CN100551910C - 具有含氮杂环修饰的苯乙烯基化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有含氮杂环修饰的苯乙烯基化合物及其应用。其目的是提供一种具有含氮杂环修饰的苯乙烯基化合物及其在制备阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统退行性疾病或二型糖尿病预防和治疗性药物中的应用。研究表明，本发明的苯乙烯基化合物不仅能抑制Aβ的聚集，还能使已经聚集的Aβ聚集体解聚，并且能最终水解清除Aβ蛋白，抑制与清除Aβ产生的毒性，在医药学领域具有广阔的应用前景。

Description

具有含氮杂环修饰的苯乙烯基化合物及其应用

技术领域

本发明涉及苯乙烯基化合物及其应用，特别是涉及一种具有含氮杂环修饰的苯乙烯基化合物及其在制备治疗和预防阿尔茨海默病、帕金森病、二型糖尿病等神经系统退行性疾病药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统退行性疾病及二型糖尿病均为蛋白质构象病。其中，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又称早老性痴呆，是一种中枢神经系统退行性疾病，临床表现为认知障碍、记忆逐渐减退，最终丧失思考能力，运动障碍，生活不能自理。病理特征主要是老年斑(senile plaque，SP)，神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)以及选择性神经元及突触丢失。随着全球人口的老龄化，阿尔茨海默病已经成为人类死亡的重要原因。多年来，临床上治疗该病的主要药物是胆碱酯酶抑制剂，它作用于胆碱能神经系统，对病症具有缓解作用，但不能阻止疾病的发生和发展。目前，关于阿尔茨海默病的发病机制并不十分清楚，但普遍认为关键的致病原因是过量的β-淀粉样多肽(β-amyloid peptide，Aβ)发生错误折叠所形成的聚集体(SP的主要成分)对细胞膜、突触及轴索产生损害作用，并导致神经元纤维缠结。因此，阻止Aβ的聚集或使Aβ降解，就能抑制与清除Aβ的毒性，从而达到治疗与预防阿尔茨海默病的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种对Aβ的聚集具有抑制作用，同时对Aβ聚集体具有解聚作用并最终能降解清除Aβ的具有含氮杂环修饰的苯乙烯基类化合物。

本发明所提供的苯乙烯基类化合物，具有式I的结构通式：

R(CH₂)_nCO(NHXCO)_mTY

                           (式I)

其中，其中，R为任意含氮杂环烷烃氨基或含4个或4个以上氮原子的非环烷烃氨基；n＝1-5；X为任意的天然、非天然氨基酸残基或相应的带有修饰基团氨基酸残基，m＝0-5；T为氧或氮原子；Y为任意具有苯乙烯基结构的化合物。

所述R优选为Cyclen(N连接-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)或Trpn(N连接-N，N’-二(3-氨基丙基)丙烷-1，3-二胺)；n优选为1；X优选为20种天然氨基酸残基之一或相应的带有修饰基团氨基酸残基(优选为经甲基修饰的)，m优选为0-3(更优选为1)；Y优选为刚果红(Congo red，CR)或安息酸(Benzoic acid，3，3’-[1，4-phenylenedi-(1E)-2，1-ethenediyl]bis[6-hydroxy-]，BA)。

所述Cyclen的化学结构式见式II：

(式II)

所述Trpn的化学结构式见式III：

(式III)

所述的CR的结构式如式IV所示：

(式IV)

所述的BA的结构式如式V所示：

(式V)

在上述苯乙烯基类化合物的结构式(式I)中的X更优选为甘氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸、丙氨酸残基、缬氨酸残基、苯丙氨酸残基或酪氨酸残基；X尤其优选为甘氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸或丙氨酸残基。

构成所述苯乙烯基类化合物的氨基酸残基可为D型(右旋)，L型(左旋)构象，优选为L型构象。

可用常规的化学合成方法合成本发明的苯乙烯基类化合物，如偶合剂存在条件下成酯或成酰胺的方法。

上述苯乙烯基类化合物与过渡金属铜、钴、镍、钯、锌或铁形成复合物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和预防阿尔茨海默病、帕金森病、二型糖尿病等神经系统退行性疾病的药物。

本发明所提供的药物的活性成分为上述苯乙烯基类化合物。

此外，所述苯乙烯基类化合物也可为药学上可接受的盐的形式存在。药学上可接受的盐包括由有机或无机碱，有机或无机酸得到的盐。由无机碱得到的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等，效果较好的为铵盐、钾盐、钙盐、锂盐、镁盐和钠盐；药剂学上可接受的无毒的有机碱盐包括伯胺盐、仲胺盐和叔胺盐。与本发明苯乙烯基类化合物反应的酸包括盐酸、磷酸、乙酸、草酸和酒石酸等。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、保护剂、吸收促进剂、填充剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等。所述赋形剂可为羧甲基淀粉、明胶、纤维素、碳酸氢钠、氯化钠或聚乙二醇；所述保护剂可为EDTA或苯甲烷铵；所述促吸收剂可为聚山梨酯-80、氮酮、羧甲基纤维素或9-十二烷基醚等。

本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成片剂、注射剂、溶液剂、颗粒剂等多种药物形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

该药物的成人口服用量一般为0.05-50mg/kg，可以一次或多次使用，疗程为1至6个月。

本发明提供了一种苯乙烯基类化合物。研究表明，该苯乙烯基类化合物不仅能抑制Aβ的聚集，还能使已经聚集的Aβ聚集体解聚，并且能最终水解清除Aβ，抑制与清除Aβ产生的毒性。以该苯乙烯基类化合物为活性成分的药物可用于治疗和预防阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统退行性疾病及二型糖尿病。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为ThT荧光法检测苯乙烯基类化合物对Aβ聚集的抑制作用的实验结果

图2苯乙烯基类化合物对Aβ聚集体的解聚作用的实验结果

图3为苯乙烯基类化合物对Aβ聚集抑制作用的电镜观察结果

图4为苯乙烯基类化合物对铜介导的Aβ产生H₂O₂抑制作用的分析结果

图5为苯乙烯基类化合物通过抑制Aβ毒性对大鼠海马趾神经元保护作用的分析结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、苯乙烯基类化合物的制备

合成本发明的苯乙烯基类化合物，包括以下步骤：

a.合成含Cyclen的单体[4，7，10-三叔丁氧羰基-1，4，7，10-四氮杂环十二院-1-基]乙酸，方法为：以Cyclen(购自美国Acros公司为原料，先与Boc2O(二碳酸二叔丁酯，购自上海吉尔生化公司)反应得到1，4，7-三叔丁氧羰基-1，4，7，10-四氮杂环十二院(3Boc-Cyclen)(参见Eiichi Kimura，Shin Aoki，Tohru Koike，and Motoo Shiro，A Tris(ZnII-1，4，7，10-tetraazacyclododecane)Complex as a New Receptor forPhosphate Dianions in Aqueous Solution，Journal of American Chemical Society，1997，Vol 119，3068-3076)，再将产物与溴乙酸乙酯反应(参见Joong Won Jeon，SangJun Son，Chang Eun Yoo，In Seok Hong，Jung Bae Song，and Junghun Suh，Protein-Cleaving Catalyst Selective for ProteinSubstrate，Organic Letters，2002，Vol 4，4155-4158)得到1，4，7-三叔丁氧羰基-10-(2-乙氧基-2-氧乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二院，最后用NaOH水解(参见Joong Won Jeon，Sang Jun Son，Chang Eun Yoo，In Seok Hong，Jung Bae Song，and Junghun Suh，Protein-CleavingCatalyst Selective for ProteinSubstrate，Organic Letters，2002，Vol4，4155-4158)得到含Cyclen的单体[4，7，10-三叔丁氧羰基-1，4，7，10-四氮杂环十二院-1-基]乙酸。

b.将刚果红(购于美国Sigma公司)与含Cyclen的单体[4，7，10-三叔丁氧羰基-1，4，7，10-四氮杂环十二院-1-基]乙酸偶合，连接条件为偶合剂EDC(购自上海延长生化公司)、HOBt(购自上海吉尔生化公司)与催化量DMAP(美国Acros公司)存在下(混合比例：4倍量的含Cyclen的单体、1倍量的刚果红、4倍量的偶合剂EDC、4倍量的HOBt与催化量的DMAP)室温反应15小时得到目的产物。

c.将步骤b反应后得到粗品用硅胶柱分离(柱分离条件为：乙酸乙酯∶石油醚(1∶4))，所得产品用切割试剂三氟乙酸(TFA，购于上海吉尔生化公司)除去保护基团，得到苯乙烯基类化合物粗品。

d.将苯乙烯基类化合物粗品经HPLC法(色谱柱：C18填料柱(购自美国安捷伦公司)：流动相：乙腈/水混合体系；流速：2.8mL/min；检测波长：215nm；柱温：室温)分离得到苯乙烯基类化合物纯品。

经检测，用上述方法制各的苯乙烯基类化合物结构正确，分子式见式VI，纯度达95％以上。

实施例2、苯乙烯基类化合物的制备

合成本发明的苯乙烯基类化合物(式VII)，包括以下步骤：

a.将安息酸(购于美国Sigma公司)与含Cyclen的单体[4，7，10-三叔丁氧羰基-1，4，7，10-四氮杂环十二院-1-基]乙酸偶合，将连接条件为偶合剂EDC(购自上海延长生化公司)、HOBt(购自上海吉尔生化公司)与催DMAP存在下(混合比例：4倍量的含Cyclen的单体、1倍量的安息酸、4倍量的偶合剂EDC与4倍量的HOBt)室温反应15小时得到目的产物。

c.将步骤b反应后得到粗品用硅胶柱分离(柱分离条件为：乙酸乙酯∶石油醚(1∶4))，所得产品用切割试剂三氟乙酸(TFA，购于上海吉尔生化公司)除去保护基团，得到苯乙烯基类化合物粗品。

d.将苯乙烯基类化合物粗品经HPLC法(色谱柱：C18填料柱(购自美国安捷伦公司，请提供色谱柱的型号及其购买处)；流动相：乙腈/水混合体系；流速：2.8mL/min；检测波长：215nm；柱温：20℃)分离得到苯乙烯基类化合物纯品。

经检测，用上述方法制备的苯乙烯基类化合物结构正确，分子式见式VII，纯度达95％以上。

实施例3、苯乙烯基类化合物的制备

合成本发明的苯乙烯基类化合物(分子式见式VIII)，包括以下步骤：

a.含Trpn的单体[3(3’，3”-二叔丁氧羰基-3’，3”-二氨基)氨基丙基氨基]乙酸的制备：合成方法为：以Trpn(购自美国Acros公司)为原料，先与Boc2O(二碳酸二叔丁酯，购自上海吉尔生化公司)反应得到3’，3”-二叔丁氧羰基-3，3’，3”-三氨基丙基胺(2Boc-Trpn)(参见Eiichi Kimura，Shin Aoki，Tohru Koike，and Motoo Shiro，ATris(ZnII-1，4，7，10-tetraazacyclododecane)Complex as a New Receptor forPhosphate Dianions in Aqueous Solution，Journal of American Chemical Society，1997，Vol 119，3068-3076)，再将产物与溴乙酸乙酯反应(参见Joong Won Jeon，Sang Jun Son，Chang Eun Yoo，In Seok Hong，Jung Bae Song，and Junghun Suh，Protein-Cleaving Catalyst Selective for ProteinSubstrate，Organic Letters，2002，Vol 4，4155-4158)得到[3(3’，3”-二叔丁氧羰基-3’，3”-二氨基)氨基丙基氨基]乙酸乙酯，最后用NaOH水解(参见Joong Won Jeon，Sang Jun Son，Chang Eun Yoo，In Seok Hong，Jung Bae Song，and Junghun Suh，Protein-Cleaving CatalystSelective for ProteinSubstrate，Organic Letters，2002，Vol 4，4155-4158)得到含Trpn的单体[3(3’，3”-二叔丁氧羰基-3’，3”-二氨基)氨基丙基氨基]乙酸。

b.将安息酸(购于美国Sigma公司)与含Trpn的单体[3(3’，3”-二叔丁氧羰基-3_’，3”-二氨基)氨基丙基氨基]乙酸偶合，将连接条件为偶合剂EDC(购自上海延长生化公司)、HOBt(购自上海吉尔生化公司)与催DMAP存在下(混合比例：4倍量的含Trpn的单体、1倍量的安息酸、4倍量的偶合剂EDC与4倍量的HOBt)室温反应15小时得到目的产物。

c.将步骤b反应后得到粗品用硅胶柱分离(柱分离条件为：乙酸乙酯∶石油醚(1∶4))，所得产品用切割试剂三氟乙酸(TFA，购于上海吉尔生化公司)除去保护基团，得到苯乙烯基类化合物粗品。

d.将苯乙烯基类化合物粗品经HPLC法(色谱柱：C18填料柱(购自美国安捷伦公司，请提供色谱柱的型号及其购买处)；流动相：乙腈/水混合体系；流速：2.8mL/min；检测波长：215nm；柱温：室温)分离得到苯乙烯基类化合物纯品。

经检测，用上述方法制备的苯乙烯基类化合物结构正确，分子式见式VIII，纯度达95％以上。

(式VIII)

实施例4、苯乙烯基类化合物的制备

合成本发明的苯乙烯基类化合物(分子式见式IX)，包括以下步骤：

a.甘氨酸甲酯(购于上海吉尔生化公司)与含Trpn的单体[3(3’，3”-二叔丁氧羰基-3’，3”-二氨基)氨基丙基氨基]乙酸(按实施例3a方案)偶合，将连接条件为偶合剂HBTU(购自上海延长生化公司)、HOBt(购自上海吉尔生化公司)存在下，1倍量的含Trpn的单体、1倍量的甘氨酸甲酯、1倍量的偶合剂HBTU与1倍量的HOBt室温反应12小时得到偶合产物。

b.将步骤a反应后得到粗品用硅胶柱分离(柱分离条件为：乙酸乙酯∶石油醚(1∶4))得到含Trpn单体连接的甘氨酸甲酯，再用NaOH水解(参见Joong Won Jeon，Sang Jun Son，Chang Eun Yoo，In Seok Hong，Jung Bae Song，and Junghun Suh，Protein-Cleaving Catalyst Selective for Protein Substrate，Organic Letters，2002，Vol 4，4155-4158)得到含Trpn单体连接的甘氨酸。

c.将步骤b得到的产物与安息酸偶合，连接条件为偶合剂EDC(购自上海延长生化公司)、HOBt(购自上海吉尔生化公司)与催DMAP存在下(混合比例：4倍量的含Trpn的单体、1倍量的安息酸、4倍量的偶合剂EDC与4倍量的HOBt)室温反应15小时得到偶合产物。

d.将步骤c反应后得到粗品用硅胶柱分离(柱分离条件为：乙酸乙酯∶石油醚(1∶4))，所得产品用切割试剂三氟乙酸(TFA，购于上海吉尔生化公司)除去保护基团，得到苯乙烯基类化合物粗品。

e.将苯乙烯基类化合物粗品经HPLC法(色谱柱：C18填料柱(购自美国安捷伦公司，请提供色谱柱的型号及其购买处)；流动相：乙腈/水混合体系；流速：2.8mL/min；检测波长：215nm；柱温：室温)分离得到苯乙烯基类化合物纯品。

经检测，用上述方法制备的苯乙烯基类化合物结构正确，分子式见式IX，纯度达95％以上。

(式IX)

实施例5、ThT荧光法检测本发明苯乙烯基类化合物对Aβ聚集的抑制作用与对Aβ聚集体的解聚作用

Aβ在体外会在近生理条件下聚集成纤维，纤维可以与硫代黄色素T(ThioflavinT，ThT)结合，在激发波长(excitation)440nm，发射波长(emission)485nm处显特异性荧光，荧光强度可以定量反映出纤维的数量，从而可实现对Aβ聚集程度进行定量测定。现用ThT荧光法检测本发明化合物对Aβ聚集的抑制作用以及对Aβ聚集体的解聚作用，实验方法如下：

Aβ42贮液配制：向Aβ42(购自美国多肽公司)中加入六氟异丙醇(HFIP)，使多肽浓度为1mg/mL，室温下轻摇12小时，用氮气吹干，加入200μMNaOH溶液，配制成100μM Aβ42贮液，置于-80℃冰箱中保存。

苯乙烯基类化合物贮液配制：将实施例1、2、3、4合成的苯乙烯基类化合物分别加入pH 7.4的PBS(Na₂HPO₄·12H₂O 3.73g，KH₂PO₄ 0.43g，NaCl 7.2g，加水至1000mL)中配制成1.92mM的贮液，置于-80℃冰箱中保存。

一、检测本发明苯乙烯基类化合物对Aβ聚集的抑制作用

取Aβ42贮液，上述苯乙烯基类化合物贮液和氯化铜配制成含20uM Aβ42，0至160uM上述苯乙烯基类化合物和0.4至128μM Cu²⁺的溶液，调pH为7.4，在37℃下温育3天，以在相同条件下温育的Aβ42贮液为对照。ThT测定方法为：取温育样品液20ul置于700ul 10uM的ThT(pH 7.4)溶液中，混合均匀，测量在激发波长(excitation)440nm，发射波长(emission)485nm处的荧光吸收。

检测结果如图1所示，Aβ42的空白样品聚集程度为100％，加入本发明实施例1、2、3、4苯乙烯基类化合物后Aβ的聚集得到显著抑制(见图1中的曲线I(实施例1制备的化合物；曲线II(实施例2制备的化合物)；曲线III(实施例3制备的化合物)；曲线IV(实施例4制备的化合物))，证明本发明的苯乙烯基类化合物可显著抑制Aβ的聚集。

二、检测化合物对Aβ聚集体的解聚作用

取Aβ42贮液，将其稀释成含20μM Aβ42的溶液，调pH为7.4，然后在37℃下温育。2天后，对温育样品进行ThT荧光与电镜(TEM)检测，发现Aβ42发生聚集，然后分别加入本发明实施例1、2、3、4苯乙烯基类化合物贮液和氯化铜配制成分别含20、40、80μM实施例1、2、3、4苯乙烯基类化合物和20、32、64μM Cu²⁺的溶液(pH 7.4)，在37℃下继续温育8天，同时用与步骤一相同的方法测定Aβ42溶液的ThT荧光吸收，连续检测8天。

其中，不同浓度的实施例2制备的苯乙烯基类化合物对Aβ聚集体解聚作用的检测结果如图2中的曲线II(20μM苯乙烯基化合物)、III(40μM苯乙烯基化合物)、IV(80μM苯乙烯基化合物)，表明本发明的苯乙烯基类化合物对已发生聚集的Aβ42聚集体(曲线I)有很好的解聚作用。此外，实施例1、3、4合成的苯乙烯基类化合物也对已发生聚集的Aβ42聚集体有很好的解聚作用，证明本发明的苯乙烯基类化合物对已发生聚集的Aβ42聚集体也有很好的解聚作用。

实施例6、电镜观察本发明苯乙烯基类化合物对Aβ聚集的抑制作用

Aβ聚集体在电镜下可明显地观察到纤维的形态，现用电镜直接观察Aβ42样品在铜网上的形态变化，以进一步检测本发明的苯乙烯基类化合物对Aβ聚集的抑制作用，检测方法如下：

苯乙烯基类化合物贮液：将实施例1、2、3、4合成的苯乙烯基类化合物分别加入pH 7.4的PBS(Na₂HPO₄·12H₂O 3.73g，KH₂PO₄ 0.43g，NaCl 7.2g，加水至1000mL)中配制成1.92mM的贮液，置于-80℃冰箱中保存。

取Aβ42贮液(配方见实施例5)，苯乙烯基类化合物贮液分别和氯化铜配制成含20μM Aβ42，40μM苯乙烯基类化合物和32μM Cu²⁺的溶液，调pH为7.4，在37℃下温育7天作为样品液，以在相同条件下温育的Aβ42贮液为对照；然后取样品液8μL置于镀有碳膜的铜网上，静置1分钟，用滤纸吸去多余液体，用水洗铜网两次，待铜网微干，滴加10μL1-2％磷钨酸染色，静置1分钟，用滤纸吸去液体，将铜网置于干燥器中干燥12-24小时；最后将负载样品的铜网置于电镜下，在电压100kV，放大倍数50000条件下观察样品形态。

其中，Aβ42与实施例2制备的苯乙烯基类化合物温育3天后的电镜观测结果见图3(标尺：100nm)中的B图，与对照相比(图3中的A图)，该苯乙烯基类化合物显著抑制了Aβ的聚集。此外，实施例1、3、4合成的苯乙烯基类化合物也可显著抑制Aβ的聚集，表明本发明的苯乙烯基类化合物可显著抑制Aβ的聚集。

实施例7、TCEP-DTNB法检测本发明苯乙烯基类化合物对Aβ产生过氧化氢的抑制作用

Aβ在有铜的介导下可生成过氧化氢(H₂O₂)。三-(2-羧基乙基)膦·盐酸盐(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP，购自美国Alfa Aesar公司)可以与过氧化氢定量反应，未反应的TCEP可以与探针5，5’-双硫联-(2-硝基苯甲酸)(5，5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid，DTNB，购自美国Sigma公司)反应生成2-硝基-5-巯基苯甲酸(2-nitro-5-thiobenzoate，NTB)，NTB在波长为410nm处附近有紫外可见吸收。因此通过检测紫外吸收强度可以定量反映出Aβ产生的过氧化氢的浓度，紫外吸收越强，说明DTNB与TCEP反应得越多，也就说明与过氧化氢反应的TCEP越少，最终就说明Aβ产生的过氧化氢越少。现用TCEP-DTNB法检测本发明苯乙烯基类化合物对Aβ产生过氧化氢的抑制情况，实验方法如下：

TCEP贮液配制：将TCEP溶解在pH 7.4的PBS(Na₂HPO₄·12H₂O 3.73g，KH₂PO₄ 0.43g，NaCl 7.2g，加水至1000mL)中得到10mM贮液。

DTNB贮液配制：将DTNB溶解在pH 7.4的PBS(Na₂HPO₄·12H₂O 3.73g，KH₂PO₄ 0.43g，NaCl 7.2g，加水至1000mL)中得到10mM贮液。

Gly-Cu贮液配置：将10mMCuCl2和60mMGly(购自吉尔生化)溶解在水中，室温振荡24小时。

配制含10μM Aβ，1μM Gly-Cu溶液、50μM TCEP和50μM的实施例1、2、3、4合成的苯乙烯基类化合物混合液，在37℃下温育60min，然后加入50μM的DTNB，测412nm的的紫外吸收，以添加过氧化氢酶(Catalase，购自Sigma公司)混合液为对照(过氧化氢酶可以分解产生的过氧化氢，可基本认为该体系为过氧化氢的空白体系)。

检测结果见图4(纵坐标表示过氧化氢的相对量；横坐标表示不同的实验组，I1为实施例1制备的苯乙烯基类化合物，I2为实施例2制备的苯乙烯基类化合物，I3为实施例3制备的苯乙烯基类化合物，I4为实施例4制备的苯乙烯基类化合物，Aβ组为未添加本发明苯乙烯基类化合物的对照组)，与对照组相比，本发明的苯乙烯基类化合物可显著抑制Aβ催化产生过氧化氢，从而减弱了Aβ的毒性作用。

实施例8、MTT(噻唑兰)法检测本发明苯乙烯基类化合物对神经细胞的保护作用

MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。大鼠海马趾神经元细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜(Formazan)颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经DMSO溶解后为蓝紫色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。现用MTT法检测本发明苯乙烯基类化合物对神经细胞的保护作用，实验方法如下：

海马趾神经元细胞的制备：大鼠神经元参见文献(Isabella A.Graef，Paul G.Mermelstein，Kryn Stankunas，Joel R.Neilson，Karl Deisseroth，Richard W.Tsien，Gerald R.Crabtree，L-type calcium channels and GSK-3 regulate theactivity of NF-ATc4 in hippocampal neurons，Nature，1999，Vol 401，703-708)中的方法制备。

化合物贮液制备：将实施例1、2、3、4合成的苯乙烯基类化合物分别加入pH 7.4的PBS(Na₂HPO₄·12H₂O 3.73g，KH₂PO₄ 0.43g，NaCl 7.2g，加水至1000mL)中配制成1.92mM的贮液，置于-80℃冰箱中保存。

取Aβ42贮液(配方见实施例5)，本发明苯乙烯基类化合物贮液和氯化铜配制成含40μM Aβ42，40μM本发明苯乙烯基类化合物贮液和32μM Cu²⁺的溶液，调pH为7.4，在37℃下温育3天作为样品液。然后取按1∶4的比例用细胞培养液稀释至培养的神经元细胞中，神经元细胞继续在37℃、5％ CO₂的条件下培养两天，然后根据MTT产品说明书(购自Sigma公司)进行MTT实验。

检测结果见图5(纵坐标表示细胞存活率，横坐标表示不同的实验组，其中I1为实施例1制备的苯乙烯基类化合物，I2为实施例2制备的苯乙烯基类化合物，I3为实施例3制备的苯乙烯基类化合物，I4为实施例4制备的苯乙烯基类化合物，Aβ组为未添加本发明苯乙烯基类化合物的对照组，空白组为本发明苯乙烯基类化合物和Aβ42贮液均未添加的空白对照组)，与未添加本发明苯乙烯基类化合物的对照组相比，本发明的苯乙烯基类化合物可明显抑制Aβ的细胞毒性，从而对神经细胞产生保护作用，使细胞存活率较高。

实施例9、毒性试验

1)一般毒性试验

采用猫和大鼠试验模型(购自军事医学科学院)，用猫(24只，雌、雄各半，体重2.4-3.7kg，分为4组，每组6只，用药剂量分别为0.05、50、120mg/kg)试验，观察实施例1、2、3、4制备的苯乙烯基类化合物对血压、呼吸频率、心率等影响；用鼠(40只，雌、雄各半，体重18-20g，分为4组，每组10只，用药剂量分别为0.05、30、50mg/kg)试验，观察实施例1、2、3、4制备的苯乙烯基类化合物对大鼠自主活动情况的影响。试验结果表明，三个剂量的本发明苯乙烯基类化合物对猫的血压、呼吸频率与幅度、心率、心律均无明显影响，对大鼠的自主活动次数也无明显影响。

2)急性毒性试验

以实施例1制备的苯乙烯基类化合物为例用下述方法检测本发明苯乙烯基类化合物的急性毒性，具体方法为：采用小鼠试验模型(购自军事医学科学院)，昆明种小鼠(40只，分为空白对照组和苯乙烯基化合物组，每组各20只)，一次最大灌胃口服给药量10.63g/kg，相当于临床拟用量(3.75mg/kg)的2834倍，观察28天，包括小鼠体重增减率、活动情况及死亡情况，试验结果如表1所示：

表1 本发明苯乙烯基类化合物对小鼠的急性毒性试验结果

试验结果表明，一次灌胃口服最大给药量10.63g/kg，相当于临床给药量的2834倍，但试验动物均未发生急性毒性反应，仅见雄性小鼠体重的增长率高于雌性小鼠，说明本发明苯乙烯基化合物的毒性很小。

3)长期毒性试验

采用大鼠试验模型，SPF级Wistar大鼠(购自军事医学科学院，体重90-100g，分为空白对照组及实施例1-4制备的本发明苯乙烯基类化合物三个剂量组(93.75、187.5及375mg/kg)，共13组，每组44只大鼠，空白对照组给予同剂量的生理盐水，每日灌胃给药一次，连服6个月，观察指标包括试验动物的一般生理指标及外周血相、血液生化、肝功、肾功等主要脏器器官指数及组织病理学检查检查等的变化，试验结果表明，大鼠口服不同剂量(93.75、187.5及375mg/kg)的本发明苯乙烯基类化合物，分别为临床用药量的25、50及100倍，连续给药6个月，未见各项指标异常，不同剂量组间也无明显差异(ρ＞0.05)，说明长期服用本发明苯乙烯基类化合物是安全的，无毒性的累积效应。

Claims (5)

1、具有含氮杂环修饰的苯乙烯基类化合物，是下述式VII，式VIII和式IX所示的化合物：

(式VII)

(式VIII)

(式IX)。

2、权利要求1中所述的苯乙烯基类化合物的盐。

3、根据权利要求2所述的盐，其特征在于：所述盐为钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、铝盐、亚锰盐、锌盐、伯胺盐、仲胺盐、叔胺盐、盐酸盐、磷酸盐、乙酸盐、草酸盐或酒石酸盐。

4、权利要求1所述的苯乙烯基类化合物在制备治疗和预防神经系统退行性疾病药物中的应用。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述神经系统退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病或二型糖尿病。

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