KR102091336B1

KR102091336B1 - 펩타이드 디포밀라아제 활성 저해용 화합물 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR102091336B1
Application number: KR1020180131184A
Authority: KR
Inventors: 강린우
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2020-03-19

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로서, 상기 화합물은 PDF(peptide deformylase)의 저해 활성을 가지고 있어 병원성 그람음성균 및 그람양성균에 대한 항균 활성을 가지며, 특히, 항생제 내성 균주에 대한 항균 활성을 가지고 있어, 병원성 세균에 의한 감염성 질환을 개선, 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

펩타이드 디포밀라아제 활성 저해용 화합물 및 이를 포함하는 조성물{Compound for inhibiting peptide deformylase and composition containing the same}

본 발명은 신규 펩타이드 디포밀라아제 활성 저해용 화합물; 상기 화합물의 제조방법; 상기 화합물을 포함하는 항균용 조성물; 및 병원성 세균에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

다제내성 세균의 등장은 세계적으로 급격히 증가되고 확산되고 있다 (Nature reviews Genetics 2003, 4(6):432-441). 이에 제약 회사에서는 수십년 전부터 신규 항생제의 개발에 천문학적인 비용과 시간을 투자하고 있고, 특히, 항생제 내성 균주인 슈퍼버그의 약물-저항 메커니즘을 회피하는데 초점을 맞추고 있다 (Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 2010, 74(3):417-433; 및 Journal of health economics 2003, 22(2):151-185). 그람-음성균인 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)와 그람-양성균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 슈퍼버그는 병원감염을 일으키는 치명적인 세균으로서, 이의 독소(pathogen)는 높은 비율로 변이를 일으켜 항생제 내성을 만들고 인간의 면역 방어를 매우 지속적으로 회피하고 있다. 그런데, 항생제는 부족해지고 새로운 항생제는 개발되지 않고 있다. 따라서, 새로운 작동 모드를 가진 항생제의 개발을 위해 새로운 항균 타겟이 필요한 실정이다.

펩타이드 디포밀라아제(peptide deformylase, PDF)는 새롭게 합성된 폴리펩타이드의 N-말단 메티오닌에서 포밀 그룹을 제거한다. PDF의 디포밀화 활성은 세균에서 최종 단백질(mature protein)을 생산하는데 중요하고 (Journal of bacteriology 1993, 175(23):7737-7740), 이러한 이유에서 PDF는 항생제 개발을 위한 중요한 타겟으로 알려져 있다 (Journal of bacteriology 1989, 171(7):4071-4072; 및 Journal of bacteriology 1989, 171(9):5215-5217). PDF는 보통 모노머 형태로 작용하고, Fe²⁺, Co²⁺ 또는 Ni²⁺와 같은 2가 금속 양이온과 함께 가수분해 활성을 가진다 (Journal of bacteriology 1989, 171(9):5215-5217; Biochemistry 1990, 29(24):5647-5659; Biochem Biophys Res Commun 1998, 246(2):342-346; J Mol Biol 1998, 280(3):515-523; Biochemistry 2000, 39(4):779-790; 및 Expert Opin Ther Targets 2001, 5(1):23-40). 3차원 구조에서 motif 1 (GΦGΦAAXQ), motif 2 (EGCΦS) 및 motif 3 (HEΦDH)은 매우 잘 보존되어 있고 금속 이온과 함께 기질 결합 포켓을 둘러싸고 있다 (J Mol Biol 1997, 266(5):939-949). 상기 motif에서 Φ은 소수성 아미노산이고, X는 모든 아미노산을 의미한다.

세균의 PDF는 class I과 class II로 분류될 수 있다 (Parasitology today 2000, 16(4):165-168). 그람-음성균의 PDF (class I)는 서로 ~30%의 서열 상동성을 가지고 있다. 그람-양성균의 PDF (class II)는 class I 보다 적은 ~15%의 서열 상동성을 가지고 있다. class II PDF의 절반 정도는 class II-특이적인 삽입이 존재한다: motif 1의 업스트림에 α-helix가 삽입되어 있고, motif 3의 앞 쪽에는 세 개의 아미노산이 삽입되어 있다 (The Journal of biological chemistry 2002, 277(34):31163-31171). 각 class는 type a와 type b로 더 분류될 수 있다. class I의 두 type은 완전히 일치된 motif을 가지고 있다. 각 type의 다양성은 C-말단 구조와 CD loop의 길이에 존재한다. class I type a PDF (PDF-Ia)는 C-말단에 α-helix를 가지고 있고, 반면, class I type b PDF (PDF-Ib)은 β-strand로 접힌 C-말단을 가지고 있다 (Cellular and molecular life sciences : CMLS 2004, 61(12):1455-1474). CD loop의 경우, PDF-Ib는 PDF-Ia의 것보다 긴 CD loop를 가지고 있다. CD loop는 리간드 결합에 따라 구조적 변경을 보인다 (Journal of agricultural and food chemistry 2016, 64(39):7307-7314). class II PDF의 경우, class II type a PDF (PDF-IIa)는 보존된 motif 2 및 motif 3에서 변이가 존재하고, 이는 금속 이온이 결합하는데 중요하며 (Microbiology 2010, 156(Pt 10):3194-3202), 촉매 활성을 잃을 수 있다 (FEBS letters 1996, 385(1-2):91-95). Class II type b PDF (PDF-IIb)는 다른 class나 type에 비해 많은 연구가 이루어지지 않았다.

모든 PDF에서는 액티노닌(actinonin)이라고 불리는 천연 화합물이 매우 효과적인 억제 활성을 보인다 (Biochemistry 2000, 39(6):1256-1262). 액티노닌은 PDF의 기질인 포밀-메티오닌-폴리펩타이드(formyl-met-polypeptide)와 유사하게 생긴 슈도-트리펩타이드 하이록사메이트 유도체(pseudo-tripeptide hydroxamate derivative)이다 (Nature 1962, 195:701-702). 대부분의 PDF 저해제는 액티노닌의 기본 구조를 바탕으로 개발되었다. 그런데, 약 20년 이상 PDF 저해제에 대한 연구를 통해 개발된 많은 저해제들 중에서 임상 단계에 들어간 것을 단지 3개의 저해제뿐이다 (Current medicinal chemistry 2015, 22(2):214-236). 많은 수의 효과적인 PDF 저해제를 생산하지 못하는 이유 중 하나는 디자인 전략으로 제시된 다양한 연구가 있으나 (Scientific reports 2017, 7:39365; Journal of medicinal chemistry 2007, 50(1):10-20; 및 Journal of molecular biology 2002, 320(5):951-962), 모든 세균의 PDF class 및 type에 대한 데이터를 집합적으로 분석한 데이터가 없다는 것이다. 또한, PDF-Ib에 대한 많은 연구가 없는 실정이다 (Journal of molecular biology 2004, 339(1):207-215).

한국등록특허 제10-1284675호

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 유기 용매 존재 하에 화학식 2의 페닐알라닌 벤질 에스터 p-톨루엔설포네이트와 화학식 3의 O-벤질-하이드록실아민 하이드로클로라이드를 반응시켜 화학식 4의 화합물을 생성하는 단계; 및 (b) 유기 용매 존재 하에 상기 화합식 4의 화합물에 활성탄 담체의 팔라듐을 첨가한 후 여과시켜 화학식 1의 화합물을 생성하는 단계;를 포함하는 제 1 항의 신규 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환의 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 (a) 유기 용매 존재 하에 화학식 2의 페닐알라닌 벤질 에스터 p-톨루엔설포네이트와 화학식 3의 O-벤질-하이드록실아민 하이드로클로라이드를 반응시켜 화학식 4의 화합물을 생성하는 단계; 및 (b) 유기 용매 존재 하에 상기 화합식 4의 화합물에 활성탄 담체의 팔라듐을 첨가한 후 여과시켜 화학식 1의 화합물을 생성하는 단계;를 포함하는 제 1 항의 신규 화합물의 제조 방법을 제공한다.

[반응식 1]

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 유기 용매는 디클로로메탄이고, 상기 (b) 단계의 유기 용매는 메탄올인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는 카르보닐디이미다졸 및 트리에틸아민을 추가적으로 더 포함하여 반응시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 항생제 내성 균주에 대한 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 병원성 그람음성균 또는 병원성 그람양성균에 대한 항균 활성을 가지는 것일 수 있고, 상기 병원성 그람음성균은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 나이세리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 쉬겔라(Shigella), 살모넬라 티피머리움(Salmonella typhimurium) 또는 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)인 것일 수 있고, 상기 병원성 그람양성균은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 반코마이신-내성 엔테로코커스(Vancomycin-resistant Enterococcus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 또는 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 PDF(peptide deformylase) 활성을 저해하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환의 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 신규 화합물은 PDF(peptide deformylase)의 저해 활성을 가지고 있어 병원성 그람음성균 및 그람양성균에 대한 항균 활성을 가지며, 특히, 항생제 내성 균주에 대한 항균 활성을 가지고 있어, 병원성 세균에 의한 감염성 질환을 개선, 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 신규 화합물인 Ku5의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 신규 화합물인 Ku5의 합성 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 Ku5에 대한 ¹H NMR (400 MHz, DMSO) 분석을 나타낸 것이다 ((ppm): 12.71 (br s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 7.29-7.17 (m, 5H), 6.51 (d, J = 8.4 Hz, 0.8H) (major rotamer), 6.13 (d, J = 8.4 Hz, 0.2H) (minor rotamer), 4.41 (ddd, J = 5.2 Hz, 8 Hz, 13.2 Hz, 0.8H) (major rotamer), 4.32 (ddd, J = 5.2 Hz, 8 Hz, 13.2 Hz, 0.2H) (major rotamer), 3.12-2.95(m, 2H, overlapped)).
도 4는 Ku5에 대한 ¹H NMR (400 MHz, DMSO+D₂O) 분석 결과를 나타낸 것이다 ((ppm): 7.30-7.18 (m, 5H, overlapped), 4.61 (dd, J = 5.6 Hz, 7.8 Hz, 0.83H) (major rotamer), 4.53 (dd, J = 5.6 Hz, 7.8 Hz, 0.17H),3.20 (dd, J = 6.8 Hz, 14.0 Hz, 0.83H), 3.15-3.04 (m, 1H, overlapped), 2.98 (dd, J = 7.2 Hz, 14.0 Hz, 0.17H)).
도 5는 Ku5에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다 (Purity (HPLC): 99.6% (254 nm)).
도 6은 Ku5에 대한 MS-ESI 분석 결과를 나타낸 것이다 (225.2 [M+H]⁺).
도 7은 FDH (Formate Dehydrogenase)-coupled Spectrophotometric Assay에 대한 것으로서, FDH의 활성에 의하여 340nm의 파장에서 흡광도를 나타내는 NADH를 생산하여 PDF의 활성을 간접적으로 정량할 수 있음을 나타낸 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다. 제조방법을 구체적으로 살펴보면, 디클로로메탄을 용매로 사용하여 화학식 3의 O-벤질-하이드록실아민 하이드로클로라이드, 카르보닐디이미다졸 및 트리에틸아민을 첨가한 후 1시간 동안 RT(room temperature)에서 교반한 후, 화학식 2의 페닐알라닌 벤질 에스터 p-톨루엔설포네이트를 첨가하여 4시간 동안 RT에서 교반한다. 이후, 반응물은 1N HCl, 탄산수소나트륨 포화 수용액, 브라인(brine) 및 건조된 무수 황산 나트륨으로 세척한다. 이후, 용매는 증발시키고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화학식 4의 화합물을 생성한다. 화학식 4의 화합물은 메탄올에 녹이고, 활성탄 담체의 팔라듐의 존재 하에 수소 대기에서 2시간 동안 RT에서 교반한 후, 여과할 수 있고, 여과액은 감압 농축하고, 에테르를 천천히 첨가하여 결정체를 얻고, 결정체는 메탄올-에테르에서 재결정화되어 화학식 1의 화합물을 생성한다.

본 발명의 항균용 조성물은 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 화장품, 피부 세정제, 모발 세정제, 질 세정제, 구강 세정제, 욕실용 세정제, 주방용 세정제, 화장품 보존제, 화장품 방부제, 식품 보존제, 식품 방부제, 식품첨가제 및 사료첨가제 소재로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 싸이코트리아 루브라 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 용어, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유전자 클로닝, 단백질 발현 및 단백질 정제

다제내성 균주인 아시네토박터 바우마니 K0420859 (Acinetobacter baumannii K0420859)로부터 유래된 펩타이드 디포밀라아제(peptide deformylase, 이하 "PDF"라 함) 유전자(이하, "AbPDF-Ia" 및 "AbPDF-Ib"로 기재함) 및 슈도모나스 에루지노사 PAE0831(Pseudomonas aeruginosa PAE083, 녹농균)로부터 유래된 PDF 유전자(이하, "PaPDF-Ib"로 기재함)는 유전체 DNA(genomic DNA)를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭되고, 발현벡터인 pET-11a로 클로닝되었다. 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus CCARM3089, MRSA, 황색포도상구균)로부터 유래된 PDF 유전자(이하, "SaPDF-IIb"로 기재함)는 유전제 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭되고, 발현벡터인 pET-29b로 클로닝되었다. 상기 4종의 PDF 단백질(AbPDF-Ia, AbPDF-Ib, PaPDF-Ib 및 SaPDF-IIb)은 PDF family 중 활성이 없는 class IIa를 제외한 class Ia, class Ib 및 class IIb의 타입을 포함하는 것이다. PCR에 사용되는 프라이머 서열은 NCBI 웹사이트에서 각 종에 대한 다른 유전체 서열을 근거로 디자인되었다. 타겟 유전자를 포함하는 클로닝된 발현벡터는 E. coli BL21(DE3)에 삽입되어 형질전환시켰다.

형질전환된 E. coli BL21(DE3) 세포는 적절한 항생제가 첨가된 LB(Luria-Bertani) 배지를 이용하여 310K에서 배양되었고, 급속생장기(exponential growth phase)에 0.5 mM의 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 넣은 후 타겟 유전자의 발현이 유도되었다. 세포는 277 K에서 6,000 x g (Vision VS24- SMTi V5006A rotor)로 20분 동안 원심분리된 후 수득되었고, 차가운 lysis buffer [25 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 35 mM Imidazole, 3 mM β-mercaptoethanol, 10% Glycerol]에서 재부유되었으며, 초음파 (Sonomasher, S & T Science, Korea)로 처리되어 균질화되었다. 세포 용해물은 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 277 K에서 21,000 x g (Vision VS24-SMTi V508A rotor)로 30분 동안 원심분리되었다.

히스티딘(His)이 태깅된 타겟 PDF 단백질을 정제하기 위해, 세포 용해물은 Ni-NTA 레진(Bio-rad)에 로딩하였고 타겟 PDF 단백질은 250 mM Imidazole이 포함된 elution buffer를 사용하여 용출시켰다. 용출물은 277 K에서 dialysis buffer [25 mM Tris-HCl pH 7.5, 15 mM NaCl, and 3 mM β-mercaptoethanol]로 투석되었다. 히스티틴-태그는 277 K에서 TEV 프로테이즈로 밤새 반응시켜 분해되었다. 추후의 정제는 buffer A [25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, and 3 mM β-mercaptoethanol]에서 평형된 HiTrap Q Anion-exchange column (GE Healthcare)을 이용하여 수행되었다. 타겟 단백질은 0 에서 100% buffer B [25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M NaCl, and 3 mM β-mercaptoethanol]에서 점차 용출되었다. 모든 정제 과정은 SDS-PAGE로 분석되었다. 결정화를 위해, 단백질 용액은 Centrifugal Filters (Amicon ® Ultra-15, MWCO 10 kDa)에서 농축되었고, 단백질 농도는 Bradford protein assay로 추정되었다. 타겟 단백질의 최종 농도는 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl 및 3 mM β-mercaptoethanol이 포함된 buffer에서 5 내지 30 mg ml^-1 로 세팅되었다.

실시예 2. 결정화, 데이터 수집 및 구조 결정

2.1. 결정화(Crystallization)

AbPDF-Ia, AbPDF-Ib, PaPDF-Ib 및 SaPDF-IIb의 정제된 PDF 단백질들은 96-Well Intelliplate (Art Robbins)에서 Hydra II e-drop automated pipetting system (Matrix)를 사용하여 287 K에서 결정화되었다. 드롭(drops)은 0.5 μl protein solution과 0.5 μl reservoir solution으로 구성되고, 287 K에서 50 μl reservoir solution에 대해 평형화되었다. 초기의 결정체를 얻은 후에는 재생산 및 최적화를 위해 행잉드롭(hanging drops)이 모액과 같은 부피로 혼합된 0.7 μL의 각 PDF로 만들어졌다. 완전한 결정체는 모액과 동결보호제(cryoprotectant: 20% glycerol 또는 20% polyethylene glycol)의 혼합물에 넣었고, 액체질소에서 100 K로 순간냉동되었다.

2.2. 데이터 수집 및 구조 결정

X-ray 데이터 수집을 위해, 한국의 PLS(Pohang Light Source)의 BL-5C와 BL-11C 및 일본 High Energy Accelerator Research Organization (KEK)의 Photon Factory의 BL-17A이 사용되었다. 데이터는 통합하여 DENZO 및 SCALEPACK를 사용하여 계산되었다 (Methods Enzymol 1997, 276:307-326). 구조의 상 결정은 CCP4 software package에 있는 페어저로 MR(molecular replacement)에 의해 수행되었다 (Phaser crystallographic software. J Appl Cryst 2007, 40:658-674). AbPDF-Ib에 대해서는 Leptospira interrogans PDF (PDB ID: 1y6h) 및 PaPDF-Ib에 대해서는 Burkholderia xenovorans PDF (PDB ID: 5vcp)가 새롭게 결정된 PDF를 위한 검색 템플레이트로 사용되었다. 전자밀도지도(electron density map) 및 피팅모델빌딩(fitting Model building)은 Program COOT을 사용하여 수행되었다 (Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 2010, 66(Pt 4):486-501). 다중 주기의 구조 정제는 CCP4 program Refmac5으로 수행되었다 (Acta crystallographica Section D, Biological crystallography 2011, 67(Pt 4):355-367). 모든 구조는 WHATIF (J Mol Graph 1990, 8(1):52-56, 29) 및 SFCheck (Appl Environ Microbiol 2009, 75(8):2304-2311)을 사용하여 확인되었다. 그래픽 제작은 Pymol을 사용하였다 (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3r1. In.; 2010).

실시예 3. 저해제(inhibitor) 디자인 및 합성

저해제의 디자인은 기존 연구를 근거로 수행되었다 (Journal of agricultural and food chemistry 2016, 64(39):7307-7314). 본 발명자들은 신규 억제제인 Ku5를 합성하였고, 구체적인 합성 과정은 다음과 같다.

3.1. 신규 화합물(이하, "Ku5"로 기재함)의 합성

도 1에 나타낸 바와 같이, 100 mg의 Ku5 (순도 > 95%)가 준비되었고, ¹H-NMR, LC-MS 및 HPLC로 확인되었다. 합성 경로는 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 모든 시재료는 상업적으로 구매하였다.

3.2. 화학식 4의 화합물 준비

디클로로메탄(dichloromethane, DCM, 40 mL)에 카르보닐디이미다졸(carbonyldiimidazole, CDI, 810 mg, 5 mmol), 화학식 3의 O-벤질-하이드록실아민 하이드로클로라이드(O-benzyl-hydroxylamine hydrochloride, 800 mg, 5 mmol) 및 트리에틸아민(triethylamine, TEA, 1.4 mL, 10 mmol)의 용액을 1시간 동안 RT(room temperature)에서 교반하고, 이후, 화학식 2의 페닐알라닌 벤질 에스터 p-톨루엔설포네이트(phenylalanine benzyl ester p-toluenesulfonate, 2.15 g, 5 mmol)를 첨가하였다. 4시간 동안의 추가 교반 후, 반응 혼합물은 1N HCl, 탄산수소나트륨 포화 수용액, 브라인(brine) 및 건조된 무수 황산 나트륨으로 세척하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (용매: 헥산에 30% 에틸아세테이트)를 수행하여 화학식 4의 화합물을 얻었다.

3.3. 화학식 1의 화합물인 Ku5의 준비

메탄올에 녹인 화학식 4의 화합물은 10% 활성탄 담체의 팔라듐(palladium on activated carbon, Pd/C)의 존재 하에 수소 대기에서 RT에서 2시간 동안 교반하고 여과시켰다. 여과액은 감압 농축하였고, 에테르를 천천히 첨가하여 결정체를 얻었고, 결정체는 메탄올-에테르에서 재결정화되어 백색 고체로서 분석학적으로 순수한 화학식 1의 화합물인 Ku5 (700 mg, 84 %)를 수득하였다.

실시예 4. 리간드-결합된 PDF의 결정화 및 구조 결정

액티노닌(actinonin)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. Ku5는 100% DMSO에 100 mM로 녹였다. AbPDF-Ia, AbPDF-Ib, PaPDF-Ib 및 SaPDF-IIb의 모든 PDF 결정체는 5 mM의 Ku5와 모액에 담궜다. 1시간 후, 저해제-PDF 결정체는 동일한 동결보호제를 넣은 후 액체질소에서 100 K로 순간냉동되었다. 공동-결정화된 저해제-PDF 결정체는 277 K에서 7 배의 몰 과량의 저해제와 단백질을 밤새 배양시킴으로써 수득할 수 있었다. 이후, 결정화를 위한 행잉드롭이 같은 조건 및 방법으로 수행되었다. 공동-결정화된 결정체는 Ku5와 AbPDF-Ib; 및 액티노닌과 PaPDF-Ib으로부터 획득되었다. 순간 냉동 과정은 아포(apo) 결정체에 사용된 동일한 프로토콜로 수행되었다. 리간드-결합 구조의 구조 결정 및 정제 역시 동일한 방법대로 수행되었다.

실시예 5. 신규 PDF 저해제인 Ku5에 대한 PDF 저해 활성(IC50) 측정

본 발명자들은 신규 PDF 저해제인 Ku5에 대한 PDF 저해 활성을 측정하기 위하여, 슈퍼박테리아 균주로부터 유래된 PDF 유전자들을 클로닝한 후 발현 및 정제하여 4종의 PDF 단백질(AbPDF-Ia, AbPDF-Ib, PaPDF-Ib 및 SaPDF-IIb)을 준비하였다. 상기 4종의 PDF 단백질은 PDF family 중 활성이 없는 class IIa를 제외한 class Ia, class Ib 및 class IIb의 타입을 포함하고 있다.

PDF 저해 활성은 FDH (Formate Dehydrogenase)-Coupled Spectrophotometric Assay로 측정되었다 (Analytical biochemistry 1997, 244(1):180-182). PDF 활성에 의해 방출되는 포름산염(formate)는 NAD⁺ 에서 NADH로 변환시키기 위해 FDH를 기질로 사용하므로, 상기 assy를 이용하여 PDF의 활성을 간접적으로 측정할 수 있다.

측정은 PDF의 기질인 fMAS(formyl-methionine-alanine-serine)를 제외한 50 mM HEPES pH 7.5, 12 mM NAD⁺, 1.2 U FDH, 1 mM NiSO₄, 10 nM AbPDF의 혼합물을 96-well plate (SPL life science)에 넣고, 증류수를 이용하여 100 μl로 맞추었다. 저해제인 Ku5는 100% DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹이고, 최종 DMSO의 농도가 5%가 되도록 첨가하였으며, 저해제의 최종 농도는 500 μg/ml, 50 μg/ml, 20 μg/ml 및 2 μg/ml으로 준비하였다. 저해제는 PDF와의 충분한 반응을 위해 310 K에서 10분 동안 미리 혼합물에 넣었고, 기질인 fMAS를 1 mM로 첨가하여 반응을 시작하였다. 기질을 첨가한 후 310 K에서 10분 동안 반응시키고, 분광광도계 Infinite M200PRO (TECAN)을 이용하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. IC50 값은 Graphpad Prism 4 (Graphpad　Software)를 이용하여 S자형 용량-반응 플롯에서 얻었다. 결과는 3번의 실험에 대한 평균값으로 나타내었다.

그 결과, 신규 화합물인 Ku5에 대한 IC50 값은 AbPDF-Ia의 경우 6.3±0.6 μM 이었고, AbPDF-Ib의 경우 6.9±2.4 이었으며, PaPDF-Ib의 경우 5.9±2.7 이었고, SaPDF-IIb의 경우 7.0±0.5 로 나타났다 (표 1).

IC₅₀(μM)
AbPDF-Ia	6.3±0.6
AbPDF-Ib	6.9±2.4
PaPDF-Ib	5.9±2.7
SaPDF-IIb	7.0±0.5

따라서, 신규 화합물인 Ku5는 PDF의 class Ia, class Ib 및 class IIb에 대한 저해 활성을 가짐으로써 신규 항생물질로서의 효과를 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)에 대한 항균용 조성물:
[화학식 1]

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시험관 내(in vitro)에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 시료에 처리하는 단계를 포함하는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)로부터 유래된 PDF(peptide deformylase) 단백질의 활성을 저해하는 방법:
[화학식 1]

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하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]

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하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)에 의한 감염성 질환의 개선용 화장료 조성물:
[화학식 1]

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