CN103012596A

CN103012596A - 具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽及其合成和应用

Info

Publication number: CN103012596A
Application number: CN2012105827327A
Authority: CN
Inventors: 王锐; 倪京满; 刘晖
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN103012596B

Abstract

本发明公开了一类具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽，是在EM1及其类似物[D-Ala²]EM1的碳末端通过二硫键连接穿膜肽SynB3，利用SynB3良好的BBB穿透性，介导EM1及其类似物[D-Ala²]EM1通过吸附作用穿透血脑屏障到达中枢，此时，利用二硫键具有血液中稳定、脑膜中易被还原而断裂的特点，在脑膜还原酶的作用下使二硫键断裂，释放出游离药物，从而发挥其镇痛活性。药效学实验表明，本发明的内吗啡肽衍生肽在显著提高镇痛活性的同时，实现了外周给药，为开发神经肽类药物的临床应用提供了广阔的前景。

Description

具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽及其合成和应用

技术领域

本发明属于生化技术领域，涉及一种内吗啡肽衍生肽，尤其涉及一种具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽；本发明同时涉及该内吗啡肽衍生肽在制备镇痛药物中的应用。

背景技术

1998年全球中枢神经系统药物的市场金额为3.3×10⁸美元，还不到全球心血管疾病药物市场份额的1/2，但仅以美国为例，中枢神经系统疾病患者却是心血管疾病患者的大约两倍（Drug Discov. Today, 2002, 7, 223）。引起这种不平衡状态的一个重要原因在于98%以上的具有潜在治疗中枢神经系统疾病的药物无法穿透血脑屏障。

中枢神经系统与外环境之间存在两重屏障。包括位于脑毛细血管内皮细胞上的血-脑屏障（blood-brain barrier, BBB）和位于脉络膜丛和脑膜上的血-脑脊液屏障（Progress in Neurobiology, 2009, 87）。血脑屏障由大脑微血管的内皮细胞紧密连接所组成。这种结构区别于外周毛细血管，外周毛细血管可以在组织和血液间相对自由地进行物质交换，而血脑屏障严格限制物质通过无论生理上的紧密连接还是代谢酶的障碍进入中枢，从而维持内环境的稳定，对中枢神经系统起到保护作用。

为了克服血脑屏障对药物转运的限制，目前常采用的方法有① 人为地用渗透压打开内皮细胞间的紧密连接。但这样做极具侵袭性，容易使不需要的，甚至是有害的物质进入脑内；② 采用高亲脂性的前体药物。但并不是所有的药物经修饰后仍能保持原有治疗效果；③ 利用在血脑屏障表达的人体自身的载体转运药物进入大脑。但这种方式要求药物必须具有载体调节特性；④ 将药物直接注射入脑。这种方法最重要的不足就在于需进行侵入性脑外科手术；⑤ 应用胶态药物载体纳米粒转运药物通过血脑屏障。这种方式要求载体材料必须是生物可降解性的。与以上提到的所有方法相比，在尽量不降低或提高其作用活性的前提下，发展天然的，无毒副作用的新策略转运治疗药物通过血脑屏障到达治疗部位对于使其尽早应用于临床显得十分必要。

内吗啡肽（Endomorphin, EM）是由美国都蓝大学神经生物学家James Zadina及其同事1997年发现的存在于人体内的一种新的神经肽（Nature, 1997, 386, 499），共有两种：内吗啡肽-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH₂，EM1)和内吗啡肽-2（Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂，EM2)。离体及在体实验表明，内吗啡肽是当今所知对μ阿片受体亲和力和选择性最高的生物活性肽，具有广泛的生理学和药理学活性，最为突出的是具有较强的中枢镇痛活性，中枢给药时，内吗啡肽可产生强度与吗啡相当而副作用较少的镇痛作用，这与其作用部位中枢μ阿片受体紧密相关，因此，内吗啡肽有望成为一种具有开发潜质的镇痛药物。但和所有的小分子多肽一样，内吗啡肽在研究中面临酶解稳定性差，生物半衰期短，不易透过血脑屏障等问题，这些缺点严重阻碍了内吗啡肽发展成为临床镇痛药物。因此，如何有效地提高神经肽类药物血脑屏障通透性并保留其原有的药物活性是发展中枢神经肽类药物首要解决的问题。

蛋白转导域（PTD），又称为细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)，最初来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1反式激活蛋白中，发现部分肽序列可不需任何膜蛋白受体的协助而穿过活细胞质膜，并对宿主细胞没有显著毒副作用（Cell, 1988, 55, 1189）。之后，一些新的天然或是合成的穿膜肽被陆续发现。CPPs具有强大的运载潜能，不同来源、不同结构的CPPs均有能力将外源性蛋白质、DNA、RNA、质粒、化学药物、脂质体等转运至细胞内，表现出相应的生物活性，并且此过程不受化合物或复合物分子类型和大小的限制。许多研究表明穿膜肽是可携带中枢神经药物穿透细胞膜的良好载体，在跨血脑屏障运输方面具有非常广泛的用途。十肽SynB3(Arg-Arg-Leu-Ser-Tyr-Ser-Arg-Arg-Arg-Phe-NH₂) 是从猪粒细胞中提取的抗菌肽PG-1中得到多肽，是一种典型的细胞穿膜肽，可不需任何膜蛋白受体的协助而穿过活细胞质膜，并对宿主细胞没有显著毒副作用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽；

本发明的另一目的是提供上述具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽的合成方法；

本发明还有一个目的，就是提供该具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽在制备阵痛药物中的应用。

（一）具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽

本发明具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽的结构式如下：

（1）

（2）

上述具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽，是在EM1及其类似物[D-Ala²] EM1的碳末端通过二硫键连接穿膜肽SynB3，利用SynB3良好的BBB穿透性，介导EM1及其类似物[D-Ala²]EM1通过吸附作用穿透血脑屏障到达中枢，此时，利用二硫键具有血液中稳定、脑膜中易被还原而断裂的特点，在脑膜还原酶的作用下使二硫键断裂，释放出游离药物，从而发挥其镇痛活性。

其中，穿膜肽SynB3连接的EM1记为EM1-SS-SynB3（结构式1表达的衍生肽），穿膜肽SynB3连接的EM1类似物[D-Ala²] EM1记为[D-Ala²] EM1-SS-SynB3（结构式2表达的衍生肽）。

（二）内吗啡肽衍生肽的合成

本发明具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽的合成方法，包括以下工艺步骤：

（1）含有半胱氨酸的内吗啡肽-1、内吗啡肽-1类似物及穿膜肽SynB3的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂，通过经典的Fmoc固相化学合成方法，合成C末端含有半胱氨酸的内吗啡肽1（EM1-Cys）、其类似物（[D-Ala²]EM1-Cys）及穿膜肽SynB3，利用C₁₈反相高效液相色谱柱对粗肽进行纯化，即得；

（2）活化巯基的PDP-SynB3的合成：将多肽SynB3、活化剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)以1:2~1:2.5摩尔比分别溶解于无水甲醇中，搅拌混合均匀，加入多肽SynB3摩尔量4~6倍的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，于室温反应6~8h，利用C₁₈反相高效液相色谱柱进行纯化，得到活化巯基的PDP-SynB3；

（3）内吗啡肽衍生肽的合成：惰性气体保护下，将巯基活化的PDP-SynB3与含有半胱氨酸的内吗啡肽-1或内吗啡肽-1类似物[D-Ala²]EM1以1:1.1~1:1.2的摩尔比溶于甲醇-水体系中（v/v=1:1~1:1.2），于室温反应6~8h；反应结束后利用C₁₈反相高效液相色谱柱进行纯化，得到目标产物——具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽。其合成路线如下：

上述方法合成的产物通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)对多肽进行表征，结果表明所纯化得到的多肽的实际分子量与理论分子量相符。

（三）内吗啡肽衍生肽的药效学实验

1、镇痛活性实验

采用小鼠温浴甩尾法来检测药物的镇痛活性。具体实验方法如下：昆明系雄性小鼠，18-20g，环境温度保持在20±0.5℃，水浴温度保持在49.5±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈值（control latency, CL），将鼠尾的1/3浸入恒温水中，记录从刚浸入水至小鼠开始甩尾或尾尖发生卷曲的时间。选用痛阈值为2-5s的小鼠，过于敏感（＜2s）和过于迟钝（＞5s）的小鼠均弃去不要。终止时间为10s以防止烫伤。测定基础痛阈时，每隔5min测定一次，每只小鼠测4-5次，选取3次数值在2-5s间并且相差小于1s的数据，求平均值即为此小鼠的基础痛阈值(T₀)。

尾静脉给药使用一次性注射器，注射体积均为100μl/只。给药后分别在第5，10，15，20，30，40，50，60min测小鼠甩尾潜伏期（test latency, TL）。药物镇痛效应(maximum possible effect, ％MPE)的计算方法：％MPE=[(TL-T₀)/(10- T₀)]×100。结果见表1.

以时间为横坐标、以％MPE为纵坐标，绘制药物镇痛时效曲线。结果见图1、2。

表1 尾静脉注射药物产生最大镇痛作用及A.U.C值

图1、2，表1的结果显示，尾静脉给药EM1-SS-SynB3在注射后10min时镇痛效应能达到43.0%，[D-Ala²]EM1-SS-SynB3的%MPE为52.8%而母体EM1和[D-Ala²]EM1-Cys的%MPE也分别只有8.1%和18.7%。虽然EM1引入D-Ala替换Pro²之后，镇痛活性有了提高，但外周给药的镇痛作用仍不明显，而连接穿膜肽之后，外周给药有了很高的镇痛活性。表明穿膜肽SynB3能够促进EM1及其类似物[D-Ala²]EM1通过血脑屏障进入中枢神经系统，释放游离药物结合脑内μ-阿片受体，从而发挥镇痛活性。

2、在体实验考察二硫键脑内断裂情况

采用小鼠温浴甩尾法，通过镇痛活性在体实验考察二硫键脑内断裂情况。具体实验方法如下：利用L-Cys模拟脑内存在的还原酶，加入[D-Ala²]EM1-SS-SynB3中。将2×10^-3mol/L的L-Cys与3×10^-4mol/L的[D-Ala²]EM1-SS-SynB3等体积混合，5min后进行侧脑室注射。结果见表2、图3。

表2 [D-Ala²]EM1-Cys、[D-Ala²]EM1-SS-SynB3、[D-Ala²]EM1-SS-SynB3+L-Cys

镇痛时效曲线中%MPE和最大镇痛效应出现时间

实验结果如图3、表2所示，[D-Ala²]EM1-SS-SynB3在给药后15min时产生最大镇痛效应，%MPE值为46.0%，[D-Ala²]EM1-Cys的%MPE值为31.6%，发生在给药后5min。而[D-Ala²]EM1-SS-SynB3与L-Cys等体积混合5min后进行侧脑室注射，10min时出现最大镇痛效应，%MPE为42.6%。作为温和的还原剂，L-Cys能够使得[D-Ala²]EM1-SS-SynB3中的二硫键在脑内断裂，释放[D-Ala²]EM1-Cys并结合μ-阿片受体，从而导致混合液的镇痛最大峰值提前。

3、体外实验考察二硫键脑内断裂情况

以[D-Ala²]EM1-SS-SynB3为例，通过测定药物在小鼠脑质膜中的稳定性考察二硫键脑内断裂情况。具体实验方法如下：

1）脑质膜标本制备

取30-35g成年雄性小鼠，颈椎脱臼处死，取大脑（去除小脑及脑桥），在干燥滤纸上滚动以除去血管等，称重。用冰冷的50mM的Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）冲洗几次，除去溢血。放脑实质于匀浆器中，加入20倍体积的(v/w)冰冷的Tris-HCl缓冲液（每管约10ml），在冰浴中研磨匀浆，研磨充分后转移到预冷的离心管中。4℃，12,000g离心25min，弃上清，加Tris-HCl缓冲液至原体积，吹打使沉淀重新悬浮，再次研磨，并转入另外两个预冷的离心管中。37℃水浴孵育30min以除去内源性多肽。4℃，12,000g再次离心25min，弃上清，加入20倍体积的Tris-HCl缓冲液，振荡混匀，分装于冻存管中，BCA法测定蛋白浓度，使脑膜蛋白浓度约为2mg/ml。振荡器震荡涡旋混匀，分装，-80℃冻存待用。

2）脑质膜孵育试验

取10μl多肽母液（10^-2M），加入到190μl血浆或脑质膜中，立即振荡混匀，然后迅速取出20μl混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育，并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min取出20μl。酶解过程的终止：于取出的样品中加入90μl乙腈振荡混匀，样品置于冰上放置5分钟，再用90μl 0.5%的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。13000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至分析。

3）反相-高效液相色谱（RP-HPLC）分析

运用RP-HPLC分析各个时间点样品的离体酶解稳定性。RP-HPLC系统由Waters Delta 600控制器，紫外监测器和Waters Delta Pak C₁₈柱（3.9 mm×150 mm）组成。检测波长：280nm，流动相流速：0.8ml/min，流动相：乙腈含0.1% TFA (A) + 水含0.1% TFA (B)，A：B =10：90→70：30，洗脱时间0-20 min。绘制药物在脑质膜中的降解曲线。进样后剩余的样品进行质谱分析。

4）实验结果

实验结果如图4、5、6所示。图4表示[D-Ala²]EM1-SS-SynB3在脑质膜中的降解曲线。由图4可知药物[D-Ala²]EM1-SS-SynB3在脑膜中迅速降解，5min内药物浓度已经小于50%。由图5结果可知：0min时仅有原型药物[D-Ala²]EM1-SS-SynB3的分子离子峰（Mw=2196），没有[D-Ala²]EM1-Cys的分子离子峰出现；由图6可知，孵育5min后[D-Ala²]EM1-SS-SynB3浓度迅速降低，在质谱图中能够看到[D-Ala²]EM1-Cys的分子离子峰（Mw=687）出现。由此可知，[D-Ala²]EM1-SS-SynB3在脑质膜中孵育5min后即释放[D-Ala²]EM1-Cys。此结果与在体实验考察二硫键断裂情况的结果一致。

综上所述，本发明的内吗啡肽衍生肽克服了原有药物内吗啡肽-1及其类似物外周给药无镇痛效果的不足，通过二硫键连接穿膜肽，使得药物能够顺利通过血脑屏障，提高药物的脑摄取量，且不损害血脑屏障的完整性，使得内吗啡肽的临床广泛应用成为可能。

附图说明

图1 为尾静脉注射EM1-SS-SynB3、EM1、生理盐水的镇痛时效曲线；

图2 为尾静脉注射[D-Ala²]EM1-SS-SynB3与EM1、[D-Ala²]EM1-Cys的镇痛时效曲线；

图3 为[D-Ala²]EM1-Cys、[D-Ala²]EM1-SS-SynB3、[D-Ala²]EM1-SS-SynB3+L-Cys的镇痛时效曲线；

图4 为[D-Ala²]EM1-SS-SynB3在脑质膜中的降解曲线；

图5 为0min时[D-Ala²]EM1-SS-SynB3在脑质膜中的色谱行为和质谱分析结果；

图6 为5min时[D-Ala²]EM1-SS-SynB3在脑质膜中的色谱行为和质谱分析结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明内吗啡肽衍生肽的合成及其结构表征进行详细说明。

实施例1：穿膜肽连接内吗啡肽-1的衍生肽——EM1-SS-SynB3合成

（1）含有半胱氨酸的内吗啡肽-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-Cys-NH₂）以及穿膜肽SynB3（Arg-Arg-Leu-Ser-Tyr-Ser-Arg-Arg-Arg-Phe-NH₂），的固相合成：

a. 树脂预处理：将氨基摩尔量为0.5mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入到反应器中，加入二氯甲烷并搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；

b. 脱F-moc保护：脱保护试剂为哌啶/DMF＝1：4（V/V），用脱保护试剂与树脂搅拌2min后抽干，重复4次，使Fmoc基团完全脱除，最后用DMF 洗涤除净脱保护试剂。

c. 缩合：依次将0.6~0.8 mol Fmoc基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入1.2~1.6 mol二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后投入到反应器内将脱除Fmoc基团保护的树脂搅拌反应40-60min，整个反应过程用氩气保护，通过茚检试剂检测反应程度，最后用DMF重复洗涤除去未反应的试剂；

d. 肽链的延长：每接一个氨基酸都是重复（b）和（c）两个过程，直至接肽完成为止；

e. 肽链从树脂上的切割：按照步骤（b）的方法将最后一个连接的氨基酸的 Fmoc基团完全脱除，用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入10-25ml的切割剂（三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：1,2-乙二硫醚：水＝82.5:5:5:5:2.5（V/V）），于室温下切割反应1.5-3小时，收集切割试剂并减压旋干，将预先冷却的乙醚（50-80ml）加入到烧瓶中用力震荡进行沉淀，静置后先去除上清的乙醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相，水相经冷冻干燥，得白色固体粉末粗肽；

f. 粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度10-20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的肽化合物；再利用反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末。

上述方法制备的产物通过ESI-MS进行表征，与设计的化合物分子量一致。

（2）活化巯基的PDP-SynB3的合成：将多肽SynB3（1mmol）、活化剂SPDP（2mmol）分别溶解于10ml无水甲醇中，搅拌混合均匀，加入6mmol的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，于室温反应6~8h，利用C₁₈反相高效液相色谱柱进行纯化，得到活化巯基的PDP-SynB3；

（3）内吗啡肽衍生肽的合成：反应瓶进行抽气换氩气。将巯基活化的PDP-SynB3（1mmol）与含有半胱氨酸的内吗啡肽-1（1.2mmol）溶于10ml甲醇/水（V/V=1:1）体系中，室温反应6~8h，通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)对反应进行监测，通过HPLC对肽进行纯化，然后通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)对多肽进行表征，结果表明所纯化得到的多肽实际分子量与理论分子量相符。具体表征数据见表3。

实施例2：穿膜肽连接内吗啡肽-1类似物的衍生肽——[D-Ala²] EM1-SS-SynB3的合成

（1）含有半胱氨酸的内吗啡肽-1类似物（Tyr-D-Ala-Trp-Phe-Cys-NH₂）以及穿膜肽SynB3（Arg-Arg-Leu-Ser-Tyr-Ser-Arg-Arg-Arg-Phe-NH₂）的固相合成：同实施例1。

（2）活化巯基的PDP-SynB3的合成：将多肽SynB3（1mmol）、活化剂SPDP（2mmol）分别溶解于10ml无水甲醇中，搅拌混合均匀，加入6mmol的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，于室温反应6~8h；利用C₁₈反相高效液相柱纯化，得到活化巯基的PDP-SynB3；

（3）内吗啡肽衍生肽的合成：反应瓶进行抽气换氩气。将巯基活化的PDP-SynB3（1mmol）与含有半胱氨酸的内吗啡肽-1类似物[D-Ala²]EM1（1.1mmol）溶于10ml甲醇/水（V/V=1:1）体系中，室温反应6~8h，通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)对反应进行监测，利用C₁₈反相高效液相柱纯化，然后通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)对多肽进行表征，结果表明所纯化得到的多肽的实际分子量与理论分子量相符。具体表征数据见表3。

表3 实施例1、2 所得产物的质谱检测结果

Claims

1.具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽，其结构如下：

。

2.如权利要求1所述具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽的合成方法，包括以下工艺步骤：

（1）含有半胱氨酸的内吗啡肽-1、内吗啡肽-1类似物及穿膜肽SynB3的固相合成：采用Rink-Amide MBHA树脂，通过经典的Fmoc固相化学合成方法，合成C末端含有半胱氨酸的内吗啡肽1、其类似物及穿膜肽SynB3，利用C₁₈反相高效液相色谱柱对粗肽进行纯化，即得；

（2）活化巯基的PDP-SynB3的合成：将多肽SynB3、活化剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯以1:2~1:2.5摩尔比分别溶解于无水甲醇中，搅拌混合均匀，加入多肽SynB3摩尔量4~6倍的N,N-二异丙基乙胺，于室温反应6~8h，利用C₁₈反相高效液相色谱柱进行纯化，得到活化巯基的PDP-SynB3；

（3）内吗啡肽衍生肽的合成：惰性气体保护下，将巯基活化的PDP-SynB3与含有半胱氨酸的内吗啡肽-1或内吗啡肽-1类似物以1:1.1~1:1.2的摩尔比溶于甲醇-水体系中，于室温反应6~8h，反应结束后利用C₁₈反相高效液相色谱柱进行纯化，得到目标产物——具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽。

3.如权利要求1所述具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽的合成方法，其特征在于：所述甲醇-水体系中，甲醇与水的体积比为1:1~1:1.2。

4.如权利要求1所述具有血脑屏障通透性的内吗啡肽衍生肽在制备镇痛活性中的应用。