CN107249580A

CN107249580A - 帕金连接酶活化方法和组合物

Info

Publication number: CN107249580A
Application number: CN201580075270.1A
Authority: CN
Inventors: J·约翰斯顿
Original assignee: An2h Discovery Ltd
Current assignee: An2h Discovery Ltd
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2017-10-13
Also published as: US20200087648A1; EP3227437A2; BR112017011644A2; WO2016090371A3; US20160160205A1; US10155936B2; MX2017007095A; KR20170092634A; AU2015357487A1; WO2016090371A2; EP3227437A4; CA2968094A1; JP2017538699A; IL252425A0

Abstract

本发明涉及通过向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指的化合物来活化帕金连接酶的方法和组合物。本发明还涉及治疗与帕金连接酶的活化相关的疾病或病症和/或降低其发生率的方法。

Description

帕金连接酶活化方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年10月5日提交的美国临时申请62/237,400、2015年9月22日提交的美国临时申请62/222,008以及2014年12月5日提交的美国临时申请62/087,972的优先权，其公开内容通过参照整体并入本申请。

技术领域

本发明涉及通过破坏锌指(zinc finger)域来活化帕金连接酶(Parkin ligase)以用于治疗益处的方法。

背景技术

泛素-蛋白酶体途径系统(UPS)是调节关键调节蛋白并降解错误折叠或异常蛋白的关键途径。UPS是多个细胞过程的核心，如果有缺陷或失衡，则会导致各种疾病的发病。泛素对蛋白质的翻译后修饰是调节蛋白质稳定性和活性的基本细胞机制，是生物学几乎所有方面的多种功能的基础。通过E3泛素连接酶的作用实现了泛素与特定蛋白底物的共价连接。这些连接酶包含超过500种不同的蛋白质，并且被归类为由其E3功能活性的结构元件定义的多个类别。特别地，HECT和RING连接酶二者将活化的泛素从硫酯转移到底物上的赖氨酸残基的e-氨基酸基团；然而，HECT连接酶具有与泛素形成中间体硫酯键的活性位点半胱氨酸，而RING连接酶用作支架以允许泛素直接从E2转移至底物。最近的证据表明，RING连接酶的亚族，RING-中间-RING(RBR)家族除了规范的RING域之外，还可能含有一种催化性半胱氨酸残基1,2(Riley等人2013.Nat Commun.4:1982，“Riley等人”)，其在此通过参照整体并入。

去泛素化蛋白和泛素特异性蛋白酶(DUB和USP)以及E3连接酶在UPS中发挥至关重要的作用。这些蛋白由稳定泛素(Ub)结合用于特化功功能的柔性锌指(ZnF)域支持。

帕金是一种RING-中间-RING E3连接酶，其在泛素与特定底物的共价连接中起作用，帕金中的突变与帕金森病、癌和分枝杆菌感染相关。对于帕金的个体RING域，关于配位Zn离子的特定残基以及它们与定义经典E2结合域的规范RING交叉支架结构的关系是有争议的问题。R0是一个新颖的域结构，但与Zn指域相比与E3RING域更为相似(Riley等人2013.Nat Commun.4:1982)。

虽然许多药物发现计划专注于UPS，但由于缺乏选择性和直接接触酶蛋白活性位点而少有成功。本发明针对的是一种破坏Zn指域的新方法，其提供针对包括肿瘤学和神经病学紊乱的各种疾病和紊乱的治疗益处。

发明内容

本发明涉及通过在其ZnF域中结合锌离子和/或半胱氨酸残基而调节UPS中连接酶的结构和/或功能，以用于治疗益处。该机制不同于结合连接酶的活性位点，其接收Ub的尾部。本发明针对的是通过将小分子配位至帕金ZnF域中的锌离子，或通过小分子与帕金ZnF域中的半胱氨酸残基的化学反应来活化帕金连接酶的方法。将小分子配位至锌离子可从ZnF域移除或不移除锌离子。小分子与半胱氨酸残基的化学反应可为可逆的或不可逆的。

本发明的具体实施方案包括活化帕金连接酶的方法。在一具体实施方案中，可以通过向受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指的化合物来活化帕金连接酶。在另一具体实施方案中，该化合物可与Zn离子配位，和/或与半胱氨酸结合或反应。在一具体实施方案中，该化合物可与半胱氨酸中的巯基反应。

在另一实施方案中，活化的帕金连接酶抑制一种或多种肿瘤。在另一具体实施方案中，活化的帕金连接酶提供多巴胺神经元保护。

可配位至Zn离子的化合物包括但不限于单齿、二齿或三齿配体。可与半胱氨酸残基中的巯基反应的化合物包括但不限于烷化剂、氧化剂、迈克尔受体、另一不饱和结构或二硫化物。

在某些实施方案中，该化合物消除受损的线粒体、增加细胞应激期间的细胞活力、减少肿瘤转化和/或减轻细胞中α-突触核蛋白。在某些实施方案中，该受试者已被诊断患有癌症。在某些实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌或前列腺癌。

在一些实施方案中，该患者已被诊断患有神经变性疾病。

在具体实施方案中，神经变性疾病是帕金森病、痴呆、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或亨廷顿病。在另外的实施方案中，痴呆是路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩症(MSA)或进行性核上性麻痹(PSP)。

在本发明的其它实施方案中，该化合物基本上破坏帕金连接酶中至少一个锌指的结构。在某些实施方案中，至少一个锌指选自以下的一种或多种：通过R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465所限定的域。在一具体实施方案中，至少一个锌指的氨基酸残基对应于选自以下的一个或多个域或与其对齐：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。在另外的实施方案中，锌指包含四个半胱氨酸残基。在一具体实施方案中，该化合物可为锌螯合剂。

在另一具体实施方案中，该化合物可与一个或多个半胱氨酸残基结合或反应。在另一具体实施方案中，该化合物可与一个或多个选自以下的半胱氨酸残基结合或反应：人帕金连接酶的C59和C377。

在一个实施方案中，该化合物可基本上破坏帕金连接酶中至少一个锌指的结构。在另一实施方案中，帕金连接酶中的锌指可位于选自以下的一个或多个域内：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。在另一具体实施方案中，基本上被破坏的锌指位于帕金连接酶的IBR氨基酸328-377中。

在另一实施方案中，该化合物可与磷酸泛素(Phospho Ubiquitin,pUB)在活化帕金连接酶中协同作用。

在某些实施方案中，帕金连接酶活化改变泛素化(ubiquitination)。

在另一实施方案中，活化帕金连接酶治疗选自以下的一种或多种疾病或疾患(ailment)或降低其发生率：阿尔茨海默氏痴呆、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、弗里德赖希共济失调、脊髓小脑性共济失调、多系统萎缩症、PSP、Tau蛋白病、弥散性路易体病、路易体痴呆、任何特征在于α-突触核蛋白异常蓄积的病症、老化过程病症、中风、细菌感染、病毒感染、线粒体相关性疾病、智力迟钝、耳聋、失明、糖尿病、肥胖、心血管疾病、多发性硬化、斯耶格伦综合征(Sjogrens syndrome)、狼疮、青光眼包括假性剥脱性青光眼、莱伯遗传性视神经病变和类风湿性关节炎。

在一具体实施方案中，细菌感染是分枝杆菌感染。在另一具体实施方案中，病毒感染是丙型肝炎感染。在另一具体实施方案中，线粒体相关性疾病选自以下的一种或多种：阿尔珀斯病、巴氏综合征/LIC(致命性小儿心肌病)、β氧化缺陷、肉碱-酰基-肉碱缺乏、肉碱缺乏、肌酸缺陷综合征、辅酶Q10缺乏、复合体I缺乏、复合体II缺乏、复合体III缺乏、复合体IV缺乏/COX缺乏、复合体V缺乏、CPEO、CPT I缺乏、CPT II缺乏、KSS、乳酸酸中毒、LBSL–脑白质营养不良、LCAD、LCHAD、利氏病或利氏综合征、勒夫特病、MAD/II型戊二酸尿症、MCAD、MELAS、MERRF、MIRAS、线粒体细胞病、线粒体DNA耗竭、线粒体脑病、线粒体肌病、MNGIE、NARP、皮尔森综合征、丙酮酸羧化酶缺乏、丙酮酸脱氢酶缺乏、POLG突变、呼吸链相关性疾病、SCAD、SCHAD和VLCAD。

本发明的另一实施方案包括治疗癌症和/或降低其发生率的方法。一个具体实施方案包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指并诱导帕金连接酶活性的化合物，其中该化合物可与Zn离子配位和/或与半胱氨酸中的巯基反应。在另一具体实施方案中，活化帕金连接酶抑制一种或多种肿瘤。在另一实施方案中，该化合物消除受损的线粒体、增加细胞应激期间的细胞活力、减少肿瘤转化和减轻细胞中α-突触核蛋白。在另一实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌或前列腺癌。

本发明的另一实施方案包括治疗帕金森病和/或降低其发生率的方法。用于治疗帕金森病和/或降低其发生率的一个具体实施方案包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指并诱导帕金连接酶活性的化合物，其中该化合物可与Zn离子配位和/或与半胱氨酸中的巯基反应。

在一些实施方案中，帕金连接酶活化改变泛素化，如由帕金通过共价结合泛素修饰底物蛋白的能力所定义的，底物蛋白为帕金自身，或另一蛋白例如线粒体融合蛋白1或2、FBW7、或者其它公开报道的帕金连接酶的底物。

本发明的另一实施方案包括药物制剂。在一具体实施方案中，该药物制剂活化帕金连接酶。在另一具体实施方案中，该药物制剂可包含有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指的化合物或其盐，和药用载体，其中该化合物或其盐可配位Zn离子，和/或与半胱氨酸中的巯基反应。在另一具体实施方案中，该化合物可与选自以下的一个或多个半胱氨酸残基结合或反应：人帕金连接酶的C59和C377。在一具体实施方案中，药物组合物是在选自以下的制剂中：固体、粉末、液体和凝胶。

附图说明

图1表明N,N'-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺，即一种螯合剂化合物(识别为AH001或表2中的化合物 76)，其增加了帕金连接酶与基于活性的泛素乙烯砜探针的反应。

图2表明6-苄基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇，即一种亲电体和螯合剂化合物(识别为AH007或表2中的化合物77)，其增加了帕金连接酶与基于活性的泛素乙烯砜探针的反应。

图3表明化合物N,N'-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺，即一种螯合剂化合物(AH001)，其增加了自动泛素化(auto-ubiquitination)测定中的帕金活性。

图4A和4B表明N,N'-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺(AH001)与pUB协同增加了自动泛素化测定中的帕金活化且允许较低浓度的pUB以活化帕金。

图5表明6-苄基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇，即一种亲电体化合物(AH007)，其增加了自动泛素化测定中的帕金活性。

具体实施方式

所有出版物、专利和专利申请，包括其中的任何附图和附录，以如同每个个体出版物、专利或专利申请、附图或附录被明确和单独指出通过参照整体并入用于所有目的的相同程度通过参照整体并入用于所有目的。

定义

药用盐包括通过使用作碱的活性化合物与无机或有机酸反应以盐形成盐而获得的那些，例如盐酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、樟脑磺酸、草酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、甲酸、氢溴酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、水杨酸、扁桃酸、碳酸等的盐。本领域技术人员将会进一步认识到，酸加成盐可以通过化合物与适当的无机或有机酸经由任何多种已知方法的反应来制备。

术语“治疗”是指减轻、缓解、延迟、减少、逆转、改善或管理受试者中病症至少一种病症症状中的一种或多种。术语“治疗”还可以指阻滞、延迟病症的发作(即病症临床表现之前的时期)或降低其发展或恶化的风险中的一种或多种。

“有效量”是指根据本发明的制剂的用量，其当给予患者用于治疗状况、障碍或病症时足以进行此种治疗。“有效量”将根据活性成分、待治疗的状况、障碍或病症及其严重程度、以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重、身体状况和响应性而变化。

适用于剂量或量的术语“治疗有效的”是指在给予有此需求的患者后足以导致期望的临床益处的化合物或药物制剂的量。

本申请提及的所有重量百分数(即，"重量％"和"wt.％"和w/w)，除非另有指示，否则是相对于药物组合物的总重量测量的。

如本申请所用的，“基本上”或“基本”是指动作、特征、性质、状态、结构、项目或结果的完全或接近完全的程度或度。例如，“基本上”被包围的对象将意味着该对象是完全封闭的或几乎完全封闭的。偏离绝对完全性的精确可允许程度在某些情况下可能取决于具体环境。然而，一般而言，完成的接近程度将以至于具有如同获得绝对和完全完成的相同的总体结果。“基本上”的使用同样适用于当在消极的内涵中使用以表示完全或接近完全缺乏行动、特征、性质、状态、结构、项目或结果时。例如，“基本上不含”其它活性剂的组合物完全缺乏其它活性剂，或者如此接近完全缺乏其它活性剂以至作用将会与如同其完全缺乏其它活性剂相同。换而言之，“基本上不含”某成分或要素或另一活性剂的组合物仍可含有此项，只要没有其可测的作用。

可以使用可在www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/获得的比对程序ClustalW2进行两个或多个蛋白/氨基酸序列的如本申请所用的“比对(alignment)”。可以使用以下缺省参数用于成对比对：蛋白权矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet；缺口开放＝10；缺口延伸＝0.1。

如本申请所用的“泛素蛋白酶体途径系统(UPS)”涉及从酵母到哺乳动物保守的泛素蛋白酶体途径，且为真核细胞中大多数短寿命蛋白的靶向降解所需的。靶标包括其及时破坏对于控制细胞分裂至关重要的细胞周期调控蛋白，以及不能在内质网内正确折叠的蛋白。泛素修饰是由三类酶进行的ATP依赖过程。“泛素活化酶”(E1)与泛素(一种高度保守的76氨基酸蛋白)形成硫酯键。该反应允许随后将泛素与“泛素缀合酶”(E2)结合，随后在泛素的羧基末端和底物蛋白上的赖氨酸残基之间形成异肽键。后一反应需要“泛素连接酶”(E3)。E3连接酶可以是单亚基或多亚基酶。在一些情况下，泛素结合和底物结合域位于通过衔接蛋白或剔除而在一起的分开的多肽上。许多E3连接酶提供特异性，因为每个可以仅修饰底物蛋白的子集。另外的特异性通过底物蛋白的翻译后修饰实现，其包括但不限于磷酸化。单泛素化的影响包括亚细胞定位的变化。然而，导致聚泛素链的多个泛素化循环是将蛋白靶向蛋白酶体用于降解所需的。多亚基26S蛋白酶体识别、展开多聚泛素化底物并将其降解成小肽。反应发生在蛋白酶体复合物的圆柱形核心内，且肽键水解采用核心苏氨酸残基作为催化亲核体。已经表明，多泛素化和降解步骤之间可能存在多泛素链受体形式的另外一层复杂性。这些受体与多聚泛素化底物的子集反应，有助于26S蛋白酶体的识别，从而促进其降解。该途径不仅在细胞内稳态中重要，而且在人类疾病中也是重要的。因为泛素/蛋白酶体依赖性降解通常用于控制细胞分裂周期和细胞生长，研究人员已发现，蛋白酶体抑制剂具有发展成为潜在的癌症治疗剂的一些前景。

通过泛素-蛋白酶体体系的蛋白降解是细胞内蛋白的非溶酶体蛋白水解的主要途径。它在各种基本细胞过程中发挥重要作用，例如调节细胞周期进程、分裂、发育和分化、细胞凋亡、细胞运输以及免疫和炎症反应的调节。该系统的核心元素是泛素与靶向蛋白的共价连接，然后由26S蛋白酶体(一种三磷酸腺苷依赖性多催化蛋白酶)识别。损害、氧化或错误折叠的蛋白以及控制许多关键细胞功能的调节蛋白是该降解过程的靶标之一。该系统的异常导致细胞稳态失调和多种疾病的发展(Wang等人Cell Mol Immunol.2006Aug；3(4):255-61)。

如本申请所用的“帕金连接酶”或“帕金”涉及在人类中通过PARK2基因编码的蛋白(Kitada T，Asakawa S，Hattori N，Matsumine H，Yamamura Y，Minoshima S，Yokochi M，Mizuno Y，Shimizu N(1998年4月)."Mutations in the parkin gene cause autosomalrecessive juvenile parkinsonism".Nature 392(6676):605–608.doi:10.1038/33416.PMID 9560156。Matsumine H，Yamamura Y，Hattori N，Kobayashi T，Kitada T，Yoritaka A，Mizuno Y(1998年4月)."A microdeletion of D6S305in a family ofautosomal recessive juvenile parkinsonism(PARK2)".Genomics 49(1):143–146.doi:10.1006/geno.1997.5196.PMID 9570960。该蛋白是多蛋白E3泛素连接酶复合体的组成部分，后者又是介导蛋白降解靶向的泛素-蛋白酶体系统的一部分。已知PARK2基因突变导致称为常染色体隐性青少年帕金森病(AR-JP)的帕金森病的家族性形式。

如本申请所用的“连接酶”是可以通过采用新化学键将两种或更多种化合物或生物分子结合在一起来催化它们的连接的酶。两者的“连接”通常伴随着依赖于较大化合物或生物分子之一的小化学基团的水解，或催化两种化合物连接在一起的酶，例如催化基团C-O、C-S、C-N等的连接的酶。泛素-蛋白(E3)连接酶是选择泛素化蛋白的高度多样化酶的一个大家族。

“Ub连接酶”涉及肿瘤、炎症和传染病的疾病发病机制。属于含有典型的RING域和催化半胱氨酸残基的E3连接酶的RING-中间-RING(RBR)家族的E3连接酶通常限于HECT E3连接酶；称为“RING/HECT”杂交酶。帕金中突变与帕金森病，癌症和分枝杆菌感染相关连。帕金被认为具有线粒体完整性作用的神经保护蛋白。人类遗传数据暗示了帕金森病(PD)发病机制中帕金活性的丧失。

如本申请所用的“锌指(ZnF)域”涉及特征在于配位锌离子以稳定功能活性的蛋白结构。ZnF稳定UPS中Ub、去泛素化酶(DUB)和连接酶(E3)的结合。

如本申请所用的“配体”通过配体中的一个或多个原子与金属结合，并且通常被称为螯合配体。通过两个位点结合的配体被分类为二齿，且三个位点为三齿。“咬角”是指二齿螯合物的两个键之间的角度。螯合配体通常通过经由有机接头连接供体组而形成。经典的双齿配体是乙二胺，它是通过两个氨基与乙烯(-CH2CH2-)连接体的连接得到的。多齿配体的典型实例是六齿螯合剂EDTA，其能够通过六个位点结合，完全围绕一些金属。螯合体系的结合亲和力取决于螯合角或咬角。许多配体能够通过多个位点结合金属离子，通常是因为配体在多于一个原子上具有孤电子对。一些配体可以通过相同的原子键合到金属中心，但是与不同数量的孤电子对键合。金属配体键的键合顺序可以部分通过金属配体键角(M-X-R)来区别。这种键角通常被称为线性的或弯曲的，关于弯曲角的程度具有进一步的探讨。例如，离子形式的亚胺配体具有三个孤电子对。一个孤电子对被用作σX供体，另外两个孤电子对可用作L型π供体。如果在π键中同时使用两个孤电子对，则M-N-R是线性的。然而，如果这些孤电子对中的一个或两个是非键合的，则M-N-R键是弯曲，并且弯曲的程度说明可能存在多少π键合。已经发现很少的杂原子，例如氮，氧和硫原子与锌相互作用，锌和这些杂原子之间的理想距离被确定。尽管羧酸盐通过单齿和双齿相互作用结合到锌上，但是主要以二齿形式结合羟肟酸盐。这些结果有助于设计具有与靶蛋白中的锌相互作用的新型抑制剂。几乎每个分子和每个离子可以作为(或“配对”)金属的配体。单齿配体包括几乎所有的阴离子和所有简单的路易斯碱。因此，卤化物和类卤化物是重要的阴离子配体，而氨、一氧化碳和水是特别常见的电荷中性配体。简单的有机物种也非常普遍，无论是阴离子(RO^-和RCO₂ ^-)还是中性(R₂O、R₂S、R_3-xNH_x和R₃P)。多齿配体的络合物称为螯合络合物。它们倾向于比单齿配体衍生的复合体更稳定。这种增强的稳定性，螯合效应通常归因于熵的影响，器有利于许多配体通过一个多齿配体的取代。当螯合配体形成至少部分包围中心原子并与其结合的大环时，将中心原子留在大环的中心。其刚性越高，其齿合度越高，大环复合物的惰性越多。

如本申请所用的“螯合剂”涉及通过形成螯合物(其中金属原子或离子在配体上的两个或更多个点上与配体结合的配位化合物，因此例如形成含有金属原子的杂环)抑制化学活性的结合剂。

如本申请所用的“螯合”涉及离子和分子结合金属离子的特殊方式。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)，螯合包括在多齿(多重键合)配体和单个中心原子之间形成或存在两个或多个单独的配位键。通常这些配体是有机化合物，且称为螯合剂、螯合试剂或掩蔽剂。

如本申请所用的“亲电体”涉及吸引至电子富集中心的物种。在化学中，亲电体是被电子吸引的试剂。它通过接受电子对来参与化学反应，以便与亲核体结合。因为亲电体接受电子，所以它们是路易斯酸。大多数亲电体带正电，具有带有部分正电荷的原子，或具有不具有电子八位位组的原子。

以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者特定或隐含引用的任何出版物是现有技术。

泛素-蛋白(E3)连接酶是选择各种蛋白用于泛素化的酶的一个大家族。已知这些泛素连接酶(称作“Ub连接酶”)在各种疾病和病症中具有作用，该疾病和病症包括但不限于，癌症、炎症和传染性疾病。

一种特定的Ub连接酶是帕金连接酶。帕金连接酶是多蛋白“E3”泛素连接酶复合物的组分，其又是介导蛋白降解的靶向的泛素-蛋白酶体系统的一部分。虽然帕金连接酶的具体功能尚不清楚，但帕金连接酶的突变与诸如帕金森病、癌症和分枝杆菌感染的各种疾病有关。因此，帕金连接酶是用于治疗干预的有吸引力的靶标。

另外，存在用于调节本领域已知的连接酶的各种已知方法。已知许多连接酶，特别是涉及泛素-蛋白酶体途径系统(UPS)的连接酶，具有稳定该连接酶中的关键蛋白结合区的锌指(ZnF)域。

ZnF域配位锌离子且该配位稳定了蛋白的功能活性。蛋白与ZnF域提供的功能活性可以包括调节重要的细胞信号通路，例如识别泛素、调节DNA，例如转录和修复，并用作细胞氧化还原传感器。锌与ZnF域的结合，或简单调节锌如何与ZnF域相互作用，对于UPS中涉及的连接酶是必要的。

已知帕金连接酶具有一个或多个ZnF域。本发明聚焦于调节帕金连接酶中ZnF域的两种不同策略。本发明的一种策略包括使用结合ZnF域并因此不允许锌的结合，或者引起诸如Zn或Zn²⁺的锌从ZnF域解离的螯合化合物。

本发明的另一种策略包括使用与ZnF域中的半胱氨酸氨基酸残基结合或反应的化合物。一个或多个半胱氨酸残基(且有时在组氨酸残基的帮助下)在ZnF域中对于结合和/或配位至锌离子是必需的。锌离子(通常Zn²⁺)可以与多个半胱氨酸或组氨酸残基配位。该域中具有的半胱氨酸残基越多，ZnF域越柔性。连接酶如帕金连接酶被认为在其ZnF域中具有与锌配位的多个半胱氨酸残基。帕金连接酶ZnF域的柔性被认为是允许域是可逆的，且因此是调节帕金连接酶的一种可能的机制。

本发明因此涉及具有亲电、螯合或亲电和螯合性质的一种或多种药物或一种或多种化合物的使用，其可以与帕金连接酶中的锌离子和/或半胱氨酸残基(一个或多个)相互作用并因此调节帕金连接酶的活性。具体地，认为不允许锌离子在帕金连接酶的ZnF域中的至少一个中配位以诱导其活性。因此，本发明涉及一种通过Zn的螯合，然后从ZnF域将其除去或通过在保持Zn在适当位置的半胱氨酸氨基酸(一个或多个)处的亲电攻击来活化帕金连接酶的方法。

因此，在本发明的一个实施方案中，活化帕金连接酶的方法包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指的一种或多种化合物。在另一实施方案中，活化帕金连接酶的方法包括向受试者给予破坏至少一个帕金连接酶锌指的两种或更多种化合物。

在一具体实施方案中，本发明化合物可为亲电体或螯合剂。在另一实施方案中，本发明化合物可能能够同时用作亲电体和螯合剂。例如，本发明化合物可以包括多个官能团，其中一官能团具有螯合性质且一官能团具有亲电性质。

在另一具体实施方案中，化合物选自以下的一种或多种：表1和表2中的化合物或其盐或酯。虽然不受限于特定理论，但认为表1或表2中的至少一些化合物可以是螯合剂，亲电体或两者。例如，认为来自表2的化合物76和97用作螯合剂，但表2的化合物113用作硫醇反应性亲电体。在另一实例中，来自表1或表2的化合物可以同时用作亲电体和亲核试剂。认为，例如，表2的化合物91和107都是螯合剂，但也可能作为硫醇反应性亲电体。因此，在另一具体实施方案中，本发明化合物是选自由表1和表2中的化合物或其盐或酯构成的组的一种或多种的亲电体、螯合剂或亲电体和螯合剂。

在另一实施方案中，表1和表2中的化合物或其盐或酯结合并活化帕金连接酶。例如，化合物N,N'-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺(AH001)，一种螯合剂化合物和6-苄基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇(AH007)，一种亲电体和螯合剂化合物，二者均可独立增加与基于活性的泛素乙烯砜探针的帕金连接酶反应。参见实施例2-3。因此，螯合剂和/或亲电体二者均可结合并活化帕金连接酶。

在另一实施方案中，化合物可为2-(4-苄基哌嗪-1-基)-N-[(2-羟基-3-丙-2-烯基-苯基)亚甲基氨基]乙酰胺(还称作Pac-1)或其盐或酯。虽然不受限于特定理论，但认为以下表2中提供为化合物114的Pac-1的结构是螯合剂，并且还可具有增加帕金连接酶反应的能力。在另一实施方案中，Pac-1或其盐还可以是亲电体和/或既为螯合剂又为亲电体。

在另一实施方案中，化合物可为Pac-1的衍生物或类似物。在一具体实施方案中，化合物可为PCT申请公开WO2010/091382、WO2013/131089、WO2013/124407、WO2014/022858、美国申请公开US2015/0210659、US2015/0231132、US2014/0073609、US20150017264、US2015/0099759、美国专利8,916,705、美国专利9,102,661、美国专利8,592,584和美国专利8,778,945中所述的化合物，其公开内容通过参照整体并入本申请。

在一特定实例中，基于活性的探针测定和质谱分析表明表1和/或表2中的一些候选化合物可以与人帕金连接酶中的多个半胱氨酸残基结合或反应。例如，质谱分析表明AH007与帕金连接酶的至少半胱氨酸残基59(C59)和半胱氨酸残基377(C377)结合。

因此，在一具体实施方案中，活化帕金连接酶的方法包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指的一种或多种化合物。在一具体实施方案中，该一种或多种化合物选自表1和/或表2，或其盐或酯。在另一实施方案中，化合物可为螯合剂、亲电体或螯合剂和亲电体。

在另一实施方案中，一种或多种化合物可与Zn离子配位，和/或与一个或多个半胱氨酸残基结合或反应。在一具体实施方案中，Zn离子可以是Zn⁺或Zn²⁺离子。在另一实施方案中，可以配位至Zn离子的化合物是单齿，二齿或三齿配体。

在另一实施方案中，该化合物可以与超过一个半胱氨酸残基中的巯基结合和/或反应。在另一实施方案中，该化合物可以与两个半胱氨酸残基中的巯基结合和/或反应。在另一实施方案中，该化合物可以与三个半胱氨酸残基中的巯基结合和/或反应。在另一实施方案中，该化合物可以与四个半胱氨酸残基中的巯基结合和/或反应。在另一具体实施方案中，该化合物可以与选自以下的一个或多个域中的一个或多个半胱氨酸残基结合或反应：人帕金连接酶的氨基酸141-225、氨基酸238-293、氨基酸313-377和氨基酸418-449。参见http://www.uniprot.org/uniprot/O60260。

在另一具体实施方案中，该化合物可以与选自以下的一个或多个半胱氨酸残基结合或反应：人帕金连接酶的C182、C258和C377。在另一具体实施方案中，该化合物可以与选自以下的一个或多个半胱氨酸残基结合或反应：人帕金连接酶的C59和C377。在一具体实施方案中，该化合物可以与人帕金连接酶的反应C377。在另一具体实施方案中，该化合物是AH007。

在另一实施方案中，该化合物可以与选自对应于或对齐于人帕金连接酶的C182、C258和/或C377的帕金连接酶、帕金连接酶衍生物或帕金连接酶同源物的一个或多个残基的一个或多个半胱氨酸残基结合或反应。在另一实施方案中，该化合物可以与选自对应于或对齐于人帕金连接酶的C59和/或C377的帕金连接酶、帕金连接酶衍生物或帕金连接酶同源物的一个或多个残基的一个或多个半胱氨酸残基结合或反应。在另一具体实施方案中，该化合物是AH007。

还认为IBR域可能在调节帕金活性中发挥关键作用。认为RO域包括至少一个如上所述的ZnF域，其可以涉及用于调节帕金连接酶的一种可能的机制。因此，在一具体实施方案中，通过向有有此需求的受试者给予化合物可以基本上破坏位于IBR域(氨基酸328-377)中的至少一个ZnF域的结构。在另一实施方案中，选自表1和/或表2的一种或多种化合物或其盐或酯可基本上破坏位于IBR域(氨基酸328-377)中的至少一个ZnF域的结构。

在另一实施方案中，该化合物可以与半胱氨酸残基(包括ZnF域内或附近的任何组氨酸残基(一个或多个))结合和/或反应。

在另一实施方案中，该化合物可基本上破坏帕金连接酶中至少一个锌指(或ZnF域)的结构。在另一实施方案中，本发明化合物可破坏帕金连接酶中的一个或多个ZnF域。

Riley等人描述了一种465个氨基酸的人帕金连接酶，其包括具有Zn配位残基的多个功能区(表3中提供的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，并在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004562.2中识别)。Riley等人探讨了指定为R0、R1、IBR和R2的4个域。R0、R1和R2，其先前指定为RING域。然而，Riley等人质疑R0、IBR和R2域是实际的还是传统的RING域：“R0是一个新颖的域结构，但其更相似于Zn指域，而不是E3RING域”。Riley等人还指出IBR或R2域都不类似规范的RING域基序，因为它们没有通常与RING域相关联的交叉支架结构。此外，R0、IBR和R2域的分析表明其锌中心可能存在缺陷。因此，R0、IBR和R2域看起来是调节帕金连接酶活性的理想域候选。R0、IBR和R2域分别是指人帕金连接酶的氨基酸141-216、氨基酸328-377和氨基酸415-465。

因此，在一具体实施方案中，可被基本上破坏的至少一个锌指对应于或对齐于选自以下的一个或多个域：人帕金连接酶的氨基酸141-216、氨基酸328-377和氨基酸415-465。在另一具体实施方案中，来自至少一个锌指的氨基酸可以在与来自人帕金连接酶的R0、IBR和R2域中的一个或多个比对中重叠。

在另一具体实施方案中，可被基本上破坏的至少一个锌指对应于或对齐于选自以下的一个或多个域：人帕金连接酶的氨基酸141-225、氨基酸238-293、氨基酸313-377和氨基酸418-449。参见http://www.uniprot.org/uniprot/O60260。

在一具体实施方案中，在帕金连接酶中的至少一个锌指包含一个、两个、三个或四个半胱氨酸残基。在另一实施方案中，至少一个锌指的破坏诱导帕金连接酶的活性。在另一实施方案中，帕金连接酶中的至少一个锌指包含来自人帕金连接酶的氨基酸141-225、氨基酸238-293、氨基酸313-377和氨基酸418-449的一个、两个、三个或四个半胱氨酸残基。例如，在一具体实施方案中，化合物可以通过与选自由人帕金连接酶的C182、C258和C377构成的组的一个或多个半胱氨酸残基结合或反应而起反应并因此破坏一个或多个锌指。

本发明的方法还包括通过向有此需求的受试者给予治疗有效量的一种或多种化合物来活化帕金连接酶的自动泛素化。在一具体实施方案中，一种或多种化合物破坏至少一个帕金连接酶锌指。在另一实例中，表1和/或表2中的化合物可用于活化帕金连接酶的自动泛素化。在另一实施方案中，表1和/或表2中的化合物可以与其他化合物一起使用以活化帕金连接酶的自动泛素化。例如，可以将帕金的内源性细胞调节剂磷酸泛素(pUB)加入到可以活化帕金连接酶及其自身泛素化的帕金连接酶中。在一个实施方案中，可向有此需求的受试者给予用作与磷酸泛素(pUB)协同活化帕金连接酶的表1和/或表2中的一种或多种化合物或其盐和酯。参见例如实施例5。在另一实施方案中，可与pUB一起给予一种或多种化合物以协同增加帕金连接酶和/或其自身泛素化的活化。在另一实施方案中，化合物可以是螯合剂和/或亲电体。在一具体实施方案中，一种或多种化合物选自表1和/或表2，或其盐或酯。

在另一具体实施方案中，帕金连接酶的活化治疗选自以下的一种或多种疾病或疾患或降低其发生率：阿尔茨海默氏痴呆、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、弗里德赖希共济失调、脊髓小脑性共济失调、多系统萎缩症、PSP、Tau蛋白病、弥散性路易体病、路易体痴呆、任何特征在于α-突触核蛋白异常蓄积的病症、老化过程病症、中风、细菌感染、病毒感染、线粒体相关性疾病、智力迟钝、耳聋、失明、糖尿病、肥胖、心血管疾病、多发性硬化、斯耶格伦综合征、狼疮、青光眼包括假性剥脱性青光眼、莱伯遗传性视神经病变、和类风湿性关节炎。

在一具体实施方案中，细菌感染是分枝杆菌感染。在另一具体实施方案中，病毒感染是HIV、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。本发明的另一实施方案包括治疗癌症和/或降低其发生率的方法，其特别包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指并诱导帕金连接酶活性的一种或多种化合物。在一具体实施方案中，活化的帕金连接酶抑制一种或多种肿瘤的生长和/或预防一种或多种肿瘤的转移。

在另一实施方案中，癌症可选自以下的一种或多种：急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌症、卡波西肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、儿童胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌、尤文氏肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、类癌瘤、未知原发性胃肠癌、心脏(心)肿瘤、淋巴瘤、原发性、宫颈癌、儿童癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性肿瘤结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、导管原位癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、成感觉神经细胞瘤、尤因肉瘤、颅内生殖细胞肿瘤、外源性生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、骨、恶性和骨肉瘤纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃部(胃)癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质肿瘤、外源性癌症、卵巢癌、睾丸癌、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、脑干癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多症、朗格汉斯细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、卡波西肉瘤、肾癌、肾细胞癌、威尔姆氏瘤和其他儿童肾肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、慢性淋巴细胞癌、慢性骨髓瘤、毛细胞癌、唇部和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(LCIS)、肺癌、非小细胞癌、小细胞癌、淋巴瘤、皮肤T细胞(蕈样真菌病和塞扎里综合征)、霍奇金癌、非霍奇金癌、巨球蛋白血症、瓦尔登斯特伦病、男性乳腺癌、骨和骨肉瘤的恶性纤维性组织细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)癌、梅克尔细胞癌、间皮瘤、恶性肿瘤、具有隐匿性原发性的转移性鳞状细胞癌、中线细胞癌涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/血浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、异型骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、骨髓性白血病、慢性髓样白血病、急性骨髓瘤多发性、慢性骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口腔癌、嘴唇和口咽癌、骨的骨肉瘤和恶性纤维性组织细胞瘤、上皮癌、低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、血浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺炎、原发性中枢神经系统淋巴瘤、直肠癌、肾细胞(肾)癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、尤因癌、卡波西癌、骨肉瘤(骨癌)、软组织癌、子宫癌、塞扎里综合征、皮肤癌、儿童黑色素瘤、梅克尔细胞癌、非黑色素瘤、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、具有隐匿性原发性的儿童鳞状颈癌、转移性癌症、胃部(胃)癌、T细胞淋巴瘤、皮肤癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾脏骨盆和输尿管的过渡细胞癌、未知原发性、儿童癌、儿童不寻常的癌症、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、威尔姆氏瘤和女性癌症。

在一具体实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌和/或前列腺癌。在另一实施方案中，给予帕金连接酶抑制受试者中的一种或多种肿瘤

在另一具体实施方案中，化合物消除受损的线粒体、增加细胞应激期间的细胞活力、减少肿瘤转化和减轻细胞中α-突触核蛋白。

在另一实施方案中，本发明的方法包括治疗帕金森病和/或降低其发生率的方法，其特别是通过向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指并诱导帕金连接酶活性的一种或多种化合物，其中该化合物可与Zn离子配位和/或与半胱氨酸(一个或多个)中的巯基反应。在另一实施方案中，该一种或多种化合物消除受损的线粒体、增加细胞应激期间的细胞活力和/或减轻细胞中α-突触核蛋白。“Somatic Mutations ofthe Parkinson’s disease‐associated gene PARK2 in glioblastoma and other humanmalignancies”(Nature Genetics Jan 2010 42(1)77-82)。

在另一实施方案中，帕金连接酶活化改变泛素化。具体而言，泛素化的改变是由帕金通过共价连接泛素，一种为帕金自身的底物蛋白或另一种蛋白如线粒体融合蛋白1或2、FBW7或其他公开报道的帕金连接酶的底物来修饰底物蛋白的能力引起的。

在一具体实施方案中，本发明的方法包括治疗癌症和/或降低其发生率的方法，其特别包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指并诱导帕金连接酶活性的化合物，其中该化合物可与Zn离子配位和/或与半胱氨酸结合或反应。在一具体实施方案中，该化合物是来自表1或表2或其盐或酯。在一具体实施方案中，帕金连接酶抑制一种或多种肿瘤的生长和/或预防一种或多种肿瘤的转移。在另一实施方案中，该化合物消除受损的线粒体、增加细胞应激期间的细胞活力、减少肿瘤转化和减轻细胞中α-突触核蛋白。在另一实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌或前列腺癌。

在另一实施方案中，用于治疗癌症和/或降低其发生率的化合物可作为单齿、二齿或三齿配体配位至Zn离子。在另一实施方案中，用于治疗癌症和/或降低其发生率的化合物可配位至Zn离子，其基本上破坏了帕金连接酶中至少一个锌指的结构。在另一实施方案中，至少一个锌指的氨基酸残基对应于或对齐于选自以下的一个或多个氨基酸域：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。在另一实施方案中，该化合物基本上破坏位于IBR域(氨基酸328-377)中的至少一个锌指的结构。在另一实施方案中，锌指包含四个半胱氨酸残基。在另一实施方案中，帕金连接酶活化改变泛素化。在另一实施方案中，该化合物与半胱氨酸中的巯基结合或反应。在另一实施方案中，半胱氨酸选自由以下构成组中的一个或多个：人帕金连接酶的C59和C377。在另一实施方案中，半胱氨酸是人帕金连接酶的C377。在另一实施方案中，化合物为AH001和/或AH007。

在另一实施方案中，用于治疗癌症和/或降低其发生率的化合物是烷化剂、氧化剂、迈克尔受体、另一不饱和结构，和/或具有二硫化物。在一具体实施方案中，该化合物也基本上破坏了帕金连接酶中至少一个锌指的结构。在另一实施方案中，至少一个锌指的氨基酸残基对应于或对齐于选自以下的一个或多个氨基酸域：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。在另一实施方案中，锌指包含四个半胱氨酸残基。

在一具体实施方案中，本发明的方法包括治疗帕金森病和/或降低其发生率的方法，其包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指并诱导帕金连接酶活性的化合物，其中该化合物可与Zn离子配位和/或与半胱氨酸结合或反应。在一具体实施方案中，该化合物是来自表1或表2或其盐或酯。在一具体实施方案中，该化合物消除受损的线粒体、增加细胞应激期间的细胞活力和/或减轻细胞中α-突触核蛋白。在另一实施方案中，可配位至锌离子的化合物是单齿、二齿或三齿配体。在另一实施方案中，至少一个锌指的氨基酸残基对应于或对齐于选自以下的一个或多个氨基酸域：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。在另一实施方案中，该化合物基本上破坏位于IBR域(氨基酸328-377)中的至少一个锌指的结构。在另一实施方案中，锌指包含四个半胱氨酸残基。在另一实施方案中，帕金连接酶活化改变泛素化。在另一实施方案中，该化合物与半胱氨酸中的巯基结合或反应。在另一实施方案中，半胱氨酸选自由以下构成组中的一个或多个：人帕金连接酶的C59和C377。在另一实施方案中，半胱氨酸是人帕金连接酶的C377。在另一实施方案中，化合物为AH001和/或AH007。

在另一实施方案中，帕金连接酶活化改变泛素化，其中泛素化的改变是由帕金通过共价连接泛素，一种为帕金自身的底物蛋白或另一种蛋白如线粒体融合蛋白1或2、FBW7或其他公开报道的帕金连接酶的底物来修饰底物蛋白的能力引起的。在一具体实施方案中，化合物诱导帕金连接酶活化。在另一实施方案中，该化合物是来自表1或表2或其盐或酯。在另一实施方案中，该化合物是烷化剂、氧化剂、迈克尔受体、另一不饱和结构，或具有二硫化物。在另一实施方案中，该化合物基本上破坏了帕金连接酶中至少一个锌指的结构。在另一实施方案中，至少一个锌指的氨基酸残基对应于或对齐于选自以下的一个或多个氨基酸域：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。在另一实施方案中，该化合物基本上破坏位于IBR域(氨基酸328-377)中的至少一个锌指的结构。在另一实施方案中，锌指包含四个半胱氨酸残基。在另一实施方案中，帕金连接酶活化改变泛素化。在另一实施方案中，该化合物与半胱氨酸中的巯基结合或反应。在另一实施方案中，半胱氨酸选自由以下构成组中的一个或多个：人帕金连接酶的C59和C377。在另一实施方案中，半胱氨酸是人帕金连接酶的C377。在另一实施方案中，化合物为AH001和/或AH007。

虽然蛋白被建立以满足细胞的结构和生物化学要求，但它们也在不仅仅用作破坏和空间管理目的的高度调节的过程被分解。蛋白具有不同的半衰期，由其它们N-末端存在的氨基酸的性质所决定。有些将会长期存在，而其他将会被快速分解。蛋白水解不仅能够使细胞处理错误折叠或损坏的蛋白，而且可以微调细胞内必需蛋白(例如参与细胞周期的蛋白)的浓度。这种快速/高度特异性的降解可以通过向靶蛋白加入一到数个泛素分子来实现。该过程称为泛素化。

泛素化对于多种生理过程至关重要，包括细胞存活和分化以及先天和适应性免疫。近年来，了解泛素在信号通路中的分子作用以及泛素系统的改变如何导致不同人类疾病的发展已经取得了相当大的进展。已经表明泛素化在癌症、代谢综合征、神经变性疾病、自身免疫、炎症性疾病、感染和肌营养不良症的发病和进展中发挥作用(Popovic等人Nature Medicine 20，1242–1253(2014))。

本发明的一些实施方案涉及治疗、预防或改善一种或多种与(但不限于)实体瘤以及肿瘤中瓦布格效应(恢复帕金活性以预防瓦布格效应)相关的疾病或紊乱的症状的方法，所述实体瘤例如神经胶质瘤(少突神经胶质细胞瘤、混合神经胶质瘤和成胶质细胞瘤)、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌。人类遗传和病理学数据支持帕金蛋白作为高价值靶标。如果没有足够的活化的帕金，则发生多巴胺神经元的细胞死亡和丧失(“Familial ParkinsonDisease Gene Product,Parkin,Is a Ubiquitin‐Protein Ligase”Nature Genetics 25,302-305,2000年7月1日)。

本发明的其它实施方案涉及治疗、预防或改善与神经疾病或紊乱相关的一种或多种症状的方法，所述神经疾病或紊乱包括但不限于阿尔茨海默氏痴呆、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、弗里德赖希共济失调、脊髓小脑性共济失调、多系统萎缩症、PSP、Tau蛋白病、弥散性路易体病、路易体痴呆、任何特征在于α-突触核蛋白异常蓄积的病症、老化过程病症和中风。

本发明的其它实施方案涉及治疗、预防或改善与以下(但不限于)相关的一种或多种症状的方法：智力迟钝、耳聋、失明、糖尿病、肥胖、心血管疾病、和自身免疫疾病例如多发性硬化、斯耶格伦综合征、狼疮、青光眼包括假性剥脱性青光眼、莱伯遗传性视神经病变、和类风湿性关节炎。

本发明的其它实施方案涉及治疗、预防或改善与如下线粒体相关性疾病或胶囊(但不限于)相关的一种或多种症状的方法：

·阿尔珀斯病

·巴氏综合征/LIC(致命性小儿心肌病)

·Β氧化缺陷

·肉碱-酰基-肉碱缺乏

·肉碱缺乏

·肌酸缺陷综合征

·辅酶Q10缺乏

·复合体I缺乏

·复合体II缺乏

·复合体III缺乏

·复合体IV缺乏/COX缺乏

·复合体V缺乏

·CPEO

·CPT I缺乏

·CPT II缺乏

·KSS

·乳酸酸中毒

·LBSL-脑白质营养不良

·LCAD

·LCHAD

·利氏病或利氏综合征

·勒夫特病

·MAD/II型戊二酸尿症

·MCAD

·MELAS

·MERRF

·MIRAS

·线粒体细胞病

·线粒体DNA耗竭

·线粒体脑病

·线粒体肌病

·MNGIE

·NARP

·皮尔森综合征

·丙酮酸羧化酶缺乏

·丙酮酸脱氢酶缺乏

·POLG突变

·呼吸链

·SCAD

·SCHAD

·VLCAD.

增加的帕金活性消除受损的线粒体(红)并增加细胞应激期间的细胞活力、减少肿瘤转化和减轻细胞中α-突触核蛋白。鉴定出多种的从帕金去除锌的帕金活化化合物。ZnF展开后的活化与其他已知的ZnF蛋白相似。

本发明还包括用于活化受试者的帕金连接酶的药物组合物。在一具体实施方案中，该药物组合物包含破坏至少一个帕金连接酶锌指的一种或多种化合物或其盐。在一具体实施方案中，该一种或多种化合物或其盐可与锌离子配位，和/或与半胱氨酸中的至少一个巯基反应。在一具体实施方案中，该药物组合物可包含选自由表1和表2中化合物所构成的组的一种或多种化合物。

在另一实施方案中，本发明中的化合物、方法和药物组合物可来自以下药物类别中的一种或多种：8-羟基喹啉；α-羟基酮；氨基甲基苯并咪唑；氨基甲基吲哚；巴比妥类；苯并异噻唑酮、羧化物、二硫代双苯甲酰胺、二硫代氨基甲酸酯、甲酰胺、酰肼、氧羟肟酸、羟基吡啶酮/羟基吡喃酮、羟基磺酰胺、咪唑、酮水合物、N-酰基邻苯二胺、N-羟基脲、O-取代的氨基膦酸酯(phosphamates)、氨基膦酸酯、膦、氨基磺酸酯、磺酰胺、磺基二亚胺、磺胺类、噻二嗪、噻二唑并硫酮和硫醇。例如，表1中的以下所列是代表性的，但不是可在本发明中使用的潜在化合物的详尽列表。

表1.潜在化合物的实例

表2.潜在化合物的实例

表3.人帕金连接酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)

本发明还涉及用于活化受试者的帕金连接酶的药物制剂，其包含破坏至少一个帕金连接酶锌指的药物的有效剂量，其中该药物或化合物可以配位锌离子，或该药物或化合物可以与半胱氨酸中的巯基反应。

本发明的其它实施方案涉及进一步包含药用赋形剂或辅料的药物制剂。

本发明的方法包括将该组合物给予受试者的任何临床上可接受的给药途径。在各个方面，给药途径是全身性的，例如口服或通过注射。药物或化合物或其药用盐或衍生物经口、经鼻、经皮、经肺、经吸入、经口腔、经舌下、经腹膜内、经皮下、经肌肉内、经静脉内、经直肠、经胸膜内、经鞘内、经门静脉内和经肠胃外给药。或者或另外地，给药途径是局部的，例如局部、肿瘤内和肿瘤周围。在一些实施方案中，口服给药化合物。

在其它实施方案中，本文公开的药物通过静脉内途径给药。在另外的实施方案中，肠胃外给药可以以推注或通过输注提供。

组合物的给药方式部分取决于原因和/或位置。本领域技术人员将认识到某些给药途径的优点。

该方法包括给予有效量的药物或化合物(或包含该药物或化合物的组合物)以实现所需的生物反应，例如，有效缓解、改善或预防待治疗病症例如肿瘤学和神经病学病症的全部或部分症状的量。

在各个方面中，表1和/或表2中所示任一结构式的化合物或其盐或酯的量为约0.001mg/kg至约100mg/kg体重(例如，约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.1mg/kg至约5mg/kg)。

所公开的化合物在药用混合物中的浓度将根据若干因素而变化，包括所给药化合物的剂量、所用化合物(一种或多种)的药代动力学特征和给药途径。药物可以以单一剂量或重复剂量给药。使用本发明化合物的剂量方案根据包括以下的各种因素来选择：患者的类型、物种、年龄、体重、性别和身体状况；待治疗病症的严重程度；给药途径；患者的肾功能和肝功能；以及所使用的特定化合物或其盐。治疗可以每天或更频繁地给予，这取决于多种因素，包括患者的总体健康状况、以及所选化合物(一种或多种)的制剂和给药途径。普通技术的医生或兽医可以容易地确定和处方所需的药物有效量以预防、对抗或阻止病症进展。

本发明的化合物或组合物可以以单一或多个单位剂量形式制造和/或给予。

本发明的其它实施方案涉及包含表1和/或表2中所示任一结构式的化合物和药用载体的组合物，药用载体例如为药用赋形剂、载体、粘合剂和/或稀释剂。

用于制剂和给予本发明所公开化合物的技术可在Remington:the Science andPractice of Pharmacy，第19版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)中找到。

在其它实施方案中，本申请所述的化合物及其药用盐、溶剂合物、水合物和前药与药用载体或稀释剂组合使用在药物制剂中。适当的药用载体包括惰性固体填充剂或稀释剂和无菌水性或有机溶液。任选地，组合物包含一种或多种另外的治疗剂。化合物将以足以在本申请所述的范围内提供所需剂量的量在此类药物组合物中存在。

在某些实施方案中，本发明的组合物可以以其已有确定的使用水平另外包含常规见于药物组合物中的其他辅助成分。因此，例如，组合物可含有附加的、相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可含有用于物理配制本发明组合物的各种剂型的附加物质，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类物质在添加时不应不适当地干扰本发明组合物的组分的生物活性。制剂可经灭菌，如果需要的话，与助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳族物质等混合，其不会与制剂的寡核苷酸有害地相互作用。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种赋形剂。在某些此类实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘石蜡、羟基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物使用已知技术来制备，其包括但不限于混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或压片过程。

另外的实施方案涉及药物制剂，该制剂选自：固体、粉末、液体和凝胶。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物是是液体(例如，悬浮液、酏剂和/或溶液)。在某些此类实施方案中，使用本领域已知的成分制备液体药物组合物，其包括但不限于水、二醇类、油、醇、调味剂、防腐剂和着色剂。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物是是固体(例如，粉末、片剂和/或胶囊)。在某些此类实施方案中，固体药物组合物包含本领域已知的一种或多种成分，其包括但不限于淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物被配制为贮库制剂。某些此类贮库制剂通常比非贮库制剂更为长效。在某些实施方案中，此类制剂通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌内注射来给药。在某些实施方案中，使用适当的聚合或疏水物质(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐来制备贮库制剂。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统可用于制备某些包括包含疏水化合物的那些的药物组合物。在某些实施方案中，使用某些有机溶剂，例如二甲基亚砜。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含共溶剂系统。某些此类共溶剂系统包含例如苄醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相。在某些实施方案中，此类共溶剂系统用于疏水化合物。此共溶剂系统的非限制性实例是VPD共溶剂系统，其是包含3％w/v苄醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80和65％w/v聚乙二醇300的无水乙醇溶液。此类共溶剂系统的比例可以相当地变化而不显著改变其溶解性和毒性特征。此外，共溶剂组分的特性可以变化：例如，可以使用其它表面活性剂代替聚山梨醇酯80；聚乙二醇的分数大小可以变化；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；且其他糖或多糖可代替葡萄糖。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含持续释放系统。此持续释放系统的非限制性实例是固体疏水性聚合物的半透性基质。在某些实施方案中，持续释放系统根据其化学性质可能会经数小时、数天、数周或数月释放药物。

在某些实施方案中，制备本发明的药物组合物用于口服给药。在某些此类实施方案中，药物组合物通过组合一种或多种药物和药用载体来配制。某些此类载体使得药物组合物能被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于受试者的口服摄取。适当的赋形剂包括但不限于填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施方案中，任选地研磨此混合物并任选地加入助剂。在某些实施方案中，形成药物组合物以获得片剂或糖衣丸芯。在某些实施方案中，加入崩解剂(例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸盐或其盐，例如藻酸钠)。

在某些实施方案中，糖衣丸芯伴随包衣提供。在某些此类实施方案中，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以添加到片剂或糖衣丸包衣中。

在某些实施方案中，用于口服给药的药物组合物是由明胶制成的推入-配合胶囊。某些此类推入-配合胶囊包含一种或多种本发明的药物，其与一种或多种填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合。在某些实施方案中，用于口服给药的药物组合物是由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的软的密封胶囊。在某些软胶囊中，本发明的一种或多种药物可溶解或悬浮在适当的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于口腔给药。某些此类药物组合物是以常规方式配制的片剂或锭剂。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于通过注射(例如静脉内、皮下、肌肉内等)给药。在某些此类实施方案中，药物组合物包含载体并且配制在水溶液中，例如水或生理相容的缓冲液，例如汉克溶液，林格溶液或生理盐水缓冲液。在某些实施方案中，包括其他成分(例如，有助于溶解或用作防腐剂的成分)。在某些实施方案中，使用适当的液体载体、悬浮剂等制备可注射悬浮液。用于注射的某些药物组合物以单位剂量形式存在在例如安瓿或多剂量容器中。某些用于注射的药物组合物是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂，例如助悬剂，稳定剂和/或分散剂。适用于用于注射的药物组合物中的某些溶剂包括但不限于亲脂性溶剂和脂肪油，例如芝麻油、合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，以及脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，此类悬浮液还可以含有增加药物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的适当的稳定剂或试剂。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于经粘膜给药。在某些此类实施方案中，在制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于通过吸入给药。某些此类用于吸入的药物组合物以气雾剂喷雾的形式在加压包装或雾化器中制备。某些此类药物组合物包括推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。在使用加压气溶胶的某些实施方案中，剂量单位可以用递送计量量的阀来确定。在某些实施方案中，可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒。某些此类制剂包含本发明的药物和诸如乳糖或淀粉的适当的粉末基质的粉末混合物。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于直肠给药，例如栓剂或保留灌肠。某些此类药物组合物包含已知的成分，例如可可脂和/或其它甘油酯。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于局部给药。某些此类药物组合物包含温和的保湿基质，例如软膏或霜剂。示例性的适当的软膏基质包括但不限于凡士林、凡士林加挥发性硅酮、以及羊毛脂和油包水乳液。示例性的适当的乳膏基质包括但不限于冷霜和亲水性软膏。

在某些实施方案中，治疗有效量足以预防、缓解或改善疾病症状或延长被治疗受试者的生存。治疗有效量的确定是在本领域技术人员的能力之内。

在某些实施方案中，将本发明的一种或多种化合物配制为前药。在某些实施方案中，体内给药时，前药在化学上被转化为生物学上、药学上或治疗上更有活性的形式。在某些实施方案中，前药是有用的，因为它们比相应的活性形式更容易施用。例如，在某些情况下，前药可以比相应的活性形式更具生物利用度(例如通过口服给药)。在某些情况下，与相应的活性形式相比，前药可具有改善的溶解性。在某些实施方案中，前药比相应的活性形式水溶性更低。在某些情况下，此类前药具有优异的跨细胞膜传输，其中水溶性对移动性有害。在某些实施方案中，前药是酯。在某些此类实施方案中，酯在给药时被代谢水解成羧酸。在某些情况下，含羧酸化合物是相应的活性形式。在某些实施方案中，前药包括与酸基结合的短肽(聚氨基酸)。在某些此类实施方案中，肽在给药时被切割以形成相应的活性形式。

在某些实施方案中，通过改变药学活性化合物来产生前药，使得活性化合物在体内给药时将被再生。前药可以被设计成改变药物的代谢稳定性或运输特性，以掩盖副作用或毒性、以改善药物的风味或改变药物的其它特征或性质。由于知晓药效学过程和药物体内代谢，一旦药学活性化合物是已知的，则本领域技术人员可以设计该化合物的前药(参见例如，Nogrady(1985)Medicinal ChemistryA Biochemical Approach，Oxford UniversityPress，New York，388-392页)。

现已总体上描述了本发明，通过参考以下以实例说明提供的实施例将更容易理解本发明，且其而无意于限制本发明。

实施例

实施例1:帕金活化剂的鉴定

测定原理：

测定基于活性基探针(ABP)与酶中活性位点半胱氨酸的不可逆反应。ABP由在N末端具有表位标记(例如HAtag)的泛素部分和C末端的反应性基团组成。帕金-RBR(不包括R0抑制域)的活性显著高于帕金-R0RBR的活性或全长帕金的活性。ABP对帕金的共价结合可以通过时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)来监测

-帕金-R0RBR、全长帕金→低TR-FRET信号(阴性对照)

-帕金RBR→高TR-FRET信号(阳性对照)

增加帕金-R0RBR活性或增加全长-帕金活性的化合物可以通过TR-FRET信号的增加来识别。

策略：使用帕金-R0RBR、全长帕金和帕金-RBR的N末端His-SUMO标记的构建体(来自Evotec Slides；基于Riley等人2013.Nat Commun.4:1982和由E3x Bio提供的信息；授予申请)

构建体：

–如通过Riley等人所述在大肠杆菌中表达具有N末端His₆-SUMO-标记(可在使用SENP1蛋白酶纯化期间潜在地除去)的全长帕金(1-465)、R0RBR(141-465)和RBR(238-465)。

-N末端His₆-标记使得能够进行TR-FRET测定→使用仍具有N末端His₆-SUMO-标记的纯化蛋白。

-对所有构建体进行小规模测试以评估全长帕金或R0RBR中的哪种构建体得到更好的产出以促进HTS测定。

阶段1：蛋白产生

–通过第三方初始基因合成具有N末端His₆-SUMO、His₆-SUMO-R0RBR和His₆-SUMO-RBR的全长帕金，密码子优化用于在大肠杆菌中表达以及亚克隆到适当的表达载体中

-通过免疫印迹(Western Blotting)评估小规模测试表达以估计可溶性蛋白的产量

-如Riley等人的概述，以6-24L的规模(取决于小规模测试表达的结果)将RBR构建体以及全长帕金结构体或R0RBR构建体转化到BL21(DE3)中并表达

-如Riley等人*所述纯化～10mg RBR构建体以及全长帕金构建体或或R0RBR构建体，即IMAC、MonoQ和尺寸排阻。

阶段2：测定开发

-目标：在1,536孔测定板格式中设置稳健的初步筛选测定

-以384孔格式建立具有合理动态范围的测定(例如使用帕金+/-R0抑制域)

-优化测定(例如，关于测定组分的浓度、缓冲液、添加剂、试剂的加入顺序和培养温度)

-运行时间进程实验以定义最佳培养时间

-论证测定稳健性(目标：Z’>0.5)

-论证读数稳定性

-测试DMSO耐受

-通过Ub滴定(与ABP竞争)论证使用帕金RBR域(不包括R0抑制域)获得的测定信号的特异性

-将测定从384孔转移至最终的1,536孔筛选板格式；使测定适应EVOscreen^TM MarkIII HTS平台

-如果需要，微调测定条件以优化此高密度板格式(目标：Z’>0.5)的测定稳健性，并论证测定适用于高通量筛选(HTS)

-在筛选条件下确认测定试剂的经时稳定性

-论证板对板和日对日测定稳健性

-估计和获得筛选和命中分析(hit profiling)所需的所有测定试剂的量。

阶段3：筛选

标记库筛选(MLS)：

-以一式三份的两种浓度预筛针对初筛测定的约2.5k种代表性的先导(lead-like)化合物的不同标记库

-使用3-σ方法(基于板的、基于无化合物DMSO孔的散射)的MLS和命中定义的统计分析

-选择初筛的最佳化合物浓度

初筛(PS):

-在一个均匀化合物浓度(n＝1)筛选针对初筛测定的约75,000种先导化合物；重新筛选不符合约定的重新筛选标准(例如Z’>0.5)的化合物板

-使用3-σ方法(基于板的、基于无化合物DMSO孔的散射)的初筛的命中定义

-统计分析初筛→初级命中化合物(帕金活化剂)

命中确认(HC)：

-选择一组最多约750个初级命中用于命中确认

-随意选取选定的化合物并重新格式化用于测试

-在化合物筛选浓度对针对初筛所选的cpds进行重新测试(n＝3)

-命中确认活动的统计分析→识别确认的小分子帕金活化剂。

阶段4：命中分析(HP):

-选择一组最多约250个确认的命中化合物用于命中分析

-随意选取选定的化合物并重新格式化用于浓度响应测试

-浓度响应测试为针对初筛测试的11点化合物连续稀释(n＝2)

-浓度响应曲线的自动数据拟合和所得IC50值的计算

-LC/MS检查命中化合物以确认化合物同一性和纯度

-活性命中化合物的结构-活性关系分析(SAR)

-经确认和剖析的小分子帕金活化剂

实施例2:使用泛素乙烯砜探针的基于活性的探针测定

可以使用不可逆地结合帕金连接酶的活性位点半胱氨酸的泛素乙烯砜探针。通过TR-FRET可以监测探针与帕金的共价结合。候选活化剂化合物可以通过归因于TR-FRET信号增加的帕金连接酶活性的增加来识别。活化化合物的筛选可以与对照区别如下：

100％活化信号＝热活化的帕金+DMSO中的100nM对照活化剂。0％活化信号＝热活化的帕金+仅DMSO。可以通过0％活化信号TR-FRET信号的增加来识别帕金活化剂。

测定条件：

材料：

测定板: 白色384孔板(Corning 3572)

酶: 帕金-His标记的203μM(10.5mg/ml)

探针: 泛素乙烯砜(HA-Ub-VS Boston Biochem U-212)

DMSO: DMSO(Sigma批号#D4540-100ML)

反应缓冲液: 50mM HEPES(pH 8.5)、150mM NaCl、0.01％吐温20、0.1％BSA

检测缓冲液: 50mM HEPES(pH 8.5)、150mM NaCl、0.01％吐温20、0.1％BSA、800mM KF

检测试剂A: 检测缓冲液中的2.6nM抗6HIS-Eu穴状化合物和40nM抗HA-XL665

Eu穴状化合物:抗6HIS-Eu穴状化合物(CisBio 61HISKLA)

XL665: 抗HA-XL665(CisBio 610HAXLA)

酶反应(仅采用活化剂预培养帕金15分钟)

帕金: 40nM

HA-Ub-VS探针:70nM

活化剂/DMSO: 2X活化剂候选物/2％DMSO

反应时间: 60分钟

温度: 22℃

总体积: 10μl反应混合物

检测反应

取10μl上述酶反应混合物并加入10μl检测试剂A，条件如下：

反应时间: 60分钟

温度: 22℃

总体积: 20μl

测定操作：

1)在酶反应缓冲液中热活化帕金(500μl/1.5ml管:EppendorfThermomixer 5分钟，在58℃400rpm并放在冰上直至需要)。

2)通过使用Bravo，采用反应缓冲液中的4.8μl 84.5nM帕金装载测定板孔。

3)通过使用HP D-300化合物分配器在DMSO中递送0.2μl 200X活化剂候选。最高200X浓度＝20μm，然后两倍稀释。

4)室温旋转1000rpm，2分钟

5)室温孵育板15分钟

6)通过使用Bravo加入反应缓冲液中的5μl 140nM HA-Ub-VS探针。

7)室温旋转1000rpm，2分钟

8)室温孵育板60分钟

9)加入检测缓冲液中的10μl 2.6nM抗6HIS-Eu穴状化合物和40nM抗HA-XL665。

10)室温旋转1000rpm，2分钟

11)室温孵育板60分钟

12)在Perkin Elmer Envision仪器上读板。

数据分析：数据可在CSV文件中读取。这些CSV文件中有两个表，分别是655nm(通道1)和615nm(通道2)波长的值。将数据转换为HTRF比率＝(通道1/通道2)*10,000

所有0uM对照(仅DMSO)的均值＝BKGD(背景–0％活化)。从每个HTRF比值减去BKGD＝HTRF-BKGD。DMSO对照中所有100uM 100nM对照活化剂的均值＝Max(100％活化)。然后使用以下方程式以计算如下的每个孔/候选物的活化％：活化％＝(HTRF-BKGD/Max)*100。

然后可以使用化合物滴定的活化％来发现活化EC50或最高活化％，如果对于候选化合物看到小于75％活化的话。

实施例3:采用候选亲电体和螯合剂化合物的基于活性的探针测定

如以上实施例2中所述采用表1和/或表2中的各种化合物进行基于活性的探针测定。至少两种化合物表明增加的帕金与基于活性的探针泛素-乙烯砜的活性。如图1中证实的，化合物N,N'-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺，一种螯合剂化合物(AH001)，其增加了帕金连接酶与基于活性的泛素乙烯砜探针的反应。

类似地，如图2中所示，6-苄基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇，一种亲电体和螯合剂化合物(AH007)，其增加了帕金连接酶与基于活性的泛素乙烯砜探针的反应。该实施例表明螯合剂和亲电体二者都可以调节和/或增加帕金连接酶活性。

实施例4:帕金pUB自动泛素化测定

使用帕金pUB自动泛素化测定以评估候选化合物活化帕金自动泛素化自身的能力的潜力。

该测定的原理是E3连接酶帕金催化泛素转移到靶蛋白，但也具有自动泛素化自身的能力。添加到该测定中的磷酸泛素(pUb)将帕金改变为小分子活化剂可以通过E1-E2级联反应使得帕金能够自动泛素化的状态。使用结合His标记的帕金的Eu穴状化合物泛素和抗6His-d2将在当Eu穴状化合物泛素自动泛素化至帕金上时产生信号，其可通过TR-FRET监测。

类似于实施例2和3中基于活性的探针测定，活化化合物的筛选可以与对照区别如下：

100％活化信＝pUb活化的帕金+DMSO中的40nM对照活化剂。

0％活化信号＝pUb活化的帕金+仅DMSO。

可以通过0％活化信号TR-FRET信号的增加来识别帕金活化剂。

材料:

测定板: 白色384孔板(Corning 3572)

酶1: 5μM E1(泛素-活化酶/UBE1 Boston Biochem E-305)

酶2: 25μM E2(UBcH7/Ube2L3 Boston Biochem E2-640)

酶3: 帕金-His标记的203μM(10.5mg/ml)，由An2H供应

pUb: 230μM(2mg/ml)磷酸泛素(S65)(Boston Biochem U-102)，由An2H供应。

Eu穴状化合物试剂:1.77μM泛素Eu(CisBio 61UBIKLA)，采用250μl蒸馏水重构。

DMSO: DMSO(Sigma批号#D4540-100ML)

PF-127: Pluronic F-127(Fisher Scientific 50-310-494)

反应缓冲液: 50mM HEPES、50mM NaCl、1mM MgCl2、0.005％吐温20、0.1％PF-127，pH 8.5

检测缓冲液: 50mM HEPES、50mM NaCl、800mM KF、5mMEDTA、0.005％吐温20、0.1％PF-127，pH 8.5

检测试剂Z: 检测缓冲液中的13.4nM抗6His-d2

d2试剂: 2.67μM抗6His-d2(CisBio 61HISDLA)，采用250μl蒸馏水重构。

测定条件：

10μl酶反应(仅预孵育帕金、pUb和活化剂15分钟)

帕金: 196nM

pUb: 392nM

活化剂/DMSO:1X活化剂/1％DMSO

E1: 5nM

E2: 50nM

泛素Eu: 8.8nM

反应时间: 120分钟

温度: 22℃

总体积: 10μl反应混合物

检测反应

取10μl上述酶反应混合物并加入10μl检测试剂Z，在以下条件下：

反应时间: 60分钟

温度: 22℃

总体积: 20μl

测定操作：

1)通过使用Bravo，采用反应缓冲液中的4.9μl 400.0nM帕金装载测定板孔。

2)通过使用HP D-300化合物分配器在DMSO中递送0.1μl 100X活化剂候选。最高100X浓度＝100μm，然后两倍稀释。在一式两份的孔中加入各化合物和对照。

3)室温旋转1000rpm，2分钟

4)室温孵育板15分钟

5)通过使用Bravo加入反应缓冲液中的5μl 10nM E1、100nM E2、17.6nM泛素Eu和2mM ATP。

6)室温旋转1000rpm，2分钟

7)室温孵育板120分钟

8)通过使用Bravo加入检测缓冲液中的10μl 13.4nM抗his d2。

9)室温旋转1000rpm，2分钟

10)室温孵育板60分钟

11)在Perkin Elmer Envision仪器上读板。

所有0uM对照(仅DMSO)的均值＝BKGD(背景–0％活化)。从每个HTRF比值减去BKGD＝HTRF-BKGD。DMSO对照中所有100uM对照活化剂的均值＝Max(100％活化)。然后使用以下方程式以计算如下的每个孔/候选物的活化％：活化％＝(HTRF-BKGD/Max)*100。

实施例5:采用候选亲电体和螯合剂化合物的帕金pUB自动泛素化测定

如以上实施例4中所述采用表1和/或表2中的各种化合物进行帕金pUB自动泛素化测定。至少两种化合物表明增加的帕金与基于活性的探针泛素-乙烯砜的活性。如图3中证实的，化合物N,N'-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺，一种螯合剂化合物(AH001)，其增加了自动泛素化测定中的帕金活性。此外，如图4A中所示，N,N'-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺(AH001)在自动泛素化测定中与pUB协同增加帕金活化。

类似地，如图5中所示，6-苄基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇，一种亲电体化合物(AH007)，其增加了自动泛素化测定中的帕金活性。该实施例表明螯合剂和亲电体二者都可以调节和/或增加自动泛素化测定中的帕金连接酶活性。

实施例6:残基C59和C377对于调节剂结合至帕金是关键的

用AH007化合物培养帕金连接酶，然后在蛋白水解消化以产生帕金连接酶片段后将混合物进行串联质谱分析。目的是识别含有结合AH007化合物的帕金的特异性片段，其揭示了帕金对该化合物的特异性结合残基。当通过质谱分析时，化合物An2H07也是片段化的。因此，也可以识别连接在帕金的特定残基上的化合物AH007的特征片。

这些片段的特征在于指示AH007预测分子量的结合小分子的片段大小的变化。质谱数据在帕金连接酶的两个特定残基上识别了AH007的三个特异性片段。该数据识别了连接于帕金连接酶的半胱氨酸残基377(C377)的AH007化合物的253.08-256.09片段和连接于C377的AH007化合物的343.14-346.14的片段。数据还识别了连接于帕金连接酶的半胱氨酸残基59(C59)的AH007化合物的253.08-256.09片段。因此，采用AH007化合物培养的帕金连接酶的质谱数据表明该化合物结合和/或连接至帕金连接酶中的两个特异性位点：C59和C377。残基C59和C377是观察到的唯一两个一致的位点，即使在与帕金连接酶的混合物中AH007化合物的浓度急剧增加时，这提示这些位点在多个其它潜在连接位点之上的特异性。还认为，至少C377包含在人帕金连接酶的ZnF域中，且因此符合柔性帕金连接酶ZnF域中的半胱氨酸残基易于被小分子候选物连接和/或中断的理论。包含C59和/或C377的帕金的肽片段将有用于设计进一步的结合测定和另外的调节剂的选择。

本申请所讨论的出版物仅仅是针对其在本申请申请日之前的公开内容而提供。本申请不得被解释为承认本发明无法凭借在先发明而先于该出版物。

虽然已结合本发明提出的具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，能够进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖本发明的任何变化、使用或改编，一般而言，其遵循本发明的原理并且包括如本发明所属领域内已知或习惯的实践范围内的以及如可以应用于上文所阐述的基本特征的以及如所附权利要求的范围中遵循的本公开内容的偏离。

序列表

<110> An2H探索有限公司

Johnston, Jennifer

<120> 帕金连接酶活化方法和组合物

<130> ANDI-001/03US 323223-2006

<150> US 62/237,400

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<150> US 62/222,008

<151> 2015-09-22

<150> US 62/087,972

<151> 2014-12-05

<160> 1

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 465

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Met Ile Val Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu

1 5 10 15

Val Asp Ser Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys

20 25 30

Arg Gln Gly Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Glu Leu Arg Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln

50 55 60

Ser Ile Val His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met

65 70 75 80

Asn Ala Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu

85 90 95

Arg Glu Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu

100 105 110

Pro Gly Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg

115 120 125

Lys Asp Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn

130 135 140

Ser Phe Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Lys Leu Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu

165 170 175

Thr Gln Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met

180 185 190

Ser Gly Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe

195 200 205

Phe Phe Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val

210 215 220

Ala Leu His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr

225 230 235 240

Cys Thr Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg

245 250 255

His Val Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu

260 265 270

Asn Asp Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro

275 280 285

Cys Val Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe

290 295 300

Arg Ile Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala

305 310 315 320

Glu Glu Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly

325 330 335

Cys Gly Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys

340 345 350

Glu Gly Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys

355 360 365

Lys Glu Ala Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser

370 375 380

Gly Thr Thr Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln

385 390 395 400

Ala Arg Trp Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys

405 410 415

Pro Cys Pro Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met

420 425 430

His Met Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn

435 440 445

Cys Gly Cys Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp

450 455 460

Val

465

Claims

1.活化帕金连接酶的方法，其包括向有此需求的受试者给予治疗有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指的化合物，其中所述化合物可与锌离子配位，和/或与半胱氨酸结合或反应。

2.权利要求1所述的方法，其中所述活化的帕金连接酶抑制一种或多种肿瘤的生长和/或预防一种或多种肿瘤的转移。

3.权利要求1所述的方法，其中所述活化的帕金连接酶提供多巴胺神经元保护。

4.权利要求2所述的方法，其中所述化合物具有选自以下的一种或多种功能：消除受损的线粒体、增加细胞应激期间的细胞活力、减少肿瘤转化和减轻细胞中α-突触核蛋白。

5.权利要求2所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有癌症。

6.权利要求5所述的方法，其中所述癌症是成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌或前列腺癌。

7.权利要求3所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有神经变性疾病。

8.权利要求7所述的方法，其中所述神经变性疾病是帕金森病、痴呆、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和亨廷顿病。

9.权利要求8所述的方法，其中所述痴呆是路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩症(MSA)或进行性核上性麻痹(PSP)。

10.权利要求1所述的方法，其中所述可与锌离子配位的化合物是单齿、二齿或三齿配体。

11.权利要求10所述的方法，其中所述可与锌离子配位的化合物基本上破坏帕金连接酶中至少一个锌指的结构。

12.权利要求11所述的方法，其中所述至少一个锌指的氨基酸残基对应于选自以下的一个或多个域或与其对齐：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。

13.权利要求12所述的方法，其中所述至少一个锌指包含四个半胱氨酸残基。

14.权利要求1所述的方法，其中帕金连接酶活化改变泛素化。

15.权利要求1所述的方法，其中所述化合物是烷化剂、氧化剂、迈克尔受体、另一不饱和结构和/或具有二硫化物。

16.权利要求15所述的方法，其中所述化合物基本上破坏所述帕金连接酶中至少一个锌指的结构。

17.权利要求16所述的方法，其中所述至少一个锌指的氨基酸残基对应于选自以下的一个或多个域或与其对齐：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。

18.权利要求17所述的方法，其中所述锌指包含四个半胱氨酸残基。

19.权利要求1所述的方法，其中活化所述帕金连接酶治疗选自以下的一种或多种疾病或疾患或降低其发生率：阿尔茨海默氏痴呆、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、弗里德赖希共济失调、脊髓小脑性共济失调、多系统萎缩症、PSP、Tau蛋白病、弥散性路易体病、路易体痴呆、任何特征在于α-突触核蛋白异常蓄积的病症、老化过程病症、中风、细菌感染、病毒感染、线粒体相关性疾病、智力迟钝、耳聋、失明、糖尿病、肥胖、心血管疾病、多发性硬化、斯耶格伦综合征、狼疮、青光眼包括假性剥脱性青光眼、莱伯遗传性视神经病变和类风湿性关节炎。

20.权利要求19所述的方法，其中所述细菌感染是分枝杆菌感染。

21.权利要求19所述的方法，其中所述病毒感染是丙型肝炎感染。

22.权利要求19所述的方法，其中所述线粒体相关性疾病选自以下的一种或多种：阿尔珀斯病、巴氏综合征/LIC(致命性小儿心肌病)、β氧化缺陷、肉碱-酰基-肉碱缺乏、肉碱缺乏、肌酸缺陷综合征、辅酶Q10缺乏、复合体I缺乏、复合体II缺乏、复合体III缺乏、复合体IV缺乏/COX缺乏、复合体V缺乏、CPEO、CPT I缺乏、CPT II缺乏、KSS、乳酸酸中毒、LBSL–脑白质营养不良、LCAD、LCHAD、利氏病或利氏综合征、勒夫特病、MAD/II型戊二酸尿症、MCAD、MELAS、MERRF、MIRAS、线粒体细胞病、线粒体DNA耗竭、线粒体脑病、线粒体肌病、MNGIE、NARP、皮尔森综合征、丙酮酸羧化酶缺乏、丙酮酸脱氢酶缺乏、POLG突变、呼吸链相关性疾病、SCAD、SCHAD和VLCAD。

23.用于活化受试者的帕金连接酶的药物组合物，其包含有效量的破坏至少一个帕金连接酶锌指的化合物或其盐，和药用载体；

其中所述化合物或其盐可配位锌离子，和/或与半胱氨酸结合或反应。

24.权利要求23所述的药物组合物，其中所述药物组合物是在选自以下的制剂中：固体、粉末、液体或凝胶。

25.权利要求23所述的药物组合物，其中所述化合物选自：表1、表2的化合物、AH001和/或AH007。

26.权利要求1所述的方法，其中所述化合物与半胱氨酸中的巯基结合或反应。

27.权利要求1所述的方法，其中所述半胱氨酸选自以下的一种或多种：人帕金连接酶的C59和C377。

28.权利要求1所述的方法，其中所述半胱氨酸是人帕金连接酶的C377。

29.权利要求1所述的方法，其中所述化合物是，

或其药用盐。

30.权利要求16所述的方法，其中所述至少一个锌指的氨基酸残基对应于选自以下的一种或多种氨基酸或与其对齐：人帕金连接酶的C59和C377。

31.权利要求16所述的方法，其中所述至少一个锌指的氨基酸残基对应于人帕金连接酶的C377或与其对齐。

32.权利要求17所述的方法，其中所述化合物基本上破坏位于IBR域(氨基酸328-377)中的至少一个锌指的结构。

33.活化帕金连接酶的方法，其包括向有此需求的受试者给予与磷酸泛素(pUB)在活化所述帕金连接酶中协同作用的化合物。

34.权利要求33所述的方法，其中所述治疗有效量的化合物破坏至少一个帕金连接酶锌指，其中所述化合物可与锌离子配位，和/或与半胱氨酸结合或反应。

35.权利要求33所述的方法，其中所述化合物基本上破坏帕金连接酶中至少一个锌指的结构。

36.权利要求35所述的方法，其中所述至少一个锌指的氨基酸残基对应于选自以下的一个或多个域或与其对齐：人帕金连接酶的R0氨基酸141-216、IBR氨基酸328-377和R2氨基酸415-465。

37.权利要求36所述的方法，其中所述化合物基本上破坏位于IBR域(氨基酸328-377)中的至少一个锌指的结构。