MX2007014843A

MX2007014843A - Induccion apoptotica selectiva en celulas cancerigenas que incluyen activacion apoptotica de procaspasa-3.

Info

Publication number: MX2007014843A
Application number: MX2007014843A
Authority: MX
Inventors: Paul J Hergenrother; Karson S Putt; Grace W Chen; Jennifer M Pearson
Original assignee: Univ Illinois
Priority date: 2005-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2008-02-14
Also published as: EP1893210A4; JP5907852B2; WO2006128173A3; WO2006128173A2; EP2659884A2; US20070049602A1; JP2013100285A; JP2008545718A; ES2763156T3; EP1893210B1; CA2610366A1; JP5513741B2; IL187603A0; DK1893210T3; EP2634581A1; EP1893210A2; EP2659884A3; AU2006251978A1

Abstract

La presente invencion se refiere a compuestos y metodos relacionados para la sintesis y el uso de compuestos en terapia para el tratamiento de cancer e induccion selectiva de apoptosis en celulas. Los compuestos son descritos en conjunto con modificacion de procaspasa tal como procaspasa-3, y en particular, las modalidades son capaces de dirigir la activacion de procaspasa-3, procaspasa-7 a formas efectoras de caspasa-3 y caspasa-7. Los niveles de procaspasa-3 pueden variar en los tipos de celulas cancerigenas; varios tipos tienen niveles relativamente elevados y pueden tener susceptibilidad incrementada a quimioterapia por compuestos y metodos descritos en este documento. Las aplicaciones terapeuticas son relevantes para una variedad de condiciones cancerigenas y tipos celulares, por ejemplo, mama, pulmon, cerebro, colon, renal, adrenal, melanoma, y otros.

Description

INDUCCIÓN APOPTOTICA SELECTIVA EN CÉLULAS CANCERÍGENAS QUE INCLUYEN ACTIVACIÓN APOPTÓTICA DE PROCASPASA-3 CAMPO DE LA INVENCIÓN La apoptosis, o muerte celular programada, juega un papel central en el desarrollo y homeostasis de todos los organismos multicelulares (Shi Y, 2002, Molecular Cell 9:459-470). Una marca frecuente de cáncer es resistencia a señales apoptóticas naturales. Dependiendo del tipo de cáncer, esta resistencia es típicamente debido a la regulación ascendente y descendente de proteínas claves en la cascada apoptótica o mutaciones en genes que codifican estas proteínas. Tales cambios ocurren en tanto la trayectoria apoptótica intrínseca, la cual canaliza a través de la mitocondria y caspasa-9, y la trayectoria apoptótica extrínseca, la cual involucra la acción de receptores de muerte y caspasa-8. Por ejemplo, alteraciones en los niveles apropiados de proteínas tales como p53, Bim, Bax, Apaf-1, FLIO y muchas otras, han sido observadas en cánceres. Las alteraciones pueden conducir a una cascada apoptótica defectiva, una en la cual la señal pro-apoptótica corriente arriba no es adecuadamente transmitida para activar la caspasa ejecutora, caspasa-3 y caspasa-7.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Como la mayoría de las trayectorias apoptóticas finalmente involucran la activación de procaspasa-3, las anormalidades genéticas corriente arriba son efectivamente "rotas" en el circuito apoptótico, y como un resultado, tales células proliferan atípicamente. Dado el papel central de la apoptosis en cáncer, se han hecho esfuerzos para desarrollar terapéuticos que dirigen proteínas específicas en la cascada apoptótica. Por ejemplo, las moléculas pequeñas o peptídicas se enlazan a miembros de la cascada, tales como p53 y proteínas en la familia Bel o el inhibidor de la familia de apoptosis (IAP) de proteínas tienen actividad pro-apoptótica, como lo hacen compuestos que promueven la oligomerización de Apaf-1. Sin embargo, debido a que tales compuestos dirigen las posiciones tempranas (o intermedias a altas) en la cascada apoptótica, cánceres con mutaciones en proteínas corriente abajo de aquellos miembros que pueden todavía ser resistentes a los efectos benéficos posibles de estos compuestos. Para propósitos terapéuticos, podrá ser ventajoso identificar una molécula pequeña que directamente activa una proteína proapoptótica lo suficientemente corriente abajo en la cascada apoptótica. El procedimiento de esta invención involucra tal posición relativamente baja en la cascada, permitiendo así la eliminación de aún aquellas células que tienen mutaciones en su maquinaria apoptótica corriente arriba. Sin embargo, las estrategias terapéuticas descritas en este documento, pueden tener una probabilidad superior de éxito si tal proteína apoptótica arriba regulada en células cancerígenas. En la presente invención, los esfuerzos para identificar moléculas pequeñas comienzan con dirigir la proteína efectora corriente abajo significante de la apoptosis, procaspasa-3. La conversión o activación de procaspasa-3 a caspasa-3, resulta en la generación de la forma de caspasa "ejecutora" activa, que subsecuentemente cataliza la hidrólisis de una multitud de sustratos de proteína. La caspasa-3 activa, es un homodímero de heterodímeros y se produce por proteólisis de procaspasa-3. In vivo, este activación proteolítica típicamente ocurre a través de la acción de la caspasa-8 o caspasa-9. Para asegurar que la proenzima o zimógeno no sea prematuramente activado, la procaspasa-3 tiene 12 aminoácidos de "captura segura" que bloquean el acceso al sitio IETD (secuencia de aminoácido, ile-glu-thr-asp) de proteólisis. Véase, Roy, S. et al.; Maintenance of caspase-3 proenzyme dormancy by an intrinsic "safety catch" regulatory tripeptide, Proc. Nati. Acad. Sci. 98, 6132-6137 (2001). Esta captura de seguridad permite a la procaspasa-3, resistir la activación autocatalítica y la proteólisis por la caspasa-9. Los estudios mutagénicos indican que tres residuos consecutivos de ácido aspártico, parecen ser los componentes críticos de la captura de seguridad. La posición de la captura de seguridad es sensible a pH; de este modo, después de la acidificación celular (como ocurre durante la apoptosis), la captura de * seguridad se piensa, permite el acceso al sitio de proteólisis, y la caspasa-3 activa puede ser producida ya sea por la acción de caspasa-9 o a través de un mecanismo de autoactivación. En cánceres particulares, la expresión de procaspasa-3 es regulada. Un estudio de aislados primarios de 20 pacientes con cáncer de colon, reveló que en promedio, la procaspasa-3 regulada arriba seis veces en tales aislados, con relación al tejido no canceroso adyacente (Roy et al., 2001). Además, la procaspasa-3 es regulada arriba en ciertos neuroblastomas, linfomas, y cánceres hepáticos Nakagawara, A. et al., 1997, Cáncer Res. 57:4578-4584; Izban, K. F. Ot al., Am. J. Pathol. 154:1439-1447; Persad, R. et al., Modem Patholo. 17:861-867). Además, se realizó una evaluación sistémica de niveles de procaspasa-3 en el panes de 60 líneas celulares usado para seleccionar cáncer por al Programa de Terapéuticos en Desarrollo del Instituto Nacional de Cancerología (NCI). La evaluación reveló que ciertos cánceres de pulmón, melanoma, renal y de mama, muestran niveles mayormente incrementados de expresión de procaspasa-3 (Svingen, P.A. et al., Clin. Cáncer Res. 10:6807-6820). Debido al papel de la caspasa-3 activa en lograr la apoptosis, los niveles de expresión relativamente altos de procaspasa-3 en ciertos tipos de células cancerosas, y la supresión mediada por captura de seguridad intrigante de su autoactivación, se razona que moléculas pequeñas que modifican directamente la procaspasa-3 podrían ser identificadas y que tales moléculas podrían tener mayor aplicabilidad en terapia de cáncer dirigido. En este documento, se describen modificadores de moléculas pequeñas de procaspasas, que incluyen en particular, activadores capaces de convertir procaspasa-3 a su forma efectora. Además, se demuestra que ciertas moléculas de fármaco pequeñas, pueden directamente e inmediatamente, activar la procaspasa-3 para lograr un efecto apoptótico en células cancerígenas in vivo. Se cree que estas son las primeras moléculas pequeñas conocidas por activar directamente la procaspasa-3. La activación directa de las caspasas ejecutoras representa una estrategia anticancerígena nueva y valiosa.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En general, los términos y frases usados en este documento, tienen su significado reconocido en la técnica, el cual se puede encontrar por referencia a textos estándares, referencias de diarios y contextos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las siguientes abreviaturas son aplicables, IAP, inhibidor de apoptosis; PAC-1, compuesto 1 que activa la caspasa; PARP, polimerasa poli (ADP-ribosa) . La invención proporciona ampliamente, compuestos, métodos de tratamiento terapéutico, métodos para seleccionar compuestos y métodos para seleccionar células y adecuabilidad al paciente para tratamiento en conjunto con modificadores de procaspasas. En una modalidad, los modificaciones son inhibidores o activadores. En una modalidad, la invención proporciona tales compuestos y métodos en conjunto con activadores de procaspasa-3 y procaspasa-7. En modalidades, las invenciones son aplicables en el contexto de una variedad de enfermedades cancerígenas y tipos de cáncer de células, tales como, mama, linfoma, adrenal, renal, melanoma, leucemia, neuroblastoma, pulmón, cerebral, y otros conocidos en la técnica . Como una introducción adicional, se ha descubierto que los compuestos son capaces de activar una enzima que es a menudo, sobre expresada en su forma inactiva en células cancerígenas. El compuesto induce muerte celular programada (apoptosis) en células cancerígenas, que incluyen aquellos que tienen procaspasa-3 regulada arriba. El cáncer es un problema grande y en crecimiento, y es ahora el número uno de muerte en los Estados Unidos. Muchos cánceres resisten la quimioterapia estándar. Los compuestos de la invención pueden tomar ventaja de un objetivo biológico que puede ser regulado arriba en células cancerígenas de este modo, puede proporcionar efectividad aún en células con defectos en su maquinaria apoptótica. Estos compuestos pueden también, ser exitosos en la terapia de cáncer dirigido, en donde se pueden tomar ventajas de la selectividad en la eliminación de células cancerígenas con toxicidad comparablemente reducida a células no cancerosas que tienen niveles inferiores de procaspasa-3. Sin querer ligarse por una teoría particular, se cree que los compuestos de la invención pueden actuar vía el mecanismo de modulación de apoptosis o muerte celular programadas por ser efectivos en el tratamiento de células cancerígenas. En una modalidad preferida, la modulación de apoptosis es por inducción de apoptosis. En otra modalidad, la modulación de apoptosis es por inhibición de apoptosis. En una modalidad, la invención proporciona un método para inducir selectivamente, apoptosis en cáncer de células, que comprende: (a) administrar a dicha célula cancerígena, un compuesto capaz de modificar una molécula de procaspasa-3 de dicha célula cancerígena; y (b) modificar dicha molécula de procaspasa-3 para inducir apoptosis. En una modalidad, dicha célula cancerígena está en un paciente en necesidad del tratamiento. En una modalidad, dicho compuesto es de fórmula ZZ: en donde n = 1 ó 2; R, independientemente de otro R, es hidrógeno, halógeno, alilo o alquilo corto; R2 = hidrógeno, alquilo corto, éster u otra porción que es removible bajo condiciones fisiológicas; R3 = hidrógeno, halógeno, alquilo, haloalquilo, alilo, alquenilo, alquenil, alcanol, o haloalquenilo; R4 y R5 son N; ó R4 = N y R5=C; ó R4 y R5 = C; y A = oxígeno o azufre. En una modalidad, dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de fórmula ZZ, PAC-1, y Estructura 5. En una modalidad, dicho compuesto es PAC-1. En una modalidad, el compuesto se selecciona de aquellos que tiene la fórmula ZZ, en donde R4 y R5 son ambos N, A es oxígeno y otros grupos variables son como se definen anteriormente. En una modalidad, el compuesto se selecciona de aquello que tienen la fórmula ZZ, en donde R4 y R5 son ambos N, A es oxígeno, R2 es hidrógeno y los otros grupos variables son como se definen anterior. En una modalidad, el compuesto se selecciona de aquellos que tiene la fórmula ZZ, en donde R4 y R5 y ambos son N, A es oxígeno, R2 es hidrógeno, R3 es alilo y otros grupos variables son como se definen anteriormente. En una modalidad, el método además comprende la etapa de valorar un parámetro de precaspasa-3 ó caspasa-3 en una célula cancerígena; en donde dicho parámetro es uno o más de una cantidad cuantitativa o semi-cuantitativa, una cantidad funcional, y un nivel de actividad de dicha procaspasa-3 o caspasa-3. En una modalidad, la invención proporciona un método para dirigir la selección in vitro de un compuesto capaz de modificar una molécula de procaspasa-3, que comprende: (a) proporcionar al menos un compuesto de prueba; (b) proporcionar una procaspasa-3 purificada; (c) exponer el compuesto de prueba a la procaspasa-3 purificada; (d) medir una actividad de procaspasa-3 seguida de exposición al compuesto de prueba; (e) identificar un compuesto modificante comparando una actividad de prueba después de la exposición del compuesto de prueba con una actividad no modificada en la ausencia de exposición al compuesto de prueba; con ello, seleccionar un compuesto capaz de modificar una molécula procaspasa-3. En una modalidad, el método además comprende comparar dicha actividad modificada o dicha actividad no modificada con una actividad de referencia; en donde dicha actividad de referencia es debido a la exposición de procaspasa-3 con un compuesto seleccionado del grupo que consiste de la fórmula estructural ZZ o subseries de compuestos de tal fórmula, PAC-1, y Estructura 5. En una modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar un compuesto capaz de activar la procaspasa-3 que comprende: a) proporcionar una procaspasa-3; proporcionar un compuesto de prueba, preferiblemente, una molécula pequeña; b) hacer reaccionar la procaspasa-3 con el compuesto de prueba, con ello, generar putativamente la caspasa-3; y c) medir la actividad de la caspasa-3. En una modalidad particular, la medición de la actividad de caspasa-3 emplea un sustrato, Ac-DEVD-pNA. En una modalidad particular, la medición usa un parámetro de lectura de longitud de onda de aproximadamente 410 nm. En una modalidad particular, la selección se lleva a cabo en paralelo, usando compuestos de prueba múltiple. En una modalidad, la invención proporciona un método de selección el cual usa la detección de una subunidad de procaspasa-3 como un indicador que la procaspasa-3 de longitud completa, es procesada a caspasa- 3. En una modalidad particular, la subunidad tiene un peso molecular de aproximadamente 19 kD, medido por una técnica de migración de gel de proteína, por ejemplo, en un manchado Western. En una modalidad, la invención proporciona un método de selección celular para un compuesto capaz de modificar una molécula de procaspasa-3, que comprende: (a) proporcionar un compuesto de prueba; (b) proporcionar una célula, en donde la célula expresa putativamente procaspasa-3; (c) exponer la célula al compuesto de prueba; (d) medir un parámetro después de la exposición al compuesto de prueba; en donde dicho parámetro comprende una o más de viabilidad celular, indicador apoptótico, y otros parámetros; (e) identificar un compuesto modificante comparando un parámetro celular probado después de la exposición al compuesto de prueba con un parámetro celular no modificado en la ausencia de exposición al compuesto de prueba; con ello, seleccionar un compuesto capaz de modificar una molécula de procaspasa-3. En una modalidad, el método además, comprende comparar dicha actividad modificada o dicha actividad no modificada con una actividad de referencia; en donde dicha actividad de referencia es debido a la exposición a un compuesto seleccionado del grupo que consiste de fórmula ZZ o subseries de compuestos de tales fórmulas PAC-1 y Estructura-5. En una modalidad, la presente invención, proporciona un método para identificar o diagnosticar una susceptibilidad potencial para tratamiento de una célula cancerígena con un compuesto activador de procaspasa, que comprende (a) valorar un parámetro de procaspasa en dicha célula cancerígena; y(b) determinar si dicho parámetro permite una susceptibilidad incrementada para activación de una procaspasa. En una modalidad, dicho parámetro de procaspasa es un nivel de procaspasa-3 y dicha procaspasa es procaspasa-3. En una modalidad, dicho parámetro de procaspasa es un nivel de procaspasa-7 y dicha procaspasa es procaspasa-7. Un nivel puede ser una cantidad cuantitativa o semi-cuantitativa, o cantidad funcional (por ejemplo, una cantidad a base de actividad, por ejemplo, una unidad estandarizada o unidad internacional). En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar una célula cancerígena, que comprende (a) identificar una susceptibilidad potencial para el tratamiento de una célula cancerígena con un compuesto activador de procaspasa; y (b) exponer dicha célula cancerígena con una cantidad efectiva del compuesto activador de procaspasa. En una modalidad, el compuesto activador de procaspasa se selecciona del grupo que consiste de fórmula ZZ o subseries de compuestos de tal fórmula, PAC-1, y Estructura 5. En una modalidad, el método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque dicho compuesto activador de procaspasa es capaz de activar la procaspasa-3, procaspasa-7, o tanto procaspasa-3 como procaspasa-7. En una modalidad, la invención proporciona un método para sintetizar PAC-1, que comprende las etapas del Esquema de Reacción 1. En una modalidad, la invención proporciona un método para sintetizar el Compuesto 5, que comprende las etapas del Esquema de Reacción 1 con modificación apropiada. En una modalidad, la invención proporciona un método para sintetizar compuestos de la fórmula ZZ como se describe en este documento y como podrá ser entendido en la técnica. En una modalidad, la invención proporciona compuestos de la fórmula ZZ: en donde n = 1 ó 2; R, independientemente de otro R, es hidrógeno, halógeno, alilo o alquilo corto; R2 = hidrógeno, alquilo corto, éster u otra porción que es removible bajo condiciones fisiológicas; R3 = hidrógeno, halógeno, alquilo, haloalquilo, alilo, alquenilo, alquenol, alcanol o haloalquenilo; R4 y R5 son N; o R4=N y R5=C; ó R4 y R5 = C; y A = oxígeno o azufre. En una modalidad, la invención proporciona compuestos de la fórmula ZZ que excluyen PAC-1, en donde la estructura de PAC-1 es: En una modalidad, la invención proporciona un compuesto de Estructura 5, en donde la estructura es: En una modalidad, una composición de la invención es un agente quimioterapéutico. En una modalidad, la invención proporciona compuestos y métodos que involucran concentraciones efectivas, preferiblemente desde 10 nM hasta aproximadamente 100 µM de las fórmulas estructurales descritas. En otra modalidad preferida, las concentraciones efectivas son desde aproximadamente 200 nM hasta aproximadamente 5 µM. En una modalidad, la concentración efectiva es considerada por ser un valor tanto como de 50% de concentración de actividad, en un ensayo de activación de procaspasa directa, en un ensayo de inducción de apoptosis celular, o en una valoración terapéutica clínica animal. En una modalidad preferida, tal valor es menos de aproximadamente 200 µM. En una modalidad preferida, el valor es menos de aproximadamente 10 µM. Los compuestos de la invención y los compuestos empleados en los métodos de esta invención incluyen, aquellos de las fórmulas descritas y sales y esteres de aquellos compuestos, que incluyen sales y esteres preferiblemente farmacéuticamente aceptables. En una modalidad, la invención proporciona formas de profármacos de composiciones. Los profármacos de los compuestos de la invención son empleados en los métodos de esta invención. Cualquier compuesto que será convertido in vivo para proporcionar una forma biológicamente, farmacéuticamente o terapéuticamente activa de un compuesto de la invención, es un profármaco. Varios ejemplos y formas de profármacos son bien conocidos en la técnica. Una biomolécula tal como una proteína precursora o ácido nucleico precursor, puede ser un profármaco. Ejemplos de profármacos se encuentran, entre otras cosas, en Design of Prodrugs, editado por H. Bundgaard, (Elsevier, 1985), Methods in Enzymology, Vol. 42, at pp. 309-396, editado por K. Widder, et . al. (Academic Press, 1985); A Textbook of Drug Design and Development, editado por Krosgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5, "Design and Application of Prodrugs," by H. Bundgaard, at pp. 113-191, 1991); H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 8, p. 1-38 (1992); H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 77, p. 285 (1988); y Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392). Cuando un grupo de sustituyentes es descrito en este documento, se entiende que todos los miembros individuales de tal grupo y todos los subgrupos, que incluyen cualquiera de los isómeros y enantiómeros del grupo de miembros, son descritos separadamente. Cuando un grupo Markush u otro agrupamiento se usa en este documento, todos los miembros individuales del grupo y todas las combinaciones y subcombinaciones posibles del grupo son propuestas para ser individualmente incluidas en la descripción. Se pretende que cualquiera de uno o más elementos de cualquier grupo Makish o listado proporcionado en la especificación, puede ser excluido de la invención si se desea. Cuando un compuesto es descrito en este documento de manera tal que un isómero o enantiómero particular del compuesto no es especificado, por ejemplo, en una fórmula o en un nombre químico, que la descripción es propuesta para incluir cada uno de los isómeros y enantiómeros del compuesto descrito individualmente o en cualquier combinación. Adicionalmente, a menos que se especifique de otro modo, todas las variantes isotópicas de compuestos descritos en este documento, están abarcadas por la descripción. Por ejemplo, se entenderá que cualquiera o más hidrógenos en una molécula descrita, pueden ser reemplazados con deuterio o tritio. Las variantes isotópicas de una molécula son en general, empleadas como estándares en ensayos para la molécula y en investigación química y biológica relacionada con la molécula o su uso. Nombres específicos de compuestos están propuestos para ser ejemplares, como se conoce que uno de habilidad en la técnica puede nombrar los mismos compuestos de manera diferente. Las moléculas descritas en este documento, pueden contener uno o más grupos ionizables [grupos a partir de los cuales puede ser removido un protón (por ejemplo, -OH, -COOH, etc.), o agregados (por ejemplo, aminas), o los cuales pueden ser cuaternizados (por ejemplo, aminas)]. Todas las formas iónicas posibles de tales moléculas y sales de los mismos, están propuestos para estar incluidos individualmente en la descripción de este documento. Con respecto a las sales de los compuestos de este documento, uno de habilidad ordinaria en la técnica puede seleccionar de entre una amplia variedad de counteriones disponibles, aquellos que son apropiados para la preparación de sales de esta invención para una aplicación dada. Por ejemplo, en generar, pueden ser empleados algunos aniones en la formación de sales de los compuestos de este documento; por ejemplo, haluro, sulfato, carboxilato, acetato, fosfato, nitrato, trifluoroacetato, glicolato, piruvato, oxalato, malato, succinato, fumarato, tartrato, citrato, benzoato, metansulfonato, etansulfonato, p-toluensulfonato, salicilato entre otros. Los compuestos de la presente invención, y sales o esteres de los mismos, pueden existir en su forma tautomérica, en la cual, los átomos de hidrógeno son transpuestos a otras partes de las moléculas y los enlaces químicos entre los átomos de las moléculas son consecuentemente reacomodados . Se debe entender que, todas las formas tautoméricas, en cuanto a que pueden existir, están incluidas dentro de la invención. Adicionalmente, los compuestos pueden tener isómeros trans y cis y pueden contener uno o más centros quirales, por lo tanto, existentes en formas enantioméricas y diasteroméricas . La invención puede abarcar todas de tales isómeros, enantiómeros individuales, así como también mezclas de isómeros cis y trans, mezclas de diatereómeros; mezclas racémicas y no racémicas de enantiómeros (isómeros ópticos); y mezclas mencionadas anteriormente enriquecidas por una o más formas; excepto como se declara de otro modo en este documento. Cuando no se hace mención de la configuración (cis, trans o R o S) de un compuesto (o de un carbono asimétrico) , entonces, se pretende cualquiera de los isómeros o una mezcla de más de un isómero. Los procesos para preparación pueden usar racematos, enantiómeros o diasterómeros como materiales de partida. Cuando se preparan productos enantioméricos o diastereoméricos, pueden ser separados por métodos convencionales, por ejemplo, por cristalización cromatográfica o fraccional. Los compuestos inventivos pueden estar en la forma libre o hidrato. Cada formulación o combinación de documentos descritos o ejemplificados en este documento, pueden ser usadas para practicar la invención, a menos que se declare de otro modo. Siempre que se describe un intervalo en la presente solicitud, por ejemplo, un intervalo de temperatura, un intervalo de tiempo o un intervalo de composición o concentración, todos los intervalos y subintervalos intermedios, así como también valores individuales incluidos en los intervalos dados, están propuestos para ser incluidos en la descripción. La información en cualquiera de las referencias descritas en este documento, pueden en algunos casos, indicar el estado de la técnica, por ejemplo, para documentos de patentes de sus fechas de presentación efectivas; se pretende que tal información pueda ser empleada en este documento, si se necesita, para excluir modalidades específicas que están actualmente encontradas en la técnica anterior. Por ejemplo, cuando se describe y/o reivindica un compuesto, se debe entender que los compuestos calificados como técnica anterior con respecto a la presente invención, incluyen compuestos para los cuales se proporciona una descripción permisiva en las referencias, no está propuesta para ser incluida en la composición del tema de las reivindicaciones de este documento . Algunas referencias proporcionadas en este documento, están incorporadas por referencia para proporcionar detalles con respecto a las fuentes de materiales de partida, materiales de partida adicionales, reactivos adicionales, métodos adicionales de síntesis, métodos adicionales de análisis, y usos adicionales de la invención. Uno de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que los materiales de partida, reactivos, sustratos sólidos, métodos sintéticos, métodos de purificación y métodos analíticos distintos de aquellos específicamente ejemplificados, pueden ser empleados en la práctica de la invención, basados en el conocimiento en la técnica y sin recurrir a experimentación indebida.

En una modalidad, la invención proporciona una composición terapéutica que comprende uno o más compuestos y para cada compuesto, una sal o éster del mismo farmacéuticamente aceptable; en donde los compuestos están presentes en la composición, en una cantidad o en una cantidad combinada efectiva para obtener el beneficio terapéutico deseado. Las composiciones terapéuticas de esta invención, opcionalmente además comprenden uno o más componentes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, portadores y excipientes como se conoce en la técnica. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula ZZ2: en donde Rl y R2 cada uno independientemente es hidrógeno, halógeno, alquilo, alilo, haloalquilo, alquenilo, alquenol, alcanol o haloalquenilo. En una modalidad, Rl y R2 cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, alilo o alquilo corto. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto seleccionado del grupo que consiste de una biblioteca combinatorial derivada de PAC-1 que comprende, un compuesto de hidrazida combinado con un compuesto de aldheído. En una modalidad, el compuesto de hidrazida se selecciona del grupo que consiste de hidrazidas generadas de compuestos AX descritos en este documento. En una modalidad, el compuesto aldheído se selecciona del grupo que consiste de compuestos BC descritos en este documento. En una modalidad, el compuesto hidrazida se selecciona del grupo que consiste de compuestos AX descritos en este documento, y el compuesto aldehido se selecciona del grupo que consiste de compuestos BX descritos en este documento. En una modalidad, la invención proporciona un método para sintetizar un compuesto derivado de PAC-1 que comprende, proporcionar un compuesto hidrazida, proporcionar un compuesto aldheído, y hacer reaccionar el compuesto hidrazida con el compuesto aldehido, con ello, sintetizar un compuesto derivado de PAC-1. En una modalidad, el compuesto hidrazida tiene la fórmula ZZ3: En una modalidad, el compuesto aldehido tiene la fórmula ZZ4: En una modalidad, el compuesto hidrazida tiene la fórmula ZZ3 y el compuesto aldehido tiene la fórmula ZZ4.

En una modalidad, la invención proporciona un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: L01 R06, L02R03, L02R06, L08R06, L09R03, L09R06 y L09R08. En una modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar un paciente con cáncer candidato para tratamiento posible con un activador de procaspasa, identificando un nivel elevado de una procaspasa en el candidato, que comprende, obtener una muestra de prueba de tejido o célula del candidato, valorar el nivel de procaspasa en la muestra de prueba, y determinar si el nivel de procaspasa es elevado en la muestra de prueba, con relación a un nivel de referencia, con ello, seleccionando un paciente de cáncer candidato para tratamiento posible con un activador de procaspasa. En una modalidad, la procaspasa se selecciona del grupo que consiste de procaspasa-2, -3, -6, -7, -8, y -9. En una modalidad particular, la procaspasa es procaspasa-3. En una modalidad, un nivel elevado de la muestra de prueba es al menos, aproximadamente 2 veces mayor que el nivel de referencia. En una modalidad, un nivel elevado de la muestra de prueba es al menos, aproximadamente 4 veces mayor que el nivel de referencia. En una modalidad, el nivel de referencia es desde una segunda muestra de prueba a partir del mismo paciente. En una modalidad, el nivel de referencia es de una muestra de tejido o célula normal. El nivel de referencia puede ser de una línea celular, tal como una línea de células cancerígenas o una línea de células normales. En una modalidad, el nivel de referencia es una cantidad de umbral absoluto. Véase, Svingen, P.A. et a., Clin. Cáncer Res. 10:6807-6820, el cual describe varias cantidades de niveles de procaspasas que incluyen, números de moléculas por célula. En una modalidad, la invención proporciona un método para inducir muerte en una célula cancerígena, que comprende, administrar a dicha célula cancerígena, un compuesto capaz de activar una molécula de procaspasa de dicha célula cancerígena. En una modalidad, la procaspasa es una o más de procaspasas-3 y procaspasa-7. En una modalidad preferida, la procaspasa es procaspas-3. En una modalidad, el compuesto tiene la fórmula estructural ZZ. En una modalidad, el compuesto tiene la fórmula estructural ZZ2. Se reconoce que, con respecto de las últimas correcciones de cualquier explicación mecanística o hipótesis que se cree o se describe en este documento, una modalidad de la invención no puede, sin embargo, ser operativa y útil.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. A) Activación in vitro de procaspasa-3 y caspasa-3 activa por PAC-1. El PAC-1 activa la procaspasa-3 con un EC50 = 0.22 µM. Las barras de error representan desviaciones estándares a partir de la media. B) El Desdoblamiento de procaspasa-3 a caspasa-3 activa, como se induce por PAC-1. La procaspasa-3 es recombinantemente expresada en E. coli con una etiqueta His-6 N-terminal y purificada. El inmunomanchado fue realizado con un anticuerpo anti-His-6. En la ausencia de PAC-1, no se observó maduración de procaspasa-3. En la presencia de 100 µM de PAC-1, el desdoblamiento para generar el fragmento pl9 se observa dentro de 1 hora, y se observa >50% de desdoblamiento después de 4 horas. Figura 2. A) Activación de mutantes en la región de "captura de seguridad" de procaspasa-3 por PAC-1. El PAC-1 tiene un EC50 para activación de 0.22 µM en la procaspasa-3 de tipo nativa (DDD) , y que corresponde a valores EC50 de 2.77 µM (DAD), 113 µM (DDA), y 131 µM (ADD) para ciertos mutantes. B) El PAC-1 activa la procaspasa-7 con un EC50 de 4.5 µM. C) Dependencia de activación de PAC-1 de procaspasa-3 en pH. A pH bajo, la captura de seguridad es "apagada", y la procaspasa-3 es esencialmente máximamente activada. Las barras de error representan desviaciones de la media. Figura 3. El PAC-1 induce apoptosis en células HL-60. A) Exposición de fosfatidilserina (medida por teñido Anexina-V) después de un tratamiento de 20 horas con 100 µm de PAC-1. B) Condensación de cromatina visualizado por teñido Hoescht después de un tratamiento de 20 horas con 100 µM de PAC-1. Figura 4. A) despolarización de membrana mitocontrial (MMP) y actividad de caspasa-3 similar en células HL-10 tratadas con 10 µM de etopósido. B) des polarización de membrana mitocontrial (MMP) y actividad similar a caspasa en células HL-60 tratadas con 100 µM de PAC-1. C) Tratamiento de PAC-1 (100 µM) induce un decremento rápido en actividad celular PARP en células HL-60, consistentes con una activación inmediata de caspasa-3/-7 celular. Por el contrario, células tratadas con etopósido (10 µM) , muestran un decremento en la actividad PARP a puntos de tiempo muy posteriores. D) El PAC-1 induce muerte celular en una manera dependiente de procaspasa-3. Para un número de líneas de células cancerígenas diversas, los niveles de procaspasa-3 fueron determinados (por citometría de flujo) y el IC50 de PAC-1, fue medido (R2=0-9822). El PAC-1 es casi potente (IC50 = 0.35 µM) en la línea de células de cáncer de pulmón NCI-H226 conocida por tener niveles elevados de procaspasa-3, pero marcadamente menos potente en células blancas de la sangre normales, derivadas de la médula ósea de un donador humano saludable. La Figura 5A ilustra los niveles de procaspasa-3 relativos en células cancerosas y normales de varios pacientes . La Figura 5B ilustra niveles IC50 para PAC-1 en una variedad de tipos celulares que tienen un intervalo de niveles de procaspasa-3 relativa. La Figura 5C ilustra el efecto de tratamiento de animales con PAC-1 en resultados de crecimiento de tumor. La Figura 5D ilustra el efecto de tratamiento oral de animales con PAC-1 en resultados de crecimiento de tumor. La Figura 5E ilustra resultados de progreso de cáncer en un modelo de cáncer de pulmón para grupos de tratamiento de control, PAC-1 y gefitinib (Iressa™; AstraZeneca) . Las células tumorales fueron inyectadas en ratones por administración i.v.; Iressa y PAC-1 se dieron oralmente a 100 mg/kg. La Figura 6A ilustra los niveles de procaspasa-3 relativos en células normales y cancerosas de tres pacientes . La Figura 6B ilustra la sensibilidad de células cancerosas y normales de 3 pacientes con tratamiento con PAC-1. La Figura 7 ilustra resultados para administrar PAC-1 intraperitonealmente en el contexto de un modelo de ratón de cáncer de pulmón.

La Figura 8A y 8B ilustran estructuras para compuestos de derivados PAC-1 y una biblioteca combinatorial . La Figura 9 ilustra una secuencia de nucleótido para peptidasa de cisteína relacionada con la apoptosis, capsasa 3 de Homo sapiens (CASP3) , variantes transcriptas alfa, ARNm, (Acceso No. NM_004346; 2689 bp de ARN lineal; obtenido de http://www.ncbi.nim.nih.gov/entrez). La Figura 10 ilustra una secuencia de nucleótido para caspasa 7 de Homo sapiens, peptidasa de cisteína relacionada con apoptopsis (CASP/) , variante de transcripto alfa, ARNm (Acceso No. NM_001227; 2605 pb; ARNm lineal, obtenido de http://www.ncbi.nlm.gov/entrez).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporcionan las siguientes definiciones para clarificar su uso específico en el contexto de la invención. Cuando se usa en este documento, el término "agente quimioterapéutico", se refiere a cualquier sustancia capaz de reducir o prevenir el crecimiento, proliferación o distribución de una célula cancerígena, una población de células cancerígenas, tumor u otro tejido maligno. El término está propuesto también para abarcar cualquier agente anticancerígeno o antitumoral.

Cuando se usa en este documento, el término "cantidad efectiva", está propuesto para abarcar contextos tales como, cantidad farmacéuticamente efectiva o cantidad terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, en modalidades, la cantidad es capaz de lograr un estado benéfico, resultado benéfico, actividad funcional en un ensayo de selección, o mejoramiento de una condición clínica. Cuando se usa en este documento, el término "célula cancerígena", está propuesto para abarcar definiciones como se entiende ampliamente en la técnica. En una modalidad, el término se refiere a una célula anormalmente regulada que puede contribuir a una condición clínica de cáncer en un humano o animal. En una modalidad, el término puede referirse a una línea de células cultivadas o a una célula dentro o derivada de un anticuerpo humano o anima. Una célula cancerígena puede ser de una amplia variedad de células diferenciadas, tejidos o tipos de órganos, como se entiende en la técnica. El término "alquilo", se refiere a una cadena de hidrocarburo saturada ramificada o no ramificada monoradial, que tiene preferiblemente, de 1 a 22 átomos de carbono y a grupos cicloalquilo que tienen de uno o más anillos que tienen 3 a 22 átomos de carbono. Grupos alquilo corto son aquellos que tienen 1 a 6 átomos de carbono que incluyen grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo, que incluyen todos los isómeros de los mismos. Los grupos alquilo largos son aquellos que tienen 8-22 átomos de carbono y preferiblemente, aquellos que tienen 12-22 átomos de carbono, así como también aquellos que tienen 12-20 y aquellos que tienen 16-18 átomos de carbono. El término "cicloalquilo", se refiere a grupos alquilo cíclicos de 3 a 22 átomos de carbono que tienen un anillo cíclico único o anillos múltiples condensados. Grupos cicloalquilo incluyen por medio de ejemplo, estructuras de anillo únicas tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo, ciclooctilo y similares, o estructuras de anillo múltiple, tales como adamantilo y similares. El término "alquenilo", se refiere a un grupo de un monoradical de un hidrocarburo insaturado ramificado o no ramificado, preferiblemente que tiene 2 a 22 átomos de carbono y a grupos cicloalquenilo que tienen uno o más anillos que tienen 3 a 22 átomos de carbono en donde al menos, un anillo contiene un doble enlace. Grupos alquenilo pueden contener uno o más enlaces dobles (C=C) , los cuales pueden ser conjugados. Los grupos alquenilo preferidos son aquellos que tienen 1 a 2 enlaces dobles. Grupos alquenilo cortos son aquellos que tienen 2 a 6 átomos de carbono que incluyen, grupos etileno (vinil) propileno, butileno, pentileno y hexileno, que incluyen todos los isómeros de los mismos. Grupos alquenilo largos, son aquellos que tienen 8-22 átomos de carbono y preferiblemente, aquellos que tienen 12-22 átomos de carbono, así como también aquellos que tienen 12-20 átomos de carbono y aquellos que tienen 16-18 átomos de carbono. El término "cicloalquenilo"; se refiere a grupos alquenilo cíclicos de 3 a 22 átomos de carbono que tienen un anillo cíclico único o anillos múltiples condensado en los cuales, al menos un anillo contiene un doble enlace (C=C) . Grupos cicloalquenilo incluyen, por medio del ejemplo, estructuras de anillos múltiples tales como, ciclopropenilo, ciclobutanilo, ciclopentenilo, ciclooctenilo, ciclooctadienilo y ciclooctatrienilo. El término "alquinilo"; se refiere a un monoradical de un hidrocarburo insaturado que tiene de 2 a 22 átomos de carbono y que tiene uno o más enlaces triple (CDC) . Grupos alquinilo incluyen, etinilo, propargilo y similares. Grupos alquinilo cortos son aquellos que tienen 2 a 6 átomos de carbono, que incluyen todos los isómeros del mismo. Grupos alquinilo largos, son aquellos que tienen 8-22 átomos de carbono y, preferiblemente, aquellos que tienen 12-22 átomos de carbono, así como también, aquellos que tienen 12-20 átomos de carbono y aquellos que tienen 16-18 átomos de carbono. El término "arilo", se refiere a un grupo que contiene un grupo carbocíclico aromático insaturado desde 6 a 22 átomos de carbono, que tiene un anillo único (por ejemplo, fenilo) , uno o más anillos (por ejemplo, bifenilo) o anillos múltiples condensados (fusionados) , en donde al menos, un anillo es aromático (por ejemplo, naftilo, dihidrofenantrenilo, fluorenilo o antrilo) . Arilos incluyen, fenilo, naftilo y similares. Grupos arilo pueden contener porciones que son alquilo, alquenilo o alquinilo, además del (los) anillos aromáticos insaturados. El término "alcarilo", se refiere a los grupos arilos que contienen porciones alquilo, es decir, alquilen-arilo y alquilen-arilo-sustituidos . Tales grupos alcarilo son ejemplificados por bencilo, fenetrilo y similares. Grupos alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo, son opcionalmente sustituidos como se describe en este documento (los términos pueden incluir variaciones sustituidas) y pueden contener 1-8 sustituyentes no hidrógeno dependientes del número de átomos de carbono en el grupo y el grado de insaturación del grupo. El término "alquileno", se refiere a un radical de una cadena hidrocarburo saturada ramificada o no ramificada, preferiblemente que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente, que tiene 1-6 átomos de carbono, y más preferiblemente, que tiene 2-4 átomos de carbono; el término puede incluir variaciones sustituidas.

Este término es ejemplificado por grupos tales como metileno (-CH2-) , etileno (-CH2CH2-) , más en general - (CH2)N, en donde n es 1-10 o más preferiblemente 1-6 o n es 2, 3 -o 4. Grupos alquileno pueden ser ramificados. Grupos alquileno pueden ser opcionalmente sustituidos. Grupos alquileno pueden tener hasta dos sustituyentes no hidrógenos por átomos de carbono. Grupos alquileno sustituidos preferidos tienen, 1, 2, 3 ó 4 sustituyentes no hidrógeno . El término "arileno", se refiere al diradical derivado de arilo (que incluye, arilo sustituido) , como se define anteriormente y se ejemplifica por 1, 2-fenileno, 1, 3-fenileno, 1, 4-fenileno, 1, 2-naftileno y similares. El término "amino", se refiere al grupo -NH2 o al grupo -NRR, en donde cada R es seleccionado independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterocíclico, siempre que ambos R no sean hidrógeno. Grupos alquilo son opcionalmente sustituidos como se discute en este documento, y pueden, dependiendo del tamaño del grupo alquilo, tener preferiblemente de 1-10 grupos sustituyentes. Grupos alquilo sustituidos incluyen aquellos que portan 1 a 8 sustituyentes, 1 a 5 sustituyentes, 1 a 3 sustituyentes, y 1 ó 2 sustituyentes. "Haloalquilo", se refiere a alquilo como se define en este documento, sustituido por uno o más grupos halo como se define en este documento, los cuales pueden ser el mismo o diferente. Grupos haloalquilo representativos incluyen, por medio del ejemplo, trifluorometilo, 3-fluorododecilo, 12,12,12-trifluorododecilo, 2-bromooctilo, 3-bromo-6-cloroheptilo y similares. El término "heteroarilo", se refiere a un grupo aromático de 2 a 22 átomos de carbono que tienen, 1 a 4 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre con al menos, un anillo (si existe más de un anillo) . Grupos heteroarilo pueden ser opcionalmente sustituidos. El término "heterociclo" o "heterocíclico", se refiere a un monoradical de grupo saturado o insaturado, que tiene un anillo único o anillos múltiples condensados, de 2-22 átomos de carbono, y de 1 a 6 heteroátomos, preferiblemente 1 a 4 heteroátomos, seleccionados de nitrógeno, azufre, fósforo y/o oxígeno con al menos, un anillo. Grupos heterocíclicos pueden ser sustituidos. El término "éster", se refiere a entidades químicas como se entiende en la técnica y en particular, puede incluir grupos de la forma (RCO-) .

Como cualquiera de los grupos anteriores los cuales contienen uno o más sustituyentes, se entiende que tales grupos no contienen alguna sustitución o patrones de sustitución, los cuales son estéricamente imprácticos y/o sintéticamente no factibles. Los compuestos de esta invención incluyen todos los nuevos isómeros estereoquímicos a partir de la sustitución de compuestos descritos . La invención puede ser además, entendida por los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1. Compuestos que activan la procaspasa La expresión aberrante o mutación de proteínas en la cascada apoptótica, es una marca frecuente de cáncer. Estos cambios pueden prevenir las señales proapoptóticas de ser transmitidas a las caspasas ejecutoras, de este modo, previniendo la muerte celular apoptótica y permitiendo la proliferación celular. La caspasa-3 y caspasa-7, son caspasas ejecutoras clave, que existen como zimógenos inactivos que son activados por señales corriente arriba. De manera importante, los niveles de expresión de procaspasa-3, son significantemente superiores en ciertas células cancerígenas, con relación a los controles no cancerosos. Se ha reportado la identificación de moléculas pequeñas que activan directamente la procaspasa-3 a caspasa-3 activa. Un compuesto particular, PAC-1, efectúa la activación in vitro con un EC50 en el orden de 220 nanomolar e induce apoptosis en una multitud de líneas de células cancerosas. Contrario a muchos fármacos anti-cancerígenos conocidos, las células tratadas con PAC-1, muestran una activación inmediata de procaspasa-3, y la toxicidad de PAC-1 se muestra por ser directamente proporcional a la cantidad de procaspasa-3 contenida en una célula. De este modo, el PAC-1 activa directamente la procaspasa-3 a caspasa-3 in vivo, permitiendo a este compuesto, inducir apoptosis aún en células que tienen maquinaria apoptótica defectiva. El PAC-1 es la primer molécula pequeña conocida por activar directamente la procaspasa-3; la activación directa de las caspasas ejecutoras es una nueva estrategia anticancerígena que puede proveer beneficios en una variedad de cánceres, que incluyen, los muchos cánceres en los cuales la procaspasa-3 es regulada arriba. Una colección de aproximadamente 20,000 moléculas pequeñas estructuralmente diversas, se selección por la capacidad para activar la procaspasa-3 in vitro. La procaspasa-3 es expresada y purificada en E. coli (Roy et al., 2001). La procaspasa-3 (a una concentración de 50 ng/ml) , se agrega a las cavidades de una placa de 384 cavidades, y los compuestos se agregan a una concentración final de aproximadamente 40 µM. Cada placa fue entonces ' incubada por dos horas a 37°C, después de lo cual, el sustrato peptídico de caspasa-3 Ac-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilida (Ac-DEVD-pNa) , se agregó a una concentración de 200 µM. La formación de cromóforo de p-nitroanilina se siguió a 405 n, durante el curso de dos horas. De los compuestos evaluados, cuatro inducen un incremento significante durante el antecedente en la hidrólisis del sustrato de caspasa-3 peptidica . De estos j ! cuatro, uno muestra un efecto dependiente de dosis fuerte ¡ en la activación de procaspasa in vitro. Como se muestra en I ! la Figura ÍA, este primer compuesto de activación de ' I procaspasa (PAC-1) , proporciona media activación máxima de procaspasa-3 a una concentración de 0.22 µM. Este compuesto no solo incrementa simplemente la actividad de caspasa-3 misma, sino no tiene efecto en la actividad catalítica de la enzima de caspasa-3 completamente procesada (Figura ÍA) . La procaspasa-3 tiene un pro-dominio N-terminal (residuos 1-28), seguido por una subunidad grande (17 kDa) ¡ y una subunidad pequeña (12 kDa) que son separadas por un enlazador inter-subunidad (Pop et al., 2003). In vivo, dos monómeros de procaspasa-3 se montan para formar un i homodímero catalíticamente inactivo que puede ser activado por desdoblamiento en D175 en el enlazador de intersubunidad. El papel preciso del dominio pro no es claro, y se ha mostrado que el desdoblamiento en la región intersubunidad solo, es suficiente para la completa actividad catalítica (Stennicke, H. R. et al., 1998). Aunque la procaspasa-3 es catalíticamente competente, es altamente resistente a autoactivación debido a la presencia de la captura de seguridad de 12 aminoácidos; sin embargo, cuando la captura de seguridad es mutada, se observa significante autoactivación de procaspasa-3 (Roy et al., 2001) . Los compuestos que interactúan con esta región regulatoria importante o en otras posiciones, pueden permitir la autoactivación de procaspasa-3. Para valorar directamente la capacidad de PAC-1 para catalizar la autoactivación de procaspasa-3, la proteína procaspasa-3 fue incubada con 100 µm de PAC-1 por puntos de tiempo que varían de una a cinco horas. Como se muestra por el manchado Western en la Figura IB, PAC-1 induce el desdoblamiento de procaspasa-3 en una forma dependiente del tiempo, con >50% de procesamiento observado después de 4 horas. Por el contrario, la procaspasa-3 incubada en amortiguador, no muestra virtualmente autoactivación sobre el mismo transcurso de tiempo. En un intento por indicar la región de procaspasa-3 con la cual el PAC-1 está interactuando, se hizo la sustitución de alanina en la tirada de ácido aspártico clave en la región de captura de seguridad, Aspl79, AspldO y Aspldl.

Mutaciones en estos puntos, reducen dramáticamente la capacidad de PAC-1 para activar la procaspasa-3, con ciertas mutaciones más perjudiciales a la activación de procaspasa-3 por PAC-1 (Figura 2A) . Como la caspasa-3, la caspasa-7 también existe como un zimógeno inactivo que es activado por proteólisis. La caspasa-2 y caspasa-7, son ambas caspasas ejecutoras y tienen homología estructura y secuencia considerable (Denault, J. B. et a., 2003). La procaspasa-7 puede también tener una región de captura de seguridad similar, aunque tiene solamente dos ácidos aspárticos en la triada clave (Asp-Thr-Asp) , en lugar de tres. Como se indica por los datos en la Figura 2B, el PAC-1 pude también activar la procaspasa-7, aunque en una manera menos eficiente que su activación de procaspasa-3 (EC50 de 4.5 µM contra 0.22 µM para activación de procaspasa-3) . La potencia de activación de procaspasa-7 por PAC-1, es similar a su efecto en el mutante Asp-Ala-Asp de procaspasa-3 (EC50 = 2.77 µM) . El efecto de PAC-1 es abolido a valores de pH bajos, en donde la procaspasa-3 se somete a rápida autoactivación (Figura 2C) . Se probó la capacidad de una molécula pequeña que activa la procaspasa-3 para inducir apoptosis en líneas de células humanas, y el PCA-1 se encontró por inducir apoptosis en una variedad de líneas de células de cáncer.

En células HL-60, la adición de PAC-1 conduce a exposición de fosfatidilserina considerable en la membrana celular, acompañada por una condensación de cromatina significante (Figuras 3A y B) . Además, el compuesto incluye desdoblamiento de PARP-1 (como se valora por un ensayo de actividad PARP in vivo; Putt KS et al., 2005) y causa despolarización de la membrana mitocondrial (véase abajo). También se observó por microscopio, significante sangrado celular. Además, la toxicidad de PAC-1 podrá ser abolida en la presencia del inhibidor de caspasa z-VAD-fmk (datos no mostrados; véase Slee et al., 1996). Si el PAC-1 está en verdad, induciendo apoptosis vía activación directa de procaspasa-3, el curso de tiempo de eventos apoptóticos debe ser alterado con relación a aquel observado con genes proapoptóticos estándares. El etopósido es bien conocido por inducir apoptosis a través de la trayectoria intrínseca; de este modo, la despolarización de la membrana mitocondrial es seguida por la activación de procaspasa-3 en células tratadas con etopósido. Sin embargo, en células HL-60 tratadas con 10 µM de etopósido, se observa la despolarización de la membrana mitocondrial, seguida por detección de actividad similar a caspasa-3 (Figura 4A) . Por el contrario, el tratamiento de células con PAC-1, da un resultado marcadamente diferente. Con PAC-1, la primera marca bioquímica observada de apoptosis es actividad enzimática similar a caspasa-3. Esta actividad es notada dentro de minutos de adición de compuesto, y 50% de activación toma lugar en solo 2 horas y también antes de cualquier despolarización de membrana mitocondrial significante (Figura 4B) . Además, la actividad PARP es rápidamente reducida en células tratadas con PAC-1, mientras esta reducción es observada a puntos de tiempo posterior en células tratadas con etopósido (Figura 4C) . Experimentos de control muestran que el PAC-1 no inhibe directamente la actividad enzimática de PARP-1. En la secuencia típica de eventos apoptóticos, las caspasas que despolarizan la membrana mitocondrial son activadas, y los sustratos de caspasa (tales como PARP-1), son desdoblados. La observación de que células tratadas con PAC-1 muestran una rápida activación de caspasa-3/-7 (antes de la despolarización de la membrana mitocondrial) y un rápido desdoblamiento de un sustrato de caspasa, es indicativo de que este compuesto ejerce su toxicidad celular a través de la activación directa de procaspasa-3. Para definir además la potencia de PAC-1, fue valorada la capacidad de este compuesto para inducir muerte celular en líneas de células cancerígena con niveles variantes de procaspasas-3. Se hizo una determinación de la cantidad de procaspasa-3 presente en líneas de células de cáncer múltiples (leucemia, linfoma, melanoma, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer renal) y en las células blancas de la sangre, aisladas de la médula ósea de un donador sano. Los valores IC50 de inducción de muerte celular, fueron obtenidos para PAC-1 en estas líneas celulares. Los datos combinados muestran una fuerte correlación entre la concentración celular de procaspasa-3 y la sensibilidad a PAC-1 (Figura 4D) . Notablemente, las células blancas de la sangre derivadas de la médula ósea de un donador humano saludable, que están entre aquellas con la cantidad más baja de procaspasa-3, y PAC-1, son comparativamente menos tóxicas a estas células. El PAC-1 es más potente contra la línea de células cancerígenas de pulmón NCI-H226, con un IC50 de 0.35 µM. De conformidad con los datos en la literatura (Svingen et al., 2004), se encontró que esta línea celular tiene una concentración de procaspasa-3 que es mayor que cinco veces aquella del control no canceroso. Contrario a estos experimentos con PAC-1, el etopósido no mostró tal correlación entre la potencia en cultivo celular y niveles celulares de procaspasa-3. Por ejemplo, el etopósido fue inefectivo (IC50 >50 µm) , en inducir muerte en tres de las líneas de células de melanoma (UACC-62, CRL-1872 y B16-F10), la línea de células de cáncer de mama (Hs 578t) , y la línea de células de cáncer de pulmón (NCI-H226) ; estas líneas tienen niveles de procaspasa-3 de 1.0, 2.4, 1.9, 3.7 y 5.3, respectivamente. El etopósido fue efectivo (IC50 <1 µM) contra HL-60, U-937, SK-N-SH y PC-12, los cuales tienen niveles de procaspasa-3 de 4.3, 4.0, 4.7, y 4.4, respectivamente. De este modo, no existe correlación total entre los niveles de procaspasa-3 e IC50 para etopósido. Las células cancerosas típicamente tienen una sensibilidad reducida a señales proapoptóticas debido a la mutación o expresión aberrante de una clasificación de proteínas en la cascada apoptótica. Como tal, muchos tipos de cáncer son notoriamente resistentes a no solamente las señales endógenas para muerte celular apoptótica, sino también a agentes quimioterapéuticos que actúan a través de mecanismos similares. La regulación arriba paradójica de niveles de expresión de procas?asa-3 en ciertos cánceres, proporciona una oportunidad para usar esta combinación extracelular existente de proteínas para inducir directamente apoptosis, de este modo, a menudo, derivando la porción corriente arriba comprometida o no funcional de la cascada. Aunque la procaspasa-3 es notoria por su incapacidad relativa para someterla a autoactivación, es dependiente de una captura de seguridad de 12 aminoácidos para mantener la misma en el estado inactivo. El PAC-1 induce la autoactivación de procaspasa-3 in vitro, y esta activación es mayormente disminuida por mutación de la región tri-aspartato clave de la captura de seguridad. Estos datos son consistentes con la noción de que el PAC-1 está interfiriendo directamente con la capacidad de la captura de seguridad. Estos datos son consistentes con la noción de que el PAC-1 está interfiriendo directamente con la capacidad de la captura de seguridad para mantener la dormancia de la procaspasa-3. En cultivo celular, el tratamiento de PAC-1 induce la rápida actividad similar a caspasa-3. Es probable que el desdoblamiento mediado por caspasa-3 de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, etc.,), entonces induce despolarización de la membrana mitocondrial y amplifica la apoptosis. Además, la potencia de PAC-1 hacia una variedad de líneas de células cancerígenas, es directamente proporcional a la concentración de procaspasa-3 en la célula. Es digno de notar que varias de las líneas celulares de PAC-1, son efectivas contra aquellas que tienen trayectorias apoptóticas defectuosas que las hacen resistentes a apoptosis; por ejemplo, la expresión Apaf-1, es dramáticamente reducida en células SK-MEL, y Bcl-2 es sobre expresado en la línea de células cancerígenas de pulmón NCI-H226. Los datos presentados en este documento, soportan completamente la noción de que los compuestos que activan la procaspasa-3, pueden ser excedentemente efectivos contra cánceres comunes. La efectividad puede ser mejorada por situaciones en las cuales, los niveles de procaspasa-3 son aberrantemente altos. La valoración de niveles de procaspasa-3 en biopsias cancerígenas, puede ser simple y rápida; como tal, la efectividad potencial de un compuesto tal como PAC-1, puede ser valorada a priori con un alto grado de exactitud. Los activadores de procaspasa-3 y métodos de este documento, así proporcionan estrategias de medicina personalizadas que pueden ser preferenciales a terapias que dependen en general, de citocinas en la esfera de tratamientos anti-cancerígenos .

MATERIALES Y MÉTODOS Materiales: Resina Ni-NTA y anticuerpo anti-penta His Alexa Fluor 647, adquirido de Qiagen (Valencia, CA) . El tinte Bradford se adquirió de Bio-Ra (Hercules, CA) . Dispositivos de transferencia Pin fueron adquiridos de V & P Scientific (San Diego, CA) . El reactivo z-vad-fmk fue adquirido de Calbiochem (San Diego, CA) . E. coli de Rosetta se adquirió de Novagen (Madison, Wl) . El anticuerpo anti-caspasa-3 fue adquirido de Sigma (St. Louis, MO) . El conjugado Anexina V Alexa Fluor 488, JC-9, y yoduro de propidio, fueron adquiridos de Mo Molecular Probes (Eugene, OR) . Reactivo de Ensayo de Proliferación Celular CellTiter 96 de IPTG y MTS/PMS, fueron adquiridos de Promega (Madison, Wl) . Suero bovino fetal fue adquirido de Biomeda (Foster City, CA) . Placas microtituladoras de 96 y 384 cavidades, laminillas de microscopio, cubre objetos de microscopio, suero de caballo y otros reactivos fueron adquiridos de Fisher (Chicago, IL) . Métodos: Condiciones de cultivo celular: células U-937, HL-60, CRL-1872, ACHN, NCI-h226, SK-MEL y UACC-62, se hicieron crecer en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%. Células SK-N-SH, B-16-F10 y Hs 578t, se hicieron crecer en medio esencial mínimo de Eagle con Earle's BBS, 1.5 g/1 de bicarbonato de sodio y suplementado con FBS al 10%. Las células PC-12 se hicieron crecer en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 5% y suero de caballo al 10%. Médula ósea humana se hizo crecer en medio DMEM suplementado con FBS al 40%. Todas las líneas celulares fueron incubadas a 37°C en 5% de C02, 95% de atmósfera de aire. Las células U-937 y HL-60 fueron divididas cada dos a tres días como sean necesarias. La médula ósea humana se cebó de solución base congelada e inmediatamente se diluyó y usó por experimentos. Todas las otras células fueron divididas cuando alcanzaron aproximadamente, 80% de confluencia . Expresión de Proteína y Purificación: 1 ml de un cultivo durante la noche, de E. coli de Rosetta, que contiene el plásmido de expresión de procaspasa-3 ó procaspasa-7, se sembró en 11 de medio LB que contiene antibiótico apropiado. Las células se indujeron con 1 mM de IPTG por 30 minutos. Las células fueron entonces centrifugadas y re-suspendidas en amortiguador de enlace NTA (150 mM de NaCl,- 50 mM de Tris, 10 mM de imidazol, pH 7.9). Las células se sometieron a lisis pasando dos veces a través de una prensa French. El lisado celular entonces se centrifugó a 14,000 x g por 30 minutos. El sobrenadante se decantó y 1 ml de resina de níquel-NTA, se agregaron. El lisado celular se incubó por 1 hora a 4°C. La resina se cargó en una columna, se lavó con 10 mL de amortiguador de enlace NTA, seguido por 10 ml de amortiguador de lavado NTA (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris, 20 mM de imidazol, pH 7.9). Las proteínas fueron eluidas en fracciones de 1 ml con 10 ml de amortiguador de elución (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris, 250 mM de imidazol, pH 7.9). Las fracciones que contienen la proteína fueron combinadas y la cantidad de proteína fue determinada usando el ensayo Bradford. Selección de biblioteca: Se diluyó procaspasa-3 aislada a 50 ng/ml en amortiguador de ensayo de caspasa (50 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 10 nM de DTT, 0.1 mM de EDTA y CHAPS al 0.1% y glicerol Al 10%, pH 7.4). 45 µl de solución de procaspasa-3 se agregaron a cada cavidad de una placa microtituladora de fondo plano de 384 cavidades (Nunc) .

Aproximadamente, 20,000 compuestos fueron seleccionados. Aproximadamente 6,000 de los compuestos fueron colectados de varias fuentes dentro del departamento de química en la Universidad de Illinois; sus estructuras fueron disponibles en http://www.scs.uiuc.edu/~phgroup/comcollections.html. Los otros aproximadamente 14,000 compuestos fueron adquiridos de Chembridge Coporation (San Diego, Califeornia) . El PAC-1 fue un miembro de los compuestos adquiridos de Chembridge Corporation. Los compuestos, se laboraron como soluciones base 10 mM en DMSO, fueron transferidos en las cavidades usando un aparato de transferencia 394-oin, que transfiere 0.2 µl del compuesto. Esto proporcionó una concentración de compuesto final de aproximadamente 40 µM. Los controles se realzaron en los cuales, solamente DMSO (que no contiene compuesto) , fueron transferidos a pin. Las placas fueron entonces incubadas por 2 horas a 37°C. Se agregaron a cada cavidad, 5 µl de solución 2 mM de Ac-DEV-pNA (N-acetil-ASP-Glu-Val-Asp-p-nitrianilido) . La placa fue entonces leída cada 2 minutos a 405 nm por 2 horas en un lector de placa Spectra Max Plus 384 (Molecular Devices, Sunny CA) . La inclinación de la porción lineal para cada cavidad, se usó para determinar la actividad de caspasas-3. Curvas de activación. La dependencia de dosis de activadores de procaspasa-3, se determinó agregando varias concentraciones del compuesto a 90 µl de una procaspasa-3, caspasa-3 activa, procaspasa-7 o caspasa-7 activa, en amortiguador de ensayo de caspasa en una placa de 96 cavidades. La placa entonces fue incubada por 12 horas a 37 °C. Se agregaron 10 µl de una solución 2 mM de Ac-DEVD-pNa en amortiguador de ensayo de caspasa, a cada cavidad. La placa se leyó cada 2 minutos a 405 nm por 2 horas en un lector de placa de 384 cavidades Max Plus. La inclinación de la porción lineal de cada cavidad, fue determinada y se calcularon las veces de incremento en las cavidades de control no tratadas. Gel de activación de PAC-1. Se expresó la procaspasa-3 y se aisló exactamente como anteriormente. La procaspasa-3 se diluyó a aproximadamente 50 µg/ml en ensayo amortiguador de caspasa. La procaspasa-3 fue entonces incubada en la presencia o ausencia de 100 µM de PAC-1 por tiempo variantes a 37°C. Después de esta incubación, un volumen igual de amortiguador de carga (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris, 2% de SDS, 20% de glicerol, pH 8.0 ) , se agregó a cada muestra de procaspasa-3. Todas las muestras fueron entonces almacenadas a -80°C hasta que se completó el curso de tiempo. Todas las muestras entonces se incubaron a 95°C por 5 minutos y a una corrida en gel SDS-PAGE al 12%. Las proteínas fueron entonces transferidas a papel de nitrocelulosa durante la noche. Los manchados se lavaron en TTBS (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris, Tween-20 al 0.1%, pH ' ¡ 7.4) y se bloquearon con una solución lechosa al 10% por 2 horas. Los manchados entonces se incubaron en una dilución 1:5000 de anticuerpo anti-Penta His Alexa Fluor 647 por 2 horas. El manchado fue entonces lavado con TTBS y explorado en un explorador fluorescente Typhoon (Amersham Biosciences, SunnyVale CA) . Mutaciones de captura de seguridad. La captura de seguridad de procaspasa-3 DDD (SEC ID NO:l; SEC ID NO: 2; SEC ID NO: 9) fue mutada a ADD (SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO:10), DAD (SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, SEC ID NO:ll) y DDA (SEC ID NO : 7 , SEC ID NO : 8 , SEC ID NO: 12), usando la estrategia de cambio rápido con los siguientes cebadores, gacagacagtggtgttgCGgatgacatggcgtgtcataaaatacc (SEC ID NO: 13) , gacagacagtggtgttgatgCtgacatggcgtgtcataaaatacc (SEC ID NO: 14) y gacagacagtggtgttgatgatgCcatggcgtgtcataaaatacc (SEC ID NO: 15), respectivamente. Véase también Figura 9 y Figura 10. Las bases mutadas están subrayadas y en mayúsculas. Todos los plásmidos mutantes fueron secuenciados para asegurar la secuencia apropiada a través del gen. Todos los plásmidos fueron expresados exactamente como procaspasa-3 tipo nativo como se describe anteriormente. La capacidad de PAC-1 para activada cada mutante de procaspasa-3, fue determinada agregando varias concentraciones de PAC-1 a 90 µl de una procaspasa-3 de tipo nativo 50 ng/ml y procaspasa-3 mutante en amortiguador de ensayo de caspasa en una placa de 96 cavidades. La placa fue entonces incubada por 12 horas a 37°C. Se agregaron entonces 10 µl de una solución 2 mM de Ac-DEVD-pNA en amortiguador de ensayo de caspasa a cada cavidad. La placa se leyó cada 2 minutos a 405 nm por 2 horas en un lector de placa de 384 cavidades Spectra Max Plus. La inclinación de la porción lineal para cada cavidad fue determinada y se calcularon las veces de incremento en actividad para cada mutante. Efecto de pH en la activación de PAC-1 de procaspasa-3. El efecto de pH en la activación de procaspasa-3 por PAC-1, se determinó diluyendo procaspasa-3 en amortiguador de ensayo de caspasa a pH (25 mM de MES, 25 mM de Tris, 25 mM de HEPES, 25 mM de PIPES, 100 mM de NaCl, 10 mM de DTT, 0.1 mM de EDTA, 0.1% de CHAPS y glicerol al 10%) a una concentración de 50 ng/ml. El amortiguador fue entonces cambiado a varios valores de pH y se agregaron 80 µl a cada cavidad de una placa de 96 cavidades. El PAC-1 se agregó a una concentración de 100 µM o DMSO se agregó como un control para cada valor de pH . La palca entonces se incubó por 12 horas a 37°C. Se agregaron entonces, 10 µl de una solución 2 mM de Ac-DEVD-pNA en amortiguador de ensayo de capsasa, a cada cavidad. La placa se leyó cada 2 minutos a 405 nm por 2 horas en un lector de placa Spectra Max Plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) . La inclinación de la porción lineal para cada cavidad se determinó y se calcularon las veces de incremento en activación para cada valor de pH. Teñido de Anexina V. 500 µl de medio que contiene 100 µM de PAC-1 o solamente DMSO como un control, se agregaron a las cavidades de una placa de 24 cavidades. 500 µl de células HL-60 a una concentración de 2 x 106 células/ml, fueron entonces agregadas a la placa de 24 cavidades. La placa se incubó por 20 horas a 37°C. Las células fueron colectadas por centrifugación y lavadas dos veces en PBS. Las células fueron entonces lavadas en amortiguador de enlace de Anexina V (10 mM de HEPES, 140 mM de NaCl, 2.5 mM de CaC12, pH 7.4 ) y resuspendidas en 100 µl de amortiguador de enlace Anexina V. 5 µl de anexina C, conjugado Alexa Fluor 488, se agregaron y los tubos fueron incubados a temperatura ambiente por 15 minutos protegidos de la luz. Se agregaron entonces, 400 µl de amortiguador de enlace de Anexina V, seguido por la adición de 1 µl de una solución 1 mg/ml de yoduro de propidio. La intensidad fluorescente de cada célula se determinó por citometría de flujo a 525 nm (canal verde) y 675 nm (canal rojo) . Al menos, 50,000 células fueron analizadas en cada experimento. Teñido de cromatina condensada. 500 µl de medio que contiene 200 µM de PAC-1 o solamente DMSO como un control, se agregaron a las cavidades de una placa de 24 cavidades. 500 µl de células HL-60 a una concentración de 2 x 106 células/ml, fueron entonces agregadas a la placa de 24 cavidades. Las células fueron incubadas por 20 horas y colectadas por centrifugación. Las células fueron, entonces lavadas en amortiguador de PBS seguidas por la adición de etanol al 100% enfriado en hielo. Las células se fijaron durante la noche a 4°C. Las células fijas fueron incubadas con 2 µg/ml de Hoechst-33258 por 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregó entonces una gota de células a una laminilla de microscopio y se cubrió con un cubre objetos de espesor No. 1. La cromatina condensada se observó a amplificación 400x en un microscopio Zeiss Axiovert 100. Inhibición de muerte celular por z-vad-fmk. 100 µl de células HL-60 a una concentración de 5 x 105 células/ml, fueron agregadas a las cavidades de una placa de 96 cavidades. Las células entonces fueron incubadas por 1 hora en la presencia o ausencia de 100 µM de z-vad-fmk, un inhibidor de caspasa de bandeja permeable. El PAC-1 fue entonces agregado a varias concentraciones, y las células fueron incubadas por unas 24 horas adicionales. La muerte celular se cuantificó por la adición de 20 µl de reactivo de Ensayo de Proliferación Celular CellTiter 96 MTS/PMS a cada cavidad. Las placas fueron incubadas a 37°C por aproximadamente 45 minutos hasta que se formó el producto coloreado. La absorbancia fue entonces medida a 490 en un lector de placa Spectra Max Plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) . Determinación in vivo de potencial de membrana mitocondrial. 1 ml de células HL-60 a una concentración de 1 x 106 células/ml, fueron agregadas a las cavidades de una placa de 24 cavidades. El PAC-1 entonces se agregó a una concentración de 100 µM o solamente se agregó DMSO como un control. Las células fueron incubadas por varios tiempos, y las células entonces fueron colectadas por centrifugación. Las células se lavaron en PBS y se resuspendieron en 1 ml de PBS. 10 µg del tinte JC-9 se agregó y las células se incubaron a temperatura ambiente por 10 minutos protegido de la luz. Las células fueron entonces lavadas dos veces con PBS y llevadas en 500 µl de PBS. La intensidad fluorescente de cada cavidad, se determinó por citometría de flujo a 525 nm (canal verde) y 675 nm (canal rojo) . Se analizaron 50,000 células en cada experimento. El cambio en el canal rojo entonces se usó para determinar la cantidad de despolarización de la membrana mitocondrial. Determinación in vivo de actividad similar a caspasa-3. La cantidad de actividad de proteasa similar a caspasa-3, se determinó por la cantidad de Ac-DEVD-pNA (N-acetil-ASP-Glu-Val-Asp-p-nitroanilido) , desdoblada por minuto por lisados celulares. Para realizar esto, 50 µl de medio que contiene concentraciones variantes de PAC-1, fueron agregadas a las cavidades de una placa de 96 cavidades. 50 µl de células HL-60 a una concentración de 5 x 106 células/ml se agregaron a la placa y se incubaron varias veces. Después del periodo de incubación, la placa se centrifugó a 1000 x g por 5 minutos para formar en pelotillas las células. Las células entonces fueron lavadas con 100 µl de PBS y resuspendidas en 150 µl de Amortiguador de Ensayo de Caspasa enfriado en hielo. Cada cavidad fue entonces sonicada para lisar las células. Se transfirieron 90 µl de lisado celular de cada cavidad en una nueva placa. Se agregó Ac-DEVD-pNA en cada cavidad para dar una concentración final de 200 µM. La placa entonces fue leída cada 2 minutos a 405 nm por 2 horas en un lector de placa Spectra Max Plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) . La inclinación de la porción lineal de cada cavidad se determinó, y se calculó la cantidad de Ac-DEVD-pNA desdoblado por minuto. Determinación in vivo de desdoblamiento PARP. La cantidad de PARP desdoblado se determinó usando un ensayo de actividad PARP in vivo. Para realizar esto, 50 µl de medio que contiene 200 µM de NAD+, se agregó a las cavidades de control de una placa de 96 cavidades. 50 µL de medio que contiene 200 µM de PAC-1 y 200 µM de NAD+, entonces se agregaron a las cavidades experimentales. 25 µl de PAC-1 y 200 µM de NAD+ entonces se agregaron a las cavidades experimentales. 25 µl de células HL-60 a una concentración de 5 x 106 células/ml, fueron entonces agregadas a cada cavidad. Las células fueron incubadas varias veces y después centrifugadas a 1000 x g por 5 minutos. El medio celular se removió y reemplazó con 50 µl de amortiguador PARP de Lisis (50 mM de Tris, 10 mM de MgCl2, pH 8.0, Tritón X-100 al 1%) que contiene 25 mM de H202. La placa entonces se incubó por 60 minutos a 37°C. Para determinar la cantidad de NAD+ todavía presente, se agregaron 20 µl de KON 2M y 20 µl de acetofenona al 20% (v/v) de solución de acetofenona (en etanol) a cada cavidad de la placa de 96 cavidades. La placa entonces se incubó por 5 minutos en un horno ajustado a 110°C. La placa fue dejada enfriar y después se leyó en un Criterio Analista AD (Molecular Devisas, Sunnyvale, CA) , con una excitación de 360 nm, una emisión de 445 nm y un espectro dicroico de valor límite 400 nm. El fluoróforo fue excitado usando una lámpara continua de 1000 W por 1.6 x 105 µs con 5 lecturas realizadas por cavidad. El número de moles de NAD+ desdoblados por minuto, entonces se calculó y se determinó la actividad PARP restante comparada con las cavidades de control. Concentración relativa de procaspasa-3 en varias líneas celulares. Se cosecharon células U-937, HL-60 y de médula ósea humana por centrifugación, mientras todas las otras líneas celulares fueron primero tripsinizadas para liberar las células y después cultivarlas por centrifugación. Todas las células fueron lavadas en PBS y resuspendidas en 1 ml de etanol al 100% enfriado en hielo. Las células fueron fijadas durante la noche a 4°C. Las células fueron centrifugadas a 1000 x g por 5 minutos, lavadas con PBS y se agregaron entonces 100 µl de una dilución 1:100 de anticuerpo anti-caspasa-3 en PBS. Las células fueron incubadas por 2 horas a temperatura ambiente, seguida por cinco lavados de PBS. Las células fueron entonces resuspendidas en 1 ml de una dilución 1:10,000 de anticuerpo etiquetado Ab Cy3 anti-ratón por 2 horas a temperatura ambiente protegido de la luz. Las células fueron lavadas cinco veces con BPS y resuspendidas en 5000 µl de PBS. La intensidad fluorescente de cada cavidad fue determinada por citometría de flujo a 675 nm (canal rojo). Al menos, 20,000 células fueron analizadas en cada experimento. La media de la población se usó para determinar la concentración relativa de procaspasa-3 en cada línea celular. Determinación de valores IC50 en varias líneas celulares. 50 µl de medio que contiene varias concentraciones de PAC-1 o etopósido, se agregó a cada cavidad de una placa de 96 cavidades, excepto a las cavidades de control, la cual contiene solamente DMSO. Células U-937, HL-60 y de médula ósea humana, fueron colectadas por centrifugación, mientras otras líneas celulares fueron primero tripsinizadas antes de la centrifugación. Las células fueron entonces resuspendidas en medio y diluidas a ya sea 1 x 106 células/ml por células U-937, HL-60 y de la médula ósea humana ó 50,000 células/ml para otras líneas celulares. 50 µl de soluciones celulares se agregaron entonces a cada cavidad y las placas fueron incubadas por ya sea 24 ó 72 horas para etopósido y PAC-1, respectivamente. La muerte celular fue cuantificada por la adición de 20 µl del reactivo de Ensayo de Proliferación Celular MTS/PMS CellTiter a cada cavidad. Las placas fueron entonces incubadas a 37 °C por aproximadamente una hora hasta que se formó el producto coloreado. La absorbancia se midió a 490 nm en un lector de placa Spectra Max Plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) . Análisis de Datos: los datos de todos los experimentos de citometría de flujo se analizaron usando Software Summit (Cytomation, Fort Collins CO) . Todas las gráficas fueron analizadas usando la Curva 2D de la Tabla. El profesor Ronald Huffman (Centro Cancerígeno de la Universidad de Illinois-Chicago) proporciona médula ósea. El profesor Guy Salvesen (Burhham Institute) , proporciona los vectores de expresión de procaspasa-3 y procaspasa-7. REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIA - Apéndice A. La información del listado de secuencia comparado separadamente, designado Apéndice A, es considerado e incorporado como parte de la especificación junto con esta.

Tabla 1. Revisión de la Información del Listado de Secuencia EJEMPLO 2 : Síntesis de compuestos que activan la procaspasa PAC-1 y otros compuestos son preparados de conformidad con los siguientes esquemas de reacción, por ejemplo, el Esquema de Reacción 1 y/o Esquema de Reacción 2. Variaciones adicionales se preparan de conformidad con los métodos conocidos en la técnica.

Esquema de Reacción 1 En un ejemplo particular, el PAC-1 es preparado de conformidad con el Esquema de Reacción 2: reflujo ¡ll reflujo al S) % 5)2% EJEMPLO 3. Análogos de PAC-1 Se prepararon compuestos análogos de PAC-1 y se valoraron por la capacidad para activar procaspasa-3 purificada directamente activa in vitro.

Tabla 2. Actividad de PAC-1 y compuestos análogos EJEMPLO 4 : Modalidades farmacéuticas Lo siguiente, describe información relevante a modalidades farmacéuticas y farmacológicas y está además, suplementada por información en la técnica disponible para uno de habilidad ordinaria. La formulación exacta, ruta de administración y dosificación, pueden ser elegidos por un especialista individual en vista de la condición de un paciente (véase por ejemplo, Fingí et al., en The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Ch. 1 p. 1). Se debe notar que es especialista que atiende podrá saber como y cuando terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, o a disfunciones de órgano, etc. Contrariamente, el especialista que atiende podrá también saber ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clínica no fue adecuada (en vista de o evitando aspectos de toxicidad) . La magnitud de una dosis administrada en el manejo del trastorno de interés puede variar con la severidad o la condición a ser tratada y la ruta de administración. La severidad de la condición puede, por ejemplo, ser evaluada en parte, por métodos de evaluación pronostica estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis, también pueden variar de conformidad con las circunstancias, por ejemplo, la edad, peso corporal y respuesta del paciente individual. Un programa comparable discutido anteriormente puede también ser usado en medicina veterinaria. Dependiendo de las condiciones específicas a ser tratadas y el método objetivo seleccionado, tales agentes pueden ser formulados y administrados sistémicamente o localmente. Las técnicas para formulación y administración se pueden encontrar en Alfonso and Gennaro (1995) y en otra parte en la técnica. Las rutas adecuadas pueden incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosal, o intestinal; suministro parenteral que incluye, administración intramuscular, subcutánea o inyecciones intramedularmente, así como también administración intraocular, intratecal, intravenosa, o intraperitoneal . Para inyección u otras rutas, agentes de la invención pueden ser formulados en soluciones acuosas, preferiblemente, en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución Hank, solución Ringer, agua para inyección, amortiguador de salina fisiológica, u otra solución. Para administración transmucosal, los penetrantes apropiados a la barrera para ser permeados, se pueden usar en la formulación. Tales penetrantes son en general, conocidos en la técnica. El uso de portadores farmacéuticamente aceptables para formular los compuestos en este documento, se describen para la práctica de la invención en dosificaciones adecuadas para administración sistémica u otra, están dentro del alcance de la invención. Con la elección apropiada del portador y práctica de manufacturación adecuada, las composiciones de la presente invención, en particular aquellas manufacturadas como soluciones, pueden ser administradas parenteralmente, tal como por inyección intravenosa u otras rutas. Los compuestos apropiados pueden ser formulados fácilmente usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para administración oral. Tales portadores permiten a los compuestos de la invención, ser formulados como tabletas, pildoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, elixires, soluciones, suspensiones y similares, por ejemplo, para ingestión oral por un paciente a ser tratado. Para otras rutas, las formulaciones pueden ser preparadas por cremas, ungüentos, lociones y similares. Agentes propuestos para ser administrados intracelularmente, pueden ser administrados usando técnicas bien conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Por ejemplo, tales agentes pueden ser encapsulados en liposomas, otras porciones que facilitan la translocación de la membrana, u otras porciones objetivo; entonces se administración como se describe anteriormente. Las liposomas pueden incluir bicapas lípidas con interiores acuosos. Todas las moléculas presentes en una solución acuosa al tiempo de la formación de liposoma, pueden ser incorporadas en el interior acuoso. Los contenidos liposomales son ambos protegidos del microambiente externo, y, debido a que los liposomas se fusionan con membranas celulares, son eficientemente suministrados en el citoplasma celular. Adicionalmente, debido a los atributos de hidrofobicidad, moléculas orgánicas pequeñas pueden ser directamente administradas intracelularmente. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la presente invención, incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el uso propuesto. La determinación de las cantidades efectivas está también dentro de la capacidad de aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, especialmente en vista de la descripción proporcionada en este documento y otra información en la técnica. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares los cuales facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones, las cuales pueden estar en la forma de tabletas, grageas, cápsulas o soluciones, que incluyen aquellas formuladas para liberación retardada o solamente ser liberadas cuando el farmacéutico alcanza el intestino delgado o grueso. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden ser manufacturadas en una manera que es por sí misma conocida, por ejemplo, por medio de mezclado, disolución, suspensión, granulación, elaboración de grageas, levitación, emulsificación, encapsulamiento, atrapamiento, liofilización y otros procesos convencionales. Formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden ser preparadas como suspensiones de inyección aceitosa apropiadas. Solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o esteres de ácido graso sintéticos, tales como oleato etílico o triglicéridos o liposomas. Suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias, las cuales incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como carboxilmetil celulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados, los cual incrementa la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden ser obtenidas combinando los compuestos activos con excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de gragea. Excipientes adecuados son, en particular, rellenadores tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea, se pueden agregar agentes desintegrantes, tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Los núcleos de grageas son opcionalmente proporcionados con revestimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar soluciones de azúcar concentrada, las cuales opcionalmente contienen goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietilen glicol y/o dióxido de titanio, soluciones de lacas y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solvente. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a los revestimientos de tabletas o grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo. Preparaciones farmacéuticas, las cuales se pueden usar oralmente, incluyen cápsulas ajustadas a presión hechas de gelatina, así como, cápsulas selladas, suaves hechas de gelatina y un plastificador, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas ajustadas a presión pueden contener el ingrediente activo en mezcla con rellenadores tal como lactosa, aglutinantes tal como almidones y/o lubricantes tal como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas suaves, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilen glicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizadores.

EJEMPLO 5. Inducción Directa de Apoptosis en Células Cancerígenas con un Activador de Molécula Pequeña de Procaspasa-3. EXTRACTO: La mutación o expresión aberrante de proteínas en la cascada apoptótica es un sello de cáncer. Estos cambios previenen señales proapoptótica de ser transmitidas a las caspasas ejecutoras, así previniendo la muerte celular apoptótica y permitiendo la proliferación celular. La caspasa-3 y caspasa-7 son las caspasas ejecutoras claves, que existen como zimógenos inactivos que se activan por señales corriente arriba. Importantemente, los niveles de procaspasa-3 son significantemente mayores en ciertas células cancerígenas en relación a controles no cancerosos. Se ha reportado la identificación de una molécula pequeña (PAC-1) que directamente activa la procaspasa-3 para activar la caspasa-3 in vi tro con un EC50 de 220 nanomolar, e induce apoptosis en una variedad de línea celulares cancerígenas. En contraste a muchos fármacos anti-cancerígenos conocidos, las células tratadas con PAC-1 muestra una activación inmediata de procaspasa-3, y la eficacia de PCA-1 se muestra por ser proporcional a la cantidad de procaspasa-3 contenida en una célula. Derivados de PAC-1 que no activan procaspasa-3 in vi tro también no tienen actividad proapoptótica. Las células cancerosas aisladas de tumores de colon primario son considerablemente más sensibles a inducción aproptótica por PAC-1 que las células de tejido no canceroso adyacente del mismo paciente; estas células cancerosas contienen un promedio de aproximadamente 7 veces más procaspasa-3 que las células del tejido primario no canceroso adyacente. Además, la sensibilidad para PAC-1 de las células primarias a partir de tumores cancerígenos de colon fuertemente se correlaciona con el nivel de procaspasa-3 objetivo. Finalmente, PAC-1 es una entidad única que es mostrada por activar o retardar el crecimiento de tumores en tres diferentes modelos de ratón, que incluye dos modelos, en donde se administra PAC-1 oralmente. Así PAC-1 directamente activa procaspasa-3 para caspasa-3 in vivo, con ello permitiendo a este compuesto inducir apoptosis aún en células que tienen maquinaria apoptótica defectuosa. PAC-1 es la primera molécula pequeña conocida para directamente activar procaspasa-3; la activación directa de caspasas ejecutoras es una estrategia anti-cancerígena que puede benéficamente probada en muchos cánceres, en los cuales se elevan los niveles de procaspasa-3. INTRODUCCIÓN: Un sello de cáncer es su resistencia a las señales apoptóticas naturales. Dependiendo del tipo de cáncer, esta resistencia es típicamente debido a ya sea sobre- o sub-regulación de proteínas clave en la cascada apoptótica, o para mutaciones en genes que codifican estas proteínas. Tales cambios ocurren tanto en la trayectoria apoptótica intrínseca, lo cual recorre a través de la mitocondria y caspasa-9, como en la trayectoria apoptótica extrínseca, lo cual involucra la acción de eliminar receptores y caspasa-8. Por ejemplo, se ha observado la alteración en niveles apropiados de p53, Bim, Bax, Apaf-1, FLIP y muchos otros, y conduce a una cascada apoptótica defectuosa, una en la cual la señal pro-apoptótica corriente arriba no es apropiadamente transmitida para activar las caspasas ejecutoras, Caspasa-3 y caspasa-7. Como las trayectorias más apoptóticas últimamente involucran la activación de procaspasa-3, estas anormalidades genéticas son efectivamente "interrumpidas" en el circuito apoptótico, y como un resultado tal como las células proliferan no controladas. Dado el papel central de apoptosis en cáncer, se hacen esfuerzas para desarrollar terapéuticos de proteínas específicas objetivo en la cascada apoptótica. Por ejemplo, aglutinantes peptídicos o de molécula pequeña para p53, proteínas en la familia Bel, o para las IAP tiene actividad pro-aproptótica, porque muchos de estos objetivo del compuestos tempranos o posiciones de intermediario en la cascada apoptótica, canceres con mutaciones en proteínas corriente abajo serán igualmente resistentes a sus efectos. Para propósitos terapéuticos será ideal identificar una molécula pequeña que activa directamente una proteína proapoptótica corriente abajo lejano en la cascada apoptótica. Además, tal estrategia terapéutica tendrá una probabilidad mayor de éxito, si los niveles de proteína aproapoptótica se elevan en células cancerígenas. La conversión de procaspasa-3 a caspasa-3 resulta en la generación de la caspasa "ejecutora" activa que cataliza subsecuentemente la hidrólisis de una multitud de sustratos de proteína. La caspasa-3 activa es un homodímero de heterodímeros y se produce por proteólisis de procaspasa-3. In vivo, esta activación proteolítica típicamente ocurre a través de la acción de caspasa-8 o caspasa-9. Para asegurar que este zimógeno no sea prematuramente activado, la procaspasa-3 tiene una captura de seguridad de ácido tri-aspártico que bloquea el acceso al sitio IEDT de proteólisis. Este es capaz de una captura de seguridad procaspasa 3 para resistir activación catalítica y proteólisis por caspasa-9. La posición de la captura de seguridad es sensible a pH; así, en la acidificación celular (como ocurre durante la apoptosis) lo atrapado seguramente permite acceder al sito de proteólisis, y la caspasa-3 se puede producir ya sea por la acción de caspasa-9 o a través de un mecanismo de autoactivación. Células de ciertos tipos de tejido cancerígeno tienen niveles elevados de procaspasa-3. Un estudio de aislados primarios de 20 pacientes con cáncer de colón revela que en procaspasa-3 promedio se eleva seis veces en tales aislados en relación a tejido no cancerígeno adyacente. Además, los niveles de procaspasa-3 se elevan en ciertas neuroblastomas, linfomas y cánceres de hígado. De hecho, una evaluación sistémica de niveles de procaspasa-3 en el panel de 60 líneas celulares usadas para el NCI revelan que cánceres de pulmón, melanoma, renal y pecho muestran noveles mejorados enormemente de procaspasa-3. Dado la importancia principal de caspasa-3 activa para apoptosis exitosa, los niveles altos de procaspasa-3 en ciertos tipos de célula cancerígenas, y la supresión mediada por lo atrapado de seguridad intrigante de su autoactivación, se estima que las moléculas pequeñas que directamente activan procaspasa-3 debe ser identificada y que tales moléculas deben tener un potencial mayor en terapia cancerígena objetivo. En este manuscrito se reporta ín vivo identificación de un activador de molécula pequeña de procaspasa-3, PAC-1. El PCA-1 es fuertemente proaproptótico en líneas celulares cancerígenas en una manera proporcional a niveles de procaspasa-3, su efecto proapoptótico es debido a su activación directa e inmediata de procaspasa-3, y es efectivo contra aislados de cáncer de colon primario y en tres modelos diferentes de ratones con cáncer. Aproximadamente se seleccionan 20,500 de moléculas pequeñas estructuralmente diversas para la capacidad de activar procaspasa-3 in vi tro . La procaspasa-3 se expresa y purifica en E. coli de conformidad a procedimientos estándares. Se agrega procaspasa-3 a las cavidades de una placa de 384 cavidades, y los compuestos se agregan a una concentración final de aproximadamente 40 µM (la concentración final de procaspasa-3 es 50 ng/ml) . Cada placa después se incuba por dos horas a 37°C, después de lo cual se agrega el sustrato Ac-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilida peptídica de caspasa-3 (Ac-DEVD-pNa) a una concentración de 200 µM. La formación del cromóforo p-nitroanilina se sigue a 405 nm durante el curso de dos horas. De los ~20,500 compuestos evaluados, cuatro inducen un incremento significante sobre la estructura en la hidrólisis del sustrato de caspasa-3 peptídica. De estos cuatro, uno muestra un fuerte efecto dependiente de la dosis en activación de procaspasa-3 in vi tro. Como se muestra en la Figura la, este primer compuesto que activa procaspasa (PAC-1) proporciona activación máxima media de procaspasa-3 a una concentración de 0.22 µM. Este compuesto simplemente no incrementa la actividad de la misma caspasa-3, como no tiene efecto en la actividad catalítica de la enzima de caspasa-3 procesada completamente (Figura ÍA) . La procaspasa-3 consiste de un pro dominio N-terminal (residuos 1-28), seguida por una subunidad grande (17 kDa) y una subunidad pequeña (12 kDa) que se separan por un enlazador de intersubunidad.22 in vivo, dos monómeros de procaspasa-3 se ensamblan para formar un homodímero que puede ser activado por desdoblamiento a D175 en el enlazador de intersubunidad. El papel principal del pro dominio no es claro, y se ha mostrado que el desdoblamiento en la región intersubunidad solo es suficiente para actividad catalítica completa. A pesar que la procaspasa-3 tiene suficiente actividad para conducirla a su maduración proteolítica, es altamente resistente para su autoactivación debido a la presencia de tres aminoácidos de atrapado de seguridad. Sin embargo, cuando lo atrapado de seguridad es mutado, se observa autoactivación significante de procaspasa-3. Para directamente valorar la capacidad de PAC-1 para catalizar la maduración de procaspasa-3 para la caspasa-3 activada, la proteína de procaspasa-3 se incuba con 100 µM de PAC-1 para los puntos de tiempos que varían de una a cinco horas. Como se muestra por el manchado Western en la Figura IB, PAC-1 induce el desdoblamiento de procaspasa-3 en la forma dependiente de tiempo, con >50% de procesamiento observado después de 4 horas. En contraste, la procaspasa-3 incubada en amortiguador no muestra virtualmente autoactivación durante el mismo espacio de tiempo. PAC-1 también es efectivo en este ensayo a una concentración de 5 µM. Después se hacen sustituciones de alanina en la tríada de ácido aspártico en la región de atrapado de seguridad de procaspasa-3, residuos de Aspl79, Aspl80 y Aspldl. Las mutaciones de estas posiciones todas dramáticamente disminuye la capacidad de PAC-1 para activar procaspasa-3, con ciertas mutaciones más perjudiciales para la activación de procaspasa-3 por PAC-1 (Figura 2A) . También caspasa-7, caspasa-7 también existen como un zimógeno inactivo que se activa por proteólisis. Las caspasa-3 y caspasa-7 ambas son caspasas ejecutoras y tienen considerable homología estructural. La procaspasa-7 también se pronostica por tener una región de atrapado de seguridad similar, aunque no tiene únicamente dos ácidos aspárticos en la tríada clave (Asp-Thr-Asp) , en lugar de tres. Como se indica por los datos en la Figura 2B, el PAC-1, también activa procaspasa-7, aunque en una manera menos i eficiente que su activación de procaspasa-3 (EC50 de 4.5 µM i contra 0.22 µM de activación de procaspasa). La potencia de activación de procaspasa-7 por PAC-1 es similar a su efecto en el mutante Asp-Ala-Asp de procaspasa-3 (EC50 = 2.77 µM) . Como se espera, el efecto de PAC-1 es abolido a valores pH bajos, en donde la procaspasa-3 pasa a autoactivación rápido (Figura 2C) . El PAC-1 también se encuentra por inducir apoptosis en una variedad de líneas celulares cancerígenas. En células HL-60 además de PAC-1 conduce a exposición de fosfatidelserina considerable en la membrana celular acompañada por condensación de cromación significante (Figuras 3A, 3B) . Además, el compuesto induce desdoblamiento del sustrato PARP-1 de caspasa (como se valora por ensayo de actividad PARP in vivo) y provoca despolarización de membrana mitocondrial (véase abajo) . La formación de ampollas celulares significantes de células tratadas con PAC-1 también se observa por microscopio. Además, la toxicidad de PAC-1 debe ser abolida en la presencia del inhibidor z-VAD-fmk de caspasa. Si PAC-1 realmente induce apoptosis vía activación directa de procaspasa-3, entonces en curso de tiempo de los eventos apoptóticos sebe ser alterado en relación al observado con agentes proapoptóticos estándares. Son bien conocidos etopósidos por inducir apoptosis a través de una trayectoria intrínseca; así la despolarización de membrana mitocondrial es seguida por activación de procaspasa-3 en células tratadas con etopósido. Efectivamente, en células HL-60 tratadas con 10 µM de etopósido, se observa despolarización de membrana mitocondrial, seguido por detección de actividad similar a caspasa-3 (Figura 4A) . En contraste, el tratamiento de células con PAC-1 proporciona resultados marcadamente diferentes. Con este compuesto, la primera huella biomédica observada de apoptosis es actividad enzimática similar a caspasa-3, con actividad notada dentro de minutos de adición PAC-1 y 50% de activación tomando lugar en justo 2 horas muy antes de cualquier despolarización de membrana mitocondrial (Figura 4B) . Además, la actividad PARP-1 es rápidamente inducida en células tratadas con PAC-1, considerando que esta reducción se observa en los puntos de tiempo posteriores en células tratadas con etopósido (Figura 4C) ; experimentos de control muestran que PAC-1 no inhiben directamente la actividad enzimática de PARP-1. En la secuencia típica de eventos apoptóticos se despolariza la membrana mitocondrial, se activan las caspasas, y se desdoblan los sustratos de caspasas (tal como PARP-1) . La observación que las células tratadas con PAC-1 muestran una activación rápida de caspasa-3/7 (despolarización de membrana mitocondrial anterior) y un desdoblamiento rápido de un sustrato de caspasa (PARP-1) es indicativo que PAC-1 ejerce una toxicidad celular a través de la activación directa de procaspasa 3. Para definir además la potencia de PAC-1, se valora la capacidad de esta compuesto para inducir muerte celular en líneas celulares cancerígenas con niveles variados de procaspasa-3. Se hace una primera determinación de los niveles de procaspasa-3 presentes en líneas celulares cancerígenas (leucemia, linfoma, melanoma, neuroblastoma, cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer adrenal y cáncer renal) . Los valores IC50 para inducción de muerta celular se obtienen por PAC-1 contra estas líneas celulares. Los datos combinados muestran una fuerte correlación entre concentración celular de procaspasa-3 y sensibilidad para PAC-1 (Figura 4D, Figura 4E) . PAC-1 es más potente contra la línea celular NCI-H226 de cáncer de pulmón, con un IC50 de 0.35 µM. Se encontró que esta línea celular tiene una concentración de procaspasa-3 que es mayor que cinco veces que los niveles de línea base. Importantemente, es una línea cancerígena (células cancerígenas de pecho, MCF-7) que se conoce por no tener expresión de procaspasa-3. PAC-1 no tiene virtualmente efecto en células MCF-7, que induce muerte con un IC50 >75 µM. En contraste, el etopósido mostrado sin tal correlación entre potencia en cultivo celular y niveles celulares de procaspasa-3. Por ejemplo, etopósido es ' inefectivo (IC50>50 µM) en la inducción de muerta en tres de las líneas celulares de melanoma (UACC-62, CRL-1872 y B16-F10), la línea celular de pecho (Hs 578t) y la línea celular de cáncer de pulmón (NCI-H226) ; estas líneas celulares tienen niveles de procaspasa-3 de 1.0, 2.4, 1.9, i 3.7 y 5.3 respectivamente. El etopósido es efectivo (IC5o<l ' µM) contra HL-60, U-937, SK-N-SH y PC-12, el cual tiene niveles de procaspasa de 4.3, 4.0, 4.7 y 4.4, respectivamente. Así, en general no se correlaciona entre j i niveles de procaspasa-3 e IC50 para etopósido. ' Varios derivados de PAC-1 se sintetizan y evalúan j tanto para sus propiedades que activan procaspasa-3 como sus efectos en células cancerígenas en cultivo celular (Tabla 3) . El derivado PAC-1 que carece del grupo alilo (PAC-1 des-alilo) es capaz de inducir activación de procaspasa-3 y muerte celular a niveles similares para PAC-1. Sin embargo, todos los otros derivados no muestran actividad en cualquier ensayo. Así, mientras parece que el grupo alilo es prescindible para actividad biológica, el hidroxilo fenólico y anillo aromáticos son todos críticos para actividad PAC-1. Estos datos también son consistentes con el mecanismo de acción propuesto de PAC-1; los compuestos que no activan procaspasa-3 in vi tro no tienen un efecto proapoptótico en células cancerígenos en cultivo. Para probar esta estrategia de activación de procaspasa-3 mediada por molécula pequeña, directa en aislados clínicos de cáncer, se obtienen tumores de colon recortados recientemente (junto con tejido no cancerígeno adyacente) de 18 pacientes del Hospital de la Fundación Carie (Urbana, IL) . El tejido cancerígeno y no cancerígeno se separa, y las células derivadas de esto se evalúan por sus niveles de procaspasa-3 y su sensibilidad para PAC-1. Como se muestra en la Figura 5A, en todos los casos las células cancerígenas tienen niveles elevados (1.7-17.2 veces, con un promedio de 7.6 veces de elevación) de procaspasa-3 en relación a las células del tejido no cancerígeno adyacente del mismo paciente. Además, estas células cancerígenas son bastante susceptibles a muerte por inducción por PAC-1. PAC-1 induce muerte celular en las células cancerígenas primarias con valores IC50 de 0.007-1.41 µM, mientras PAC-1 induce muerte celular en el tejido no cancerígeno adyacente con valores IC50 de 5.02-9.98 µM (Figura 5B y Tabla 4). El tejido cancerígeno que tiene niveles elevados de procaspasa-3 es extremadamente sensible a PAC-1. Por ejemplo, PAC-1 induce muerte en las células cancerígenas del paciente 17 con un IC50 de 7 nM, y estas células están sobre 700 veces más sensibles a PAC-1 que las células del tejido normal adyacente. Véase también la Figura 6A que muestra concentraciones de procaspasa-3 relativas en muestras cancerígenas y normales de los Pacientes 1, 2 y 3 sobre un periodo de tiempo de aproximadamente 54 días; la Figura 5B ilustra que las células en tejido cancerígeno puede ser mayor que aproximadamente 80 veces más sensible a PAC-1 en comparación con tejido normal. Además a las células del tejido no cancerígeno de los 18 pacientes, PAC-1 también se evalúa contra cuatro de los otros tipos celulares no cancerígenos: se aislan glóbulos blancos de la médula ósea de un donador saludable, Hs888Lu (células de fibroblasto de pulmón) , MCF-10A (células de fibroblasto de pecho) y Hs578Bst (células epiteliales de pecho) . Notablemente, los tipos celulares no cancerígenos están entre aquellos con la cantidad inferior de procaspasa-3, y PAC-1 es completamente menos capaz para inducir muerte en estas células, con valores IC50 de 3.2-8.5 µM (Figura 5B, rombos verdes). Como es aparente de la Figura 5B, PAC-1 induce muerte en una amplia variedad de tipos celulares (líneas celulares no cancerígenas, células primarias no cancerígenas, líneas celulares cancerígenas, células cancerígenas primarias) en una manera directamente relacionada al nivel de procaspasa-3. La elevación de procaspasa-3 en células cancerígenas permite a PAC-1 selectivamente inducir muerte en estos tipos celulares.

PAC-1 se evalúa en un modelo de injerto heterólogo de ratón usando una forma de liberación lenta de suministro del fármaco. En este modelo, se forman tumores subcutáneos en ratones (BALB/c (desnudos) atímicos hembras ovarioctamizados usando la línea celular ACHN (cáncer renal) . Una vez que los tumores se miden por ser mayores que aproximadamente 30 mm2, se administra fármaco vía el implante de una pelotilla de PAC-1 y colesterol, proporcionando niveles bajos y estables de liberación del compuesto. Se usan tres grupos de ratones, con pelotillas que contienen 0 mg, 1 mg y 5 mg de PAC-1, seis ratones por grupo, con cuatro tumores por ratón. Los tamaños de tumores se monitorean por aproximadamente 8 semanas. Como se muestra en la Figura 5C, el crecimiento del tumor es significantemente retardado en los ratones que se implantaron con pelotillas que contienen 5 mg de PAC-1. La evaluación de ingesta de alimento en la última semana del experimento no mostró diferencia en el consumo de alimento entre los tres grupos de ratones. Después los ratones se sacrifican, se toman muestras de plasma a partir de cada ratón, y el contenido de PAC-1 de cada uno se analiza. Para ratones que reciben una pelotilla de 5 mg de PAC-1, este análisis revela a PAC-1 por ser representado a una concentración de 5 nM en el plasma después de 54 días del experimento.

Se evalúa PAC-1 en un segundo modelo de injerto heterólogo de ratón, esté usa administración oral como la forma de suministro del fármaco. En este modelo, se forman tumores de injerto heterólogo subcutáneos en ratones BALB/c-nu/nu antímicos machos (5 semanas de edad, SLC, Hamamaysu, Japón) usando la línea celular NCI-H226 (cáncer de pulmón), ocho ratones por grupo, tres tumores por ratón. Después de la formación de los tumores en los ratones, los ratones se tratan con PAC-1 vía alimentación forzada oral una vez al día por 21 días a una concentración de 0, 50 ó 100 mg/kg y se sacrifican 1 semana más tarde. Como claramente se indica por la gráfica en la Figura 5D, la administración oral de PAC-1 significantemente retarda el crecimiento de tumor en una manera dependiente de la dosis. Finalmente, PAC-1 se evalúa en un modelo de ratón en donde las células NCI-H226 se inyectan en ratones BALB/c-nu/nu atímicos machos vía inyección de la vena de la cola. El experimento total dura 28 días; los ratones se tratan una vez al día con PAC-1 (100 mg/kg) vía alimentación forzada oral en los días 1-4 y 7-11. Al otro día que los ratones no reciben PAC-1. Un segundo grupo de ratones reciben únicamente el vehículo. Después de 28 días los ratones se sacrifican, y se examinan sus pulmones. Como se muestra en la Figura 5E, hay una clara diferencia entre el pulmón del ratón control (con masa de tumor gris obvio) y el pulmón del ratón tratado con PAC-1. Los resultados también se muestran en un panel de un animal tratado con gefitinib (Iressa™; AstraZeneca) . Las células cancerígenas típicamente tienen una sensibilidad reducida para señales proapoptóticas debido a la mutación o expresión aberrante de un surtido de proteínas en la cascada apoptótica. Tal como, muchos tipos de cáncer son notoriamente resistentes a no únicamente señales endógenas para muerte celular apoptótica, pero también a agentes quimioterapéuticos que actúan a través de mecanismos similares. La elevación de niveles de procaspasa-3 en ciertos canceres proporciona una oportunidad para usar esta reserva intracelular existente de proteína para directamente inducir apoptosis, así derivando a menudo la porción corriente arriba no funcional de la cascada. PAC-1 induce la autoactivación de procaspasa-3 in vi tro . En cultivo celular, el tratamiento con PAC-1 induce actividad similar a caspasa-3 rápida. Es probable que el desdoblamiento mediado por caspasa-3 de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, etc.), después induzca la despolarización de la membrana mitocondrial y amplifica la apoptosis. Además, la potencia de PAC-1 hacia una variedad de tipos celulares cancerígenos y no cancerígenos es proporcional a la concentración de procaspasa-3 en la célula. Como las células cancerígenas primarias aisladas de tumores de colon recortados que tienen niveles elevados de procaspasa-3, estas células son considerablemente más sensibles a PAC-1 que las células de tejido no cancerígeno adyacente. Es digno de notar que varias de las líneas celulares contra PAC-1 son efectivas que tiene trayectorias apoptóticas defectuosas que las hacen resistentes a apoptosis; por ejemplo, la expresión Apaf-1 es dramáticamente disminuida en células SK-MEL-5, y Bcl-2 es sobreexpresada en la línea celular cancerígena NCI-H226 del pulmón. Finalmente, PAC-1 es efectivo en tres diferentes modelos de ratón de cáncer, que incluye dos en donde PAC-1 se administra oralmente. Los datos presentados en este documento soportan la noción que procaspasa-3 que activa los compuestos pueden ser extremadamente efectivos contra una variedad de canceres comunes en los cuales niveles de procaspasa-3 son muy aberrantes. La valoración de niveles de procaspasa-3 en biopsias cancerígenas es simple y rápida; tal como, la efectividad potencial de un compuesto tal como PAC-1 se puede valorar a priori con un grado alto de exactitud. Tales estrategias de medicina personalizada pueden ser preferenciales para terapias que confíen en citotoxinas generales y pueden ser valiosas en terapia anticancerígenas . El profesor Guy Salvesen (Bumham Institute) proporciona los vectores de expresión procaspasa-3 y procaspasa. LEYENDA DE FIGURAS Las Figuras 1 y 2. La estructura de PAC-1 se muestra en otra parte en la especificación. Fig. ÍA) Activación in vi tro de procaspasa-3 y caspasa-3 activa por PAC-1. PAC-1 activa procaspasa-3 con un EC50 = 0.22 µM. Fig. IB) Desdoblamiento de procaspasa-3 a caspasa-3 activa inducida por PAC. La procaspasa-3 es recombinantemente expresada en E . coli con una etiqueta His-6 N-terminal y purificada. Se realiza el inmunomanchado con un anticuerpo His-6. En la ausencia de PAC-1 no se observa maduración de procaspasa-3. En la presencia de 100 µM PAC-1, se observa desdoblamiento para generar el fragmento pl9 dentro de 1 hora, y >50% del desdoblamiento se observa después de 4 horas. PAC-1 también es efectivo a 5 µM en este ensayo. Fig. 2A) Activación de mutantes en la región de "captura de seguridad" de procaspasa-3 por PAC-1. PAC-1 tiene un EC50 para activación de 0.22 µM en procaspasa-3 de tipo nativo (DDD), y que corresponde a valores EC50 de 2.77 µM (DAD), 113 µM (DDA) y 131 µM (ADD) para los mutantes. Fig. 2B) PAC-1 activa procaspasa-7 con un EC50 de 4.5 µM. Fig. 2C) Dependiente de PAC-1 de activación de procaspasa-3 en pH. En pH bajo la captura de seguridad es apagada y la procaspasa-3 es esencialmente máximamente activada. Las barras de error representan derivaciones estándar de la media . Las Figuras 3 y 4. PAC-1 induce apoptosis en células HL-60. Fig. 3A) Expone fosfatidilserina (medico por teñido Anexina-V) después de 20 horas de tratamiento con 100 µM PAC-1. PAC-1 también es efectivo a 5 µM en este ensayo (véase figura 2 de soporte) . Fig. 3B) La condensación cromática como se visualiza por teñido Hoescht después de un tratamiento de 20 horas con 100 µM PAC-1. Fig. 4A) Despolarización de membrana mitocondrial (MMP) y actividad similar a caspasa-3 en células HL-60 tratadas con 10 µM de etopósido. Fig. 4B) Despolarización de membrana mitocondrial (MMP) y actividad similar a caspasa-3 en células HL-60 tratadas con 100 µM PAC-1. Fig. 4C) El tratamiento PAC-1 (100 µM) induce disminución rápida en actividad PARP en células HL-60, consistentes con una activación inmediata de caspasa-3/7 celular. En contraste, células tratadas con etopósido (10 µM) muestra una disminución en actividad PARP en muchos puntos de tiempo posteriores. Fig. 4D) y Fig. 4E) PAC-1 induce muerte celular en una manera dependiente de procaspasa-3. Para un número de diversas líneas celulares, los niveles de procaspasa-3 se determinan (por citometría de flujo con un anticuerpo a procaspasa-3) y el IC50 de PAC-1 se mide (a través de 72 horas de tratamiento con un intervalo de concentraciones PAC-1 y cuantificación usando el ensayo MTS). PAC-1 es bastante potente (IC50 = 0.35 µM) en la línea celular cancerígena NCI-H226 de pulmón conocida por tener altos niveles de procaspasa-3. Las barras de error representan derivaciones estándar de la media. Tabla 3. PAC-1 y PAC-1 des-alilo activan procaspasa-3 in vi tro e induce muerte en células cancerígenas en cultivo celular, pero otros análogos estructurales no tienen efecto de activación de procaspasa-3 in vi tro y no proporciona inducción de muerte en cultivo celular. Figura 5. Fig. 5A) Se elevan niveles de procaspasa-3 en células derivadas de tejido cancerígeno de colon recientemente recortados. Se obtienen tumores de colon primario recientemente recortados (junto con tejido no cancerígeno adyacente) de 18 diferentes pacientes, se separa el tejido cancerígeno y no cancerígeno, y se miden los niveles de procaspasa-3 para cada uno usando un anticuerpo a procaspasa-3 y citometría de flujo. En promedio, las células del tejido cancerígeno tienen 7.6 veces elevación en procaspasa-3 comparado a las células derivadas del tejido no cancerígeno adyacente del mismo paciente. Fig. 5B) PAC-1 induce muerte celular en una manera proporcional al nivel celular de procaspasa-3. Los círculos rojos representan las células cancerígenas primarias de 18 tumores de colon. Los triángulos negros representan las mismas líneas cancerígenas descritas en la Figura 4D. Los rombos verdes son cuatro tipos de células no cancerígenas: Hs888Lu (células de fibroblasto de pulmón), MCF-10A (células de fibroblasto de pecho) , Hs578Bst (células epiteliales de pecho) y células de glóbulo blanco aisladas de la médula espinal de un donador saludable. Los cuadrados azules son las células no cancerígenas primarias aisladas de los márgenes de tumor de los 18 pacientes. Tabla 4) Células derivadas de tejido cancerígeno de colon primario son considerablemente más sensibles a inducción de muerte por PAC-1 que las células derivadas del tejido no cancerígeno adyacente del mismo paciente. Fig. 5C) PAC-1 reduce el crecimiento de tumores en un modelo de injerto heterólogo de cáncer. Los tumores se forman con la línea celular ACHN (cáncer renal) por inyección subcutánea, con seis ratones en cada grupo, y seis ratones en cada grupo, y cuatro tumores por ratón. Una vez que los tumores crecen aproximadamente 30 mm2, se implanta PAC-1 como una pelotilla de colesterol. Las barras de error representan error estándar de la media. Fig. 5D) La administración oral de PAC-1 significantemente retarda el crecimiento del tumor en un modelo de injerto heterólogo de ratón. Los tumores se forman usando la línea celular NCI-H226 (cáncer de pulmón) por inyección subcutánea, ocho ratones en cada grupo, y tres tumores por ratón. Se administra PAC-1 o vehículo una vez al día por administración forzada oral en los días 1-21. Las barras de error representan errores estándar de la media. Fig. 5E) La administración oral de PAC-1 significantemente retarda el crecimiento del tumor en un modelo de inyección i.v. Se inyectan ratones por i.v. con la línea celular NCI-H226 (cáncer de pulmón) . Se tratan los ratones con PAC-1 (100 mg/kg) vía administración forzada oral siguiendo el protocolo como se describe en el texto. Las imágenes muestran los pulmones de los ratones que no reciben PAC-1 y tienen una gran cantidad de masa de tumor gris en el pulmón. En contraste, los ratones que no reciben PAC-lal menos no tienen materia gris visible.

Tabla 3. Compuestos seleccionados que indican niveles de actividad.

EC50 (µM) para IC50 (µM) para Compuesto activación de inducción de muerte procaspasa -3 en células HL-60 C^OJC O 0.43 1.74 PAC-1 des-aillo roj >50 >100 " VA >50 >100 ?"^ (XCUD >50 >100 (XO. >50 >100 Tabla 4. Niveles de Concentración de actividad PAC-1 en pacientes EJEMPLO 6. Prueba de PAC-1 en modelo de ratón de cáncer de pulmón . Se emplea un modelo de injerto heterólogo usando células NCI-H226 (cáncer de pulmón) . Se proporciona PAC-1 intraperitonealmente (i.p.) a 10 mg/kg. Se realiza una comparación de eficacia con gefitinib (Iressa™; AstraZeneca, Wilmington, Delaware) a 40 mg/kg usando 5 ratones por grupo. Se muestran los resultados en la Figura 7, que indica que PAC-1 está asociado con reducción del crecimiento en volumen de tumor.

EJEMPLO 7. Uso de derivados combinatoriales , síntesis y terapéuticos . Se preparan un número de compuestos como derivados de la estructura PAC-1. Se hacen reaccionar el grupo hidrazida con un grupo aldehido para proporcionar una biblioteca combinatorial de compuestos derivados. Cualquiera de uno de los grupos (AX) precursores de hidrazina designado Ll-20 se usan para generar hidrazidas, las cuales se hacen reaccionar con cualquiera de uno de los grupos aldehido (BX) designado 1-28, así proporcionando compuestos derivados PAC-1 560. Se sintetiza un compuesto derivado usando métodos como se describen en este documento y de conformidad con conocimientos disponibles en la técnica. Véase el esquema de reacción y estructuras del componente abajo, adicional a la Figura 8A y 8B.

AX OH ( a NCrt Br «.JU1X6' J._ I 1fiBr L1 L6 L1 L5 L15 L20 L10 BX En una modalidad, tal compuesto derivado es además modificado, por ejemplo, para alterar una propiedad tal como actividad, solubilidad, toxicidad, estabilidad y/o otras propiedades en conexión con aplicaciones t II farmacéuticas . Se usan los compuestos derivados como agentes anti-cancerígenos . Los compuestos son validados como capaces de tener actividad antineoplásica, apoptosis, regulación y/o activación de procaspasa-3. Por ejemplo, se usan aislados primarios de cáncer de colon recientemente removidos para valorar niveles de procaspasa-3 y sensibilidad de las células a niveles del compuesto de prueba, en donde un compuesto de prueba es PAC-1 o un compuesto derivado. Los compuestos se clasifican con respecto a la propensión para inducir muerte celular en células cancerígenas contra células normales. En una valoración adicional, se realiza un compuesto derivado, probado in vitro o in vivo. Se evalúa la estabilidad en conexión con exposición a microsomas de hígado .

EJEMPLO 8. Actividad de ciertos derivados en relación a PAC-1. Se prueban PAC-1 y ciertos derivados en la línea celular HL-60 y se determinan valores IC50. Los resultados se indican en la Tabla 5 (en donde las designaciones L- y R- se refieren a estructuras mostradas en las series AX y BX anteriores, respectivamente) . Varios de los derivados PAC-1 exhiben un nivel de actividad que es generalmente aproximadamente un orden de magnitud mayor que el compuesto PAC-1. Tabla 5 . s s s s s DECLARACIONES CON RESPECTO A INCORPORACIÓN POR REFERENCIA Y VARIACIONES Todas las referencias a través de esta solicitud, por ejemplo, documentos de patente que incluye patentes emitidas y otorgadas o equivalentes; publicaciones de solicitud de patente; solicitudes de patente no publicada; y documentos de literatura sin patente u otra fuente de material; se incorporan por referencia en este documento en su totalidad, sin embargo individualmente se incorporan por referencia, para la extensión de cada referencia es al menos parcialmente no consistente con la descripción en esta solicitud (por ejemplo, una referencia que es parcialmente consistente es incorporada por referencia excepto para la porción parcialmente inconsistente de la referencia) . Se incorporan cualquiera de apéndice o apéndices de esta, por referencia como parte de la especificación y/o dibujos . Si los término "comprende", "comprenden", "comprendido" o "que comprende" se usan en este documento, son para ser interpretados como específicamente la presencia de las características, enteros, etapas o componentes declarados referidos, pero no impide la presencia o adición de una o más de otras características, enteros, etapas, componentes o grupo del mismo.

Modalidades separadas de la invención también se planean para ser abarcar, en donde los término "que comprende" o "comprende (n) " o "comprendido" son opcionalmente reemplazados con los términos, análogos en gramática, por ejemplo; "que consiste/consiste (n) " o "que consiste esencialmente de/consiste (n) esencialmente de" con ello describir modalidades adicionales que no son necesariamente coextensivos. Para clarificación, como se usa en este documento "que comprende" es sinónimo con "que tiene", "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por", y es inclusivo o terminado abierto y no es excluido adicional, elementos no declarados o etapas del método. Como se usa en este documento, "que consiste de" excluye cualquier elemento, etapa, componente o ingrediente no especificado en el elemento reivindicado. Como se usa en este documento, "que consiste esencialmente de" no son materiales o etapas excluidos que no afectan materialmente las características básicas y nuevas de la reivindicación (por ejemplo, que no afecta un ingrediente activo) . En cada ejemplo en este documento, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de" y "que consiste de" puede ser reemplazado con cualquiera de otros dos términos. La invención ilustrativamente descrita en este documento la forma más adecuada que puede ser practicada en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, las cuales no se describen específicamente en este documento. La invención se ha descrito con referencia a varias modalidades y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, se entenderá que se pueden hacer muchas variaciones y modificaciones mientras permanezcan dentro del espíritu y alcance de la invención. Se apreciará por un experto ordinario en la técnica que las composiciones, métodos, dispositivos, elementos de dispositivos, materiales, características opcionales, procedimientos y técnicas diferentes de aquellos específicamente descritos en este documento se pueden aplicar a la práctica de la invención como ampliamente se describe en este documento sin recurso para experimentación excesiva. Todos los equivalentes funcionales en la técnica de composiciones, métodos, dispositivos, elementos, materiales, procedimientos y técnicas descritos en este documento; y porciones de los mismos; se pretenden ser abarcados por esta invención. Siembre que un intervalo sea discutido, todos los subintervalos y valores individuales se pretendan abarcar. Esta invención no se limita por las modalidades discutidas, incluyendo cualquier muestra en los dibujos o ejemplificado en la especificación, los cuales se dan por cualquier vía de ejemplo o ilustración y no de limitación. El alcance de la invención será limitado únicamente por las reivindicaciones.

REFERENCIAS Estas solicitudes son particularmente incorporadas por referencia en su totalidad: Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 60/516556 por Hergenrother et al., presentada el 30 de Octubre de 2003; Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 60/603246 por Hergenrother et al., presentada el 20 de Agosto de 2004; U.S. 10/976,186 por Hergenrother et al., presentada el 27 de Octubre de 2004. US 6,762,045 Membrana derivada de caspasa-3, composiciones que comprende a la misma y métodos de uso del mismo; US 6,534,267 Polinucleótidos que codifican activadores de caspasas; US 6,403,765 Apaf-1 truncado y métodos de uso del miso; US 6,303,329; 6,878,743 por Choong, et al., emitida el 12 de Abril de 2005; US 20040077542 por Wang, Xiaodong; et al., publicada el 22 de Abril de 2004; US 20040180828 por Shi, Yigong, publicada el 16 de Septiembre de 2004. Slee EA et al., Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethylketone (Z-VAD.FMK) inhibits apoptosis by blocking the processing of CPP32, Biochem J. 1996 1 de l Abril; 315 (Pt 1) :21-4. 1. Hanahan, D. & Weinberg, R. A. The hallmarks of cáncer. Cell 100, 57-70 (2000) . 2. Okada, H. & Mak, T. W. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. Nature Rev. Cáncer 4, 592-603 (2004) . 3. Roy, S. et al. Maintenance of caspase-3 proenzyme dormancy by an intrinsic "safety catch" regulatory tripeptide. Proc. Nati. Acad. Sci. 98, 6132-6137 (2001) . 4. Svingen, P. A. et al. Components of the cell death machine and drug sensitivity of the National Cáncer Institute Cell Line Panel. Clin. Cáncer Res. 10, 6807-6820 (2004) . 5. Lowe, S. W., Cepero, E. & Evan, G. Intrinsic tumor suppression. Nature 432, 307-315 (2004). 6. Vogeistein, B. & Kinzler, K. W. Achules' heel of cáncer. Nature 412, 865-866 (2001) . 7. Traven, A., Huang, D. C. & Lithgow, T. Protein hijacking: key proteins held captive against their will. Cáncer Cell 5, 107-108 (2004). 8. Soengas, M. S. et al. Inactivation of the apoptosis effector Apaf-1 in malignant melanoma. Nature 409, 207-211 (2001) . 9. Wajant, H. Targeting the FLICE inhibitory protein (FLIP) in cáncer therapy. Mol. Interv. 3, 124-127 (2003) . 10. Denicourt, C. & Dowdy, S. F. Targeting apoptotic pathways in cáncer cells. Science 305, 1411-1413 (2004) . 11. Vassilev, L. T. et al., In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science 303, 844-848 (2004). 12. Degterev, A. et al., Identification of small-molecule inhibitors of interaction between the BH3 domain and BcI-XL. Nature Cell Biol. 3, 173-182 (2001). 13. Becattini, B. et al., Rational design and real time, in-cell detection of the proapoptotic activity of a novel compound targeting BcI-XL. Chem. Biol. 11, 389-395 (2004) . 14. Wang, J.-L. et al., Structure-based discovery of an organic compound that binds Bcl-2 protein and induces apoptosis of tumor cells. Proc. Nati. Acad. Sci. 97, 7124-7129 (2000) . 15. Li, L. et al., A small molecule Smac imic potentiates TRAIL- and TNFa- mediated cell death. Science 305, 1471-1474 (2004) . 16. Nguyen, J. T. & Wells, J. A. Direct activation of the apoptosis machinery as a mechanism to target cáncer cells. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7533-7538 (2003) . 17. Jiang, X. et al., Distincitive roles of PHAP proteins and prothymosin-a in a death regulatory pathway. Science 299, 223-226 (2003) . 18. Boatright, K. M. & Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 725-731 (2003) . 19. Nakagawara, A. et al., High levéis of expression and nuclear localization of interleukin-lß converting enzyme (ICE) and CPP32 in favorable human neuroblastomas. Cáncer Res. 57, 4578-4584 (1997) . 20. Izban, K. F. et al., Characterization of the interleukin-lß-converting enzyme/Ced-3-family protease, caspase-3/CPP32 , in Hodgkin's disease. Am. J. Pathol. 154, 1439-1447 (1999) . 21. Persad, R. et al. Overexpression of caspase-3 in hepatocellular carcinomas. Modern Patholo. 17, 861-867 (2004) . 22. Pop, C, Feeney, B., Tripathy, A. & Clark, A.

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Identification from a combinatorial library of a small molecule that electively induces apoptosis in cáncer cells.

J Am Chem Soc. 3 de Diciembre de 2003; 125(48): 14672-3.

PMID: 14640619.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para inducir selectivamente apoptosis en una célula cancerígena, que comprende: (a) administrar a dicha célula cancerígena, un compuesto capaz de modificar una molécula procaspasa-3 de dicha célula cancerígena; y (b) modificar dicha molécula de procaspasa-3 para inducir apoptosis.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha célula cancerígena está en un paciente en necesidad del tratamiento .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho compuesto es de fórmula ZZ: en donde n = 1 ó 2; R, independientemente de otro R, es hidrógeno, halógeno, alilo o alquilo corto; R2 = hidrógeno, alquilo corto, éster u otra porción que es removible bajo condiciones fisiológicas; R3 = hidrógeno, halógeno, alquilo, haloalquilo, alilo, alquenilo, alquenil, alcanol, o haloalquenilo; R4 y R5 son N; ó R4 = N y R5=C; ó R4 y R5 = C; y A = oxígeno o azufre.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicación 1-3, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de fórmula ZZ, PAC-1, y Estructura 5.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque dicho compuesto es PAC-1.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque comprende la etapa de valorar un parámetro de procaspasa-3 o caspasa-3 en una célula cancerígena; en donde dicho parámetro es uno o más de una cantidad cuantitativa o semi-cuantitativa, una cantidad funcional, y un nivel de actividad de dicha procaspasa-3 o caspasa-3.

7. Un compuesto de la fórmula estructural ZZ en donde n = 1 ó 2; R, independientemente de otro R, es hidrógeno, halógeno, alilo o alquilo corto; R'2 = hidrógeno, alquilo corto, éster u otra porción que es removible bajo condiciones fisiológicas; R3 = hidrógeno, halógeno, alquilo, haloalquilo, alilo, alquenilo, alquenil, alcanol, o haloalquenilo; R4 y R5 son N; ó R4 = N y R5=C; ó R4 y R5 = C; y A = oxígeno o azufre.

8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque excluye un compuesto de una estructura PAC-1, en donde la estructura de PAC-1 es:

9. Un método para dirigir la selección in vitro para un compuesto capaz de modificar una molécula de procaspasa-3, que comprende: (a) proporcionar al menos un compuesto de prueba; (b) proporcionar una procaspasa-3 purificada; (c) exponer el compuesto de prueba a la procaspasa-3 purificada; (d) medir una actividad de procaspasa-3 seguida de exposición al compuesto de prueba; (e) identificar un compuesto modificante comparando una actividad de prueba después de la exposición del compuesto de prueba con una actividad no modificada en la ausencia de exposición al compuesto de prueba; con ello, seleccionar un compuesto capaz de modificar una molécula procaspasa-3.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende comparar dicha actividad modificada o dicha actividad no modificada con una actividad de referencia; en donde dicha actividad de referencia es debido a la exposición de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de la fórmula estructural ZZ o subseries de compuestos de tal fórmula, PAC-1, y Estructura 5.

11. Un método de selección celular para un compuesto capaz de modificar una molécula de procaspasa-3, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un compuesto de prueba; (b) proporcionar una célula, en donde la célula expresa putativamente procaspasa-3; (c) exponer la célula al compuesto de prueba; (d) medir un parámetro después de la exposición al compuesto de prueba; en donde dicho parámetro comprende una o más de viabilidad celular, indicador apoptótico, y otros parámetros; (e) identificar un compuesto modificante comparando un parámetro celular probado después de la exposición al compuesto de prueba con un parámetro celular no modificado en la ausencia de exposición al compuesto de prueba; con ello, seleccionar un compuesto capaz de modificar una molécula de procaspasa-3.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además, comparar dicha actividad modificada o dicha actividad no modificada con una actividad de referencia; en donde dicha , actividad de referencia es debido a la exposición a un compuesto seleccionado del grupo que consiste de fórmula ZZ, PAC-1 y Estructura-5.

13. Un método para identificar o diagnosticar una susceptibilidad potencial para tratamiento de una célula cancerígena con un compuesto activador de procaspasa, caracterizado porque comprende (a) valorar un parámetro de procaspasa en dicha célula cancerígena; y(b) determinar si dicho parámetro permite una susceptibilidad incrementada para activación de una procaspasa.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el parámetro de procaspasa es un nivel de procaspasa-3 y dicha procaspasa es procaspasa-3.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho parámetro de procaspasa es un nivel de procaspasa-7 y dicha procaspasa es procaspasa-7.

16. Un método para tratar una célula cancerígena, caracterizado porque comprende (a) identificar una susceptibilidad potencial para el tratamiento de una célula cancerígena con un compuesto activador de procaspasa; y (b) exponer dicha célula cancerígena con una cantidad efectiva del compuesto activador de procaspasa.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el compuesto activador de procaspasa se selecciona del grupo que consiste de fórmula ZZ, PAC-1, y Estructura 5.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque dicho compuesto activador de procaspasa es capaz de activar la procaspasa-3, procaspasa-7 , o tanto procaspasa-3 como procaspasa-7.

19. Un método para sintetizar PAC-1, caracterizado porque comprende las etapas del Esquema de Reacción 1.

20. Un método para sintetizar el Compuesto 5, o compuestos de fórmula ZZ, caracterizado porque comprende las etapas del Esquema de Reacción 1 con modificación apropiada.

21. Un compuesto de Estructura 5, en donde la fórmula estructural es:

22. Un compuesto que tiene la fórmula ZZ2: caracterizado porque Rl y R2 son cada uno independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo, alilo, haloalquilo, alquenilo, alquenol, alcanol o haloalquenilo.

23. El compuesto de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque Rl y R2 son cada uno independientemente hidrógeno, halógeno, alilo o alquilo corto.

24. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste de una biblioteca combinatorial derivada de PAC-1, caracterizado porque comprende un compuesto hidrazida combinado con un compuesto aldehido.

25. El grupo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el compuesto hidrazida se selecciona del grupo que consiste de hidrazidas generadas de compuestos AX descritos en este documento, y el compuesto aldehido se selecciona del grupo que consiste de compuestos BX descritos en este documento.

26. Un método para sintetizar un compuesto derivado de PAC-1, caracterizado porque comprende proporcionar un compuesto hidrazida, proporcionar un compuesto aldehido y hacer reaccionar el compuesto hidrazida con el compuesto aldehido, con ello, sintetizar un compuesto derivado de PAC-1.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto hidrazida tiene la fórmula ZZ3:

28. El método de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, caracterizado porque el compuesto aldehido tiene la fórmula ZZ4:

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-28, caracterizado porque el compuesto hidrazida tiene la fórmula ZZ4.

30. Un compuesto caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: L01R06, L02R03, L02R06, L08R06, L09R03, L09R06 y L09R08.

31. Un método para seleccionar un paciente con cáncer candidato para tratamiento posible con un activador de procaspasa identificando un nivel elevado de una procaspasa en el candidato, caracterizado porque comprende obtener una muestra de prueba de tejido o célula de un candidato, valorar el nivel de caspasa en la muestra de prueba, y determinar si el nivel de procaspasa es elevado en la muestra de prueba con relación a un nivel de referencia, con ello, seleccionar un paciente con cáncer candidato para tratamiento posible con un activador de caspasa.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la procaspasa se selecciona del grupo que consiste de procaspasa-2, 3, 6, 7, 8 y 9.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-32, caracterizado porque la procaspasa es procaspasa-3.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-33, caracterizado porque dicho nivel elevado de la muestra de prueba es al menos, aproximadamente 2 veces mayor que el nivel de referencia.

35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-34, caracterizado porque dicho nivel elevado de la muestra de prueba es al menos, aproximadamente 4 veces mayor que el nivel de referencia.

36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-35, caracterizado porque el nivel de referencia es desde una segunda muestra de prueba a partir del mismo paciente.

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-36, caracterizado porque el nivel de referencia es de una muestra de tejido o célula normal.

38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-37, caracterizado porque el nivel de referencia es de una línea celular.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-38, caracterizado porque el nivel de referencia es de una línea de células cancerígenas.

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-39, caracterizado porque el nivel de referencia es de una línea de células normales.

41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-40, caracterizado porque el nivel de referencia es una cantidad de umbral absoluto.

42. Un método para inducir muerte en una célula cancerígena, caracterizado porque comprende administrar a dicha célula cancerígena, un compuesto capaz de activar una molécula de procaspasa-3 de dicha célula cancerígena.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el compuesto tiene la fórmula estructural ZZ.

44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el compuesto tiene la fórmula estructural ZZ2.