）切割及沉淀：脱侧链保护基及从树脂上裂解肽。向抽干后的反应瓶中加入裂解溶液如TFA:茴香醚=38:0.1，室温振荡反应，过滤除去树脂，滤液减压浓缩蒸出大部分TFA，浓缩液滴入冷乙醚中，振荡；过滤出的树脂加入裂解溶液重复切割，一并滴入冷乙醚。-20℃放置，4℃6000-8000rpm离心，小心倒去上清，沉淀物即为权利要求1所述的次血红素六肽Dh-βAHTVEK-X； 
优选地，还包括10）粗产品的纯化步骤：采用高效液相色谱法（HPLC）纯化产物。 
在一个优选实施方案中，在所述生成-CONMe-键的偶联反应中，使用氨基组分5-10倍HATU/HOAt作为偶联反应的缩合剂，使用DMF、NMP或含有不同配比DMF、NMP和DMSO的混合溶液作为反应的溶剂。 
在第三方面中，本发明提供了一种制备第一方面所述的氮甲基化衍生物的制备方法，包括以下步骤： 
1）以H-Lys(Boc)-NH2为初始原料，以DMF为溶剂，加入活化的Fmoc-Glu(OBut)-OH(PyBOP活化)，室温25℃搅拌2小时，反应完成后在40℃蒸发出去溶剂。加入乙醚溶解，并以10%柠檬酸水溶液、水、10%碳酸氢钠水溶液反复洗涤，收集乙醚层，加入无水硫酸钠干燥，蒸发除去乙醚，得到DhHP-6的C末端二肽。 
2）上述带保护基的二肽以DMF溶解，以20%哌啶/DMF脱除Fmoc保护基，加入活化的Fmoc-Val-OH，在室温25℃搅拌2小时，反应完成后在40℃蒸发出去溶剂DMF。加入乙醚沉淀三肽产品。用乙醚反复洗涤三次后溶于乙酸乙酯中，并以10%柠檬酸水溶液、水、10%碳酸氢钠水溶液反复洗涤。取乙酸乙酯相，以硫酸钠干燥后除去有机溶剂。 
3）重复上述步骤2）依以上述方法一直到DhHP-6合成完成。以三氟乙酸脱除保护基后用冷乙醚沉淀得粗品； 
优选地，还包括4）粗产品的纯化步骤：采用高效液相色谱法（HPLC）纯化产物。。 
在第四方面中，本发明提供了一种如第一方面所述的DhHP-6氮甲基化衍生物用于制备促进细胞增殖活性的试剂的用途。 
在第五方面中，本发明提供了一种如第一方面所述的DhHP-6氮甲基化衍生物用于制备在血清中使用的具有抗酶解高稳定性的试剂的用途。 
在第六方面中，本发明提供了一种如第一方面所述的DhHP-6氮甲基化衍生物用于制备在肠匀浆提取液中使用的具有抗酶解高稳定性的试剂的用途。 
附图说明
图1为DhHP-6单氮甲基化修饰物(1000)的HPLC图。 
图2为DhHP-6单氮甲基化修饰物(1000)的ESIMS图。 
图3为DhHP-6单氮甲基化修饰物(0100)的HPLC图。 
图4为DhHP-6单氮甲基化修饰物(0100)的ESIMS图。 
图5为DhHP-6单氮甲基化修饰物(0010)的HPLC图。 
图6为DhHP-6单氮甲基化修饰物(0010)的ESIMS图。 
图7为DhHP-6双氮甲基化修饰物(1100)的HPLC图。 
图8为DhHP-6双氮甲基化修饰物(1100)的ESIMS图。 
图9为DhHP-6双氮甲基化修饰物(1010)的HPLC图。 
图10为DhHP-6双氮甲基化修饰物(1010)的ESIMS图。 
图11为DhHP-6双氮甲基化修饰物(0110)的HPLC图。 
图12为DhHP-6双氮甲基化修饰物(0110)的ESIMS图。 
图13为DhHP-6三氮甲基化修饰物(1110)的HPLC图。 
图14为DhHP-6三氮甲基化修饰物(1110)的ESIMS图。 
图15示出了DhHP-6单氮甲基化衍生物β-细胞增殖活性测定结果。 
图16示出了DhHP-6双氮甲基化衍生物β-细胞增殖活性测定结果。 
图17示出了DhHP-6及其氮甲基化衍生物血清稳定性。 
图18示出了DhHP-6氮甲基化衍生物在肠匀浆提取液中抗酶解稳定性。 
图19示出了DhHP-6氮甲基化衍生物在肠匀浆提取液中半衰期。 
具体实施方式
本发明提供了DhHP-6新衍生物的制备方法。特别是以本领域技术人员通常使用的固相法或液相法合成。合成中所使用的保护基可以是Fmoc体系，也可以的是Boc体系。现以Fmoc体系为例加以说明。 
缩略词表 
Figure BDA00001718273200071
主要试剂、材料及来源 
Rink Amide MBHA树脂、HATU、HOAT、PyBOP、HOBT、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-N-Me-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-N-Me-Val-OH、Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-OH、以上试剂均购自吉尔生化（上海）有限公司 
TFA购自Fluka公司 
茴香醚（Anisole）购自Sigma公司 
DMF、NMP、NMM、哌啶为国产分析纯，乙腈为国产色谱纯，均购自天津彪仕奇科技发展有限公司 
RIN-m5F细胞(胰岛β-细胞)购自国家微生物菌种资源库 
实施例1 Dh-βAla-His-NMe-Thr-Val-Glu-Lys-NH2（结构代号：1000）的制备 
（1）树脂溶胀：将0.1mmol Rink Amide MBHA树脂与4ml DMF加入反应瓶（天津市天玻玻璃仪器有限公司）中，室温下振摇30min，树脂溶胀后抽干DMF，DMF洗3min/次×6次，再次抽干。 
（2）脱除Fmoc保护基：加入4ml脱保护试剂（20%哌啶/DMF溶液），室温下振摇20min，DMF洗3min/次×6次，抽干。 
（3）生成-CONH-键的偶联方法：向反应瓶中加入0.3mmol Fmoc-氨基酸（Fmoc-Lys(Boc)-OH）、0.3mmol PyBOP、0.3mmol HOBT、0.45mmol NMM，再加入4ml DMF，室温振摇反应2小时，抽干，DMF洗3min/次×6次，抽干。得到Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（4）重复步骤（2），（3）：依次将Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Val-OH、Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-OH连接到序列上，得到Fmoc-N-Me-Thr(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（5）重复步骤（2）得到: 
NH-Me-Thr(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（6）生成-CONMe-键的偶联方法：向含有上步反应产物NH-Me-Thr(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
反应瓶中加入0.6mmol Fmoc-氨基酸（Fmoc-His(Trt)-OH）、0.6mmol HATU、0.6mmol HOAT、0.9mmol NMM，再加入4ml NMP，室温振摇反应2小时，抽干，NMP洗3min/次×6次，抽干。得到Fmoc-His(Trt)-N Me-Thr(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（7）重复步骤（2），（3）：将Fmoc-β-Ala-OH，连接到序列上，再脱除N末端Fmoc保护基，得到六肽NH2-β-Ala-His(Trt)-NMe-Thr(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHAResin。 
（8）向含有上步反应产物的反应瓶中加入0.12mmol次血红素、0.12mmol PyBOP、0.45mmol NMM和4ml溶剂DMF。室温振摇反应1.5h，抽干，DMF洗3min/次×6次，抽干。得到Dh-β-Ala-His(Trt)-N-Me-Thr(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin。 
（9）得到的树脂肽用甲醇洗3min/次×6次，抽干，真空干燥过夜。 
偶联及脱保护反应的监测 
每次偶联及脱保护反应后，取出几粒树脂检测反应是否完成。正常N末端用Kaiser Test；含Me的N末端用Chloranil test。 
Kaiser Test试剂A为氰化钾的吡啶溶液，试剂B为茚三酮的正丁醇溶液，试剂C为苯酚的正丁醇溶液。 
Kaiser Test方法：待检测的树脂数粒放入试管中，分别加入上述试剂各两滴，120℃反应5min，若偶联反应完全，树脂粒为亮黄色，若脱保护反应完全，树脂粒为蓝色或紫红色。 
Chloranil test试剂A为乙醛的DMF溶液，试剂B为四氯苯醌的DMF溶液。 
Chloranil test方法：待检测的树脂数粒放入试管中，分别加入上述试剂各两滴，室温反应5min，观察树脂珠的颜色，若树脂珠是蓝色的，有仲胺存在,表明接肽偶联不完全。 
（10）切割：脱氨基酸的侧链保护基及从树脂上裂解肽。向抽干后的反应瓶中加入4ml裂解溶液（TFA:茴香醚=38:0.1），室温振荡反应2h，过滤除去树脂，过滤出的树脂中加入4ml裂解溶液重复切割0.5h，过滤，合并滤液。滤液减压浓缩蒸出大部分TFA得到浓缩的肽裂解液。 
（11）沉淀：浓缩液滴入40ml冷乙醚中，振荡；-20℃放置1h，4℃ 6000-8000rpm离心10min，小心倒去上清，沉淀物即为目标产物Dh-βAla-His-NMe-Thr-Val-Glu-Lys-NH2（1000）。沉淀物再用冷乙醚洗两次。真空干燥过夜。 
（12）粗产品的纯化：采用高效液相色谱法（HPLC）二次纯化产物。接得馏分经旋转蒸发除去乙腈后冻干得到纯品。纯品经质谱测定其分子量。 
一次HPLC纯化条件： 
色谱柱：Agilent HC-C18柱（10μm 20×250mm） 
流动相A：水，0.1%TFA；流动相B：90%乙腈，0.1%，TFA。 
梯度洗脱B%：0~5min:5%，5~10min:5%~28%，10~70min:28%~58% 
流  速:20ml/min. 
柱  温:室温25℃ 
检测波长：390nm 
二次HPLC纯化条件： 
流动相A：10%乙腈，0.1%TFA；流动相B：90%乙腈，0.1%，TFA。 
梯度洗脱B%：0~10min:5%，10~30min:5%~28%。 
样品用50%氨水调PH至8-10后上样纯化。 
Dh-βAla-His-NMe-Thr-Val-Glu-Lys-NH2(1000)：DhHP-6单氮甲基化修饰物的HPLC图见附图（1），ESIMS测定见附图（2）。 
实施例2 
Dh-βAla-His-NMe-Thr-NMe-Val-NMe-Glu-Lys-NH2（结构代号：1110）的制备 
（1）树脂溶胀：将0.1mmol Rink Amide MBHA树脂与4ml DMF加入反应瓶中，室温下振摇30min，树脂溶胀后抽干，DMF洗3min/次×6次，抽干。 
（2）脱除Fmoc保护基：加入4ml脱保护试剂（20%哌啶/DMF溶液），室温下振摇20min，DMF洗3min/次×6次，抽干。 
（3）生成-CONH-键的偶联方法：向反应瓶中加入0.3mmol Fmoc-氨基酸（Fmoc-Lys(Boc)-OH）、0.3mmol PyBOP、0.3mmol HOBT、0.45mmol NMM，再加入4ml DMF，室温振摇反应2小时，抽干，DMF洗3min/次×6次，抽干。得到Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin。 
（4）重复步骤（2）脱除Fmoc保护基和步骤（3）生成-CONH-键的偶联反应：将Fmoc-NMe-Glu(OtBu)-OH、连接到序列上，得到Fmoc-NMe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（5）重复步骤（2）脱除Fmoc保护基得到产物: 
HN-Me-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（6）生成-NMe-键的偶联：向含有上一步反应产物的反应瓶中加入0.6mmol Fmoc-N-Me-氨基酸（此步骤为Fmoc-N-Me-Val-OH）、0.6mmol HATU、0.6mmol HOAT、0.9mmol NMM，再加入4ml NMP，室温振摇反应2小时，抽干，NMP洗3min/次×6次，抽干。得到Fmoc-NMe-Val-NMe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（7）重复步骤（2）脱除Fmoc保护基和步骤（3'）生成-CON Me-键的偶联：依次将Fmoc-NMe-Thr(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH连接到肽链上。得Fmoc-His(Trt)-NMe-Thr(tBu)-NMe-Val-NMeGlu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（8）重复步骤（2）脱除Fmoc保护基和步骤（3）生成-CONH-键的偶联：将Fmoc-β-Ala-OH，连接到序列上，再脱除N末端Fmoc保护基，得到产物NH2-β-Ala-His(Trt)-NMe-Thr(tBu)-NMe-Val-CON Me-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。 
（9）向含有上步反应产物反应瓶中加入0.12mmol次血红素，0.12mmol PyBOP、0.45mmol NMM，再加入4ml DMF，室温振摇反应1.5h，抽干，DMF洗3min/次×6次，抽干。得到Dh-β-Ala-His(Trt)-CON-Me-Thr(tBu)-CON-Me-Val-CON-Me-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-RinkAmide MBHA树脂。 
（10）得到的树脂肽用甲醇洗3min/次×6次，抽干，真空干燥过夜。偶联及脱保护反应的监测如实施例1所述 
（11）切割：脱氨基酸的侧链保护基及从树脂上裂解肽。向抽干后的反应瓶中加入4ml裂解溶液（TFA:茴香醚=38:0.1），室温振荡反应2h，过滤除去树脂，过滤出的树脂中加入4ml裂解溶液二次裂解0.5h,合并滤液。滤液减压浓缩蒸出大部分TFA，得到浓缩的肽裂解液。 
（12）沉淀：浓缩液滴入40ml冷乙醚中，振荡；-20℃放置1h，4℃ 6000-8000rpm离心10min，小心倒去上清，沉淀物即为目标产物Dh-βAla-His-CON-Me-Thr-CON-Me-Val-CON-Me-Glu-Lys-NH2（1110）沉淀物再用冷乙醚洗两次。真空干燥过夜。 
（13）粗产品的纯化：采用高效液相色谱法（HPLC）二次纯化产物。接得馏分经旋转蒸发除去乙腈后冻干得到纯品。纯品经质谱测定其分子量。HPLC纯化条件如实施例1所述。 
Dh-βAla-His-CON-Me-Thr-CON-Me-Val-CON-Me-Glu-Lys-NH2（1110）：DhHP-6三氮甲基化修饰物的HPLC图见附图（13），ESIMS测定见附图（14）。 
采用与实施例1或2相似的制备方法制备了下列不同的单、双、三和四个位点的氮甲基化肽。 
1)Dh-βAla-His-Thr-NMe-Val-Glu-Lys-NH2（结构代号：0100），HPLC图见附图（3），ESIMS测定见附图（4）。 
2)Dh-βAla-His-Thr-Val-NMe-Glu-Lys-NH2（结构代号：0010）HPLC图见附图（5），ESIMS测定见附图（6）。 
3)Dh-βAla-His-Thr-Val-Glu-NMe-Lys-NH2（结构代号：0001） 
4)Dh-βAla-His-NMe-Thr-NMe-Val-Glu-Lys-NH2（结构代号：1100），HPLC图见附图（7），ESIMS测定见附图（8）。 
5)Dh-βAla-His-NMe-Thr-Val-NMe-Glu-Lys-NH2（结构代号：1010），HPLC图见附图（9），ESIMS测定见附图（10）。 
6)Dh-βAla-His-NMe-Thr-Val-Glu-NMe-Lys-NH2（结构代号：1001） 
7)Dh-βAla-His-Thr-NMe-Val-NMe-Glu-Lys-NH2（结构代号：0110），HPLC图见附图（11），ESIMS测定见附图（12）。 
8)Dh-βAla-His-Thr-NMe-Val-Glu-NMe-Lys-NH2（结构代号：0101）。 
9)Dh-βAla-His-Thr-Val-NMe-Glu-NMe-Lys-NH2（结构代号：0011）。 
10)Dh-βAla-His-NMe-Thr-NMe-Val-Glu-NMeCH3-Lys-NH2（结构代号：1101） 
11)Dh-βAla-His-NMe-Thr-NMe-Val-Glu-NMeCH3-Lys-NH2（结构代号：1011） 
12)Dh-βAla-His-Thr-NMe-Val-NMe-Glu-NMe-Lys-NH2（结构代号：0111） 
13)Dh-βAla-His-NMe-Thr-NMe-Val-NMe-Glu-NMe-CH3-Lys-NH2（结构代号：1111） 
实施例3 液相法合成DhHP-6及其氮甲基化衍生物： 
本发明氮甲基化衍生物也可用液相法合成。液相法包括以下步骤： 
1）以H-Lys(Boc)-NH2为初始原料，以DMF为溶剂，加入活化的Fmoc-Glu(OBut)-OH(PyBOP活化)，室温25℃搅拌2小时，反应完成后在40℃蒸发出去溶剂。加入乙醚溶解，并以10%柠檬酸水溶液、水、10%碳酸氢钠水溶液反复洗涤，收集乙醚层，加入无水硫酸钠干燥，蒸发除去乙醚，得到DhHP-6的C末端二肽。 
2）上述带保护基的二肽以DMF溶解，以20%哌啶/DMF脱除Fmoc保护基，加入活化的Fmoc-Val-OH，在室温25℃搅拌2小时，反应完成后在40℃蒸发出去溶剂DMF。加入乙醚沉淀三肽产品。用乙醚反复洗涤三次后溶于乙酸乙酯中，并以10%柠檬酸水溶液、水、10%碳酸氢钠水溶液反复洗涤。取乙酸乙酯相，以硫酸钠干燥后除去有机溶剂。 
3）重复上述步骤2）依以上述方法一直到DhHP-6合成完成。以 三氟乙酸脱除保护基后用冷乙醚沉淀得粗品。该粗品用HPLC纯化（与固相法同条件）。 
液相法合成氮甲基化衍生物，视各步骤使用的氨基酸类型（N-甲基氨基酸或普通氨基酸）的不同，可以实现一个或多个不同位点的DhHP-6氮甲基化异构体目标分子。 
实施例4 DhHP-6氮甲基化衍生物β-细胞增殖活性测定方法与结果 
MTT法β-细胞增殖活性测定实验： 
实验试剂： 
(1)磷酸盐缓冲液（pH 6.4 0.1mol/L）：4℃保存。 
(2)DhHP-6和DhHP-6氮甲基化系列衍生物用含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基配制为1mM的储液，-20℃储存备用。 
(3)葡萄糖和棕榈酸钠分别用含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基配制为500mM和0.2mM的储液。 
(4)MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝）：称取250mg MTT，加50ml PBS（0.01mol/L，pH 7.4）溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。 
(5)含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基。 
(6)含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。 
(7)RIN-m5F细胞。 
实验方法： 
(1)将RIN-m5F细胞接种于96孔板，每孔5×104个细胞，置于37℃，5% CO2培养箱内培养24h后加入待测样品（上述DhHP-6和DhHP-6氮甲基化系列衍生物），继续培养24h（增殖活性），以未加入待测样品的细胞作为对照。 
(2)在培养结束前4h，向每孔中加入20μl 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h。 
(3)1000转/分离心5min，小心吸弃上清，再加入DMSO 150μl/孔，于微量振荡器上缓慢振荡反应10min。 
(4)在酶标仪上于490nm、630nm处双波长测光吸收值。 
表1 DhHP-6单氮甲基化衍生物MTT法胰岛β-细胞增殖活性测定结果 
Figure BDA00001718273200142
实验结论: 
1.DhHP-6随浓度升高呈梯度增殖，阳性和阴性对照差异明显。 
2.DhHP-6单氮甲基化衍生物四个样品刺激胰岛β细胞增殖情况如下：（0010）、（0100）和（0001）增殖率随浓度升高而增大，增殖率（0010）高于（0100）和（0001）。（1000）呈负增殖。 
表2 DhHP-6双氮甲基化衍生物MTT法胰岛β-细胞增殖活性测定结果 
表2续 
Figure BDA00001718273200151
实验结论: 
1.DhHP-6随浓度升高呈梯度增殖，阳性和阴性对照差异明显。 
2.DhHP-6双氮甲基化衍生物增殖率随浓度升高而增大，但三者的增殖率不及标准品。 
3.DhHP-6三氮甲基化衍生物（1110）和四氮甲基化衍生物（1111）MTT法胰岛β-细胞增殖活性测定结果均呈负增长。 
实施例5 DhHP-6氮甲基化衍生物的过氧化物模拟酶活性测定过氧化物酶活力测定方法： 
测活体系:总体积0.5ml,首先向反应池中加入0.5mM抗坏血酸和酶液各50μl,磷酸盐缓冲液（pH=7.0，含0.1mM EDTA）350μl,参比池中加0.5mM抗坏血酸50μl，磷酸盐缓冲液400μl。37℃下保温5min,各加入50μl 5mM过氧化氢,混匀,启动反应,测定265nm的光吸收的下降,反应时间5min 
以维生素C（Vc）和过氧化氢为底物，测定了DhHP-6和氮甲基化系列衍生物的过氧化物酶活力。其中DhHP-6的比活为26.9×102U/μmol,(每分钟氧化1μmol抗坏血酸所需的酶量定义为一个活力单位)。结果显示，氮甲基衍生物[0010]，[1010]，[0110]和[1011]四个样品的过氧化物酶活力较DhHP-6的酶活力高，是高效的抗坏血酸过氧化物模拟酶。[1000],[0100],[1100],[0101]和[0111]五种氮甲基衍生物的过氧化活力较DhHP-6的酶活力低。显示出不同的修饰位点对酶活力大小有影响。 
表3 DhHP-6及其氮甲基衍生物的过氧化物酶活力测定结果 
  试样   活力(U/μmol)×102
  DhHP-6   26.9
  1000   5.2
  0100   4.8
  0010   31.2
  0001   nd
  1100   3.25
  1010   31.5
  1001   nd
  0110   33.5
[0185] 
  0011   28.4
  0101   4.25
  1110   nd
  1101   nd
  1011   29.8
  0111   9.4
  1111   nd
实施例6 DhHP-6氮甲基化衍生物在血清中稳定性研究与结果 
实验方法：DhHP-6及其氮甲基化衍生物样品用PBS缓冲液（PH 7.4,0.1mol/L）溶解，配制成样品浓度为250μg/ml的溶液。样品溶液中加等体积小鼠血清（制备方法：昆明鼠尾静脉取血置入离心管中，3000rpm离心，取上清液）混匀，37℃孵育24h。分取0、6、12、18、24hr孵育样品100μl，加等体积12.5% TFA终止反应，12000rpm离心5min。取上清液，以1M NaOH调PH 5-7，HPLC测定纯度。 
HPLC条件： 
色谱柱：XDB-Eclipse C18(4.6*150mm,5um) 
柱温：25℃ 
流动相：A:10%ACN-H2O-0.1%TFA 
B:90%ACN-H2O-0.1%TFA 
梯度洗脱：10%B->in 5min->20%B->in 12min->32%B->in 4min->52%B->in 10min->52%B 
流速：1.0ml/min 
波长：386nm 
测定结果见下表： 
表4 DhHP-6及其氮甲基化衍生物在血清中稳定性测定结果 
Figure BDA00001718273200161
﹡注：为小鼠血清 
讨论：稳定性排序0110、1010、0010>1110>1000、 0100>DhHP-6>1100，说明肽链经N-Me化修饰后，DhHP-6稳定性提高。由于肽链N端被次血红素Dh封闭，肽链能有效抵抗血清中氨肽酶降解。测定结果显示，所有Val-NMe-Glu的肽链稳定性均很好，推测羧肽酶是血清中稳定性的主导者，因为其最适底物需要2个肽键，所以肽键Val-CONH-Glu经N-甲基修饰生成Val-CONCH3-Glu键，血清中稳定性显著提高。而1000和1100不能保护C端氨基酸，所以这两个肽链的稳定性较差。 
实施例7 DhHP-6氮甲基化衍生物在肠匀浆提取液中抗酶解稳定性研究与结果 
实验方法：DhHP-6及其氮甲基化衍生物样品以PBS（PH 7.4）缓冲液配制，浓度1mg/ml，加等体积小鼠肠匀浆（取小肠，PBS冲洗干净内容物，剪碎，加5ml的PBS，200rpm匀浆2min，12000rpm离心5min。取上清1ml以PBS稀释10倍），混匀，37℃孵育8h。分取0、20、40min及1、2、3、4、6、8h孵育样品100μl，加等体积12.5%TFA终止反应，12000rpm离心5min。取上清，以1M NaOH调PH 5-7，HPLC测定纯度。HPLC条件同上，测定结果见下表： 
表5 DhHP-6及其氮甲基化衍生物在肠匀浆提取液中抗酶解稳定性测定结果 
    DHP6+gut*   0100+gut   1000+gut   1100+gut   0010+gut   0110+gut   1010+gut   1110+gut
时间（hr）   含量%   含量%   含量%   含量%   含量%   含量%   含量%   含量%
0   97.02   95.78   88.84   94.94   94.91   94.45   93.33   94.31
0.33   20.63   25.74   63.01   68.3   nd   nd   nd   nd
0.67   10.66   10.03   46.18   57.99   nd   nd   nd   nd
1   1.82   2.97   23.46   45.78   nd   nd   91.41   nd
2   1.54   2.16   2.91   28.83   85.35   87.89   89.65   92.45
3   1.82   1.94   2.28   19.8   nd   nd   87.11   nd
4   nd   nd   nd   nd   73.72   79.04   84.33   90.38
6   1.32   1.43   1.23   3.98   57.54   69.6   79.40   87.76
8   nd   nd   nd   nd   49   62.39   73.35   84.02
t1/2（h）   0.184   0.204   0.396   1.367   8.077   13.051   23.023   49.50
*注：gut为肠匀浆提取液 
讨论：稳定性排序基本与血清中一致，肠内丰富的水解酶，使肽链降解较血清严重，DhHP-6在20min有80%被酶降解，而DhHP-6氮甲 基化衍生物（除0100外）对肠道酶水解的稳定性比DhHP-6显著提高，多氮甲基化修饰的衍生物对肠道酶水解的稳定性明显优于单氮甲基化修饰衍生物，说明抗酶解能力与氮甲基化的数量相关，另外不同位点的氮甲基化对保护DhHP-6的贡献有差别，其中Val-CONH-Glu至关重要，His-CONH-Thr次之，推测主要是羧肽酶在水解肽链起主导作用，此外还有其他内肽酶的参与，按一级降解反应拟合，计算半衰期1010为DhHP-6的125倍，具有很好的应用前景。 

Claims (8)

1.一种次血红素六肽（DhHP-6）氮甲基化衍生物，其特征在于氨基酸序列为：Dh-βAHTVEK-X
其中Dh为次血红素，βA为β丙氨酸，H为α组氨酸，T为α苏氨酸，V为α缬氨酸，E为α谷氨酸，K为α赖氨酸，X为游离羧基或酰胺基；
并且其中：第2位的H与第3位的T之间键可为-CONH-或-CONCH-3-;
第3位的T与第4位的V之间键可为-CONH-或-CONCH3-;
第4位的V与第5位的E之间键可为-CONH-或-CONCH3-;并且
第5位的E与第6位的K之间键可为-CONH-或-CONCH3-。
2.如权利要求1所述的DhHP-6氮甲基化衍生物，其特征在于其结构为：
Dh-βAH(-Me-)TVEK-X，结构代号1000；
Dh-βAHT(-Me-)VEK-X，结构代号0100；
Dh-βAHTV(-Me-)EK-X，结构代号0010；
Dh-βAHTVE(-Me-)K-X，结构代号0001；
Dh-βAH(-Me-)T(-Me-)VEK-X，结构代号1100；
Dh-βAHT(-Me-)V(-Me-)EK-X，结构代号0110；
Dh-βAHTV(-Me-)E(-Me-)K-X，结构代号0011；
Dh-βAH(-Me-)TV(-Me-)EK-X，结构代号1010；
Dh-βAH(-Me-)TVE(-Me-)K-X，结构代号1001；
Dh-βAHT(-Me-)VE(-Me-)K-X，结构代号0101；
Dh-βAH(-Me-)T(-Me-)V(-Me-)EK-X，结构代号1110；
Dh-βAH(-Me-)T(-Me-)VE(-Me-)K-X，结构代号1101；
Dh-βAH(-Me-)TV(-Me-)E(-Me-)K-X，结构代号1011；
Dh-βAHT(-Me-)V(-Me-)E(-Me-)K-X，结构代号0111；或
Dh-βAH(-Me-)T(-Me-)V(-Me-)E(-Me-)K-X，结构代号1111；
其中Dh为次血红素，βA为β丙氨酸，H为α组氨酸，T为α苏氨酸，V为α缬氨酸，E为α谷氨酸，K为α赖氨酸，X为游离羧基或酰胺基。
3.一种制备如权利要求1或2所述的氮甲基化衍生物的制备方法，包括以下步骤：
1）树脂溶胀：将Rink Amide MBHA树脂与DMF加入反应瓶中，室温下振摇，树脂溶胀后抽干，DMF洗涤，抽干；
2）脱除Fmoc保护基：加入脱保护试剂如20%哌啶/DMF溶液，室温下振摇，DMF洗涤，抽干；
3）生成-CONH-键的偶联方法：向反应瓶中加入Fmoc-氨基酸、PyBOP、HOBT、NMM，再加入DMF，室温振摇反应，抽干，DMF洗涤，抽干；
4）重复步骤2）和3）：依次将其他Fmoc-氨基酸及Fmoc-N-Me-氨基酸连接到序列上，再脱除N末端Fmoc保护基，得到NH-Me-氨基酸-RinkAmide MBHA Resin；
5）生成-CON-Me-键的偶联方法：向反应瓶中加入Fmoc-氨基酸、HATU、HOAT、NMM，再加入NMP，室温振摇反应，抽干，NMP洗涤，抽干；
6）重复步骤2）和3）：依次将其他Fmoc-氨基酸连接到序列上，再脱除N末端Fmoc保护基，得到βAHTVEK-X-Rink Amide MBHA Resin，
其中βA为β丙氨酸，H为α组氨酸，T为α苏氨酸，V为α缬氨酸，E为α谷氨酸，K为α赖氨酸，X为游离羧基或酰胺基，
并且其中：第2位的H与第3位的T之间键可为-CONH-或-CONMe-，第3位的T与第4位的V之间键可为-CONH-或-CONMe-，第4位的V与第5位的E之间键可为-CONH-或-CONMe-，并且第5位的E与第6位的K之间键可为-CONH-或-CONMe-；
8）向反应瓶中加入氨基酸衍生物1.2倍摩尔数的次血红素次血红素及各缩合剂，室温振摇反应，抽干，DMF洗涤，抽干，得到Dh-βAHTVEK-X-Rink Amide MBHA Resin，其中Dh-βAHTVEK-X为权利要求1所述的次血红素六肽；
9）切割及沉淀：脱侧链保护基及从树脂上裂解肽，向抽干后的反应瓶中加入裂解溶液如TFA:茴香醚=38:0.1，室温振荡反应，过滤除去树脂，滤液减压浓缩蒸出大部分TFA，浓缩液滴入冷乙醚中，振荡；过滤出的树脂加入裂解溶液重复切割，一并滴入冷乙醚，-20℃放置，4℃6000-8000rpm离心，小心倒去上清，沉淀物即为权利要求1所述的次血红素六肽Dh-βAHTVEK-X；
优选地，还包括10）粗产品的纯化步骤：采用高效液相色谱法（HPLC）纯化产物。
4.一种制备如如权利要求1或2所述的氮甲基化衍生物的制备方法，包括以下步骤：
1）以H-Lys(Boc)-NH2为初始原料，以DMF为溶剂，加入活化的Fmoc-Glu(OBut)-OH(PyBOP活化)，室温25℃搅拌2小时，反应完成后在40℃蒸发出去溶剂，加入乙醚溶解，并以10%柠檬酸水溶液、水、10%碳酸氢钠水溶液反复洗涤，收集乙醚层，加入无水硫酸钠干燥，蒸发除去乙醚，得到DhHP-6的C末端二肽；
2）上述带保护基的二肽以DMF溶解，以20%哌啶/DMF脱除Fmoc保护基，加入活化的Fmoc-Val-OH，在室温25℃搅拌2小时，反应完成后在40℃蒸发出去溶剂DMF，加入乙醚沉淀三肽产品，用乙醚反复洗涤三次后溶于乙酸乙酯中，并以10%柠檬酸水溶液、水、10%碳酸氢钠水溶液反复洗涤，取乙酸乙酯相，以硫酸钠干燥后除去有机溶剂；
3）重复上述步骤2）依以上述方法一直到DhHP-6合成完成，以三氟乙酸脱除保护基后用冷乙醚沉淀得粗品；
优选地，还包括4）粗产品的纯化步骤：采用高效液相色谱法（HPLC）纯化产物。
5.如权利要求3所述的氮甲基化衍生物的制备方法，其特征在于生成-CONMe-键的偶联反应，为使用氨基组分5-10倍HATU/HOAt作为偶联反应的缩合剂，用DMF、NMP或含有不同配比DMF、NMP和DMSO的混合溶液作为反应的溶剂。
6.如权利要求1或2所述的DhHP-6氮甲基化衍生物用于制备促进细胞增殖活性的试剂的用途。
7.如权利要求1或2所述的的DhHP-6氮甲基化衍生物用于制备在血清中使用的具有抗酶解高稳定性的试剂的用途。
8.如权利要求1或2所述的的DhHP-6氮甲基化衍生物用于制备在肠匀浆提取液中使用的具有抗酶解高稳定性的试剂的用途。
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