CN101157726A - 亚血红素短肽化合物及在抗白内障药物制备中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种亚血红素短肽化合物，包括亚血红素Dh、短肽β－Ala－His－X－Lys；其中，X可以是Thr－Val－Glu或其中的任意一个氨基酸用其相应的β－氨基酸、γ－氨基酸代替的氨基酸序列；亚血红素与短肽间的连接方式是亚血红素上的羧基与肽链上的氨基以酰胺键相连；上述结构可以是单体，即亚血红素上的两个羧基之一与肽链连接，两种单体形式为同分异构体。本发明还提供了其在抗白内障药物制备中的用途。
Description
技术领域
本发明提供一种亚血红素短肽化合物，同时还提供了其在治疗白内障疾病中的医药用途，属于生物制药技术领域。
背景技术
本发明所涉及的亚血红素短肽化合物，是以铁卟啉为辅基的微过氧化物酶，包括由细胞色素C(Cyt C)水解而来的八肽(简称：MP-8)、九肽(简称：MP-9)、十一肽(简称：MP-11)。它们均含有共价结合的亚血红素，并在肽段中含有一个组氨酸残基，人们发现它们是一类很好的过氧化物酶模拟物。它们具有较好的抗氧化活性。
发明内容
本发明公开了一种亚血红素短肽化合物，是一种新的化合物。
本发明还提供了亚血红素短肽化合物在抗白内障药物制备中的用途。
本发明所说的亚血红素短肽化合物包括亚血红素(Deuterohemin，用Dh表示)、短肽(用β-Ala-His-X-Lys表示)；其中，X可以是Thr-Val-Glu或其中的任意一个氨基酸用其相应的β-氨基酸、γ-氨基酸代替的氨基酸序列。亚血红素与短肽间的连接方式是亚血红素上的羧基与肽链上的氨基以酰胺键相连。
上述结构可以是单体，即亚血红素上的两个羧基之一与肽链连接，两种单体形式为同分异构体，结构如A.、B所示；
本发明中化合物的制备方法以本领域技术人员所通常的Fmoc固相肽合成法合成。原料及试剂：接肽树脂为Rink Amide MBHA树脂。氨基酸衍生物为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(But)-OH、Fmoc-β-Thr(But)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-β-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-γ-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH。
偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
树脂用DMF溶胀30分钟，然后脱保护20分钟，用DMF洗涤，反应器中加入氨基酸衍生物及缩合剂，室温反应2小时，洗涤，再脱保护，加入氨基酸衍生物及缩合剂，重复进行至接上所有的氨基酸。反应器中再加入切割试剂，室温反应1小时，后过滤，滤液在乙醚中沉淀，得粗品。
粗产品的纯化：采用高效液相色谱法进行纯化。洗脱液为三氟乙酸水溶液，乙腈。流速为20ml/min，监测波长为214nm。
本发明的化合物具有清除自由基抑制白内障形成的活性，按照常规的制药技术，可以将其制备成任何一种常规药剂，例如：片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、透皮吸收剂、注射剂等。
做为含有本发明化合物组合药，其组成为含有治疗有效量的本发明化合物，所说的化合物在药物组合物当中可以是单独使用，也可以与其他药物配合使用。
本发明的药物组合物除了含有上述化合物之外，还含有常规的药物赋形剂，例如：粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、调味剂、增溶剂、溶剂、防腐剂等。
以下药理实验证明本发明具有治疗白内障的药理活性和医疗效果：
实验例1、
亚血红素短肽化合物D1~D4对大鼠晶状体细胞体外抗白内障的保护作用
据统计，在60岁以上的老年群体中，不同程度的老年性白内障眼病发病率接近100％。老年性白内障是晶状体在老化过程当中逐渐发生蛋白质变性，使晶体由透明状态变成浑浊或不透明状态的结果。老年性白内障的发病机理非常复杂，为多种因素共同作用的结果。目前多数研究认为氧自由基损伤是老年性白内障形成的首位危险因素，许多实验表明氧化损伤发生在晶状体浑浊之前。硒模型是简单快速、可重复的通过氧化损伤而致晶状体浑浊的白内障模型。Ostadaiova等于1978年首先报道了给大鼠乳鼠一次注射亚硒酸钠溶液可诱发大鼠产生间歇性核性白内障，此后亚硒酸钠逐渐成为诱导老年性白内障模型的典型药物，用硒模型模拟老年性白内障，探讨老年性白内障的发病机理和防治方法。
正常人晶状体房水中H2O2的浓度为23-30μmol/L，而几乎所有白内障患者的房水H2O2均高于正常人，平均值为82μmol/L，最高可达663μmol/L。实验表明高浓度的过氧化氢能够100％的诱导培养晶状体发展为白内障。
用亚硒酸钠和过氧化氢作为诱导剂，建立了亚硒酸钠体外诱导白内障模型和过氧化氢体外诱导白内障模型，观察D1~D4的抗氧化效果，同时进一步探讨白内障的发病机理和防治途径。
1.D1~D4对亚硒酸钠诱导白内障的保护作用
在60μM亚硒酸钠条件下，随着诱导时间的延长，晶状体最终发展成为白内障，而空白对照组和给药组晶状体仍然透明澄清。
表1 亚硒酸钠诱导晶状体持续培养的形态观察结果
| 时间(小时) | 12 | 24 | 48 | 72 |
| 对照组亚硒酸钠(60μM)D1D2D3D4 | IIIIII | IIIIIII | IIVIIIII | IVIIIIIIII |
2.D1~D4对过氧化氢诱导白内障的保护作用
在100μM过氧化氢条件下，随着诱导时间的延长，晶状体最终发展成为白内障，而空白对照组和给药组晶状体仍然透明澄清。
表2过氧化氢亚硒酸钠诱导晶状体持续培养的形态观察结果
| 时间(小时) | 12 | 48 | 72 | 96 |
| 对照组过氧化氢(100μM)D1D2D3 | IIIII | IIIIII | IIIIIII | IIVIIII |
| D4 | I | I | I | II |
实验例2、
本实验通过大鼠半乳糖白内障模型，以白内停为阳性对照药，探讨亚血红素短肽化合物D1～D4抗白内障的作用，为其开发利用提供科学依据。
1.材料与方法
1.1动物
Wistar大鼠，雄性，体重250～280g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK-2002-0001。
1.2药物、试剂
亚血红素短肽化合物D1～D4，吉林大学生命科学学院研制提供，以生理盐水配制所需浓度使用；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、蛋白质(双缩脲法)测定试剂盒，为南京建成生物工程所产品，批号分别为20060618、20060622、20060624。
1.3实验方法
1.3.1实验分组 将雄性Wistar大鼠随机分为组，每组10只。分别为空白组、模型组(半乳糖白内障组)、给药组(亚血红素短肽化合物D1～D4)、阳性药组(白内停组)。其中空白对照组、模型组腹腔注射生理盐水20ml/kg，给药组按9.0、6.0、3.0μg/眼剂量滴眼给药。
2.结果
2.1亚血红素短肽化合物D1～D4滴眼给药对大鼠白内障晶状体混浊的发生时间。
结果见表1。D1～D4按9.0、6.0、3.0μg/眼剂量滴眼给药能明显延缓大鼠晶状体混浊的发生时间，延迟大鼠白内障的发生，并且药效强于阳性药(白内停)。
表1 D1～D4对大鼠晶状体混浊发生时间的影响
| 组别 | 眼数(只) | 混浊发生时间(天) |
| 对照组模型组D1高剂量组D1中剂量组D1低剂量组D2高剂量组D2中剂量组D2低剂量组D3高剂量组 | 202020202020202020 | -7.80±0.699.02±0.97**8.85±0.85**8.61±0.78*9.13±0.93**8.74±0.81**8.53±0.76*9.34±0.95** |
| D3中剂量组D3低剂量组D4高剂量组D4中剂量组D4低剂量组白内停 | 202020202020 | 8.91±0.88**8.72±0.69*9.69±0.91**8.87±0.83**8.63±0.71*8.94±0.92** |
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
2.2亚血红素短肽化合物D1～D4滴眼给药对大鼠白内障晶状体混浊程度的影响观察记录实验第22天各组大鼠晶状体混浊情况。结果见表2，D1～D4按9.0、6.0、3.0μg/眼剂量滴眼给药，能明显抑制大鼠白内障晶状体混浊度的发生的发展，药效优于对照药(白内停)。
表2 D1～D4对大鼠白内障晶状体混浊程度的影响
| 组别 | 眼数(只) | 晶状体混浊程度 | ||
| 0 | I | II | ||
| 对照组模型组D1高剂量组D1中剂量组D1低剂量组D2高剂量组D2中剂量组D2低剂量组D3高剂量组D3中剂量组D3低剂量组D4高剂量组D4中剂量组D4低剂量组白内停 | 202020202020202020202020202020 | 2001076106610859759 | 041011101012101010111110107 | 0***160***2**4*0***2**4*0***2**4*0**3*5*4* |
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，
2.4亚血红素短肽化合物D1～D4腹腔注射对大鼠白内障晶状体混浊的发生时间。结果见表4。D1～D4按9.0、6.0、3.0μg/只剂量腹腔注射能明显延缓大鼠晶状体混浊的发生时间，延迟大鼠白内障的发生，并且药效强于阳性药(白内停)。
表4 D1～D4腹腔注射对大鼠晶状体混浊发生时间的影响
| 组别 | 眼数(只) | 混浊发生时间(天) |
| 对照组模型组D1高剂量组D1中剂量组D1低剂量组D2高剂量组D2中剂量组D2低剂量组D3高剂量组D3中剂量组D3低剂量组D4高剂量组D4中剂量组D4低剂量组白内停 | 202020202020202020202020202020 | -7.80±0.698.99±0.94**8.92±0.80**8.87±0.71*9.03±0.56**8.94±0.76**8.85±0.68*9.18±0.46**9.04±0.63**8.96±0.71*9.09±0.376**8.86±0.58**8.48±0.58*8.94±0.92** |
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
2.5亚血红素短肽化合物D1～D4腹腔注射对大鼠白内障晶状体混浊程度的影响
观察记录实验第22天各组大鼠晶状体混浊情况。结果见表5，D1～D4按9.0、6.0、3.0μg/只剂量腹腔注射能明显抑制大鼠白内障晶状体混浊度的发生的发展，药效优于对照药(白内停)。
表5 D1～D4腹腔注射对大鼠白内障晶状体混浊程度的影响
| 组别 | 眼数(只) | 晶状体混浊程度 | ||
| 0 | I | II | ||
| 对照组模型组D1高剂量组D1中剂量组D1低剂量组D2高剂量组 | 202020202020 | 200129811 | 04810109 | 0***160***1**2*0*** |
| D2中剂量组D2低剂量组D3高剂量组D3中剂量组D3低剂量组D4高剂量组D4中剂量组D4低剂量组白内停 | 202020202020202020 | 98119810989 | 10109109109107 | 1**2*0***1**3*0***2*2*4* |
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，
2.6亚血红素短肽化合物D1～D4腹腔注射对大鼠白内障晶状体SOD、GSH-Px活性及GSH、MDA含量的影响
结果见表6，D1～D4按9.0、6.0、3.0μg/只剂量腹腔注射能明显能明显降低大鼠白内障晶状体脂质过氧化产物-丙二醛(MDA)的含量，明显提高白内障晶状体超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，及谷胱甘肽(GSH)的含量。并且作用强于阳性药(白内停)。
表6 D1～D4腹腔注射对大鼠白内障晶状体SOD、GSH-Px活性及GSH、MDA含量的影响
| 组别 | 动物数(只) | SOD(NU/g蛋白) | GSH-Px(U/g蛋白) | GSH(μmol/g蛋白) | MDA(nmol/g蛋白) |
| 对照组模型组D1高剂量组D1中剂量组D1低剂量组D2高剂量组D2中剂量组D2低剂量组D3高剂量组D3中剂量组D3低剂量组D4高剂量组D4中剂量组 | 10101010101010101010101010 | 281.21±11.25**201.28±16.87326.54±17.01***313.25±15.10***301.21±13.14***328.67±16.89***309.35±15.77***301.54±13.74***319.63±16.57***309.39±15.41***302.31±14.12***331.45±17.24***323.36±15.14*** | 1.84±0.29**0.84±0.092.94±0.40***2.81±0.45***2.68±0.41***3.01±0.36***2.76±0.25***2.59±0.37***2.89±0.37***2.82±0.52***2.57±0.51***3.06±0.54***2.89±0.55*** | 2.78±0.42**2.08±0.434.21±0.61***4.02±0.46***3.97±0.41***4.39±0.59***3.98±0.52***3.86±0.38***4.36±0.58***4.15±0.39***3.86±0.58***4.22±0.53***4.13±0.38*** | 7.87±1.08***20.13±1.9410.12±1.42***12.13±1.23***13.10±1.48***10.36±1.22***12.35±1.76***13.24±1.67***10.35±1.282***12.04.22***13.46±1.38***10.24±1.362***12.03±1.32*** |
| D4低剂量组白内停 | 1010 | 310.35±14.29***214.52±15.12 | 2.63±0.38***0.95±0.12 | 3.93±0.15***2.25±0.67 | 13.15±1.33***18.14±2.84 |
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01***P＜0.001
结论：试验结果证明：D1～D4按9.0、6.0、3.0μg/眼剂量滴眼给药，以及按9.0、6.0、3.0μg/只剂量腹腔注射。
1.能明显延缓大鼠白内障晶状体混浊的发生时间。
2.能明显减轻白内障晶状体混浊程度。
3.能明显降低白内障晶状体脂质过氧化产物-丙二醛(MDA)的含量。
4.可明显提高白内障晶状体超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH-Px)活性，及谷胱甘肽(GSH)的含量。
表明D1～D4能显著延迟大鼠白内障的发生，抑制白内障晶状体混浊程度的发展，药效优于对照药(白内停)。D1～D4可通过降低白内障晶状体脂质过氧化产物MDA，提高抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性，及谷胱甘肽的含量，达到防治白内障的目的。
附图说明
图1为本发明化合物D1～D4的质谱图，分子量为1227.1。
具体实施方式
下面的实施例，可以更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
D1(Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys)的固相合成
原料：Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(But)-OH、Fmoc-β-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应：称取Rink Amide MBHA树脂，树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-β-Ala-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-His(Trt)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Thr(But)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-β-Val-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Glu(otBu)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割：上述反应的树脂干燥后加入切割试剂三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化：将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。经质谱鉴定分子量为1227.1，与D1理论分子量相符(图1)。
实施例2
D2(Dh-β-Ala-His-Thr-β-Val-Glu-Lys)的固相合成
原料：Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-β-Thr(But)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应：称取Rink Amide MBHA树脂，树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-β-Ala-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-His(Trt)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-β-Thr(But)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Val-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Glu(otBu)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割：上述反应的树脂干燥后加入切割试剂三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化：将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。经质谱鉴定分子量为1227.1，与D2理论分子量相符(图1)。
实施例3
D3(Dh-β-Ala-His-Thr-Val-γ-Glu-Lys)的固相合成
原料：Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(But)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-γ-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应：称取Rink Amide MBHA树脂，树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-β-Ala-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-His(Trt)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Thr(But)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Val-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-γ-Glu(otBu)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割：上述反应的树脂干燥后加入切割试剂三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化：将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。经质谱鉴定分子量为1227.1，与D3理论分子量相符(图1)。
实施例4
D4(Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-γ-Glu-Lys)的固相合成
原料：Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-β-Thr(But)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-γ-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应：称取Rink Amide MBHA树脂，树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-β-Ala-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-His(Trt)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-β-Thr(But)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Val-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-γ-Glu(otBu)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割：上述反应的树脂干燥后加入切割试剂三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化：将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。经质谱鉴定分子量为1227.1，与D4理论分子量相符(图1)。
化合物D1~D4是一种抗坏血酸过氧化物酶的模拟物，通过体外测活实验，该组化合物的酶活力与背景技术中提到的MP-9相比较如下：
表1过氧化物酶活性测定
| 样品 | 活性(U/μmoL) |
| D1 | 2.63×103 |
| D2 | 3.14×103 |
| D3 | 4.06×103 |
| D4MP-9 | 2.89×1034.2×103 |
表1中数据表明，化合物D1~D4与MP-9的活力相当。但在预防白内障方面的研究，MP-9来源于细胞色素C的水解物，虽然具有很高的过氧化物酶活性，但该类物质制备困难，特别是纯化手续复杂，产品纯度较差。而化合物D1~D4的制备方法基于肽合成方法，因此工艺简便易行。得到的产品产率较高、纯度较高。抗白内障效果也很明显。
实施例5
称取D1.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys；D2.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys；D3.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-γ-Glu-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-γ-Glu-Lys的其中一种100mg，溶于1000ml 0.9％氯化钠溶液，混合均匀后，分装成0.1mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封，灭菌制成产品。
实施例6
称取D1.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys；D2.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys；D3.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-γ-Glu-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-γ-Glu-Lys的其中一种100mg，溶于1000 ml水中制成水溶液，混合均匀后，分装成0.1mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封，灭菌，冻干制成成品。
实施例7
称取D1.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys；D2.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys；D3.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-γ-Glu-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-γ-Glu-Lys的其中一种100mg，药用淀粉0.5kg，按公知的胶囊制备技术和装备制成胶囊，每粒10mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊项下要求。
实施例8
D1.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys；D2.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-Glu-Lys；D3.Dh-β-Ala-Hi s-Thr-Val-γ-Glu-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-β-Thr-Val-γ-Glu-Lys的其中一种100mg，微晶纤维素560g，无水乳糖380g，硬脂酸镁200g，氧化硅30g，按公知的制片技术和装备制成片剂，每片10mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下要求。
Claims (2)
1.一种亚血红素短肽化合物，包括亚血红素Dh、短肽β-Ala-His-X-Lys；其中，X可以是Thr-Val-Glu或其中的任意一个氨基酸用其相应的β-氨基酸、γ-氨基酸代替的氨基酸序列；
亚血红素与短肽间的连接方式是亚血红素上的羧基与肽链上的氨基以酰胺键相连；
上述结构可以是单体，即亚血红素上的两个羧基之一与肽链连接，两种单体形式为同分异构体，结构下所示；
2.权利要求1所述的亚血红素短肽化合物在抗白内障药物制备中的用途。
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