BRPI1008651B1 - compostos ativadores de procaspase, medicamento que os compreende e uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

compostos ativadores de procaspase, medicamento que os compreende e uso dos mesmos a presente invenção refere-se a composições e métodos, que são descritos nas modalidades relativas à indução de morte celular, tal como em células de câncer. compostos e métodos relacionados para síntese e uso dos mesmos, inclusive o uso de compostos em terapia para o tratamento de câncer e indução seletiva de apoptose em células são descritos. são descritos compostos que tem efeitos de neurotoxicidade mais baixos do que outros compostos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSTOS ATIVADORES DE PROCASPASE, MEDICAMENTO QUE OS COMPREENDE E USO DOS MESMOS.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US De No. Serial 61 /151.064 depositado em 9 de fevereiro de 2009 por Hergenroter e outro, que está incorporado através por na totalidade.
DECLARAÇÃO SOBRE DESENVOLVIMENTO OU PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADA [002] A presente invenção foi feita com apoio do governo sob R01-CA120439 concedido por National Institute of Health, 1 T32 GM070421 concedido por National Institute of Health e F31CA13013801 S1 concedido por National Institute of Health. O governo tem certos direitos na invenção.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO [003] Apoptose, ou morte celular programada, desempenha um papel central no desenvolvimento e homeostasia de todos os organismos multicelulares (Shi Y, 2002, Molecular Cell 9:459-470). Uma indicação oficial frequente de câncer é a resistência a sinais apoptóticos naturais. Dependendo do tipo de câncer, esta resistência é tipicamente devido à super ou subregulação de proteínas fundamentais na cascata apoptótica ou a mutações em genes que codificam estas proteínas. Tais alterações ocorrem igualmente na série de reação apoptótica intrínseca, em que funis atravessam as mitocôndrias e caspase-9, e a série de reação apoptótica extrínseca, que envolve a ação de morte dos receptores e caspase-8. Por exemplo, alterações nos próprios níveis de proteínas tais como p53, Bim, Bax, Apaf-1, FLIP e muitos outros que foram observados em cânceres. As alterações podem conduzir a uma cascata apoptótica defeituosa, uma na qual o sinal pró
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2/103 apoptótico a montante não é transmitido adequadamente para ativar as caspases executoras, caspase-3 e caspase-7. A figura 1 mostra aspectos da cascata apoptótica.
[004] Assim como a maioria das séries de reação apoptóticas no final das contas envolve a ativação de procaspase-3, anormalidades genéticas a montante são efetivamente quebras na circuição apoptótica, e como resultado tais células proliferam atipicamente. Dado o papel central da apoptose no câncer, foram feitos esforços para desenvolver terapêuticas que alvejam proteínas específicas na cascata apoptótica. Por exemplo, aglutinantes de molécula pequena ou peptídicos para membros de cascata tais como p53 e proteínas na família BcI ou para o inibidor da família apoptose (IAP) de proteínas, tem atividade pró-apoptótica, assim como fazem compostos que promovem a oligomerização de Apaf-1. Entretanto, porque tais compostos alvejam posições precoces (ou intermediárias a altas) na cascata apoptótica, cânceres com mutações em proteínas a jusante daqueles membros ainda podem ser resistentes aos possíveis efeitos benéficos daqueles compostos.
[005] Para propósitos terapêuticos seria vantajoso identificar uma molécula pequena que diretamente ativa uma proteína pró-apoptótica bem mais a jusante na cascata apoptótica. O método para a invenção envolve uma tal posição relativamente baixa na cascata, desse modo permitindo o extermínio de até mesmo aquelas células que têm mutações em sua maquinaria apoptótica a montante. Além disso, as estratégias terapêuticas aqui descritas podem ter uma probabilidade mais alta de sucesso se aquela proteína pró-apoptótica fosse superregulada em células de câncer. Na presente invenção, os esforços para identificar moléculas pequenas começaram com alvejamento da proteína efetora a jusante significante de apoptose, procaspase-3.
[006] A conversão ou ativação de procaspase-3 para caspase-3
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3/103 resulta na geração da forma de caspase executora ativa que subsequentemente catalisa a hidrólise de uma multidão de substratos de proteína. A caspase-3 ativa é um homodímero de heterodímeros, e é produzida por proteólise de procaspase-3. In vivo, esta ativação proteolítica ocorre tipicamente através da ação de caspase-8 ou caspase-9. Para assegurar que a proenzima ou zimogênio não seja ativado prematuramente, a procaspase-3 tem um linguete de segurança de 12 aminoácidos que bloqueia o acesso ao sítio de IETD (sequência de aminoácido, ile-glu-thr-asp) de proteólise. Veja Roy, S. e outro; Maintenance of caspase-3 proenzyme dormancy by an intrinsic safety catch regulatory tripeptide, Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 6132-6137 (2001).
[007] Este linguete de segurança permite a procaspase-3 resistir a ativação autocatalítica e proteólise por caspase-9. Estudos mutagênicos indicam que três resíduos de ácido aspártico consecutivos parecem ser os componentes críticos do linguete de segurança. A posição do linguete de segurança é sensível ao pH; desse modo, em acidificação celular (quando ocorre durante a apoptose) acredita-se que o linguete de segurança permite o acesso ao sítio de proteólise, e caspase-3 ativa pode ser produzida pela ação da caspase-9 ou através de um mecanismo de autoativação.
[008] Em particular, cânceres, a expressão de procaspase-3 é superregulada. Um estudo de isolados primários a partir de 20 pacientes com câncer de cólon, revelou que em média, a procaspase-3 foi superregulada seis vezes em tais isolados relativos ao tecido não canceroso adjacente (Roy e outro, 2001 ). Além disso, a procaspase-3 é superregulada em certos neuroblastomas, linfomas e cânceres de fígado (Nakagawara, A., e outro, 1997, Cancer Res. 57:4578-4584; Izban, K. F. e outro, Am. J. Pathol. 154:1439-1447; Persad, R. e outro, Modern Patholo. 17:861-867). Além disso, uma avaliação sistemática
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4/103 foi realizada de níveis de procaspase-3 no painel de linhagem celular 60 usado para avaliação de câncer pelo National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program. A avaliação revelou que certos cânceres de pulmão, melanoma, renal e mama mostram níveis grandemente realçados de expressão de procaspase-3 (Svingen, P.A. e outro, Clin. Cancer Res. 10:6807-6820).
[009] Devido ao papel da caspase-3 ativa na obtenção de apoptose, aos níveis de expressão relativamente altos de procaspase-3 em certos tipos de células cancerosas, e à supressão mediada por linguete de segurança intrigante de sua autoativação, deduziu-se que moléculas pequenas que diretamente modificam a procaspase-3 podem ser identificadas e que tais moléculas podem ter grande aplicabilidade na terapia de câncer alvejada.
[0010] Descreveu-se aqui, entre outros, composições e métodos que incluem moléculas pequenas capazes de induzir morte celular. Nas modalidades, composições e métodos envolvem compostos que podem interagir diretamente ou indiretamente com membros de série de reação de morte celular programada tal como procaspase-3. Nas modalidades, composições e métodos da invenção reduziram a neurotoxicidade quando comparado a outros compostos que interagem diretamente ou indiretamente com membros de série de reação de morte celular programada tal como procaspase-3.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0011] A invenção amplamente fornece compostos, composições e métodos de tratamento terapêutico. Nas modalidades, as invenções são aplicáveis no contexto de uma variedade de doenças de câncer e tipos de células cancerígenas tais como mama, linfoma, suprarrenal, renal, melanoma, leucemia, neuroblastoma, pulmão, cérebro, e outros conhecidos na técnica.
[0012] Como uma outra introdução, compostos capazes de ativar
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5/103 uma enzima que é frequentemente superexpressada em sua forma inativa em células de câncer foram descobertos. Os compostos induzem a morte celular programada (apoptose) em células de câncer, incluindo aquelas que têm procaspase-3 superregulada. Muitos cânceres resistem a quimioterapia padrão. Compostos da invenção podem tirar proveito de um alvo biológico, que pode ser superregulado em células de câncer e desse modo pode provar ser eficaz até mesmo em células com defeitos em sua maquinaria apoptótica. Estes compostos também podem ter êxito na terapia de câncer alvejada, onde pode haver vantagens de seletividade no extermínio de células de câncer com reações adversas comparavelmente reduzidas para células não cancerosas que têm níveis inferiores de procaspase-3. Estas reações adversas podem incluir toxicidade, particularmente neurotoxicidade.
[0013] Sem desejar estar ligada por uma teoria particular, acreditase que modalidades de compostos, composições e métodos da invenção podem agir por meio do mecanismo de modulação de apoptose ou morte celular programada para ser eficazes no tratamento de células de câncer. Em uma modalidade preferida, a modulação de apoptose é por indução de apoptose. Em outra modalidade, a modulação de apoptose é por inibição de apoptose.
[0014] São fornecidos compostos que têm um núcleo de quelação de zinco de N-acilidrazona com pelo menos um grupo polar ligado a um anel de fenila terminal. Também são fornecidos compostos que têm um núcleo de quelação de zinco de orto-hidroxil N-acilidrazona com pelo menos um grupo polar ligado a um anel de fenila terminal. [0015] Mais especificamente, são fornecidos compostos que têm a fórmula (FX1):
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6/103
Figure BRPI1008651B1_D0001
R4
R5
A
Figure BRPI1008651B1_D0002
m
Figure BRPI1008651B1_D0003
(FX1) em que [0016] X1, X2, X3, X4 e X5 são cada qual independentemente C ou
N, em que quando X1, X2, X3, X4 e X5 forem N, os R10, R11, R12, R13 e R14 correspondentes estão ausentes;
um dentre R10, R11, R12, R13, R14, R3, R7, R8 ou R9 contém um grupo polar selecionado a partir do grupo que consiste em: um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxilato, um grupo sulfonila e um grupo aril sulfonila;
os outros dentre R10, R11, R12, R13, R14, R3, R7, R8 ou R9 são cada qual independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: hidrogênio, halogênio, um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxilato, um grupo sulfonila, um grupo aril sulfonila, um grupo alcóxi, C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi e C2-C6 alquenila; n e m são cada qual independentemente números inteiros de 1 a 3; R4 e R5 são cada qual independentemente CH ou N; A é O ou S; R6 é hidrogênio ou C1-C6 alquila; X é oxigênio; e R2 é hidrogênio, C1-C6 alquila ou C1-C6 alcóxi.
[0017] Também é fornecido um Composto que tem a fórmula (FX11):
Figure BRPI1008651B1_D0004
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7/103 (FX11) em que
X1, X2, X3, X4 e X5 são cada qual independentemente C ou N, em que quando X1, X2, X3, X4 e X5 forem N, os R10, R11, R12, R13 e R14 correspondentes estão ausentes;
um dentre R10, R11, R12, R13 e R14 contém um grupo polar selecionado a partir do grupo que consiste em: um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxilato, um grupo sulfonila e um grupo aril sulfonila;
os outros dentre R10, R11, R12, R13 e R14 são cada qual independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: H, halogênio,-OH, um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo amino, um grupo carboxilato, um grupo sulfonila, um grupo aril sulfonila e um grupo alcóxi; n e m são cada qual independentemente números inteiros de 1 a 3; R4 e R5 são cada qual independentemente CH ou N; A é O ou S; R6 é hidrogênio ou C1-C6 alquila; R3, R7, R8, R9 são cada qual independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi ou C2-C6 alquenila; X é oxigênio; e R2 é hidrogênio, C1-C6 alquila ou C1-C6 alcóxi.
[0018] Em uma modalidade, R2X é -OH em quaisquer das fórmulas e estruturas aqui fornecidas. Em uma modalidade, R3 é metóxi ou alila em quaisquer das fórmulas e estruturas aqui fornecidas. Em uma modalidade, na Fórmula (FX1), um dentre R10, R11, R12, R13, R14, R3, R7, R8 ou R9 é selecionado a partir do grupo que consiste em: -NO2; COOH;
O
---( 19R18RC-)-S—NRaRb v 'qll
O onde Ra e Rb são cada qual independentemente hidrogênio, C1-C6 alquila e C1-C6 alcóxi;
R18 e R19 são cada qual independentemente selecionados a
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8/103 partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-C6 alquila; e q é um número inteiro de 0 a 3; e
Figure BRPI1008651B1_D0005
onde R16 e R17 são cada qual independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-C6 alquila, e p é um número inteiro de 0 a 3.
[0019] Em uma modalidade, na Fórmula (FX1) ou (FX11), um dentre R10, R11 ou R12 é selecionado a partir do grupo que consiste em: NO2; -COOH;
O
---( 19R18RC-)-S—NRaRb v 'qll
O onde Ra e Rb são cada qual independentemente hidrogênio, C1-C6 alquila e C1-C6 alcóxi; R18 e R19 são cada qual independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-C6 alquila; e q é um número inteiro de 0 a 3; e
Figure BRPI1008651B1_D0006
Figure BRPI1008651B1_D0007
onde R e R17 são cada qual independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e
C1-C6 alquila, e p é um número inteiro de 0 a 3.
[0020] Em uma modalidade, na Fórmula (FX1), um dentre R10, R11,
R12, R13, R14, R3, R7, R8 ou R9 é
O
---( 19R18RC-)-S—NRaRb v 'qll
O onde Ra e Rb são cada qual independentemente hidrogênio,
C1-C6 alquila e C1-C6 alcóxi; R18 e R19 são cada qual independente mente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e
C1-C6 alquila; e q é um número inteiro de 0 a 3.
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9/103 [0021] Em uma modalidade, na Fórmula (FX1) ou (FX11), um den tre R10, R11, R12, R13 ou R14 é
O
---( 19R18RC-)-S—NRaRb v 'qll
O onde Ra e Rb são cada qual independentemente hidrogênio, C1-C6 alquila e C1-C6 alcóxi; R18 e R19 são cada qual independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-C6 alquila; e q é um número inteiro de 0 a 3.
[0022] Em uma modalidade, na Fórmula (FX1) ou (FX11), R12 é
O
---( 19R18RC-)-S—NRaRb 'qll
O onde Ra e Rb são cada qual independentemente hidrogênio,
C1-C6 alquila e C1-C6 alcóxi; R18 e R19 são cada qual independente mente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e
C1-C6 alquila; e q é um número inteiro de 0 a 3. Em uma modalidade, em R12, Ra e Rb são cada qual hidrogênio, e q é 0.
[0023] Em uma modalidade, R3 é alila, X é O e R2 é hidrogênio. Em uma modalidade, R12 é -S(=O)2-NH2. Em uma modalidade, R11, R12 e R13 são metóxi. Em uma modalidade, R3 é alila, X é O e R2 é hidrogênio. Em uma modalidade, um ou dois dentre X1, X2, X3, X4 e X5 (é)são N.
[0024] Também é fornecido um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11) tendo a fórmula (FX2):
Figure BRPI1008651B1_D0008
(FX2)
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10/103 onde as variáveis são como descrito em outro lugar aqui para as Fórmulas (FX1) ou (FX11).
[0025] Também é fornecido um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11) tendo a fórmula (FX12):
Figure BRPI1008651B1_D0009
Figure BRPI1008651B1_D0010
(FX12) onde as variáveis são como descrito em outro lugar aqui para as Fórmulas (FX1) ou (FX11).
[0026] Também é fornecido um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11) tendo a fórmula (FX3), (FX4), (FX5) ou (FX6):
Figure BRPI1008651B1_D0011
Figure BRPI1008651B1_D0012
(FX4);
Figure BRPI1008651B1_D0013
H (FX5);
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11/103
Figure BRPI1008651B1_D0014
[0027] Também é fornecido um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11) tendo a fórmula (FX7) ou (FX8):
OMe
Figure BRPI1008651B1_D0015
(FX7);
Figure BRPI1008651B1_D0016
[0028] Também é fornecido um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11) que inclui um rótulo fluorescente. Também é fornecido um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11) tendo a estrutura (FX9):
Figure BRPI1008651B1_D0017
Figure BRPI1008651B1_D0018
(FX9).
[0029] Também é fornecido em uma modalidade, um método de seletivamente induzir apoptose em uma célula de câncer, compreendendo administrar à referida célula de câncer, um composto capaz de modificar uma molécula de procaspase-3 da referida célula de câncer; em que o referido composto é o composto de Fórmula (FX1) ou
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12/103 (FX11). Também é fornecido em uma modalidade, um método de seletivamente induzir apoptose em uma célula de câncer, compreendendo administrar à referida célula de câncer, um composto capaz de modificar uma molécula de procaspase-3 da referida célula de câncer; em que o referido composto é o composto de Fórmula (FX1) ou (FX11), e em que a referida célula de câncer está em um paciente com necessidade de tratamento. Também é fornecido em uma modalidade, um método de tratar uma célula de câncer, compreendendo (a) identificar uma suscetibilidade potencial ao tratamento de uma célula de câncer com um composto ativador de procaspase; e (b) expor a referida célula de câncer a uma quantidade eficaz do composto ativador de procaspase; em que o composto ativador de procaspase é o composto de Fórmula (FX1) ou (FX11). Também é fornecido em uma modalidade, um método de tratar uma célula de câncer, compreendendo (a) identificar uma suscetibilidade potencial ao tratamento de uma célula de câncer com um composto ativador de procaspase; e (b) expor a referida célula de câncer a uma quantidade eficaz do composto ativador de procaspase; em que o composto ativador de procaspase é o composto de Fórmula (FX1) ou (FX11), em que o referido composto ativador de procaspase é capaz de ativar pelo menos uma dentre procaspase-3 e procaspase-7. Também é fornecido em uma modalidade, um método de induzir morte em uma célula de câncer, compreendendo administrar à referida célula de câncer um composto capaz de ativar uma molécula de procaspase-3 da referida célula de câncer, em que o referido composto é o composto de Fórmula (FX1) ou (FX11). Também é fornecido em uma modalidade, um medicamento que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais compostos de Fórmula (FX1) ou (FX11). Também é fornecido em uma modalidade, um método de preparar um medicamento para tratamento de uma célula de câncer, que compreende um ou mais compostos de Fórmula (FX1) ou (FX11).
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Também é fornecido em uma modalidade, um método de induzir apoptose em uma célula, compreendendo administrar à referida célula, um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11). Também é fornecido um método como aqui descrito, em que o composto ativador de procaspase tem um logBB de -0,4 a -2. Também é fornecido um método como aqui descrito, em que o composto de fórmula (FX1) ou (FX11) tem um logBB de -0,4 a -2. Também é fornecido um método como aqui descrito, em que o composto não cruza a barreira hematoencefálica a tal ponto para causar efeitos neurotóxicos apreciáveis em um paciente. Também é fornecido um método ex vivo, compreendendo contatar uma célula com uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11). Também é fornecido um método de tratar uma célula, o método que compreende a etapa de contatar uma célula com uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (FX1) ou (FX11). Também é fornecido um composto de acordo com a Fórmula (FX1) ou (FX11) para uso em terapia. Também é fornecido um composto de acordo com a Fórmula (FX1) ou (FX11) ou o tratamento de câncer. Também é fornecido o uso de um composto de acordo com a Fórmula (FX1) ou (FX11) na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.
[0030] Em um aspecto, pelo menos um substituinte nos compostos da invenção é um grupo polar. Em uma modalidade, A é O. Em uma modalidade, R4 e R5 são N. Em uma modalidade, m e n são ambos 1. Em uma modalidade, X1, X2, X3, X4 e X5 são todos C. Em uma modalidade, R6 é H. Em uma modalidade, R7, R8 e R9 são todos H. Em uma modalidade, R3 é alila. Em uma modalidade, R10 e R14 são H e R11, R12 e R13 são cada qual metóxi. Em uma modalidade, R2X é -OH. Em uma modalidade, R3 é metóxi. Em uma modalidade, um dentre R3, R7, R8 e R9 é metóxi. Em uma modalidade, dois dentre R3, R7, R8 e R9 são metóxi. Em uma modalidade, três dentre R3, R7, R8 e R9 são
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14/103 metóxi. Em uma modalidade, um dentre R10, R11, R12, R13 e R14 é metóxi. Em uma modalidade, dois dentre R10, R11, R12, R13 e R14 são metóxi. Em uma modalidade, R10 e R13 são metóxi. Em uma modalidade, três dentre R10, R11, R12, R13 e R14 são metóxi. Em uma modalidade, apenas um dentre R10, R11, R12, R13 e R14 não é hidrogênio. Em uma modalidade, apenas um dentre R11, R12, R13 e R14 não é hidrogênio. Em uma modalidade, R11 ou R12 não é hidrogênio.
[0031] Em um aspecto da invenção, um composto de quaisquer das fórmulas descritas e mostradas aqui, é rotulado com um rótulo fluorescente. O uso de um rótulo fluorescente com os compostos e métodos da invenção permite localizar o composto em um sistema desejado, determinação da concentração do composto, e tem outros usos, como conhecido na técnica. A identidade, uso, síntese e escolha de um rótulo fluorescente particular estão dentro do nível de experiência de alguém versado na técnica. Em uma modalidade particular, o rótulo fluorescente é Alexa Fluor 350. Pretende-se que outros rótulos fluorescentes sejam incluído e descritos aqui, como se eles fossem listados individualmente.
[0032] Em um aspecto da invenção, compostos da invenção não cruzam a barreira hematoencefálica em uma quantidade suficiente para causar uma quantidade de neurotoxicidade que requereria a terminação do tratamento ou outros efeitos adversos. Em um aspecto da invenção, compostos da invenção têm um logBB de -0,4 a -2, por exemplo.
[0033] Em um aspecto da invenção, compostos da invenção induzem a morte celular em células de câncer. Em modalidades deste aspecto da invenção, os compostos da invenção induzem a morte celular em células de linfoma, leucemia, melanoma, cervicais e de câncer de mama.
[0034] Quando aqui usado, um grupo polar compreende pelo
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15/103 menos uma ligação que é pelo menos parcialmente polar, quando o termo é usado na técnica. Um grupo polar contém pelo menos uma ligação com um momento de dipolo. Um grupo polar quando aqui usado, pode incluir um grupo polar como uma parte de um grupo químico global, quando o termo é usado na técnica.
[0035] Quando aqui usado, um grupo sulfonamida tem a estrutura:
O
---( 19R18Rc4-S—NRaRb q II o , onde Ra e Rb são cada qual independentemente hidrogênio, C1-C6 alquila e C1-C6 alcóxi; R18 e R19 são cada qual independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-C6 alquila; e q é um número inteiro de 0 a 6. Em uma modalidade, Ra e Rb são cada qual hidrogênio.
[0036] Quando aqui usado, um grupo sulfonila contém a estrutura: -SO2-. Em uma modalidade, o grupo sulfonila é uma parte de um grupo o
S-(-CR16R1H—
II v 'p aril sulfonila que tem a estrutura: o , onde R16 e
R17 são cada qual independentemente selecionados a partir do grupo
Figure BRPI1008651B1_D0019
que consiste em hidrogênio e C1-C6 alquila, onde o grupo arila pode ser opcionalmente substituído por um ou mais heteroátomos no anel e pode ser opcionalmente substituído por um ou mais átomos de halo gênio, grupos nitro, grupos C1-C6 alquila, e grupos C1-C6 alcóxi, e p é um número inteiro de 0 a 6. Um grupo sulfonila pode ser terminado por qualquer substituinte adequado tal como hidrogênio ou C1-C6 alquila. [0037] Quando aqui usado, alila refere-se ao grupo alquenila -CH2CH=CH2.
[0038] Quando aqui usado, um grupo nitro contém a estrutura: NO2. Em uma modalidade, um grupo nitro pode ser o grupo terminal de um grupo alquilnitro, onde um a 6 grupos metileno opcionalmente substituídos precedem o grupo funcional nitro. Quando aqui usado, um
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16/103 grupo carboxilato contém a estrutura: -COOH. Em uma modalidade, o grupo carboxilato é terminado por um grupo C1-C6 alquila em vez de hidrogênio.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0039] A figura 1 mostra alguns aspectos de ativação de molécula pequena de procaspase-3.
[0040] A figura 2 mostra PAC-1 seletivamente exterminar uma variedade de células de câncer.
[0041] A figura 3 mostra o retardamento por PAC-1 do crescimento do tumor em modelos de xenoenxerto de camundongo de câncer.
[0042] A figura 4 mostra retardamento por PAC-1 do crescimento de tumor em camundongos.
[0043] A figura 5 mostra PAC-1 Aliviar a Inibição de Zn2+ de Procaspase-3. Como avaliado pela clivagem do substrato de Ac-DEVDpNA, a capacidade do zinco de inibir a atividade mutante (D3A, 2,5 pM) de procaspase-3 (D9A/D28A/D175A) in vitro é reduzida na presença de PAC-1 (50 μΜ). Dados mostrados são representativos de três tentativas.
[0044] figura 6 mostra que PAC-1 realça a atividade de mutante de procaspase-3(D9A/D28A/D175A) (D3A) quando analisada em um tampão contendo 10 μΜ de ZnSO4.
[0045] figura 7 mostra que PAC-1-I-8 realça a atividade de mutante de procaspase-3(D9A/D28A/D175A) (D3A) quando analisada em um teor contendo 10 μΜ de ZnSO4.
[0046] figura 8 mostra que a titulação de ZnSO4 em uma solução de PAC-1 (50 μΜ em Hepes a 50 mM, KNO3 a 100 mM, tampão em pH 7,2) causa uma alteração nos espectros visíveis a UV de PAC-1. São mostrados concentrações de ZnSO4 de 0 a 75 μΜ em incrementos de 5 μΜ.
[0047] figura 9 mostra análise da interação de ligação de PAC-1
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Zn2+ e estequiometria pelo método de variações contínuo. Com base no local do valor de pico, a estequiometria foi determinada ser 1:1, e a Kd foi determinada ser 42 nM. Barras de erro representam o desviopadrão da média.
[0048] figura 10 mostra uma titulação que ZnSO4 em uma solução de PAC-1-I-8 (50 μΜ em Hepes a 50 mM, KNO3 a 100 mM, tampão em pH 7,2) não causa uma alteração nos espectros visíveis a UV de PAC-1-I-8.
[0049] figura 11 mostra o percentual de morte celular por concentrações variantes de PAC-1-II-7.
[0050] figura 12 mostra o percentual de morte celular por concentrações variantes de PAC-1-IV-3.
[0051] figura 13 mostra a Ligação de Zinco de PAC-1-II-6.
[0052] figura 14 mostra os resultados de um estudo de microscopia confocal.
[0053] figura 15 mostra o conformista de energia mais baixa do complexo de PAC-1-Zn2+.
[0054] figura 16 mostra a caracterização in vitro de S-PAC-1. A) Estruturas de PAC-1 e S-PAC-1. B) A curva de formação do complexo Zn2+:S-PAC-1. S-PAC-1 liga zinco com uma Kd de 46 ± 5 nM. C) SPAC-1 ativa a procaspase-3 D3A in vitro. Uma concentração de 10 μM de procaspase-3 não clivável (D3A) foi incubada na presença de 15 μM de zinco exógeno. A adição de 50 μM de S-PAC-1 resulta em um aumento rápido na atividade durante os primeiros cinco minutos seguidos por um aumento lento durante os 60 minutos subsequentes. D) S-PAC-1 induz a apoptose em células U-937. As células U-937 foram incubadas com 50 μM de SPAC-1 durante 12 horas e analisadas por manchamento de anexina V/PI.
[0055] figura 17 mostra as características de S-PAC-1. A) Farma
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18/103 cocinéticas de S-PAC-1 administrado intraperitoneal em camundongos. Camundongos C57/BL6 foram tratados com 125 mg/kg de SPAC-1 solublizado em 2-hidroxipropil-b-ciclodextrina por meio de administração intraperitoneal. Os camundongos foram sacrificados em vários tempos e sangue foi retirado. A concentração de S-PAC-1 no soro foi determinada por LC. 125 mg/kg de S-PAC-1 tem uma concentração de plasma de pico de ~170 μΜ e uma meia vida de ~1 hora. B) Farmacocinéticas de S-PAC-1 em dose única em cães de caça de pesquisa. Quatro cães de caça foram administrados com uma dose intravenosa única de S-PAC-1 (25 mg/kg em 2-hidroxipropil-pciclodextrina), sangue foi retirado em vários tempos, e concentração de S-PAC-1 de soro foi determinada por LC. S-PAC-1 tem uma concentração de plasma de pico de ~150 μΜ e uma meia-vida de ~3 horas em cães. C) Três cães de caça saudáveis foram administrados com uma infusão contínua de S-PAC-1. Os cachorros receberam uma dose de carregamento inicial durante o curso de 10 minutos seguido por uma infusão de taxa constante durante as próximas 24 horas. Sangue foi retirado em vários pontos de tempo e a concentração de SPAC-1 no plasma foi determinada por análise de LC. A infusão contínua de S-PAC-1 foi bem tolerada e bem sucedida no estabelecimento de uma concentração de soro em estado estável de S-PAC-1 em cães. [0056] figura 18 mostra as farmacocinéticas de S-PAC-1 em cães transportando linfoma. Cães inscritos na tentativa clínica foram administrados com S-PAC-1 em 7 mg/kg de dose de carregamento e 3 mg/kg/hr de infusão de taxa constante para 24 (A-C) ou 72 (D-E) horas. Sangue foi retirado em vários pontos de tempo e a concentração de soro de S-PAC-1 foi determinado por análise de LC.
[0057] figura 19 mostra o efeito antitumor de tratamento com SPAC-1. Topo) Escores RECIST para paciente 1 durante o curso de 7 semanas. Setas indicam os dias de tratamento. Durante o curso de
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19/103 tratamento, o paciente 1 experimentou uma diminuição de 27% no escore RECIST. Depois que o tratamento terminou, o tamanho de tumor aumentou rapidamente (dia 42). Base) Varreduras CT dos linfonodos mandibulares (esboçado) indicam uma diminuição significante no tamanho de tumor antes do tratamento (dia 0) e uma semana depois da administração de S-PAC-1 (Dia 7).
[0058] figura 20 mostra dados de ensaio de titulação de fluorescência EGTA representativos onde S-PAC-1-Zn: KD = 46 ± 5 nM. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0059] Em geral, os termos e frases usados aqui têm seu significado reconhecido na técnica, que pode ser encontrado por referência em textos padrões, referências de jornal e contextos conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0060] As seguintes abreviações são aplicáveis. IAP, inibidor de apoptose; PAC-1, composto ativador de procaspase 1; PARP, Poli(ADP-ribose) polimerase.
[0061] As definições são fornecidas para clarificar seu uso específico no contexto da invenção.
[0062] Quando aqui usado, o termo agente quimioterapêutico refere-se a qualquer substância capaz de reduzir ou prevenir o crescimento, proliferação, ou expansão de uma célula cancerosa, uma população de células cancerosas, tumor, ou outro tecido maligno. O termo também é pretendido abranger qualquer antitumor ou agente anticâncer.
[0063] Quando aqui usado, o termo quantidade eficaz é pretendido abranger contextos tal como uma quantidade farmaceuticamente eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz. Por exemplo, em modalidades a quantidade é capaz de alcançar um estado benéfico, resultado benéfico, atividade funcional em um ensaio de avaliação, ou melhoria de uma condição clínica.
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20/103 [0064] Quando aqui usado, o termo célula cancerosa é pretendido abranger definições como amplamente entendido na técnica. Em uma modalidade, o termo refere-se a uma célula anormalmente regulada que pode contribuir a uma condição clínica de câncer em um ser humano ou animal. Em uma modalidade, o termo pode referir-se a uma linhagem celular cultivada ou uma célula dentro ou derivada de um corpo humano ou animal. Uma célula cancerosa pode ser de uma ampla variedade de célula diferenciada, tecido, ou tipos de órgão como é compreendido na técnica.
[0065] O termo alquila refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto de monorradical ramificada ou não ramificada saturada preferivelmente tendo de 1 a 22 átomos de carbono e a grupos cicloalquila tendo um ou mais anéis tendo 3 a 22 átomos de carbono. Grupos alquila curtos são aqueles tendo 1 a 6 átomos de carbono incluindo grupos metila, etila, propila, butila, pentila e hexila, incluindo todos os isômeros dos mesmos. Grupos alquila longos são aqueles tendo 8-22 átomos de carbono e preferivelmente aqueles tendo 12-22 átomos de carbono bem como aqueles tendo 12-20 e aqueles tendo 16-18 átomos de carbono.
[0066] O termo cicloalquila refere-se a grupos alquila cíclicos de 3 a 22 átomos de carbono tendo um único anel cíclico ou anéis condensados múltiplos. Grupos cicloalquila incluem aqueles tendo anéis de 3-8 membros e aqueles tendo 5 e 6 anéis de membro. Grupos cicloalquila incluem, por meio de exemplo, estruturas de anel isoladas tais como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-octila, e similares, ou estruturas de anel múltiplas tal como adamantanila, e similares.
[0067] O termo alquenila refere-se a um monorradical de um grupo hidrocarboneto ramificado ou não ramificado insaturado tendo preferivelmente de 2 a 22 átomos de carbono e a grupos cicloalquenila
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21/103 tendo um ou mais anéis tendo 3 a 22 átomos de carbono em que pelo menos um anel contém uma ligação dupla. Grupos alquenila podem conter uma ou mais ligações duplas (C=C) que pode(m) ser conjugada(s). Grupos alquenila preferidos são aqueles tendo 1 ou 2 ligações duplas. Grupos alquenila curtos são aqueles tendo 2 a 6 átomos de carbono incluindo grupos etileno (vinila) propileno, butileno, pentileno e hexileno, incluindo todos os isômeros dos mesmos. Grupos alquenila longos são aqueles tendo 8-22 átomos de carbono e preferivelmente aqueles tendo 12-22 átomos de carbono bem como aqueles tendo 1220 átomos de carbono e aqueles tendo 16-18 átomos de carbono. O termo cicloalquenila refere-se a grupos alquenila cíclicos de 3 a 22 átomos de carbono tendo um anel cíclico isolado ou anéis condensados múltiplos em que pelo menos um anel contém uma ligação dupla (C=C). Grupos cicloalquenila incluem, por meio de exemplo, estruturas de anel isoladas tais como ciclopropenila, ciclobutenila, ciclopentenila, ciclo-octenila, ciclo-octadienila e ciclo-octatrienila. O termo alila referese ao grupo alquenila -CH2-CH=CH2.
[0068] O termo alquinila refere-se a um monorradical de um hidrocarboneto insaturado tendo preferivelmente de 2 a 22 átomos de carbono e tendo uma ou mais ligações triplas (C=C). Grupos alquinila incluem etinila, propargila, e similares. Grupos alquinila curtos são aqueles tendo 2 a 6 átomos de carbono, incluindo todos os isômeros dos mesmos. Grupos alquinila longos são aqueles tendo 8-22 átomos de carbono e preferivelmente aqueles tendo 12-22 átomos de carbono bem como aqueles tendo 12-20 átomos de carbono e aqueles tendo 16-18 átomos de carbono.
[0069] O termo arila refere-se a um grupo contendo um grupo carbocíclico aromático insaturado de 6 a 22 átomos de carbono tendo um único anel (por exemplo, fenila), um ou mais anéis (por exemplo, bifenila) ou múltiplos anéis condensados (fundidos), em que pelo me
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22/103 nos um anel é aromático (por exemplo, naftila, di-hidrofenantrenila, fluorenila, ou antrila). Arilas incluem fenila, naftila e similares. Grupos arila podem conter porções que são alquila, alquenila ou aquinila além do(s) anel(éis) aromático(s) insaturado(s). O termo alcarila refere-se aos grupos arila contendo porções de alquila, isto é, -alquileno-arila e alquileno-arila substituído. Tais grupos alcarila são exemplificados por benzila (-CH2-fenila), fenetila e similares.
[0070] Grupos alquila, alquenila, alquinila e arila são opcionalmente substituídos como descrito aqui (o(s) termo(s) pode(m) incluir variações substituídas) e podem conter 1-8 substituintes de não hidrogênio dependentes do número de átomos de carbono no grupo e o grau de insaturação do grupo. Todas as tais variáveis como descrito aqui podem ser não substituídas (em que quaisquer grupos variáveis que podem ser hidrogênio são hidrogênio) ou substituídas por um ou mais substituintes de não hidrogênio selecionados de halogênio, incluindo flúor, cloro, bromo ou iodo, C1-C3 haloalquila, hidroxila (OH), tiol (HS), C1-C6 alquila, C1-C3 alquila, C1-C6 alcóxi, C1-C3 alcóxi, fenila, benzila, alquenila, C2-C4 alquenila, alquinila, C2-C4 alquinila, -NH2, NR’H, -NR’R, R'CO-, R'RNCO-, R'CO-NH- ou R'CO-NR-, onde R' e R são C1-C6 alquila, C1-C3 alquila ou fenila.
[0071] O termo grupo amino refere-se ao grupo -NH2 ou ao grupo -NR'R onde cada R' e R é selecionado independentemente do grupo consistindo em grupos hidrogênio, alquila ou arila.
[0072] Um grupo alcóxi é um grupo alquila que foi modificado por ligação ao oxigênio e pode ser representado pela fórmula R-O e também pode ser referido como um grupo éter alquílico. Exemplos de grupos alcóxi incluem, porém não são limitados a, metóxi, etóxi, propóxi, butóxi e heptóxi. Grupos alcóxi incluem grupos alcóxi substituídos em que a porção de alquila substituída dos grupos é substituída como fornecido aqui com relação à descrição de grupos alquila. Quando aqui
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23/103 usado MeO- refere-se a CH3O-.
[0073] Haloalquila refere-se à alquila como definido aqui substituída por um ou mais grupos halo como definido aqui, que podem ser os mesmos ou diferentes. Grupos haloalquila representativos incluem, por meio de exemplo, trifluorometila, 3-fluorododecila, 12,12,12trifluorododecila, 2-bromooctila, 3-bromo-6-cloro-heptila, e similares.
[0074] O termo halo ou halogênio refere-se a um grupo halogênio tal como um flúor (-F), cloro (-Cl), bromo (-Br), iodo (-I) ou astato (At).
[0075] O termo heteroarila refere-se a um grupo aromático de 2 a 22 átomos de carbono tendo 1 a 4 heteroátomos selecionados dentre oxigênio, nitrogênio e enxofre dentro de pelo menos um anel (se houver mais de um anel). Grupos heteroarila podem ser opcionalmente substituídos. Grupos heteroarila incluem entre outros aqueles tendo anéis de 5 e 6 membros e aqueles tendo um ou dois nitrogênio no anel, aqueles tendo um ou dois oxigênios no anel bem como aqueles tendo um ou dois enxofres no anel.
[0076] O termo heterociclo ou heterocíclico refere-se a um grupo saturado ou insaturado de monorradical tendo um único anel ou múltiplos anéis condensados, de 2-22 átomos de carbono e de 1 a 6 heteroátomos, preferivelmente 1 a 4 heteroátomos, selecionados de nitrogênio, enxofre, fósforo e/ou oxigênio dentro de pelo menos um anel. Grupos heterocíclicos podem ser substituídos. Anéis preferivelmente têm 3-10 membros e mais especificamente têm 5 ou 6 membros.
[0077] O termo éster refere-se a entidades químicas como compreendido na técnica e em particular pode incluir grupos da forma (RCO-).
[0078] Sobre quaisquer dos grupos acima que contêm um ou mais substituintes, compreende-se, que tais grupos não contêm qualquer
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24/103 substituição ou padrões de substituição que são sinteticamente não práticos e/ou sistemicamente não possíveis. Os compostos desta invenção incluem todos os novos isômeros estereoquímicos que surgem da substituição dos compostos descritos.
[0079] Como é habitual e bem conhecido na técnica, átomos de hidrogênio nas fórmulas descritas aqui não são sempre mostrados explicitamente, por exemplo, átomos de hidrogênio ligados aos átomos de carbono de anéis aromáticos e alicíclicos não são sempre mostrados explicitamente nas fórmulas. As estruturas fornecidas aqui, por exemplo no contexto da descrição das fórmulas, são pretendidas ser conduzidas por alguém de experiência razoável na técnica da composição química de compostos dos métodos e composições da invenção, e como será entendido por alguém versado na técnica, as estruturas fornecidas não indicam os ângulos de ligação específicos entre os átomos destes compostos.
[0080] Deve ser notado que quando aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma, e a/o incluem referência plural a menos que o contexto dite claramente de outra maneira. Desse modo, por exemplo, referência a uma célula inclui uma pluralidade de tais células e equivalentes das mesmas conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim sucessivamente. Igualmente, os termos um (ou uma), um ou mais e pelo menos um podem ser usado alternadamente aqui. Também deve ser notado que os termos compreendendo, incluindo, e tendo podem ser usados alternadamente. A expressão de qualquer dentre as reivindicações XX-YY (em que XX e YY referem-se aos números das reivindicações) é pretendida fornecer uma reivindicação dependente múltipla na forma alternativa, e em algumas modalidades é alternável com a expressão como em qualquer uma dentre as reivindicações XX-YY.
[0081] A menos que definido de outra maneira, todos os termos
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25/103 técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como geralmente entendido por alguém versado na técnica a qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão que a invenção não é intitulada para pré-datar tal descrição em virtude de invenção anterior.
[0082] Em algumas modalidades, um lipossoma ou micela pode ser utilizado como um portador ou veículo para a composição.
[0083] Toda formulação ou combinação de componentes descrita ou exemplificada aqui pode ser usada para praticar a invenção, a menos que de outra maneira declarado.
[0084] As composições, preparações e formulações presentes podem ser formuladas em composições diagnosticas ou terapêuticas para administração enteral, parenteral, tópica, aerossol, inalação ou cutânea. Liberação tópica ou cutânea das composições, preparações e formulações também podem incluir formulação em aerossol, cremes, géis, soluções, etc. As composições, preparações e formulações presentes são administradas em doses eficazes para alcançar o efeito diagnóstico e/ou terapêutico desejado. Tais doses podem variar amplamente dependendo das composições particulares empregadas na composição, os órgãos ou tecidos a ser examinados, o equipamento empregado no procedimento clínico, a eficácia do tratamento obtido, e similares. Estas composições, preparações e formulações contêm uma quantidade eficaz da(s) composição(ões), junto com veículos farmacêuticos convencionais e excipientes apropriados para o tipo de administração considerada. Estas composições, preparações e formulações também podem opcionalmente incluir agentes de estabilização e agentes de realce de penetração na pele. Um paciente ou indiví
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26/103 duo, usado equivalentemente aqui, refere-se a um animal. Em particular, um animal refere-se a um mamífero, preferivelmente um ser humano. O indivíduo pode qualquer: (1) ter uma condição diagnosticável, evitável e/ou tratável por administração de um composto ou composição da invenção; ou (2) estar suscetível a uma condição que é diagnosticável, evitável e/ou tratável administrando-se um composto ou composição desta invenção.
[0085] Em uma modalidade, uma composição da invenção é um agente quimioterapêutico.
[0086] Em uma modalidade, a invenção fornece compostos e métodos que envolvem concentrações eficazes preferivelmente de cerca de 10 nM a cerca de 100 μΜ das fórmulas estruturais descritas. Em outra modalide preferida, as concentrações eficazes são de cerca de 200 nM a cerca de 5 μΜ. Em uma modalidade, a concentração eficaz é considerada ser um valor tal como uma concentração de atividade de 50% em um ensaio de ativação de procaspase direto, em um ensaio de indução de apoptose celular, ou em uma avaliação terapêutica clínica animal. Em uma modalidade preferida, tal valor é menor que cerca de 200 μΜ. Em uma modalidade preferida, o valor é menor que cerca de 10 μΜ.
[0087] Compostos da invenção e compostos úteis nos métodos desta invenção incluem aqueles das fórmulas descritas e sais e ésteres destes compostos, incluindo preferivelmente sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis.
[0088] Em uma modalidade, a invenção fornece formas de profármaco de composições. Pró-fármacos dos compostos da invenção são úteis nos métodos desta invenção. Qualquer composto que será convertido in vivo para fornecer uma forma biologicamente, farmaceuticamente ou terapeuticamente ativa de um composto da invenção é um profármaco. Vários exemplos e formas de profármacos são bem co
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27/103 nhecidos na técnica. Uma biomolécula tal como uma proteína precursora ou ácido nucleico precursor pode ser um profármaco. Exemplos de profármacos são encontrados, inter alia, em Design of Prodrugs, editado por H. Bundgaard, (Elsevier, 1985), Methods in Enzymology, Vol. 42, at pp. 309-396, editado por K. Widder, e outro (Academic Press, 1985); A Textbook of Drug Design and Development, editado por Krosgaard-Larsen e H. Bundgaard, Capítulo 5, Design and Application of Prodrugs, by H. Bundgaard, at pp. 113-191, 1991); H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 8, p. 1-38 (1992); H. Bundgaard, e outro, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 77, p. 285 (1988); e Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, páginas 388-392).
[0089] Em uma modalidade, uma composição da invenção está em uma forma que é isolada ou purificada.
[0090] É reconhecido que independente da última correção de qualquer explicação mecanística ou hipótese acreditada ou descrita aqui, uma modalidade da invenção pode ser no entanto operativa e útil.
[0091] Quando um grupo de substituintes é descrito aqui, é compreendido que todos os membros individuais desse grupo e todos os subgrupos, incluindo quaisquer isômeros e enantiômeros dos membros de grupo, são descritos separadamente. Quando um grupo Markush ou outro agrupamento é aqui usado, todos os membros individuais do grupo e todas as combinações e subcombinações possíveis do grupo são pretendidos que sejam incluídos individualmente na descrição. É pretendido que qualquer um ou mais membros dentre qualquer grupo Markush ou listagem fornecido na especificação pode(m) ser excluído(s) da invenção se desejado. Quando um composto é descrito aqui tal que um isômero ou enantiômero particular do composto não é especificado, por exemplo, em uma fórmula ou em um nome
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28/103 químico, esta descrição é pretendida incluir cada isômeros e enantiômero do composto descrito individualmente ou em qualquer combinação. Adicionalmente, a menos que de outra maneira especificado, todas as variantes isotópicas de compostos descritos aqui são pretendidas ser abrangidas pela descrição. Por exemplo, será entendido que qualquer um ou mais hidrogênios em uma molécula descrita pode(m) ser substituído(s) com deutério ou trício. Variantes isotópicas de uma molécula são geralmente úteis como padrões em ensaios para a molécula e em pesquisa química e biológica relacionada à molécula ou seu uso. Nomes específicos de compostos são pretendidos ser exemplares, visto que é conhecido que alguém versado na técnica pode nomear os mesmos compostos diferentemente.
[0092] Moléculas descritas aqui podem conter um ou mais grupos ionizáveis grupos dos quais um próton pode ser removido (por exemplo, -OH,-COOH, etc.) ou adicionados (por exemplo, aminas) ou que podem ser quaternizados (por exemplo, aminas). Todas as possíveis formas iônicas de tais moléculas e sais dos mesmos são pretendidas ser incluídas individualmente aqui na descrição. Com respeito a sais dos compostos aqui, alguém versado na técnica pode selecionar dentre uma ampla variedade de contraíons disponíveis daqueles que são apropriados para preparação de sais desta invenção para um determinada aplicação. Por exemplo, em geral quaisquer ânions podem ser empregados aqui na formação de sais de compostos; por exemplo, haleto, sulfato, carboxilato, acetato, fosfato, nitrato, trifluoroacetato, glicolato, piruvato, oxalato, malato, sucinato, fumarato, tartarato, citrato, benzoato, metanossulfonato, etanossulfonato, p-toluenossulfonato, salicilato e outros.
[0093] Compostos da presente invenção, e sais ou ésteres dos mesmos, podem existir em sua forma tautomérica na qual átomos de hidrogênio são transpostos para outras partes das moléculas e as liga
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29/103 ções químicas entre os átomos das moléculas são por conseguinte rearranjadas. Deveria ser entendido que toda forma tautomérica, na medida em que eles podem existir, estão incluídas dentro da invenção. Adicionalmente, os compostos podem ter isômeros trans e cis e podem conter um ou mais centros quirais, existindo portanto em formas enantioméricas e diastereoméricas. A invenção pode abranger todos os tais isômeros, enantiômeros individuais, bem como misturas de isômeros cis e trans, misturas de diastereômeros; misturas não racêmicas e racêmicas de enantiômeros (isômeros óticos); e as misturas precedentes enriquecidas para uma ou mais formas; exceto quando declarado de outra maneira aqui. Quando nenhuma menção específica é feita da configuração (cis, trans ou R ou S) de um composto (ou de um carbono assimétrico), em seguida qualquer um dos isômeros ou uma mistura de mais de um isômero é pretendido. Os processos para preparação podem usar racematos, enantiômeros, ou diastereômeros como materiais de partida. Quando produtos enantioméricos ou diastereoméricos são preparados, eles podem ser separados por métodos convencionais, por exemplo, por cristalização cromatográfica ou fracionária. Os compostos inventivos podem estar na forma livre ou de hidrato.
[0094] Toda formulação ou combinação de componentes descritos ou exemplificados aqui pode ser usada para praticar a invenção, a menos que de outra maneira declarado.
[0095] Sempre que uma faixa é descrita no pedido presente, por exemplo, uma faixa de temperatura, uma faixa de tempo, um logBB, ou uma composição ou faixa de concentração, todas as faixas e subfaixas intermediárias, bem como todos os valores individuais incluídos nas faixas produzidas são pretendidas que sejam incluídas na descrição.
[0096] Informação em qualquer referência descrita aqui pode em
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30/103 alguns casos indicar o estado da técnica, por exemplo, para documentos de patente a partir de suas datas de arquivamento eficazes; pretende-se que tal informação possa ser empregada aqui, se necessário, para excluir modalidades específicas que são de fato constatadas estar na técnica anterior. Por exemplo, quando um composto é descrito e/ou reivindicado, deve ser entendido que compostos qualificados como técnica anterior com respeito à presente invenção, incluindo compostos aos quais uma descrição facilitadora é fornecida nas referências, não são pretendidos ser incluídos na composição das reivindicações do assunto aqui.
[0097] Algumas referências fornecidas aqui estão incorporadas por referência para fornecer detalhes relativos às fontes de materiais de partida, materiais de partida adicionais, reagentes adicionais, métodos adicionais de síntese, métodos adicionais de análise, e usos adicionais da invenção. Alguém versado na técnica apreciará que materiais de partida, reagentes, substratos sólidos, métodos sintéticos, métodos de purificação, e métodos analíticos diferentes daqueles especificamente exemplificados podem ser empregados na prática da invenção com base no conhecimento na técnica e sem recurso para experimentação indevida.
[0098] A invenção também pode ser entendida pelos seguintes exemplos não limitantes.
Exemplo 1. Terapia Anticâncer Personalizada e PAC-1 [0099] Como também discutido aqui, a apoptose é um tipo de morte celular programada comum em organismos multicelulares. A evasão da apoptose é uma marca oficial de câncer e muitos cânceres são resistente a sinais apoptóticos naturais. Esta resistência é frequentemente devido à expressão aberrante e mutação de proteínas apoptóticas a montante que previnem a própria transmissão de sinais proapoptóticos para proteases de cisteína-ácido aspártico a jusantes, as caspases.
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No final das contas, a ativação da caspase-3 executora é a etapa comprometida fundamental na maioria das séries de reação apoptóticas. Surpreendentemente, a procaspase-3 é superregulada em muitos cânceres porém as alterações na cascata apoptótica a montante impedem de ser ativadas.
[00100] Vários compostos proapoptóticos foram desenvolvidos para alvejar as proteínas apoptóticas a montante de caspase-3. Entretanto, os obstáculos acima mencionados impedem frequentemente estes compostos de terem seu efeito proapoptótico desejado em células cancerosas. Uma estratégia anticâncer personalizada e mais eficaz envolve a ativação direta de proteínas proapoptóticas a jusante de qualquer obstáculo na cascata. figura 1 mostra alguns aspectos de ativação de molécula pequena de procaspase-3.
[00101] Foi informado que PAC-1 como uma molécula pequena que diretamente ativa a procaspase-3 para caspase-3 in vitro e em muitas linhagens de célula cancerosa, induzindo apoptose em células cancerosas (Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 543-550). PAC-1 também mostrou a eficácia em múltiplos modelos de camundongo de cânceres.
[00102] Mutações e expressão aberrante de proteínas apoptóticas a montante previnem os sinais pró-apoptóticos de alcançar caspases efetoras a jusante. O executor fundamental, procaspase-3 é superregulada em muitos cânceres. Muito esforço foi gasto no objetivo de uma molécula pequena capaz de diretamente ativar a procaspase-3. Algum deste esforço é descrito aqui como um antecedente adicional para a presente invenção.
[00103] O Esquema 1 mostra uma Análise de Alta Produtividade exemplar para Ativador de Procaspase-3.
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Figure BRPI1008651B1_D0020
Figure BRPI1008651B1_D0021
□Η
Àm3X = 405 nm
Esquema 1 [00104] ~20.000 Compostos foram avaliados com um substrato cromogênico quanto a sua capacidade de ativar procaspase-3 para caspase-3 ativa. PAC-1 foi identificado como um composto capaz de ativar procaspase-3 em uma maneira dependente de dose. PAC-1-I-8 é um composto estruturalmente relacionado que não mostra nenhuma atividade.
Figure BRPI1008651B1_D0022
PAC-1 [00105] figura 2 mostra que PAC-1 Seletivamente Extermina as Células Cancerosas. PAC-1 induz a morte em células isoladas de tumores de cólon recém ressecados. Tumores de cólon primários recém ressecados (junto com tecido não canceroso adjacente) foi obtido de 23 pessoas, o tecido canceroso e não canceroso foi separado. PAC-1 induz a morte celular de uma maneira proporcional à concentração celular de procaspase-3. Os círculos representam as células cancerosas primárias dos 23 tumores de cólon. Os triângulos pretos representam uma variedade de linhagens de célula cancerosa. Os diamantes são quatro tipos de célula não cancerosa: Hs888Lu (células de fibroblasto pulmonares), MCF-10A (células de fibroblasto de mama), Hs578Bst (células epiteliais de mama) e glóbulos brancos isolados da medula óssea de um doador saudável. Os quadrados são as células não canPetição 870190064046, de 09/07/2019, pág. 37/117
33/103 cerosas primárias isoladas das margens de tumor das 23 pessoas. [00106] As figuras 3 e 4 mostram o retardamento de PAC-1 do crescimento de tumor em modelos de xenoenxerto de camundongo de câncer. (Putt, e outro, Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 543-550.) Para figura 3, os tumores foram formados em camundongos usando a linhagem celular NCI-H226 (câncer de pulmão) por injeção subcutânea, com oito camundongos em cada grupo e três tumores por camundongo. PAC-1 ou veículo foi administrado uma vez por dia por gavagem oral em 1-21 dias. Barras de erro são s.e.m. Para figura 4, os Camundongos foram injetados com a linhagem celular NCI-H226. Os camundongos foram tratados com PAC-1 (100 mg kg-1) por meio de gavagem oral que segue o protocolo descrito em (Putt, e outro, Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 543-550.). Os pulmões dos camundongos de controle têm uma quantidade grande de massa de tumor cinza, considerando que os camundongos que receberam PAC-1 não têm quase nenhum tumor visível.
[00107] Íons de zinco são conhecidos por inibirem procaspase-3. PAC-1 pode ativar a procaspase-3 na presença de zinco de uma maneira dependente de dose e trocar a IC50 de inibição de zinco. PAC-1I-8 não pode ativar procaspase-3, porém mostra a inibição em concentrações altas. figuras 5, 6 e 7 mostra que PAC-1 alivia a Inibição de Zn2+ de Procaspase-3. O efeito de uma faixa de concentrações de zinco sobre a atividade enzimática de caspase-3 e procaspase-3 foi examinado. Todos os tampões foram tratados primeiro com resina Chelex© para remover quaisquer contaminantes de metal de traço. Como a procaspase-3 se autoproteolizará lentamente para ativar a caspase-3, o mutante triplo de procaspase-3 no qual todos os três sítios de clivagem de caspase foram removidos (D9A/D28A/D175A) foi criado. Consistente com os dados na literatura, este mutante triplo de procaspase-3 é proteoliticamente estável e tem atividade de ~200 vezes menor que aquele de caspase-3 (dados não mostrados). Ensaios
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34/103 de enzima na presença de zinco indica que este metal inibe poderosamente a caspase-3 (dados não mostrados), procaspase-3 (dados não mostrados), e o mutante de procaspase-3 (D9A/D28A/D175A) (figura 5). figura 8 mostra que PAC-1 realça a atividade de mutante de procaspase-3 (D9A/D28A/D175A) (D3A) quando analisado em um tampão contendo 10 μΜ de ZnSO4. Como mostrado, PAC-1 na verdade inibe estas três enzimas em concentrações de composto altas. Dados mostrados são representativos de três tentativas. figura 7 mostra PAC-1-I-8 realça a atividade de mutante de procaspase-3 (D9A/D28A/ D175A) (D3A) quando analisada em um tampão contendo 10 μΜ de ZnSO4. PAC-1-I-8 na verdade inibe esta enzima em concentrações de composto altas mesmo na ausência de ZnSO4.
[00108] figuras 8, 9 e 10 mostra que PAC-1 é um quelador de metal. Na presença de zinco, PAC-1 mostra um aumento característico na absorvência em 405 nm. O derivado inativo não mostra nenhuma alteração na absorvência mesmo em concentrações altas de zinco. Usando esta troca de absorvência, a constante de ligação para o complexo PAC-1: Zn2+ pode ser determinada pelo método de variação contínuo. Como mostrado na figura 8, a titulação de PAC-1 com quantidades crescentes de ZnSO4 resulta em uma alteração no espectro visível a UV deste composto. Esta troca na absorvência molar na ligação de Zn2+ fornece um método conveniente para determinar igualmente a estequiometria de ligação de PAC-1-Zn2+ q e a constante de dissociação desta interação. Uma versão modificada do método de variações contínuas foi usada para esta determinação. A absorvência em 410 nm foi adquirida para várias frações em mol de ZnSO4 e PAC-1 com uma concentração total de 50 μΜ. Estes valores foram normalizados em seguida contra a absorvência máxima possível na ponto estequiomeria (isto é, quando todos de Zn2+ são ligados por PAC-1 em excesso) que foi fixado como 1. A aplicação do método das variações contí
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35/103 nuas revelou que PAC-1 liga Zn2+ em uma estequiomteria de 1:1, como comprovado pelo pico em fração de 0,5 mol no gráfico na figura 9. Também evidente a partir da figura 9 é a natureza muito forte desta interação de molécula pequena - metal. Na estequiometria de 1:1, PAC-1 tem trocado sua absorção ao estado ligado por zinco quase completamente (96% de PAC-1 são ligados por Zn2+ em uma relação de 1:1 de PAC-1-Zn2+). Usando este valor de 96% e a equação log Ka=0,3010-log M+log ymáx-2log (1-ymáx), foi obtida uma Kd=42nM para a interação de PAC-1-Zn2+. Enquanto a Kd para a interação de PAC-1-Zn2+ é 42 nM, como mostrado na figura 8, uma alteração de absorvência ainda é observada com concentrações micromolares de zinco. Isto é devido à concentração alta de ligante total (50 μΜ) nesta experiência em relação à Kd. Com base nas concentrações de zinco e PAC-1 utilizadas nesta experiência, a equação de Adair prediz uma ocupação de sítio média de população quase máxima para o complexo PAC-1-Zn2+ em ~30 μΜ de zinco, consistente com os dados obtidos (figura 8). Titulação de ZnSO4 em PAC-1-I-8 não produziu nenhuma alteração espectral quando monitorada por espectroscopia de UV-vis, consistente com a noção que PAC-1-8 não liga Zn2+. Para confirmar este resultado, um segundo método foi usado para determinar a constante de dissociação de PAC-1-Zn2+. Nesta experiência, um complexo pré-formado de PAC-1 e Zn2+ foi titulado com EGTA ácido etileno glicol bis(éter p-aminoetil)N,N’-tetra-acético, um aglutinante de metal com uma afinidade conhecida para Zn2+, e a absorvência em 410 nm foi monitorada. Usando o valor de literatura para a constante de associação de EGTA-Zn2+, foi calculada a constante de dissociação de PAC1-Zn2+ como 55 nM, em geral de acordo com Kd de 42 nM calculada através do método de variações contínuas. figura 10 mostra a titulação de ZnSO4 em uma solução de PAC-1-I-8 (50 μΜ em Hepes a 50 mM, KNO3 a 100 mM, tampão em pH 7,2) não causa uma alteração nos
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36/103 espectros visíveis a UV de PAC-1-I-8. Mostradas são as concentrações de ZnSO4 de 0 a 70 pM em 5 pM de incrementos.
Exemplo 2. Sínteses de PAC-1 e Derivados [00109] A modelagem molecular resultou no conformista de energia mais baixa do complexo de PAC-1-Zn2+ mostrado na figura 15. Esta estrutura foi obtida de uma procura conformacional dentre 23 conformistas de baixa energia usando campo de força de MMFF. O modelo sugere a interação com o esqueleto de N-acil hidrazona, a hidroxila fenólica e uma interação de cátion-pi com o anel de benzila.
[00110] Uma família de derivados de PAC-1 estruturalmente modificados foi sintetizada para investigar estes componentes estruturais e seu papel na ligação de zinco e o potencial citotóxico desta família de compostos.
[00111] Quatro classes de derivados foram sintetizadas para investigar a posição fenólica (classe I), o grupo benzila (classe II), a combinação destes anéis (classe III) e o esqueleto de N-acil hidrazona (classe IV). Estas classes são mostradas acima no Esquema 2.
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37/103
I
Figure BRPI1008651B1_D0023
II
III
Figure BRPI1008651B1_D0024
Figure BRPI1008651B1_D0025
IV
Esquema 2 [00112]
Informação adicional abrange estes compostos e classes são encontradas em: Peterson, e outro, J. Med. Chem. 2009, 52,
5721-5731. A maioria dos compostos de Classe l-lll foi sintetizada como mostrado no Esquema 3A, por meio de condensação das hidrazidas e aldeídos apropriados. Como mostrado no Esquema 3A, rendimentos para esta condensação estavam entre 72 e 95%, a exceção sendo 1g, que espontaneamente forma um dímero de dissulfeto, resultando em um rendimento diminuído. Através de tais reações de condensação, 11 derivados de Classe I (1 a-k), 7 derivados de Classe Il (2a-g), e 1 derivado de Classe III (3) foram sintetizados. Os blocos de construção de hidrazida no Esquema 1 foram sintetizados através da reação de vários cloretos de benzila com piperazina, alquilação dos produtos resultantes com cloroacetato de etila, seguido por reação do éster resultante com hidrazina. Os blocos de construção de aldeído
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38/103 foram adquiridos ou sintetizados de materiais de partida simples. Três derivados de Classe IV também poderíam ser sintetizados através de reações de condensação análogas. Desse modo, os compostos necessitando de um dentre dois nitrogênios de piperazina (4a-c) foram sintetizados das hidrazidas e aldeídos correspondentes como mostrado no Esquema 3, eqs 1 e [00113] 2. Entretanto, vários derivado na Classe IV não podem ser sintetizados por meio de reações de condensação análogas e vias sintéticas alternativas requeridas. Desse modo, composto 4d foi sintetizado por redução da hidrazona em PAC-1 usando NaCNBH3 (Esquema 4A, eq 3). Os compostos 4e-g foram sintetizados por reação de 27 com o cloreto apropriado (Esquema 4A, eqs 4-6). Estas classes sondam a eletrônica destes sistemas de anel bem como os heteroátomos coordenados envolvidos no complexo.
Figure BRPI1008651B1_D0026
71% refluxo 22 h
EtOH, refluxo 19 h
Figure BRPI1008651B1_D0027
Figure BRPI1008651B1_D0028
c HCI, EtOH, refluxo 13 h
Figure BRPI1008651B1_D0029
PAC-1
Figure BRPI1008651B1_D0030
Alila Br, K2CO;
DMF, temperatura
Figure BRPI1008651B1_D0031
microondas: 100W ambiente, 2-3 h
97% líquido 10 min
Figure BRPI1008651B1_D0032
Esquema 3. Síntese de PAC-1 [00114] Com alternação de substituinte em ambos anéis, derivados de PAC-1 de classe l-lll foram sintetizados com a mesma via como
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Figure BRPI1008651B1_D0033
Figure BRPI1008651B1_D0034
mostrado no Esquema 3A:
Figure BRPI1008651B1_D0035
Figure BRPI1008651B1_D0036
Hidrazida
Aldeído
Pro- Rendiduto mento
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 13 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 1 95%
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 14 r5= oh, r6, R7 = h 1a
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 15 Rs= MeS, Re, R7 = H 1b
5 Ri,R2, R3i R4 = H, Xi,X2,X3 = C 16 r5= nh2, r6, R7 = h 1c
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 17 r5= cooh, r6, R7 = h 1d
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 18 Rs= CO2Me, Re, R7 = H 1e
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 19 R5= Cl, R6, R7 = h 1f
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 20 r5= sh, r6, R7 = h ig
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 21 Rs, Re, R7 = H 1h
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 22 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 1j
5 Ri,R2, R3i R4 = H,Xi,X2, X3 = C 23 Rs= OMe, Re = Alila, R7 = H 1k
6 Ri, R2, R3i R4 = H, Xi, = N, X2, X3 = C 13 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 2a
7 Ri, R2, R3i R4 = H, Xi, = N, X2, = N, X3 = C 13 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 2b
8 Ri, R2, R3i R4 = H, Xi, X2, = C, X3 = N 13 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 2c
9 R-ι, R2, = H, R3,= F, R4 = H, Xi, X2, X3 = C 13 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 2d
10 Ri, = OMe, R2, R3, Rá = H, R4, = OMe Xi,X2, X3 = C 13 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 2e
11 R1, R2 =H, Rs = OMe, R4, = H, X1, X2, Xs = C 13 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 2f
12 R1, = H, R2 = NO2, R3i R4i= H, Xi, X2, Xs = C 13 R5= OH, R6 = Alila, R7 = H 2g
10 R1, = OMe, R2, R3 = H, R4 = OMe X1, 14 r5= oh, r6, R7 = h 3
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X3 = C
Esquema 3A. Nota-se que variáveis R são fornecidas para este esquema e o uso não é necessariamente igual ao restante da descrição. Todas as tais variações ao longo da descrição são facilmente compreendidas por alguém versado na técnica.
[00115] Compostos de classe IV foram sintetizados com modificação leve como mostrado abaixo.
Figure BRPI1008651B1_D0037
H
Figure BRPI1008651B1_D0038
67%
PAC-1-IV-4
NaCNBH3
3:1/THF:AcOH
Figure BRPI1008651B1_D0039
temperatura ambiente, 24 h
Figure BRPI1008651B1_D0040
Figure BRPI1008651B1_D0041
PyBOP, DIPEA
CH2CI2
MW:60 °C, 30min, 300W
45-57%
Figure BRPI1008651B1_D0042
PAC-1 -IV-7
Esquema 4. Síntese de compostos de classe IV.
[00116] Alguns compostos de classe IV foram sintetizados usando o método mostrado no Esquema 4A.
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Figure BRPI1008651B1_D0043
refluxo, 16 h
Figure BRPI1008651B1_D0044
Figure BRPI1008651B1_D0045
Figure BRPI1008651B1_D0046
Figure BRPI1008651B1_D0047
Esquema 4A.
[00117] Métodos sintéticos para as quatro classes de compostos são fornecidos aqui. Material - Todos os reagentes foram obtidos de Fisher a menos que de outra maneira indicado. Todos os tampões foram feitos com água purificada MilliQ. Ac-DEVD-pNA foi sintetizado. Caldo de Luria (LB) foi obtido de EMD. Etoposídeo foi obtido de Sigma. Tampão de Atividade de Caspase contém Hepes a 50 mM (pH 7,4), NaCI a 300 mM é tratado com Chelex®. Tampão de ligação de Ni NTA contém Tris a 50 mM (pH 8,0), NaCI a 300 mM, e imidazol a 10 mM. Tampão de Lavagem Ni NTA contém Tris a 50 mM (pH 8,0), NaCI a 300 mM, e imidazol a 20 mM. Tampão de Eluição Ni NTA contém Tris a 50 mM (pH 8,0), NaCI a 300 mM, e imidazol a 500 mM. Tampão de Ligação Anexina V contém HEPES a 10 mM pH 7,4, NaCI a 140
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42/103 mM, CaCI2 a 2,5 mM, BSA a 0,1%. As proteínas de procaspase-3 rotuladas por 6xHis de terminal C foram expressas como descrito abaixo.
[00118] Cultura Celular - Células de linfoma humanas U937 e células de melanoma humanas SK-Mel-5 foram obtidas de ATCC. As células foram cultivadas em meio de crescimento RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% e pen-estrep. a 1%. As células foram incubadas a 37 °C e CO2 a 5%. Subcultura de células SK-Mel-5 foi obtida através de tripsinização de monocamada de célula usando diluição de TrisinaEDTA a 0,05% (Gibco) e outra cultura em meio de crescimento RPMI 1640 suplementado com FBS e pen-estrep. como acima.
[00119] Ensaio de Morte Celular - Células de linfoma humanas U937 foram semeadas nas cavidades de placa de 96 cavidades em uma densidade de 5000 células por cavidade em 200 pL de meio de crescimento RPMI 1640 com FBS a 10% e pen-estrep. a 1%. A cada cavidade foi adicionado 2 pL de soluções de matéria-prima de composto 100X em DMSO em concentrações variadas de forma que as células sejam tratadas com concentrações entre 0 pM e 100 pM de composto. Cada concentração foi testada cinco vezes. Em cada placa, 5 cavidades receberam 10 pM de etoposídeo como um controle positivo e 5 cavidades receberam 2 pL de DMSO como um controle negativo. As placas foram em seguida incubadas a 37 °C e CO2 a 5% durante 72 horas. Depois do período de incubação de 72 horas, as placas foram analisadas usando um ensaio de Sulforrodamina B como previamente descrito. Especificamente, a cada cavidade da placa foram adicionados 50 pL de uma solução a 80% (p/v) de TCA em H2O e as placas foram permitidas descansar durante a noite a 4 °C. As placas foram em seguida lavadas suavemente com um vapor de H2O cinco vezes para remover o TCA em excesso e as proteínas de soro precipitadas. As placas foram em seguida permitidas secar a ar depois que
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100 pL de uma Sulforrodamina B a 0,057% (p/v) em uma solução de ácido acético a 1% (v/v) foram adicionados a cada cavidade e permitidas manchar durante 30 minutos em temperatura ambiente. Depois do manchamento, as cavidades foram lavadas 5 vezes suavemente com 100 pL de ácido acético a 1% (v/v) para remover a tintura não ligada. As placas foram em seguida permitidas secar a ar. 200 pL de base de Tris a 10 mM (pH 10,5) foram em seguida adicionados a cada cavidade e as placas foram colocadas em um agitador orbital durante cinco minutos. O OD foi em seguida lido em 510 nm em uma leitora de placa Molecular Dynamics o percentual de morte celular calculado e normalizado ao controle positivo (100% de morte celular) e o controle negativo (0% de morte celular). O percentual de morte celular foi calculado por média para cada concentração de composto e plotado como uma função da concentração de composto. Os dados foram ajustados em uma curva de dose resposta logística usando a curva de Tabela 2D e o valor de IC50 foi calculado. A experiência foi repetida três vezes e a média dos valores de IC50 calculados foi relatada. O erro padrão da média (SEM) foi determinado e relacionado para as experiências triplicadas. As curvas de dose-resposta individuais não são mostradas.
[00120] A expressão recombinante e purificação de procaspase3/caspase-3- Procaspase-3 e caspase-3 foram recombinantemente expressas e purificadas exatamente como previamente descrito. Brevemente, procaspase-3 e caspase-3 foram expressas do plasmídeo de expressão pHC332 na cepa BL21 eletrocompetente (DE3) de Escherichia coli (Novagen). A proteína C-terminalmente rotulada por 6xHis foi purificada usando a resina Ni NTA (Qiagen). As frações contendo proteína contendo foram coletadas e agrupadas. A proteína purificada foi em seguida também purificada para remover qualquer zinco contaminante aplicando-se a proteína a uma coluna PD-10 (GE Healthcare) carregada com Tampão de Atividade de Caspase que tinha sido trata
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44/103 do com resina Chelex®. Os frações contendo proteína, livre de zinco resultante em Tampão de Atividade de Caspase foram agrupadas, a concentração determinada e a solução de proteína foi congelada instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenada a -80°C.
[00121] Ensaio de Atividade de Caspase-3 - Matérias-prinas livres de zinco (2X) de caspase-3 (1 μΜ) foram preparados em Tampão de Atividade de Caspase. Soluções de matéria-prima de composto foram feitas (2X) em várias concentrações de 200 μΜ a 200nM em Tampão de Atividade de Caspase. Uma matéria-prima (10X) de ZnSO4 (25 μΜ) em Tampão de Atividade de Caspase foi preparada. A cada cavidade de placa de 384 cavidades foram adicionados 20 μΐ de caspase-3 (500 nM final), 20 μΐ de matéria-prima de composto, e 5 μΐ de ZnSO4 (2,5 μΜ final) ou tampão. Cada placa continha cavidades de controle positivo (0 μΜ de zinco e nenhum composto) e cavidades de controle negativo (2,5 μΜ de zinco e nenhum composto). As placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, a cada cavidade da placa foram adicionados 5 μΐ de uma matéri-prima a 2 ίηΜ de substrato de Ac-DEVD-pNA e a absorvência em 405 nm foi monitorado imediatamente a cada 1 minuto durante 30 minutos em uma leitora de placa spectramax Molecular Devices, Sunny Vale, CA). O declive de cada cavidade foi usado para determinar a atividade e foi normalizado às cavidades de controle positivo e negativo para produzir uma atividade percentual. Foi calculada a média dos dados para cada concentração de composto (4 cavidades) e a atividade percentual foi plotada como uma função de concentração de composto. Os dados foram analisados usando a Curva da Tabela 2D e ajustados em uma curva de dose-resposta logística. A maioria dos compostos obtidos obtiveram uma atividade máxima em 10 μΜ. A atividade percentual em 10 μΜ foi determinada para cada composto e relatada como uma média da três experiências replicadas com o SEM correspondente. As
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45/103 curvas de dose-resposta individuais não são mostradas.
[00122] Ensaio de Titulação de Fluorescência de EGTA - Este ensaio de titulação é com base em um protocolo publicado. Antes da titulação, a cubeta foi preenchida com EDTA (10 mM) durante 10 min, seguido por água desionizada estéril e acetona lavando para remover quaisquer íons de metal residual. PAC-1 ou derivado (60 μΜ) foi adicionado a um cubeta contendo tampão (Hepes: 50 mM, KNO3: 100 mM, pH 7,2) com EGTA (7,3 mM) para obter uma diluição de 10 vezes (concentração de PAC-1 final: 6 μM). Zn(OTf)2 (0-10 mM) foi adicionado incrementalmente. A formação do complexo Zn-PAC-1 (ou derivado) foi monitorado pelo aumento na intensidade de fluorescência (ex/em: 410 nm/475nm). A intensidade de fluorescência em 475 nm foi plotado contra concentração de Zn livre ([Zn]f/M) calculada usando o programa MaxQuelador. Os dados foram analisados usando KaleidaGraph e ajustados a uma curva de formação com base na Eq S1 derivada por protocolo publicado.
I = (ImínKD + lmáx[Zn]f)/(KD + [Zn]f) onde lmín e Imáx foram definidos como a intensidade de fluorescência da sonda livre (PAC-1 ou derivado neste caso) e aquela do complexo Zn-sonda respectivamente.
[00123] Manchamento lmunofluorescente - Lamínulas de borossilicato no. 1 de 18 mm redondas (VWR) foram revestidas com poli-lisina agitando-se a lamínula em uma solução de poli-lisina (Sigma) durante 1 hora e lavando em seguida com MilliQ. Células de melanoma humanas SK-Mel-5 foram cultivadas na lamínula revestida com poli-lisina na base de uma placa de 12 cavidades. Quando as Células obtiveram 80% de confluência, as células foram tratadas com DMSO ou 100 μM de PAC-1 em DMSO (DMSO total < 1%) durante 1 hora. As células foram em seguida lavadas duas vezes com 1 mL de PBS e fixadas em formaldeído a 3,7% em PBS durante 10-15 minutos em temperatura
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46/103 ambiente. As células foram lavadas em seguida novamente duas vezes com PBS e em seguida permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% em PBS durante 5 minutos. As células foram bloqueadas em seguida em BSA a 3%em PBS durante 10 minutos e incubadas com um anticorpo anti-procaspase-3 de coelho 1:500 durante 1 hora. A lamínula foi em seguida lavada 5 vezes com PBS e incubada com uma diluição de 1:1000 do anticorpo conjugado de Alexafluor 647 anticoelho secundário durante 20 minutos protegido da luz. A lamínula foi lavada novamente 5 vezes com PBS e uma vez com MiIIiQ H2O. A lamínula foi em seguida montada em lâminas de vidro usando Fluorosave (Calbiochem) e armazenada no escuro até imageamento. As células foram imageadas em um microscópio Leica SP2 Multiphoton Confocal.
[00124] Imageamento de Célula Viva - Células SK-Mel-5 foram cultivadas na base de câmaras de crescimento de borossilicato no. 1 (Nunc) a uma confluência de ~80%. As células foram em seguida tratadas com DMSO, 25 μΜ de FAM-DEVD-fmk em DMSO, 25 μΜ de AF350-PAC-1 em DMSO, ou ambos 25 μM de FAM-DEVD-fmk e 25 μM de AF350-PAC-1 simultaneamente durante 1 hora a 37 °C e CO2 a 5%. As células foram em seguida lavadas 5 vezes com meio de crescimento RPMI 1640 necessitando de vermelho fenol. As células foram em seguida permitidas também incubar a 37 °C durante 2 horas antes do imageamento. Para células manchadas com verde SYBR para manchamento nuclear, uma diluição de 1:100.000 de verde SYBR em meios foi adicionada imediatamente antes do imageamento. As células foram imageadas em um microscópio Leica SP2 Multifoton Confocal.
[00125] Análise de Imagem - As imagens foram ajustadas em brilho e contraste para permitir claridade. Nas imagens, o canal vermelho foi ajustado usando Image J para refletir um gradiente de intensidade linear entre 10 e 28. Para o canal verde, as imagens foram ajustadas a um gradiente de intensidade linear entre 0 e 44. Para explicar o offset
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47/103 das óticas do microscópio, o canal vermelho foi compensado manualmente por 5 pixels na direção x e o canal verde foi compensado manualmente por 6 pixels na direção i. As imagens foram filtradas com uma mancha de Gaussian com um raio de 1 pixel para melhorar a relação sinal/ruído. Usando o tampão Image J em, JACoP, a % de sobreposição foi determinada usando o coeficiente de sobreposição Manders.
[00126] Indução de Apoptose por derivados de PAC-1 - Células U937 (1 mL de 1 x 106 células /mL) foi tratada com 5 pL de matériasprimas de etanol dos vários compostos para alcançar uma concentração final de 50 μΜ. As células foram incubadas a 37 °C durante 12 horas. As células foram centrifugadas (200g durante 5 min), lavadas com PBS (2 mL), ressuspensas em 500 μL de Tampão de Ligação Annexin V. Para cada amostra foram adicionados 10 μL de mancha de Annexin V conjugada por FITC (Southern Biotech) e 10 μL de iodeto de propídio (Sigma) a uma concentração final de 50 μg/mL. As populações de célula foram analisadas em um citômetro de fluxo de célula Benton Dickinson LSR Il.
Materiais e Métodos
Geral [00127] Todas as reações que requerem condições anidras foram conduzidas sob uma atmosfera positiva de nitrogênio ou argônio em artigos de vidro secados em forno. Técnicas de seringa padrão foram usadas para adição anidro de líquidos. Tetra-hidrofurano seco foi obtido ignorando-se as colunas de alumina ativadas ou peneiras moleculares em um sistema de purificação de solvente comercial (Innovative Technologies). A menos que de outra maneira notado, todos os materiais de partida, solventes e reagentes foram adquiridos de fornecedores comerciais e usados sem outra purificação. Cromatografia flash foi realizada usando sílica-gel de 230-400 malha. Hidrazida 5, PAC-1, 1a,
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1h,, 3-alilsalicilaldeído, 2-mercaptobenzaldeído, 23, 30, 44 foram preparados de acordo com o método da literatura com modificações. Análise de Composta [00128] Todas as experiências de RMN foram registradas em CDCI3 (Sigma), CD3OD (sigma) ou Acetona-d6 (Sigma) em um espectrômetro Varian Unity 400 MHz ou 500 MHz com solvente não deuterado residual como a referência interna. Desvio químico, δ (ppm); constantes de acoplamento, J (Hz); multiplicidade (s = singleto, d = dubleto, t = tripleto, q = quarteto, m = multipleto); e integração são relatados. Dados espectrais de massa de alta resolução foram registrados em um espectrômetro de massa de ESI de tempo de trajetória/quadripolar híbrido Micromass Q-Tof Ultima na University of Illinois Mass Spectrometry Laboratory. Todos os pontos de fusão são não corrigidos. HPLC analítica realizada em um coluna Altima C18, 2,1x20 mm, fase móvel A é TFA a 0,1% em H2O, B é acetonitrila usando um sistema de gradiente de 0-45% de B durante 5 min, em seguida 4555% de B de 5-10 min, em seguida 55-100% de B durante 10-15 min, constante 100% durante 15-20 min, e de 100-0% durante 20-25. LCMS realizada em uma coluna C18, 2,1x5 mm, fase móvel A é TFA a 0,1% em H2O, B é acetonitrila usando um sistema de gradiente com constante 0% B durante 0-2 min, em seguida 0-50% de B de 2-5 min, em seguida 50-100% de B durante 5-7 min, constante 100% durante 7-8 min, e de -0% durante 8-10.
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Esquema S1. Sínteses de derivados de PAC-1
Figure BRPI1008651B1_D0048
38. S1. = H. F? = GF~. R4 - K, Kf.X-.S5 = C '36' P1 = H. S.-= ?ÍO;. S'1. S4 = H, :<·.iW = C refluxo 15-18 h
Figure BRPI1008651B1_D0049
Figure BRPI1008651B1_D0050
5; S- FFF4?4 = Η. X'.X4 ,*
S: RfR'R'S8 = 4...X’ = M í
T. R'..PÍ G5 ?4 = >4. X1 =c. .x^ = n. >:s
8: = H..X1..X; = C. K3= íi
EtOH, refluxo
15-17h
Figure BRPI1008651B1_D0051
f 3-0, -íh-s iac.
1&·. p’ = ΟΜΐ. R-. f; - 4. R4 = Offe x-.xí.>::! = c H. íl.sí= H. R’ = OM». KJ = H, .<' s; = £ 11R: = H. =5 = 1¾. ='. = χ’λ4.?;5» c
Figure BRPI1008651B1_D0052
Esquema S2. Síntese de 4C
O
Figure BRPI1008651B1_D0053
acetona, renuxo, 2U n
NI-bNI-b
Figure BRPI1008651B1_D0054
EtOH, refluxo 18 h
Figure BRPI1008651B1_D0055
EtOH, refluxo 13 h
4c
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Figure BRPI1008651B1_D0056
Esquema S3. Síntese de 4a-b
Figure BRPI1008651B1_D0057
R= Bn,4a R = t-BOC, 4b
NH2NH2
EtOH, refluxo, 19 h
R =Bn, 24 R = f-BOC, 25
Esquema S4. Síntese de 4f - g
Figure BRPI1008651B1_D0058
Figure BRPI1008651B1_D0059
Cl1:1 DCM/ saturado NaHCO3
Temperatura ambiente 4h
O CH
Figure BRPI1008651B1_D0060
Π= 1.30 (88½)
KíCCh
Figure BRPI1008651B1_D0061
n^2.
n = 1. 4s(6e%)
Figure BRPI1008651B1_D0062
Figure BRPI1008651B1_D0063
2,3 acetona/cloroOH
Figure BRPI1008651B1_D0064
THF, refluxo 2,5 h
Figure BRPI1008651B1_D0065
fórmio refluxo 18 h
Esquema S5. Síntese de 2d e 4e
Figure BRPI1008651B1_D0066
HNMe-NH2
Etanol, refluxo 17 h
Figure BRPI1008651B1_D0067
Figure BRPI1008651B1_D0068
1:1 DCM/ saturado NaHCO3
Temperatura ambiente 4h
Figure BRPI1008651B1_D0069
R = H, 46 (34¾)
R - Me, 47 (&9%)
R = H 48(33%)
R = Me, 28 (91%)
Figure BRPI1008651B1_D0070
acetona refluxo, 18 h
Figure BRPI1008651B1_D0071
I
R
R - H R’ = F íd (64%)
R = Me. R’ - H 4e (81%)
Figure BRPI1008651B1_D0072
Figure BRPI1008651B1_D0073
(SS%)
Exemplo 3. Avaliação de Derivado de PAC-1 [00129] figura 11 mostra alívio da inibição de caspase-3 mediada
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51/103 por zinco para o composto I-II-7. figura 12 mostra alívio da inibição de caspase-3 mediada por zinco para composto I-IV-3. Os gráficos representam três experiências de dose resposta separadas. As barras de erro representam o erro padrão da média para cada ponto de dados. figura 13 mostra os espectros de absorvência para o composto 1-II-6 com e sem zinco.
[00130] Derivado de PAC-1 foram avaliados em cultura celular e em ensaios in vitro quanto a sua capacidade de exterminar células cancerosas, ativar procaspase-3 in vitro, e ligar zinco. Compostos que ativam procaspase-3 geralmente têm baixos valores de IC50 em células U937. Dados exemplares são mostrados abaixo nas Tabelas 1-4.
[00131] A indução de morte celular foi determinada usando a linhagem celular U-937 (linfoma humano). Células U-937 crescem em cultura como uma suspensão. Para estas experiências, as células foram expostas a uma faixa de concentrações de composto durante 72 h, a morte celular foi quantificada por meio de um ensaio de sulforrodamina B, e valores de IC50 foram calculados de curvas de dose-resposta logísticas.
[00132] A partir dos dados, é visto que (1) derivados de PAC-1 que não podem ligar zinco não ativam a caspase-3 in vitro, e não induzem apreciavelmente a morte em células U-937 em cultura. Esta informação sugere que a capacidade de ligação de zinco de PAC-1 é importante para suas propriedades de indução de morte celular. (2) O motivo orto-hidróxi N-acilhidrazona é crítico para ligação de zinco. (3) Virtualmente todos compostos que ligam zinco ativam a caspase-3 in vitro e induzem a morte em células U-937 em cultura. Apenas os compostos l-IV-1 e l-IV-2, que não mostram ativação de caspase-3 in vitro porém ainda são citotóxicos às células U-937, são exceções a esta tendência. De forma interessante, foi constatado que estes dois compostos (a uma concentração de 10 μΜ) são inibidores razoavelmente
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52/103 potentes da atividade enzimática de caspase-3; desse modo, qualquer efeito ativador do composto pode ser mascarado por esta inibição. Este efeito de inibição é consistente com dados anteriores mostrando que PAC-1 também inibirá procaspase-3/caspase-3 em altas concentrações de composto.
Tabela 1. Compostos de classe I
Composto
PAC-1
PAC-1-1-1
PAC-1-I-2
PAC-1-I-3
PAC-1-I-4
PAC-1-I-5
PAC-1-I-6
PAC-1-I-7
PAC-1-I-8
PAC-1-I-9
PAC-1-ΙΙΟ
PAC-1-I11
Estrutura
Figure BRPI1008651B1_D0074
H
Figure BRPI1008651B1_D0075
H
Figure BRPI1008651B1_D0076
Figure BRPI1008651B1_D0077
Figure BRPI1008651B1_D0078
μ
Figure BRPI1008651B1_D0079
U937 (ICso μΜ)
Caspase-3 (% de Ativação em 10 pm)
Ligação de Zinco (KD) nM
4,8 ± 1,0 45,8 ±4,8 50
15,3 ±2,0 30 ±2 79
61 ±22 0 ND
>100 0 ND
>100 0 ND
>100 0 ND
57 ±5 0 ND
>100 0 ND
>100 0 ND
>100 0 ND
1,8 ±0,4 59 ±5 46
32 ±12 0 ND
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53/103
Tabela 2. Compostos de classe II:
Composto
PAC-1-11-1
PAC-1-II-2
PAC-1 -II-3
PAC-1-II-4
PAC-1-II-5
PAC-1-II-6
Estrutura
Figure BRPI1008651B1_D0080
Tabela 3. Compostos de classe III:
Composto
PAC-1-II1-1
Estrutura
0Me
Figure BRPI1008651B1_D0081
Caspase-3
U937 (IC50 μΜ) (% de Ativação em 10 pm) Ligação de Zinco (KD) nM
9,5 ±1,8 48 ±3 76
14±2 20,6 ± 1,6 70
21 ±6 26,3 ±0,2 50
2,0 ±0,2 24,2 ± 1,7 96
1,0 ± 0,1 31 ±3,6 36
2,7 ±0,8 24 ± 3,4 41
U937 (IC50 μΜ) Caspase-3 (% de Ativação em 10 pm) Ligação de Zinco (KD) nM
12±2 30,7 ± 1,2 68
Tabela 4. Compostos de classe IV:
Composto
PAC-1-IV-1
PAC-1-IV-2
PAC-1-IV-3
PAC-1-IV-4
PAC-1-IV-5
Estrutura
Figure BRPI1008651B1_D0082
Figure BRPI1008651B1_D0083
Figure BRPI1008651B1_D0084
Figure BRPI1008651B1_D0085
Figure BRPI1008651B1_D0086
Me
U937 (IC50 μΜ) Caspase-3 (% de Ativação em 10 pm) Ligação de Zinco (KD) nM
28±1,1 0 ND
6,5±3,6 0 ND
2,7±1,1 36±3* 50
59±14 17,1±1,2 ND
22±3 0 ND
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54/103
PAC-1-IV-6
PAC-1-IV-7
Figure BRPI1008651B1_D0087
>100 4,1±1,0 ND >100 4,4±0,9 ND
Exemplo 4. Microscopia Confocal [00133] Microscopia confocal foi realizada com PAC-1 fluorescente para investigar a localização sub-celular de PAC-1 em células, para confirmar que PAC-1 mata células cancerosas ligando-se ao Zn2+. A versão fluorescente de PAC-1 foi sintetizada clicando Alexa Fluor 350 em PAC-1 como mostrado no Esquema 5.
Figure BRPI1008651B1_D0088
Figure BRPI1008651B1_D0089
Esquema 5.
[00134] O composto fluorescentemente rotulado AF-PAC-1 mostrado acima tem atividade similar àquela de PAC-1 nestes ensaios (IC50 versus células U-937 =14,8 (3,2 μΜ; ativação de caspase-3 em 10 μΜ = 6,3 (1,6% e em 50 μΜ=20 (3%; Kd para zinco=61 (9 nM). figura 14 mostra os resultados do estudo de microscopia confocal. A colocalização de AF-PAC-1 com sítios de atividade enzimática de caspase-3/-7. Células SK-MEL-5 tratadas com DMSO mostram níveis antecedentes de manchamento em ambos os canais vermelhos e verdes (sombreado cinza aqui). Células tratadas apenas com AF-DEVD-fmk não mostram qualquer manchamento acima dos níveis antecedentes. Células
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55/103 tratadas apenas com AF-PAC-1 mostram o manchamento pontilhado no citoplasma sem aumento na emissão em 520 nm. Células tratadas simultaneamente com AF-PAC-1 e FAM-DEVD-fmk mostram pontos de atividade de caspase-3/-7 intensa (pseudocoloridos) e manchamento pontilhado de AF-PAC-1 (pseudocolorido), que exibe boa colocalização na imagem incorporada.
Exemplo 5. Tentativas Clínicas com Cachorros para PAC-1 [00135] A formulação de PAC-1 com 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina foi administrado em animais em doses mais altas. Cachorro sofreu toxicidade neurológica aguda (ataxia e convulsão). Estudos adicionais em camundongos mostraram sintomas similares em doses altas. Acredita-se que PAC-1 cruza a barreira hematoencefálica (BBB) e quela o zinco inibitório ligado aos receptores de NMDA. Como um resultado, um novo composto, PAC-ll-9 foi sintetizado e testado. Outra informação sobre este composto é descrita em outro lugar aqui.
Tabela 5. Predição de Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica (BBB)
Composto
Estrutura
PAC-1
Figure BRPI1008651B1_D0090
U937 (IC50 μΜ) LogBB BB ([cérebro]/ ________________________________[sangue]) 4,8±1,0 -0,07 0,85/1
PAC-1 -II-9
Figure BRPI1008651B1_D0091
3,9±1,4 -1,26 0,05/1 logBB =-0.0148 x (PSA) + 0.152 x (ClogP) + 0.139 www.daylight.conn
ChemDraw
Resultados Preliminares
Cães
PAC-1 (mq/kq Neurotoxicidade
12,5 Não
25,0 sim
37,5 sim
PAC-1 -II-9 (mq/kq Neurotoxicidade
12,5 Não
25,0 sim
37,5 sim
Camundongos
PAC-1 (mq/kq Neurotoxicidade
25,0 sim
PAC-1 -II-9 (mq/kq Neurotoxicidade
60,0 não
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Estudos animais preliminares mostraram que PAC-1-II-9 foi útil para melhorar a emissão de neurotoxicidade.
[00136] Compostos adicionais e dados LogBB são fornecidos na tabela 6.
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Tabela 6.
Composto
Estrutura
PAC-1
PAC-1-1-1
PAC-1-111-1
PAC-1-1-10
PAC-1-11-1
PAC-1-II-4
Figure BRPI1008651B1_D0092
Figure BRPI1008651B1_D0093
Figure BRPI1008651B1_D0094
U937 (IC50 μΜ) Caspase-3 (% de Ativação em 10 μΜ) Ligação de Zinco (Kd) nM LogBB Solubilidade em Ciclodextrano (mg β-CD μΐηοΙ < composto)
4,8±1,0 45,8±4,8 50 -0,07 5,3
15,312,0 30±2 79 -0,23
12±2 30,7±1,2 68 -0,52
1,8±0,4 59±5 46 0,08
9,5±1,8 48±3 76 -0,50
2,0±0,2 24,2±1,7 96 -0,06
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Tabela 6 continuação PAC-1-II-5 CM* x > N
PAC-1-II-6 A HGA M
PAC-1-IIV-3 OXU-OÓ
PAC-1-III-2 H η H Λ V V
PAC-1-III-3 1-Ν-ΛΝ'Ν^ν CWk H i/W*
PAC-1-III-4 As. v . Kl..;.C->.L W h-vAJ·' u _ OMe CiM>t
PAC-1-III-5 H
1,0±0,1
2,7±0,8
2,7±1,1
27±9,4
38±6,2
17,5
8,4±1,8
31±3,6 36 -0,36
24±3,4 41 -0,24
36±3* 50 0,1
-0,9
-1,1
-0,9
-0,9
15,2
7,1
58/103
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Tabela 6 continuação
PAC-1 -III-6 ...... 0 í' Á T \ / Π X | T V 1 I I M ÓMe
PAC-1-II-7 ’ PI
PAC-1-II-8 J >· |\| H
PAC-1-II-9 ·= Ά ΗϊίΓ H Η ιλ·^ *··. H ϊ ''Γ Ί í? KJ - H >'ιϊί\^ο ho3S''x^/ Η>Φ)
5,5±1,5
4,6±1,0
2,3
3,6
10,7
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-1,1
0,8
4,0
-1,02
1,26
5,6
3,5
59/103
60/103
Exemplo 6. PAC-II-9 (S-PAC-1) reduz a neurotoxicidade [00137] A indução de morte celular apoptótica é uma estratégia anticâncer promissora. Um evento crítico na cascata de apoptose é a ativação proteolítica de zimógenos procaspase para as capases ativas, cisteína proteases que então clivam escores de substratos celulares. Em 2006, uma pequena molécula que realça a atividade catalítica de procaspase-3 e induz sua autoativação para a caspase-3 foi reportada. Este composto, chamado PAC-1, induz a apoptose em células de câncer, e exibe atividade antitumor em modelos de xenoenxerto de murino quando administrado oralmente como uma formulação com base em lipídeo ou implantado subcutaneamente como um pélete de colesterol. Aqui a avaliação de PAC-1 (liberado como um bolo intravenoso) em camundongos é reportada, e estes estudos revelam que altas dosagens de PAC-1 induzem à neurotoxicidade. Com base nesta descoberta e no mecanismo putativo de neurotoxicidade, um derivado de PAC-1, chamado S-PAC-1, foi designado, sintetizado, e avaliado. Similar ao PAC-1, o S-PAC-1 ativa a pró-caspase-3 e induz à morte apoptótica em células de câncer; entretanto, ele não induz nenhuma neurotoxicidade, quando avaliado em camundongos e cães. Um protocolo de infusão intravenosa contínua foi estabelecido para S-PAC-1 em cães, permitindo este composto atingir uma concentração plasmática de estado constante de ~15 μΜ durante 24 horas. Cinco cães de estimação com linfroma foram avaliados em uma experiência clínica pequena com S-PAC-1. Os resultados mostram que o S-PAC-1 é bem tolerado nestes pacientes, e estes tratamentos induziram regressão parcial ou doença estável em 4 de 5 pacientes.
[00138] Na última década, o potencial de terapêuticas alvejadas como estratégias anticâncer personalizadas foi demonstrado. Estes métodos tiram partido de proteínas específicas presentes em células de câncer para conferir especificidade versus células normais (1). Tais
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61/103 fármacos personalizados chocam-se contra alvos (2) que originam-se de uma translocação cromossômica (Gleevec para a proteína de fusão BCR-ABL (3)), formas mutantes específicas de uma proteína que resultam em ativação constitutiva (mutação Iressa e EGFR, (4) PLX4032 e BRAF mutante (5,6)), ou uma proteína que é superexpressa em células de câncer (descritas também abaixo). Como uma das marcas de câncer é a resistência à apoptose (7-9), as proteínas apoptóticas são particularmente alvos interessantes para a descoberta de fármaco anticâncer (10). De fato, a atividade anticâncer tem sido demonstrada com compostos que alvejam a expressão desregulada de proteínas apoptóticas, incluindo pequenos rompedores de molécula da interação p53-MDM2 (11,12), inibidores de Bcl-2 (13), e ligantes para XIAP (14,15).
[00139] Membros da família de caspase de cisteína protease são os agentes fundamentais tanto na iniciação quanto na execução de apoptose. Estas enzimas existem na célula como zimogênios de baixa atividade (pró-enzimas) que são proteoliticamente ativados à enzima madura, altamente ativa. Mais crítico a apoptose é a conversão proteolítica de procaspase-3 à caspase-3. Quando igualmente séries de reação apoptóticas intrínsecas e extrínsecas convergem para ativar procaspase-3, e como caspase-3 tem mais de 100 substratos celulares, a ativação de procaspase-3 para caspase-3 é um evento pivotal e comprometido na cascata apoptótica. Interessantemente, procaspase-3 é superexpressa em uma variedade de histologias de tumor incluindo câncer de mama (16), câncer de cólon (17), câncer de pulmão (18), linfoma (19), neuroblastoma (20), melanoma (21) e câncer do fígado (22), sugerindo que uma molécula pequena que ativa procaspase-3 poderia ter seletividade para células cancerosas versus células normais. Em 2006 foi informado a detecção de uma molécula pequena, chamada PAC-1, que aumenta atividade de procaspase-3 in vitro, in
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62/103 duz morte em células cancerosas em cultura, e tem eficácia em modelos de xenoenxerto de camundongo múltiplos quando administrados oralmente como uma formulação de base de lipídio ou subcutaneamente implantada como um pélete de colesterol (23). PAC-1 ativa procaspase-3 in vitro através da quelação de íons de zinco inibitórios (24), e síntese derivada e avaliação revelaram que a atividade biológica de PAC-1 é ligada para ter um motivo de quelação de zinco orto-hidróxi N-acil hidrazona intacto (25). Muitos dados sugerem que PAC-1 induz morte apoptótica em células cancerosas através da quelação de zinco de procaspase-3, mais notavelmente a colocalização de um derivado de PAC-1 fluorescente com sítios de atividade de caspase-3 celular (25).
[00140] Como o primeiro composto de ativação de procaspase, experiências com PAC-1 mostram o potencial de ativação de procaspase-3 como uma estratégia anticâncer viável. Para também desenvolver PAC-1 como um terapêutico experimental para o tratamento de câncer em pessoas, buscou-se caracterizar o efeito deste composto quando administrado intravenosamente e em sistemas modelo de tumor in vivo mais sofisticados, especificamente, caninos com câncer espontâneo. A avaliação de terapêuticos experimentais em cães de estimação com câncer oferece muitas vantagens sobre modelos de xenoenxerto de murino (26). Aqui, foram informadosestudos de toxicidade de PAC-1 intravenoso em camundongos, e a detecção de um derivado de PAC-1 (chamado S-PAC-1) que induz apoptose em linhagens celulares de câncer em cultura, é bem tolerado em camundongos e cães de pesquisa, e tem eficácia em uma tentativa pequena de pacientes caninos com linfoma espontâneo.
[00141] Formulação de PAC-1. Para expedir a investigação translacional de ativadores de procaspase-3 para tratar os pacientes de câncer humanos, a tolerabilidade de PAC-1 quando administrada intrave
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63/103 nosamente (a via de liberação de fármaco mais comum para agentes anticâncer convencionais) foi avaliada. Nesta extremidade foi primeiro aperfeiçoado um procedimento de formulação que confiantemente manteve concentrações altas de PAC-1, um fármaco lipofílico, em solução aquosa. O agente de solubilização permitindo a dissolução e manutenção de PAC-1 em solução aquosa foi 2-hidoxipropil-pciclodextrina. Em uma solução aquosa a 200 mg/mL de 2-hidoxipropilβ-ciclodextrina, PAC-1 é solúvel a 20 mg/mL. Dissolução completa requer acidificação da solução aquosa em pH 1,5-2, e em seguida a solução é restabelecida em pH 5-6. Usando este procedimento PAC-1 permanecerá em solução e será estável durante pelo menos 5 dias quando armazenado a 4°C.
[00142] Toxicidade de PAC-1. Em um esforço para caracterizar a viabilidade e tolerabilidade de PAC-1 intravenosamente administrado, camundongos C57/BL6 foram administrados PAC-1 (dissolvido em 2hidoxipropil^-ciclodextrina) a 10, 20, 30 e 50 mg/kg por meio de injeção da veia da cauda lateral, e os animais foram observados durante 24 horas. Em 10 mg/kg de PAC-1, nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado. Camundongos que receberam 20 mg/kg de PAC-1 desta maneira exibiram sintomas neurológicos moderados incluindo letargia, e ataxia moderada; estes sintomas persistiram durante 20 minutos depois da injeção, ponto no qual os camundongos recuperaram e mostraram nenhum outro sinal de toxicidade. Camundongos que receberam 30 mg/kg de PAC-1 exibiram sinais evidentes de neurotoxicidade incluindo espasmos (1/3), ataxia (3/3) e perda de equilíbrio (3/3) com começo ocorrendo dentro de 5 minutos de injeção e durando aproximadamente 15 minutos. Camundongos que receberam 50 mg/kg de PAC-1 exibiram sintomas neurotóxicos agudos com ataxia mais pronunciada e perda de equilíbrio. Nestes, espasmos musculares de dosagem foram observados em todos os camundongos. Camundongos
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64/103 que receberam apenas o veículo de 2-hidoxipropil-p-ciclodextrina não exibiu toxicidade. Apesar desta neurotoxicidade observada em camundongos, PAC-1 foi administrado seguramente a cães em doses inferiores. Para confirmar que esta neurotoxicidade não foi espécies específicas, 60 mg/kg de PAC-1 foi administrado i.v. a um cachorro de caça de pesquisa saudável durante o curso de 10 minutos. Administração desta concentração alta de PAC-1 resultou em neurotoxicidade similar incluindo ataxia e espasmos que duraram no máximo 20 minutos.
[00143] Determinada a afinidade conhecida de PAC-1 para zinco in vitro (24), e sua capacidade demonstrada de ligar-se a zinco celular (25), hipotetizou-se que a neurotoxicidade observada em camundongos e cães que foram administrados com PAC-1 em 2-hidoxipropil-pciclodextrina foi causada pela quelação de zinco intracelular em receptores de NMDA dentro do sistema nervoso central dos camundongos tratados. Esta hipótese é consistente com dados a partir de estudos in vivo de outros queladores de zinco que induzem um fenótipo neurológico rememorativo de que foram observados com PAC-1. (27,28) Realmente, em análise de silico de PAC-1 prediz a divisão através da barreira hematoencefálica (BBB)29 mostra que PAC-1 tem um logBB calculado de-0,07. Este logBB correlataria a uma relação de divisão de 0,85/1,0 entre o sangue e o cérebro, sugerindo que uma quantidade significante de PAC-1 pode estar entrando no sistema nervoso central. Vários estudos indicaram que quelação de armazenamentos de zinco intracelulares alivia supressão tônica de receptores de NMDA, resultando em hiperexcitação neuronal (28,30).
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65/103
Figure BRPI1008651B1_D0095
Figure BRPI1008651B1_D0096
1:2 THF/Acetona, refluxo, 22 h K2CO3 81%
Figure BRPI1008651B1_D0097
, oel. HCI
Figure BRPI1008651B1_D0098
Figure BRPI1008651B1_D0099
1:2 CHsCN/MeOH, refluxo, 15 h 71%
2:1 EtOH/MeOH, refluxo, 16 h 88%
Figure BRPI1008651B1_D0100
S-PAC-1 [00144] Síntese em grande escala de S-PAC1. Veja informação de suporte para as vias sintéticas em 1, 2 e 5.
[00145] Projeto de S-PAC-1. Para superar esta neurotoxicidade, foi sintetizado um derivado de PAC-1 que teve uma tendência inferior para cruzar o BBB para exibir neurotoxicidade diminuída e permitir dosagens em concentrações mais altas. Um grupo funcional polar instalado no anel de benzila de PAC-1 deveria diminuir o logBB predito enquanto mantendo a atividade do composto origem. Como tal S-PAC-1, um derivado de sulfonamida de PAC-1, foi projetado como um composto predito para ter uma capacidade notadamente diminuída de cruzar o
BBB (logBB de -1,26). A via sintética para S-PAC-1 é mostrada no Esquema 6; esta via é uma modificação da via sintética para PAC-1 previamente relatado (23). Brevemente, sulfonamida 1 é acoplada com piperazina 2 para fornecer éster 3 em bom rendimento. O éster é em seguida reagido com hidrazina para produzir hidrazida 4, que é em seguida condensado com aldeído 5 para fornecer S-PAC-1. Todos os detalhes experimentais para esta via e dados espectrais para S-PAC-1 e os vários intermediários podem ser encontrados em outro lugar aqui. Notavelmente, a sequência de reação é altamente escalável; realmente, os rendimentos listados no Esquema 6 são para produção de 40 gramas de S-PAC-1. Crítico a esta graduação foi o desenvolvimento de protocolos de purificação fáceis para cada intermediário. Desse modo, o composto 2 é purificado por meio de recristalização de etanol, hidrazida 3 é purificada por recristalização de metanol, e o produto fi
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66/103 nal é purificado por cromatografia em sílica-gel e recristalização de metanol. Conduzindo-se esta síntese quatro vezes em uma escala de 40 gramas, mais 160 g de S-PAC-1 foi bem sucedidamente produzido. Detalhes da síntese de escala menor de S-PAC-1 podem ser encontrados em outro lugar aqui.
[00146] S-PAC-1 liga íons de zinco. A atividade de S-PAC-1 foi caracterizada em vários ensaios bioquímicos. Uma experiência de titulação de competição de EGTA (31) foi usada para determinar a constante de ligação para o complexo de S-PAC-1:Zn2+. Nesta experiência, uma solução contendo uma quantidade conhecida de EGTA e S-PAC1 foi titulada com concentrações crescentes de Zn2+ e a fluorescência de S-PAC-1 foi monitorada em 475 nm. Mudanças em fluorescência na presença de Zn2+ foram usadas para delinear uma curva de formação (figura 16b). Usando a constante de ligação conhecida de EGTA, a concentração de zinco livre pode ser calculada e usada para determinar a constante de ligação do complexo de S-PAC-1:Zn2+. Este complexo tem um Kd de 46 ± 5 nM comparado a 52 ± 2 nM para PAC1:Zn2+. (25) (figura 20).
[00147] Ensaio de Titulação de Fluorescência de EGTA - Este ensaio de titulação é com base em um protocolo publicado. (Huang, Org. Lett. 2007, 9, 4999-5002). Antes da titulação, cubeta foi incubada com EDTA (10 mM) durante 10 minutos, seguido por água desionizada estéril e lavagem com acetona para remover qualquer íon de metal de resíduo. PAC-1 ou derivado (60 pM) foi adicionado a uma cubeta contendo tampão (Hepes: 50 mM, KNO3: 100 mM, pH 7,2) com EGTA (7,3 mM) para obter uma diluição de 10 vezes (concentração de PAC-1 final: 6 pM). Zn(OTf)2 (0 - 10 mM) foi adicionada incrementalmente. A formação de complexo de Zn-PAC-1 (ou derivado) foi monitorado pelo aumento em intensidade de fluorescência (ex/em: 410 nm/475nm). Intensidade de fluorescência a 475 nm foi plotada contra concentração
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67/103 de Zn livre ([Zn]f/M) calculado usando programa de MaxChelator. (Patton, Cell Calcium, 2004, 35, 427-431). O dados foram analizados usando KaleidaGraf e ajustado em uma curva de formação com base em Eq S1 derivado por protocolo publicado.
I = (IminKD + lmáx[Zn]f)/(KD + [Zn]f) Eq S1 onde lmín e Imáx foram definidos como a intensidade de fluorescência da sonda livre (PAC-1 ou derivado neste caso) e aquela do complexo Zn-sonda respectivamente.
[00148] S-PAC-1 ativa procaspase-3 in vitro. A capacidade de SPAC-1 ativar procaspase-3 recombinantemente expressa na presença de zinco exógeno in vitro foi avaliada. Para garantir que a atividade da proenzima estava sendo monitorada, um mutante proteoliticamente não clivável de procaspase-3 (em que os três resíduos de sítio de clivagem de ácido aspártico são mutados em alanina (D9A/D28A/D175A)) foi usado (24,32). Esta proteína recombinantemente expressa foi incubada na presença de 10 pM de zinco, e SPAC-1 foi adicionado à amostra e a atividade da enzima foi monitorado em intervalos de 15 minutos. Como mostrado na figura 16c, S-PAC-1 rapidamente (dentro de 5 minutos) aumenta a atividade enzimática da proenzima por inibição mediada por zinco de alívio.
[00149] S-PAC-1 induz morte celular em múltiplas linhagens celulares de câncer em cultura. Tendo confirmado que S-PAC-1 quela zinco e ativa procaspase-3 in vitro, a atividade anticâncer de S-PAC-1 foi avaliada contra um painel de humano, canino, e linhagens celulares de câncer de murino. Células foram incubadas com concentrações variadas de composto durante 72 horas depois da qual morte celular foi avaliada usando um ensaio de sulforodamina B. (33) Os valores de IC50 para PAC-1 e S-PAC-1 são relatados na Tabela 1A. Na maioria dos exemplos, S-PAC-1 é equipotente em PAC-1, embora PAC-1 pareça ser mais potente em células de HeLa. Igualmente PAC-1 e S
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PAC-1 parece ser potente contra todas as linhagens celulares de linfoma testado embora as espécies de origem. Outra análise com células U-937 mostram que S-PAC-1 induz apoptose nestas células. Células U-937 foram tratadas com DMSO, 50 pM de PAC-1 ou 50 pM de SPAC-1 durante 12 horas. Depois da incubação, apoptose foi avaliada por manchamento de anexina V/PI e analisada por citometria de fluxo (figura 16d). Igualmente tratamento de PAC-1 e S-PAC-1 leva a um aumento na população de células exibindo manchamento de anexina V. Nesta experiência, S-PAC-1 induz apoptose à mesma extensão como PAC-1 (~40%).
[00150] Em um esforço para determinar uma estratégia de tratamento apropriada para a avaliação de S-PAC-1 in vivo, a dependência de tempo de citotoxicidade de S-PAC-1 foi avaliada. Células de U-937 foram tratadas com S-PAC-1 durante vários comprimentos de tempo. Depois do tratamento com S-PAC-1, células foram lavadas para remover composto e foram cultivadas em meio de crescimento sem composto. Morte celular foi avaliada em 72 horas durante todo o tempo de tratamento. Um valor de IC50 foi determinado durante cada tempo de exposição e relatado na Tabela 1 B. Em 3, 6 e 9 horas o valor de IC50 foi maior do que a concentração mais alta testada. Em 12 horas de exposição, uma redução rápida no valor de IC50 é observada. Em 24 horas de exposição, o valor de IC50 está próximo de um mínimo e mostra pouca variação sobre o curso das 48 horas subsequentes. Estas experiências de dependência de tempo sugerem que S-PAC-1 será muito eficaz in vivo se células cancerosas são expostas ao composto durante pelo menos 24 horas.
[00151] S-PAC-1 não tem efeito neurotóxico em camundongos. Tendo confirmado a atividade de S-PAC-1 in vitro e em cultura de célula, o efeito tóxico de S-PAC-1 foi avaliado em camundongos de C57/BL6. De uma maneira análoga à determinação de toxicidade de
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PAC-1, S-PAC-1 (solubilizado com 2-hidoxipropil-p-ciclodextrina) foi administrado em camundongos de C57/BL6 por meio de injeção de veia da cauda lateral a 12,5 mg/kg, 25 mg/kg, 37,5 mg/kg e 350 mg/kg. Nenhuma neurotoxicidade foi observada ainda na dose de 350 mg/kg. [00152] Com a meta inicial de avaliar S-PAC-1 em modelos de tumor de murino, as farmacocinéticas de S-PAC-1 em camundongos foi determinada. Se S-PAC-1 pudesse ser administrado de uma maneira para permitir concentrações plasma de S-PAC-1 para exceder ~10 pM sobre o curso de 24 horas, o tratamento poderia ser eficaz induzindose ativação de procaspase-3 e apoptose em células de tumor. Para desenvolver uma estratégia de tratamento ao longo destas linhagens, camundongos C57/BL6 foram tratados com 125 mg/kg de S-PAC-1 em 2-hidoxipropil-p-ciclodextrina por meio de administração intraperitoneal. Camundongos foram sacrificados e sangue tirado em pontos de tempo variados depois da administração. Amostras de sangue foram centrifugadas e o soro foi coletado e analisado por cromatografia líquida para determinar a concentração de fármaco. A concentração de fármaco com o passar do tempo para S-PAC-1 é mostrada na figura 17A. A concentração de plasma de pico obtida por esta dose é ~170 pM em 30 minutos depois da injeção. A concentração de protoplasma de S-PAC-1 em seguida rapidamente diminui sem S-PAC-1 permanecendo no sangue em 4 horas pós-injeção. Análise destes dados indica a meia vida de eliminação de S-PAC-1 a ser de ~1 hora em camundongos. Com base na concentração de plasma de pico obtida e a meia vida curta de S-PAC-1 em camundongos, foi predito que os camundongos necessitariam ser tratados com uma dose de 350 mg/kg de SPAC-1 a cada duas horas, para obter e manter uma concentração de plasma mínima de 10 pM durante o curso de 24 horas. Embora este regime de dosagem frequente para S-PAC-1 (intraperitoneal a cada 2 horas durante 24 horas) foi tecnicamente possível, outra avaliação de
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S-PAC-1 como um novo agente terapêutico usando modelos de tumor de murino não foi metodologicamente prático. Como tal buscou-se também investigar S-PAC-1 em um sistema experimental de mamífero maior, especificamente cães suportando câncer saudáveis e espontâneos, que conferiram maior praticabilidade para a manutenção de Sconcentrações de estado estacionário de PAC-1 durante períodos prolongados de tempo.
[00153] Avaliação de S-PAC-1 em cães de pesquisa. Cães de caça de pesquisa saudáveis foram utilizados para investigações farmacocinéticas e de toxicidade de S-PAC-1. Quatro cães de caça de pesquisa foram tratados com 25 mg/kg de S-PAC-1 (solubilizados em 2hidoxipropil-p-ciclodextrina) por meio de injeção i.v. durante 10 minutos. Amostras de soro múltiplas foram coletadas durante 24 horas para caracterizar o perfil farmacocinético de S-PAC-1 intravenosamente administrado em cães. Além da análise farmacocinética, a tolerabilidade hematológica e não hematológica de única-dose, administração de S-PAC-1 intravenosa foi monitorada em cães de pesquisa semanalmente durante 4 semanas consecutivas. (Tabela 2A). Como mostrado na figura 17B, a concentração de plasma de pico resultando desta dose de bolo i.v. de 25 mg/kg é ~150 qM, similar aquela obtida nos camundongos tratados com a dose intraperitoneal de 125 mg/kg. A partir da análise do perfil farmacocinético, a meia vida de S-PAC-1 em cães foi calculada para ser 3 horas. Adicionalmente, tratamento de S-PAC-1 intravenoso em dose única foi bem tolerado por todos os 4 cães de pesquisa e nenhum evento adverso a curto ou longo prazo foi observado com estes animais como um resultado de tratamento.
[00154] Embora a meia-vida de 3 horas em cães seja uma melhoria significante sobre a meia-vida de S-PAC-1 em camundongos, cálculos farmacocinéticos prognosticaram que o fármaco necessitaria ser administrado várias vezes durante o curso de um dia para manter níveis
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71/103 de soro acima de ~10 μΜ. Alternativamente, a infusão de taxa contínua pode ser usada para manter uma concentração de soro em estado estacionário de um fármaco durante o curso do tratamento. Estratégias de infusão de taxa contínua foram usadas com outros fármacos quimioterapêuticos tais como dacarbazina (34), citosina arabinosídeo (35), e gencitabina (36) com tempos de infusão até 98 horas. Adicionalmente, YM155, um fármaco proapoptótico investigacional que exibe atividade aumentada com tempos de exposição mais longos, está atualmente em tentativas clínicas e utiliza uma infusão de taxa contínua de 168 horas. (37) [00155] Três cães de pesquisa saudáveis foram utilizados para determinar se S-PAC-1 poderia ser seguramente administrado por meio de um regime de infusão de taxa contínua, e para determinar níveis de dosagem apropriados para manter concentrações de plasma acima de ~10 μM. Cada cachorro recebeu uma dose de carregamento inicial por meio de infusão i.v. sobre o curso de 10 minutos seguido por uma dosagem de manutenção liberada por uma bomba de infusão durante 24 horas adicionais. Cada cachorro foi observado ao longo do curso de suas infusões de 24-horas para reações adversas e sangue foi tirado em intervalos para avaliar o perfil farmacocinético de tratamento de SPAC-1. Além disso, seguindo conclusão de infusão de S-PAC-1, cães de pesquisa foram avaliados quanto à toxicidade hematológica e não hematológica semanalmente durante 4 semanas consecutivas.
[00156] S-PAC-1 administrado como uma infusão de taxa contínua de 24-horas pode ser produzido para cães de pesquisa e facilmente alcança concentrações de plasma de estado estacionário micromolar. Perfis farmacocinéticos para os cães administrados com S-PAC-1 desta maneira mostra que concentrações de plasma de estado estacionário correlacionam-se com escala de dose (figura 17C). Com base nestes resultados foi prognosticado que uma dose de carregamento de 7
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72/103 mg/kg e infusão de taxa constante de 3 mg/kg/hr seriam suficientes para obter concentração de plasma de estado estacionário de ~10 pM. Adicionalmente, a infusão de taxa contínua de S-PAC-1 foi bem tolerada em todas as doses examinadas e nenhuma toxicidade hematológica ou não hematológica foi observada em quaisquer dos cães de pesquisa.
[00157] Tendo confirmado na atividade in vitro de S-PAC-1, mostrou que o composto pode ser seguramente administrado por meio de infusão de taxa contínua, e que concentrações de plasma de estado estacionário de S-PAC-1 de >10 pM podem ser obtidas para uma duração de 24 horas, uma tentativa clínica pequena (n=5) de cães de estimação de um cliente com linfoma espontâneo foi conduzido. Cânceres surgindo espontaneamente em cães de estimação compartilham muitas semelhanças com cânceres humanos incluindo aparecimento histológico, genéticas de tumor, alvos moleculares, comportamento biológico e clínico e resposta à terapia (38). Destes cânceres caninos espontâneos, linfoma multicêntrico é o mais comum, ocorrendo em 13 a 24 de todos 100.000 cães (39). O progresso clínico e tratamento de célula B multicêntrica ou linfoma canino de célula T tem muitas das mesmas características do linfoma não Hodgkin em seres humanos. Linfoma canino e o linfoma não Hodgkin humano respondem igualmente clinicamente aos mesmos fármacos citotóxicos tais como doxorrubicina, vincristina e ciclofosfamida. Estes fármacos são componentes do protocolo de tratamento de CHOP, qual é a primeira terapia de linhagem para difundir linfoma de célula B grande em seres humanos (40). Quando administrado a cães, o protocolo de CHOP induzirá enfraquecimento clínico completo em aproximadamente 90% de cães diagnosticados com linfoma (41,42). Similar à resposta humana, a maioria dos cães que obtém enfraquecimento com terapia de CHOP experimentará recaída da doença (43). Dado os atributos comuns en
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73/103 tre o linfoma humano e canino, a avaliação de S-PAC-1 em uma tentativa clínica de linfoma canino fornece informação translacional importante para o desenvolvimento de S-PAC-1 como um novo terapêutico humano.
[00158] Critérios de inclusão para tentativa de S-PAC-1. Cães apresentados ou referenciados à University of Illinois-Urbana Champaign, College of Veterinary Medicine, Small Animal Clinic foram considerados para matrícula na tentativa clínica. Critérios de inclusão para pacientes elegíveis foram o seguinte: histologicamente ou citologicamente confirmaram linfoma multicêntrico; carga de tumor mensurável; estado de desempenho favorável; uma expectativa de vida de >4 semanas; nenhuma quimioterapia prévia dentro de 3 semanas de entrada de estudo; e nenhuma doença co-mórbida significante incluindo insuficiência renal ou hepática, história de insuficiência cardíaca congestiva, ou coagulopatia clínica. Além disso, donos de animais de estimação tiveram que ter assinado uma forma de consentimento informada escrita antes da entrada de estudo de acordo com diretrizes universitárias.
[00159] Toxicidade e farmacocinética de S-PAC-1 em pacientes de linfoma caninos. Cinco pacientes cães receberam tratamento com SPAC-1 por meio de um de dois regimes de tratamento (resumidos na Tabela 7C). Pacientes matriculados no primeiro regime de tratamento receberam uma infusão contínua de 24 horas uma vez por semana de S-PAC-1 durante 4 ciclos semanais. Pacientes matriculados no segundo regime de tratamento receberam uma infusão contínua de 72 horas de S-PAC-1 a cada duas semanas durante 2 ciclos de tratamento. Sangue foi coletado durante cada ciclo de tratamento de S-PAC-1 para análise farmacocinética. Além disso, sangue foi coletado de todos os cães de estimação a cada visita de acompanhamento programada para caracterizar toxicidade hematológica e não hematológica. Entre administrações, pacientes foram monitorados pelos donos de animais
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74/103 de estimação para contagens observacionais de toxicidade gastrointestinal aderindo o grupo de oncologia Co-operativo Veterinário terminologia comum e critérios para eventos adversos (VCOG_CTCAE) (44). Todos os pacientes matriculados em regimes de tratamento 1 ou 2 não demonstraram toxicidade hematológica ou não hematológica clinicamente significante (Tabela 7C e D). Apenas eventos adversos menores foram relatados pelos donos de animais de estimação tal como irritação autolimitante e localizada no sítio de infusão (n=3), perda passageira de apetite (n=1), e diarreia moderada (n=2). Todas as reações adversas baixaram dentro de 48 horas do fim de cada ciclo de tratamento.
[00160] Análise farmacocinética indicou que todos os pacientes tiveram concentrações de soro mensuráveis de S-PAC-1, como mostrado na figura 18. Concentrações de S-PAC-1 alcançaram a um estado estacionário dentro de 6 horas do começo da infusão. De acordo com a predição dos cães de pesquisa saudáveis, uma infusão com uma dose de carregamento de 7 mg/kg e uma infusão de taxa constante de 3 mg/kg/hr foi suficiente para alcançar concentrações de plasma de estado estacionário >10 pM na maioria dos tratamentos.
[00161] Atividade antitumor de S-PAC-1. Avaliação de carga de tumor foi monitorada ao longo do curso do estudo por meio de medidas de calibrador cumulativas de linfonodos periféricos bem como varredura CT dos linfonodos mandibulares. Medida de calibrador foi feita de acordo com o método de RECIST (45). Brevemente, a medida de comprimento linear mais longa foi registrada para 4 pares de linfonodos periféricos (mandibular, pré-escapular, inguinal, e popliteal), com a adição destes valores produzindo uma contagem de RECIST. Além de medidas de calibrador para todos os 4 grupos de linfonodos periféricos, varreduras CT foram realizadas dos linfonodos mandibulares em todo paciente, permitindo medida precisa e objetiva de comprimento
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75/103 linear de linfonodo máximo. Dos 5 pacientes tratados, um paciente (paciente 1) mostrou uma resposta parcial com uma redução de -30% igualmente em contagem de RECIST e as medidas de linfonodo mandibulares por varredura CT sobreo curso do tratamento de 4 semanas (figura 19A e B). Seguindo os quatro ciclos de tratamento, administração de fármaco foi parada e o cachorro foi monitorado por RECIST durante 2 semanas subsequentes. Na ausência de tratamento, as contagens de RECIST para este cachorro aumentou dramaticamente (dia 36 e 42). Além desta resposta parcial, três pacientes mostraram doença estável (pacientes 2-4) enquanto um paciente mostrou progressão de doença (paciente 5).
[00162] S-PAC-1 é o primeiro composto na classe de PAC-1 (e o primeiro ativador de molécula pequena de procaspase-3) a ser avaliado em uma tentativa clínica de pacientes com câncer. Como tal estes dados são importantes para a estratégia de ativação de procaspase-3 como uma terapia anticâncer. Talvez não seja surpreendendo que doses altas de PAC-1 induzem neurotoxicidade, determinado o mecanismo de ação do composto e sua permeabilidade prognosticada da BBB. Além disso, o breve atraso no início desta neurotoxicidade (~5 minutos) sugere que a neurotoxicidada observada não é um resultado da concentração de plasma de pico inicial de PAC-1, porém bastante o resultado de uma redistribuição de PAC-1 pela BBB. Homeóstase de zinco é importante no sistema nervoso central (46), e receptores de NMDA requerem zinco ligado para fornecer uma inibição tônica (28). Zinco ligado a receptores de NMDA com uma baixa afinidade (Kd = 5,5 pM) (47) que sugere que um quelador de zinco com uma afinidade mais alta para zinco tal como PAC-1 ou S-PAC-1 (Kd = 46 e 52 NM respectivamente) poderia ser capaz de bem sucedidamente isolar zinco destes receptores. Vários estudos indicam que quelação de zinco intracelular resulta em hiperexcitação destes receptores (27), resultan
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76/103 do em sintomas tal como movimento muscular descontrolado e convulsão (28). Realmente um quelador de célula de zinco permeável, TPEN, foi mostrado induzir neurotoxicidade severa em camundongos em baixas concentrações e morte rápida em concentrações mais altas (48).
[00163] Há vários fatores que afetam a permeabilidade de um composto através da BBB incluindo polaridade, lipofilicidade, e tamanho (29). Uma estratégia para reduzir a permeabilidade de um composto ao BBB é aumentar a polaridade da molécula. Adição do grupo funcional sulfonamida é um candidato bom para tal aumento de polaridade como o motivo de aril sulfonamida é comum em vários terapêuticos de molécula pequenas. FDA aprovou fármacos contendo o grupo funcional aril sulfonamida incluem Celecoxib (Celebrex®), Tansulosina (Flomax®), e hidroclorotiazida.
[00164] Cães de estimação com linfoma representam uma ferramenta significante para a investigação de novos fármacos investigacionais (26). Quase 1 em 4 cães de estimação nos US morrem de câncer (49), e sem tratamento o tempo de sobrevivência médio a partir do diagnóstico é 4-6 semanas. O padrão de cuidado para cães com linfoma é administração de terapia de CHOP (26). Esta terapia consiste em 16 cursos de administração de fármaco durante 19 semanas e normalmente resulta em enfraquecimento completo. Similar à doença humana, a maioria dos cães que obtém enfraquecimento experimentará recaída frequentemente acompanhada por resistência a fármaco. Como tal, novos farmacóforos são necessários para tratar igualmente linfoma primário e recorrente. Como mostrado na Tabela 6C, um cachorro matriculado no estudo atual (paciente 1) foi em enfraquecimento durante 5 meses depois da terapia de CHOP, e foi recentemente diagnosticado com linfoma recorrente. Sob matrícula no estudo este cachorro mostrou uma diminuição de 27% no tamanho do tumor com
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77/103 respeito a tratamento de S-PAC-1. Esta resposta parcial é significante determinando a duração de tratamento comparativamente curta (4 semanas para S-PAC-1 vs. 19 semanas para CHOP). É ajudando que quatro entre cinco pacientes obtiveram resposta parcial ou doença estável durante 4 semanas em duração, como linfoma canino é geralmente uma malignidade rapidamente progressiva com aumento dramático de linfonodos periféricos dentro de semanas de diagnóstico de doença. Isto é também ilustrado pelo aumento rápido observado nos linfonodos do paciente 1 depois da cessação de tratamento.
[00165] Compostos na classe PAC-1 ativam a procaspase-3 por meio de quelação de íons de zinco inibitórios (25). Zinco intracelular é constatado principalmente em complexos firmemente ligados em metaloproteases, domínios de ligante de zinco, e outras proteínas de ligação de metal; entretanto, aproximadamente 10% de zinco celular é acreditado existir em uma mistura lábil livremente ligada (50). Vários estudos implicam zinco lábil como um regulador antiapoptótico endógeno (51-54). Interessantemente, quelação da mistura livremente ligada de zinco é uma estratégia emergindo anticâncer (24,25). Recentemente, outro quelador de zinco de molécula pequena, ML-133, foi relatado ter propriedades anticâncer in vitro e em um modelo de xenoenxerto de murino de câncer de cólon (55). Embora não relatado pelos autores, ML-133 pode agir de uma maneira similar a PAC-1 e S-PAC-1 (isto é ativação de procaspase-3). Desse modo, a avaliação de SPAC-1 é da mesma forma útil na quelação da mistura de zinco lábil como uma estratégia anticâncer.
[00166] Em conclusão, S-PAC-1 é uma molécula pequena citotóxica potente com atividade similar ao composto origem, PAC-1. Enquanto doses altas de PAC-1 (quando administradas em 2-hidroxipropil-pciclodextrina) induzem neurotoxicidade in vivo, S-PAC-1 não causa este efeito colateral. S-PAC-1 pode ser seguramente administrado em
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78/103 camundongos, cães de pesquisa, e cães suportando linfoma, e mostra efeito clínico encorajador nesta avaliação de uma dosagem preliminar. Dada a ausência de neurotoxicidade com S-PAC-1 é antecipado que S-PAC-1 provará ser seguro em doses mais altas do que aqueles avaliadas aqui. Uma tentativa clínica canina total de S-PAC-1 incluindo escala de dose em cães com linfoma está atualmente a caminho. Tabela 6. A) Análise de citotoxicidade de PAC-1 e S-PAC-1 em várias cepas celulares de câncer em cultura. B) Dependência de tempo de citotoxicidade de S-PAC-1 em células U-937. C) Características dos cinco cães transportando linfoma tratados com S-PAC-1.
Cepa celular Espécies Origem Valor IC50 de PAC-1 (UM) Valor IC50 de S-PAC-1 (UM)
U-937 Humana Linfoma 9,3±0,5 7,7±1,2
EL-4 Camundongos Linfoma 3,8±0,9 7,1±1,3
17-71A Cão Linfoma 2,5±0,9 2,7±0,8
GL-1 Humana Linfoma 4,9±0,3 7,1 ±0,3
OSW Cão Linfoma 8,6±1,3 11,0±0,9
Jurkat Humana Leucemia 5,7±2,8 4,5±1,1
SK-Mel-5 Humana Melanoma 11,5±3,6 8,6±1,3
HeLa Humana Cervical 15,5±3,8 28,4±7,7
MDA-MB-231 Humana Mama 9,9±1,0 11,7±5,3
Esta cepa celular foi avaliada usando o ensaio de viabilidade celular MTS
B)
Tempo de Exposição (hora) IC50 (^M)
1 >100
3 >100
6 >100
9 20±12
12 9,7±1,1
24 5,9±1,0
48 5,6±0,8
72 5,2±0,3
Paciente Raça Macho/Fêmea Idade Peso (lb)
1 Raça Mista Castrado 7 79
Labrador Macho
2 Retriever Fêmea 7 89
3 Newfoundland Macho Intacto Castrado 4 160
4 Corgi Fêmea 8 30
Golden Castrado
5 Retriever Fêmea 7 80
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79/103 continuação
Paciente Imunofenótipo Terapia anterior Tratamento
1 Linfoma de célula B CHOP 24 h
2 Linfoma de célula T não submetido a tratamento 24 h
3 Linfoma de célula T não submetido a tratamento 24 h
4 Linfoma de célula B não submetido a tratamento 24 h
5 Linfoma de célula B não submetido a tratamento 24 h
Tabela 7. A) Selecionar parâmetros hematológicos e não hematológicos de cães de pesquisa tratados com dose única de SPAC-1, C) cães transportando linfoma tratados com S-PAC-1 em uma infusão de taxa contínua de 24 horas toda semana durante 4 tratamentos consecutivos, e D) cães transportando linfoma tratados com SPAC-1 em uma infusão de taxa constante de 72 horas semana sim, semana não, durante 2 tratamentos consecutivos.
A)
Parâmetro Faixa de Referência Dia 0 Dia 7 Dia 14 Dia 21
WBC 6,0-17,0 x 1000 8,1 8,1 9 9,6
Neutrófilo 3,0-11,5 x 1000 4,4 5 5,1 5,2
Plaqueta 1,5-9,0 x 100000 1,4 2 1,7 1,7
Creatinina 0,5-1,6 mg/ml 0,7 0,8 0,6 0,8
ALT do Fígado 17,0-87,0 U/L 31 29 29 30
C)
Parâmetro Faixa de Referência Dia 0 Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 28
WBC 6-17,0 x 103 8,8±3,3 11,1±4,2 9,7±3,1 11,0±3,9 10,1±2,4
Neutrófilo 3-11,5 x 103 6,7±0,6 8,7±0,8 7,2±0,5 8,8±1,1 7,6±0,4
Plaqueta 2-0 x 105 2,6±0,5 2,6±0,8 2,7±0,7 2,7±1,0 2,4±1,0
Creatinina 0,5-1,6 mg/dl 1,2±0,1 1,1±0,1 1,2±0,1 1,2±0,2 1,6±0,9
ALT 17-87 U/L 50,7±19,9 46,2±11,0 41,0±13,2 43,0±15,5 53,0±30,5
BUN 7,0-31,0 mg/dl 17,2±2,6 14,0±1,6 14,6±1,1 15,5±2,8 24,5±16,7
Sódio 141-161 mEa/L 148,7±2,1 145,3±2,1 147,0±1,7 149,3±1,2 149,7±1,5
Potássio 3,9-5,7 mEq/L 4,4±0,3 4,3±0,2 4,4±0,3 4,4±0,4 4,0±0,6
Cloreto 104-125 mEq/L 117,0±1,0 111,3±3,1 113,3±1,5 118,0±1,7 113,7±4,9
Cálcio 7,9-11,5 mg/dl 11,3±1,9 11,7±2,1 11,4±2,5 11,0±1,1 12,0±2,7
Fósforo 2,4-6,5 mg/dl 3,6±1,0 3,5±0,3 3,2±0,3 3,2±0,6 3,8±0,8
ALP 12-110 U/L 26,7±11,2 37,3±18,4 45,7±16,5 45,0±18,5 49,0±20,7
Bilirrubina 0,08-0,5 mg/dl 0,1±0,1 0,1±0,1 0,1±0,1 0,1±0,1 0,1±0,1
D)
Parâmetro Faixa de Referência Dia 0 Dia 14 Dia 28
WBC 6-17,0 x 103 18,4±5,3 11,8±2,4 18,3±12,2
Neutrófilo 3-11,5 x 103 13,5±1,4 8,1±2,3 12,3±0,8
Plaqueta 2-9 x 105 2,8±0,8 2,7±0,8 2,5±0,0
Creatinina 0,5-1,6 mg/dl 0,8±0,2 0,7±0,3 0,7±0,2
ALT 17-87 U/L 73,0±42,4 81,0±58,0 57,5±46,0
BUN 7,0-31,0 mg/dl 13,2±4,5 16,0±0,1 12,7±0,9
Sódio 141-161 mEq/L 148,0±5,7 148,0±0,0 148,0±1,4
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Potássio 3,9-5,7 mEq/L 4,6±0,2 4,2±0,1 4,4±0,0
Cloreto 104-125 mEq/L 117,5±0,7 116,5±3,5 115,0±1,4
Cálcio 7,9-11,5 mg/dl 9,8±0,7 9,9±0,4 9,9±0,3
Fósforo 2,4-6,5 mg/dl 4,3±0,1 3,7±0,3 3,5±1,0
ALP 12-110 U/L 98,0±65,1 63,0±65,1 81,5±75,7
Bilirrubina 0,08-0,5 mg/dl 0,2±0,1 0,2±0,1 0,2±0,1
WBC-Glóbulos brancos, ALT-Alanina transferase, BUN-Ureia sanguínea ALP-Alcalina fosfatase
Materiais e Métodos
Gerais [00167] Todas as reações que requerem condições anidras foram conduzidas sob uma atmosfera positiva de nitrogênio ou argônio em artigos de vidro secados em forno. Técnicas de seringa padrões foram usadas para adição anidra de líquidos. Tetra-hidrofurano seco foi obtido passando por colunas de alumina ativada ou peneiras moleculares em um sistema de purificação de solvente comercial (Innovative Technologies). A menos que de outro modo observado, todos os materiais de partida, solventes, e reagentes foram adquiridos de fornecedores comerciais e usados sem outra purificação. Cromatografia flash foi realizada usando sílica-gel de 230 a 400 malhas. Os compostos 1, 2, e 5 (Naganawa, Bioorg Med Chem, 2006, 14, 7121-7137) foram preparados de acordo com os métodos da literatura.
Análise de Composto [00168] Todos os experimentos de RMN foram registrados em D2O (Sigma), CD3OD (sigma) ou Acetona-ctô (Sigma) em um espectrômetro Varian Unity de 400 MHz ou 500 MHz com solvente não deuterado residual como a referência interna. Deslocamento químico, δ (ppm); constantes de acoplamento, J (Hz); multiplicidade (s = singleto, d = dubleto, t = tripleto, q = quarteto, m = multipleto); e integração são reportados. Dados espectrais de massa de alta resolução foram registrados em um espectrômetro de massa ESI de tempo-detrajetória/quadripolar híbrido Micromass Q-Tof Ultima na University of Illinois Mass Spectrometry Laboratory. Todos os pontos de fusão não
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81/103 são corrigidos. LC-MS realizada em uma coluna C18, 2,1x5 mm, fase móvel A é TFA a 0,1% em H2O, B é acetonitrila usando um sistema de gradiente com constante 0% B durante 0-2 min, em seguida 0-50% B de 2-5 min, em seguida 50-100% B durante 5-7 min, constante 100% durante 7-8 min, e de 100-0% durante 8-10.
Esquema 7. Síntese de escala em Minigrama de S-PAC-1.
Figure BRPI1008651B1_D0101
NH4OH, 0 °C THF, 1h 95%
Figure BRPI1008651B1_D0102
Br
Figure BRPI1008651B1_D0103
THF, refluxo,
Figure BRPI1008651B1_D0104
25h 49%
Figure BRPI1008651B1_D0105
NaHCO3 acetona, refluxo,
22h 81%
Figure BRPI1008651B1_D0106
nh2nh2
EtOH, refluxo,
18h 79%
Figure BRPI1008651B1_D0107
H2N %
Figure BRPI1008651B1_D0108
Figure BRPI1008651B1_D0109
,nh2
Figure BRPI1008651B1_D0110
HCl (7 mol%)
Figure BRPI1008651B1_D0111
EtOH, refluxo, S-PAC-1
15h 82%
Esquema 8. Síntese de escala em grama de S-PAC-1.
Figure BRPI1008651B1_D0112
Figure BRPI1008651B1_D0113
THF, reflux, 5h
43%
Figure BRPI1008651B1_D0114
NH4OH, 0oC THF, 1h 78%
Figure BRPI1008651B1_D0115
THF/acetona, refluxo,
24h 60%
Figure BRPI1008651B1_D0116
,K2CO3
Figure BRPI1008651B1_D0117
nh2nh2
EtOH/MeOH, reflux, 16h
EtOH/MeOH, refluxo,
Figure BRPI1008651B1_D0118
O
Figure BRPI1008651B1_D0119
H
16h 91%
Figure BRPI1008651B1_D0120
HCl (7 mol %)
Figure BRPI1008651B1_D0121
Figure BRPI1008651B1_D0122
CHsCNZMeOH, refluxo, S-PAC-1
48h 55%
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82/103
2-(4-(4-Sulfamoilbenzil)piperazin-1-il)acetato de etila (3)
Figure BRPI1008651B1_D0123
[00169] Para uma mistura agitada de 1 (108 g, 440,7 mmols, 1,4 equiv.) e K2CO3 (132,4 g, 958,2 mmols, 3 equiv.) em 3:2 de
THF/acetona (2192 mL no total) foi adicionado 2-(piperazin-1-il)acetato de etila, 2 (79,9 g, 319,4 mmol, 1 equiv.). A reação foi refluxada durante 24 h monitorando-se por TLC. A solução foi filtrada e o sólido foi lavado com acetona (80 mL). O filtrado foi concentrado em vácuo, e em seguida purificado por recristalização em etanol para proporcionar 3 (57,4 g, 60%) como sólido amarelo-claro. Na escala em miligrama, o produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna flash em sílicagel (1:4 de MeOH/EtOAc). 1H-RMN (500 MHz, CD3OD): δ 7,86 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,52 (d, J = 8,0Hz, 2H), 4,17 (q, J = 7,1Hz, 2H), 3,61 (s, 2H), 3,24 (s, 2H), 2,58 (amplo d, J = 50,4Hz, 8H), 1,26 (t, J = 7,1Hz, 3H). 13C RMN (126 MHz, CD3OD): δ 170,4, 142,8, 142,4, 129,7, 126,0, 61,9, 60,6, 58,5, 52,5, 52,4, 13,3. HRMS (ESI): encontrado: 342,1487 (M+1); calcd. para C15H24N3O4S: 342,1488, ponto de fusão: 153,0 154,5. IR (líquido): 3319, 1739, 1160 cm-1.
4-((4-(2-hidrazinil-2-oxoetil)piperazin-1il)metil)benzenossulfonamida (4)
Figure BRPI1008651B1_D0124
Figure BRPI1008651B1_D0125
[00170] A uma solução agitada de 3 (110,9 g, 324,8 mmols, 1 equiv.) em 2:1 de etanol/metanol (650 mL no total, 0,5 M) foi adicionado hidrazina anidra (30,6 mL, 974,5 mmols, 3 equiv.). A reação foi refluxada durante 16 h monitorando por TLC (1:1 de MeOH/EtOAc). A mistura reacional foi concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em CH2CI2 e lavada com água (100 mL) e salmoura (100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2CI2 (3 x 80 mL) e EtOAc (80 mL). A
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83/103 camada orgânica combinada foi secada em Na2SÜ4, filtrada e concentrada em vácuo. A purificação com recristalização em metanol produzir 4 (96,3 g, 91%) como sólido branco. Na escala em miligrama, a reação foi conduzida em etanol (0,06 M). 1H RMN (500 MHz, CD3OD): δ 7,85 (d, J = 8,2Hz, 2H), 7,51 (d, J = 8,2Hz, 2H), 3,61 (s, 2H), 3,04 (s, 2H), 2,54 (amplo s, 8H), 13C RMN (126 MHz, CD3OD): δ 170,2, 142,8, 142,4, 129,7, 126,0, 61,9, 59,8, 53,0, 52,6. HRMS (ESI): encontrado: 328,1436 (M+1); calcd. para C13H22N5O3S: 328,1443, ponto de fusão: 194,5 - 196,0. IR (líquido): 3320, 1670, 1158 cm-1.
(E)-4-((4-(2-(2-(3-alil-2-hidroxibenzilideno)hidrazinil)-2oxoetil)piperazin-1-il)metil)benzenessulfonamida (S-PAC-1) [00171] A uma solução agitada de 5 (28,8 g, 177,3 mmols, 1 equiv.) em 1:2 de acetonitrila/metanol (1180 mL no total, 0,15 M), 4 (98,7 g. 301,4 mmol, 1,7 equiv.) e HCl (7 % em mol) foram adicionados. A reação foi refluxada durante 48 h monitorando-se por TLC. A solução foi concentrada em vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna flash em sílica-gel (1:4 de MeOH/EtOAc), e seguido por recristalização em metanol para proporcionar S-PAC-1 (45,9 g, 55%) como sólido esbranquiçado. Na escala em miligrama, a reação foi conduzida em etanol (0,02 M). 1H RMN (500 MHz, (CD3)2CO): δ 11,86 (s, 1H), 10,79 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 7,85 (d, J = 8,2Hz, 2H), 7,53 (d, J = 8,2Hz, 2H), 7,19 (d, J = 7,6Hz, 2H), 6,86 (t, J = 7,6Hz, 1H), 6,56 (s, 2H), 6,02 (tdd, 1H, J=6,7Hz, J=10,1Hz, J=16,9Hz), 5,04 (m, 2H), 3,60 (s, 2H), 3,42 (d, J = 6,7Hz, 2H), 3,18 (s, 2H) 2,57 (amplo d, J = 46,5Hz, 8H). 13C RMN (126 MHz, (CD3)2CO): δ 165,7, 156,4, 150,0, 143,4, 143,2, 136,9, 131,8, 129,32, 129,30, 127,9, 126,2, 119,1, 117,8, 115,1, 62,0, 61,1, 53,7, 52,9, 33,8. HRMS (ESI): encontrado: 472,2014 (M+1);
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84/103 calcd. para C23H30N5O4S: 472,2019. Ponto de fusão: 108,5 - 111,0. IR (líquido): 3227, 1684, 1606, 1157 cm 1. Pureza: >99,5% (LC-MS).
4-(Piperazin-1 -ilmetil)benzenossulfonamida (6) [00172] Piperazina anidra (860 mg, 10,0 mmols, 5 equiv.) foi adicionada ao THF (10 mL), e a mistura foi aquecida em refluxo até que a piperazina fosse dissolvida completamente. À solução, 1 (500 mg, 2,0 mmol, 1 equiv.) foi adicionado. A mistura reacional foi refluxada durante 2,5 hr monitorando por TLC. A mistura reacional foi neutralizada com solução de KOH a 1 M, e em seguida concentrada em vácuo. A purificação com cromatografia de coluna flash em sílica-gel (1:4 de MeOH/EtOAc) proporcionou 6 (250 mg, 49%) como semissólido amarelo-claro. 1H RMN (400 MHz, D2O/(CD3)2CO): δ 7,84 (d, J = 8,4Hz, 2H), 7,51 (d, J = 8,4Hz, 2H), 3,69 (s, 2H), 3,42 (s, 2H), 3,22 (m, 4H), 2,74 (m, 4H), 1,87 (s aparente, 1H). 13C RMN (126 MHz, CDCh): δ 140,93, 140,87, 131,0, 126,3, 61,1, 49,0, 43,13, HRMS (ESI): encontrado: 256,1114 (M+1); calcd. para C11H18N3O2S: 256,1120, IR (líquido): 3142, 1158 cm-1.
Exemplo 7. Modalidades Farmacêuticas [00173] O seguinte descreve informação pertinente às modalidades farmacêuticas e farmacológicas e também é suplementado por informação na técnica disponível para alguém versado na técnica. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser selecionadas por um único médico devido à condição de um paciente (veja por exemplo Fingl e outro, em The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Cap. 1 pág. 1 ).
[00174] Deve ser notado que o médico assistente sabe como e quando terminar, interromper, ou ajustar a administração devido à toxicidade, ou às disfunções de órgão, etc. Contrariamente, o médico assistente também sabe ajustar o tratamento em níveis mais altos se a resposta clínica não foi adequada (levando em conta ou excluindo os
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85/103 aspectos de toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no controle do distúrbio de interesse pode variar com a gravidade da condição a ser tratado e à via de administração. A gravidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos de avaliação de prognóstico padrão. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose, também podem variar de acordo com circunstâncias, por exemplo a idade, peso corporal e resposta do paciente individual. Um programa comparável ao que foi discutido acima pode ser usado em medicina veterinária.
[00175] Dependendo das condições específicas a ser tratadas e do método de alvejamento selecionado, tais agentes podem ser formulados e administrados sistemicamente ou localmente. Técnicas para formulação e administração podem ser encontradas em Alfonso e Gennaro (1995) e em outro lugar na técnica. Vias adequadas podem incluir, por exemplo, administração oral, retal, transdérmica, vaginal, transmucosal, ou intestinal; liberação parenteral, incluindo injeções intramusculares, subcutâneas, ou intramedularmente, bem como administração intraocular, intratecal, intravenosa ou intraperitoneal.
[00176] Para injeção ou outras vias, os agentes da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tal como solução de Hanks, solução de Ringer, água para injeção, tampão de solução salina fisiológica ou outra solução. Para administração transmucosal, penetrantes apropriados para a barreira a ser penetrada podem ser usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.
[00177] Uso de veículos farmaceuticamente aceitáveis para formular os compostos aqui descritos para a prática da invenção em dosagens adequadas para administração sistêmica ou outra está incluído no escopo da invenção. Com própria escolha de veículo e prática industrial adequada, as composições da presente invenção, em particu
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86/103 lar aquelas formuladas como soluções, podem ser administradas parenteralmente, tal como por injeção intravenosa, ou outras vias. Compostos apropriados podem ser formulados usando facilmente veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas para administração oral. Tais veículos permitem os compostos da invenção ser formulados como comprimidos, pílulas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, suspensões, elixires, soluções, suspensões e similares, por exemplo para ingestão oral por um paciente a ser tratado. Para outras vias, as formulações podem ser preparadas para cremes, unguentos, loções, e similares.
[00178] Os agentes pretendidos ser administrados intracelularmente podem ser administrados usando técnicas bem conhecidas por aqueles versado na técnica. Por exemplo, tais agentes podem ser encapsulados em lipossomas, outras porções facilitadoras de translocação de membrana, ou outras porções de alvejamento; em seguida administrados como descrito acima. Os lipossomas podem incluir bicamadas de lipídio esféricas com interiores aquosos. Todas as moléculas presentes em uma solução aquosa na hora da formação de lipossoma podem ser incorporadas no interior aquoso. Os teores de lipossômicos são ambos protegidos do microambiente externo e, porque os lipossomas fundem-se com membranas celulares, são eficazmente liberados no citoplasma da célula. Adicionalmente, devido aos atributos de hidrofobicidade, moléculas orgânicas pequenas podem ser administradas diretamente intracelularmente.
[00179] Composições farmacêuticas adequadas para uso na presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para alcançar o propósito pretendido. A determinação das quantidades eficazes está bem incluída na capacidade daqueles versados na técnica, especialmente levando em conta a descrição fornecida aqui e outra informação na téc
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87/103 nica.
[00180] Além dos ingredientes ativos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processo dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. As preparações formuladas para administração oral podem estar na forma de comprimidos, drágeas, cápsulas, ou soluções, incluindo aqueles formulados para liberação atrasada ou apenas liberados quando o farmacêutico alcança o intestino delgado ou grosso.
[00181] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas de uma maneira que é por si mesma conhecida, por exemplo, por meio de misturação, dissolução, suspensão, granulação, preparação de drágea, levigação, emulsificação, encapsulação, captura, liofilização convencionais e outros processos.
[00182] Formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Veículos ou solventes lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tal como carboximetil celulose sódica, sorbitol ou dextrana. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
[00183] Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas combinando-se os compostos ativos com excipiente sólido, opcionalmente moendo uma mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, depois de adicionar auxiliares adequados, se desejado, para
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88/103 obter comprimidos ou núlceos de drágea. Excipientes adequados são, em particular, cargas tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil celulose, carboximetilcelulose sódica e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes de desintegração podem ser adicionados, tal como polivinil pirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal dos mesmos tal como alginato de sódio.
[00184] Núcleos de drágea são opcionalmente fornecidos com camadas adequadas. Para este propósito, soluções de açúcar concentradas podem ser usadas, as quais podem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solvente. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drágeas para identificação ou para caracterizar as combinações diferentes de doses de composto ativo.
[00185] Preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de liberação controlada, bem como cápsulas macias, seladas feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de liberação controlada podem conter os ingredientes ativos em mistura com carga tal como lactose, aglutinantes tais como amidos e/ou lubrificantes tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, óleo de parafina, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, os estabilizadores podem ser adicionados.
[00186] Este pedido incorpora por referência cada qual dos seguintes pedidos em totalidade para todos os propósitos: Pedido Provisório
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89/103
U.S. Serial 60/684.807 depositado em 26 de Maio de 2005, inventores Paul J. Hergenroter, Karson S. Putt, Grace W. Chen, Jennifer M. Pearson [parecer do procurador número 47-05P]; Pedido Provisório U.S. Serial 60/743.878 depositado em 28 de Março de 2006 inventores Paul J. Hergenrother, Karson S. Putt, Grace W. Chen, Jennifer M. Pearson [parecer do procurador número 47-05P1]; Pedido Provisório US Serial 11/420.425 depositado em 25 de Maio de 2006 inventores Paul J. Hergenrother, Karson S. Putt, Grace W. Chen, Jennifer M. Pearson [parecer do procurador número 47-05US]; Pedido Internacional PCT Serial PCT/US 06/020910 depositado em 26 de Maio de 2006 inventores Paul J. Hergenrother, Karson S. Putt, Grace W. Chen, Jennifer M. Pearson [parecer do procurador número 47-05WO]; Pedido Internacional PCT Número PCT/US2008/061510 depositado em 25 de Abril de 2008 inventores Paul J. Hergenrother, Karson S. Putt, Joseph S. Sandhorst, Quinn P. Peterson, e Valerie Fako [parecer do procurador número 73-07 WO]; Pedido Provisório US Serial 60/914.592 depositado em 27 de Abril de 2007 inventores Paul J. Hergenrother; Karson S. Putt; Joseph S. Sandhorst; Quinn P. Peterson; Valerie Fako [parecer do procurador número 73-07P]. Pedido Provisório US número serial 12/597,287, depositado em 23 de Outubro de 2009 [parecer do procurador número 73-07 EUA]. Compostos reivindicados como composições da matéria em pedidos de patente listados aqui tendo um inventor idêntico ao pedido presente não são pretendidos ser reivindicados como composições da matéria no pedido presente e pretende-se que a descrição suficiente esteja presente no pedido presente a ser capaz de excluir cada composto das reivindicações individualmente ou em combinação.
DECLARAÇÕES REFERENTES À INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA E VARIAÇÕES [00187] Todas as referências ao longo deste pedido, por exemplo,
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90/103 documentos de patente que incluem equivalentes ou patentes emitidos ou concedidos; publicações de pedido de patente; pedidos de patente não publicados; e documentos de literatura de não patente ou outro material de fonte; estão por este meio aqui incorporados por referência aqui em suas totalidades, como se individualmente incorporados por referência, a medida em que cada referência é pelo menos parcialmente não incompatível com a descrição neste pedido, (por exemplo, uma referência que é parcialmente incompatível está incorporada por referência com exceção da porção parcialmente incompatível da referência).
[00188] Qualquer anexo ou anexos estão até aqui incorporados por referência como parte do relatório descritivo e/ou desenhos.
[00189] Onde os termos compreendem, compreende, compreendido, ou compreendendo são aqui usados, eles devem ser interpretados como especificando a presença dos aspectos declarados, números inteiros, etapas, ou componentes referidos, porém não para excluir a presença ou adição de um ou mais outros aspectos, número inteiro, etapa, componente, ou grupo dos mesmos. Modalidades separadas da invenção também são pretendidas ser abrangidas em que os termos compreendendo ou compreende(m) ou compreendido são opcionalmente substituídos com os termos, análogo em gramática, por exemplo; consistindo/consiste(m) ou consistindo essencialmente em/consiste(m) essencialmente em para desse modo descrever modalidades adicionais que necessariamente não são de extensão igual. Para clarificação, quando aqui usado compreendendo é sinônimo com tendo, incluindo, contendo ou caracterizado pelo fato de, e é inclusivo ou em aberto e não exclui etapas de método, elementos não relacionados, adicionais. Quando aqui usado, consistindo em exclui qualquer elemento, etapa, componente, ou ingrediente não especificado no elemento de reivindicação. Quando aqui usado, consis
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91/103 tindo essencialmente em não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e novas da reivindicação (por exemplo, não afetando um ingrediente ativo). Em cada exemplo aqui, quaisquer dos termos compreendendo, consistindo essencialmente em e consistindo em podem ser substituídos com qualquer um dos outros dois termos. A invenção ilustrativamente descrita aqui adequadamente pode ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que especificamente não são descritas aqui.
[00190] A invenção foi descrita com referência às várias modalidades e técnicas específicas e preferidas. Entretanto, deve ser entendido que muitas variações e modificações podem ser feitas enquanto permanecendo dentro do espírito e escopo da invenção. Será apreciado por alguém versado na técnica que composições, métodos, dispositivos, elementos de dispositivo, materiais, aspectos opcionais, procedimentos e técnicas diferentes daqueles especificamente descritos aqui podem ser aplicados à prática da invenção como amplamente descrito aqui sem recorrer à experimentação indevido. Todos os equivalentes funcionais conhecidos na técnica de composições, métodos, dispositivos, elementos de dispositivo, materiais, procedimentos e técnicas descritos aqui; e porções dos mesmos; são pretendidos que sejam abrangidos por esta invenção. Sempre que uma faixa é descrita, todas as subfaixas e valores individuais são pretendidos ser abrangidos. Esta invenção não deve ser limitada pelas modalidades descritas, incluindo quaisquer mostradas nos desenhos ou exemplificadas no relatório descritivo, que são determinadas por meio de exemplo ou ilustração e não de limitação. O escopo da invenção será apenas limitado pelas reivindicações.
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LISTAGEM DE REFERÊNCIAS
Pedido Provisório U.S. Serial 60/684.807 depositado em 26 de Maio de 2005; Pedido Provisório U.S. Serial 60743878 depositado em 28 de Março de 2006; Pedido Provisório U.S. Serial 11/420.425 depositado em 25 de Maio de 2006 (publicado como US 20070049602, 1 de Março de2007); Pedido Internacional PCT Serial PCT/US 06/020910 depositado em 26 de Maio de 2006 (publicado como WO2006/128173, 30 de Novembro de 2006), que estão incorporados por referência aqui, referem-se à matéria objeto do presente pedido.
Estes pedidos são particularmente incorporados por referência em sua totalidade: Pedido de Patente Provisório U.S. No. 60/516556 por Hergenrother e outro, depositado em 30 de Outubro de 2003; Pedido de Patente Provisório U.S. No. 60/603246 por Hergenrother e outro, depositado em 20 de Agosto de 2004; U.S. 10/976.186 por Hergenrother e outro, depositado em 27 de Outubro de 2004.
Pedido Provisório U.S. Serial 60/684.807 depositado em 26 de Maio de 2005; Pedido Provisório U.S. Serial 60743878 depositado em 28 de Março de 2006; Pedido Provisório U.S. Serial 11/420.425 depositado em 25 de Maio de 2006; Pedido Internacional PCT Serial PCT/US 06/020910 depositado em 26 de Maio de 2006; Pedido Provisório US Serial 60/914.592 depositado em 27 de Abril de 2007.
US 6.762.045 Membrane derived caspase-3, compositions comprising the same and methods of use therefore; US 6.534.267 Polynucleotides encoding activators of caspases; US 6.403.765 Truncated Apaf-1 and methods of use thereof; US 6.303.329; 6.878.743 por Choong, e outro, emitida em 12 de Abril de 2005; US 20040077542 por Wang, Xiaodong; e outro, publicado em 22 de Abril de 2004; US 20040180828 por Shi, Yigong, publicado em 16 de Setembro de 2004.
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Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (FX1):
    Figure BRPI1008651B1_C0001
    X1, X2, X3, X4 e X5 são cada um independentemente C ou N, em que pelo menos um de X1, X2, X3, X4 e X5 é C e quando X1, X2, X3, X4 ou X5 é N, o correspondente R10, R11, R12, R13, ou R14 está ausente;
    um de R10, R11, R12, R13, e R14 é
    O
    ---( 19R18RC-)-S—NRaRb 'qll o
    em que Ra e Rb são cada um independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C6 alquila, e C1-C6 alcóxi; R18 e R19 são cada um selecionados independentemente a partir do grupo consistindo de hidrogênio e C1C6 alquila; e q é um inteiro de 0 a 3;
    R7, R8, e R9 são cada um selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em: hidrogênio, halogênio, um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo -NH2 ou o grupo -NR'R em que cada R' e R é independentemente hidrogênio, ou um grupo C1-C6 alquila ou arila, um grupo carboxilato, um grupo arilsulfonila, C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi, e C2-C6 alquenila;
    os membros restantes de R10, R11, R12, R13, e R14, são cada
    Petição 870190100840, de 08/10/2019, pág. 4/12
  2. 2/5 um selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em: hidrogênio, halogênio, um grupo hidroxila, um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo -NH2 ou o grupo -NR'R em que cada R' e R é independentemente hidrogênio, ou um grupo C1-C6 alquila ou um grupo arila, um grupo carboxilato, um grupo arilsulfonila, C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi e C2-C6 alquenila; desde que, quando R10, R11, R12, R13, ou R14 for um grupo hidroxila, R7, R8, e R9 são cada um selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em: hidrogênio, halogênio, C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi e C2-C6 alquenila;
    arila é um grupo contendo um grupo carbocíclico aromático insaturado de 6 a 22 átomos de carbono tendo um único anel, um ou mais anéis, ou múltiplos anéis fundidos, em que pelo menos um anel é aromático;
    R3 é metóxi ou alila;
    n e m são cada um independentemente inteiros de 1 a 3;
    R4 e R5 são cada um independentemente CH ou N;
    A é O ou S;
    R6 é hidrogênio ou C1-C6 alquila;
    X é oxigênio; e
    R2 é hidrogênio ou C1-C6 alquila.
    2. Composto de fórmula (FX1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que
    X1, X2, X3, X4, X5, n, m, A, R4, R5, R2, R6, e X são como definidos; os membros restantes de R10, R11, R12, R13, e R14 são cada um independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: hidrogênio, halogênio, um grupo hidroxila, um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo -NH2 ou o grupo -NR'R, um grupo carboxilato, um grupo arilsulfonila, e C1-C6 alcóxi; e
    R7, R8, e R9 são cada um independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi ou C2-C6
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  3. 3/5 alquenila.
    3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R2 é hidrogênio.
  4. 4. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (FX1):
    Figure BRPI1008651B1_C0002
    em que
    X3, é C, e X1, X2, X3, X4 e X5 são cada um independentemente C ou N, em que, quando X1, X2, X4 ou X5 é N, o correspondente R10, R11, R13, ou R14 está ausente;
    R3, R7, R8, e R9 são cada um selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em: hidrogênio, halogênio, um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo -NH2 ou o grupo -NR'R em que cada R' e R é independentemente hidrogênio, ou um grupo C1-C6 alquila ou um grupo arila, um grupo carboxilato, um grupo arilsulfonila, C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi, e C2-C6 alquenila ;
    R10, R11, R13, e R14 são cada um independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: hidrogênio, halogênio, um grupo hidroxila, um grupo sulfonamida, um grupo nitro, um grupo NH2 ou o grupo -NR'R em que cada R' e R é independentemente hidrogênio, ou um grupo C1-C6 alquila ou arila, um grupo carboxilato, um grupo arilsulfonila, C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi, C2-C6 alquenila; desde que, quando R10, R11, R13, ou R14 for um grupo hidroxila, R3, R7, R8, e R9 são cada um selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em: hidrogênio, halogênio, C1-C6 alquila, C1-C6
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    4/5 alcóxi e C2-C6 alquenila;
    arila é um grupo contendo um grupo carbocíclico aromático insaturado de 6 a 22 átomos de carbono tendo um único anel, um ou mais anéis, ou múltiplos anéis fundidos, em que pelo menos um anel é aromático;
    R12 é
    O
    --( 19R18RC4-S—NRaRb /qll o
    em que Ra e Rb são cada um independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C6 alquila, e C1-C6 alcóxi; R18 e R19 são cada um selecionados independentemente a partir do grupo consistindo de hidrogênio e C1C6 alquila; e q é um inteiro de 0 a 3;
    n e m são cada um independentemente inteiros de 1 a 3;
    R4 e R5 são cada um, independentemente, CH ou N;
    A é O ou S;
    R6 é hidrogênio ou C1-C6 alquila;
    X é oxigênio; e
    R2 é hidrogênio ou C1-C6 alquila.
  5. 5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Ra e Rb são cada um hidrogênio e q é 0.
  6. 6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, 2, ou 4, caracterizado pelo fato de que R3 é alila e R2 é hidrogênio.
  7. 7. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um, dois ou três de R11, R12, e R13 são metóxi.
  8. 8. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um ou dois de X1, X2, X3, X4 e X5 são N.
  9. 9. Composto, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 4, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (FX3):
    Petição 870190100840, de 08/10/2019, pág. 7/12
    5/5
    Figure BRPI1008651B1_C0003
    (FX3)
  10. 10. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um rótulo fluorescente.
  11. 11. Composto, de acordo com a reivindicação 1, 2, ou 4, caracterizado pelo fato de que
    Ra e Rb são cada um hidrogênio;
    q é 0;
    R3 é alila; e
    R2 é hidrogênio.
  12. 12. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais compostos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
  13. 13. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o câncer é selecionado de câncer de mama, linfoma, câncer adrenal, câncer renal, melanoma, leucemia, neuroblastoma, câncer de pulmão ou câncer cerebral.
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