JP2003511068A

JP2003511068A - Ｐｎａを使用した遺伝子選択

Info

Publication number: JP2003511068A
Application number: JP2001530467A
Authority: JP
Inventors: ニールセン，ペーテル・イー; ショウ，カルステン; ウィッセンバッハ，マルギット
Original assignee: パンセコ・アクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-10-13
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2003-03-25
Also published as: EP1220903A1; AU7773100A; WO2001027262A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、感染性微生物、特に細菌と戦うときに使用するための新規医薬品に関する。より詳細には、増強された抗感染特性を備えた新規ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を入手するために陽イオンペプチド類をＰＮＡへ接合させることによって修飾されたペプチド核酸（ＰＮＡ）配列に関する。ＰＮＡ配列は、抗感染療法を開発するために、例えば大腸菌のような微生物中の１種以上の標的遺伝子を同定するための方法で使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、感染性微生物、特に細菌と戦うときに使用するための新規医薬品に
関する。より詳細には、本発明は微生物と戦うときに有効であるように選択され
、増強された抗感染特性を備えた新規ＰＮＡ分子を入手するために修飾されたペ
プチド核酸（ＰＮＡ）配列に関する。

【０００２】［発明の背景］１９４０年代にペニシリンが発見されて以降、ますます多くの新規医薬品が探
求されてきた。多数の医薬品もしくは抗生物質は、既に存在する医薬品から発見
または開発されてきた。しかし、年月を重ねるにつれて細菌の多くの菌株は、以
前には有効な医薬品であった現在入手可能な１種以上の医薬品に対して耐性を持
つようになってきた。臨床医が現在使用している抗生物質の数は１００以上であ
る。

【０００３】大多数の抗生物質は、天然微生物集団の産物であり、これらの集団において発
見された耐性特性は種間で広まる可能性があり、農業および医学で使用される抗
生物質からの選択的圧力下で病原体によって獲得されてきたと思われる（Ｄａｖ
ｉｓ、１９９４）。抗生物質耐性は、抗生物質を化学的に変化させる、もしくは
変性させる酵素をコードする細菌含有遺伝子内で引き起こされる可能性がある。
もう１つの可能性は、細菌が細胞壁を抗生物質に対して不浸透性にする酵素をコ
ードする、またはそれらがそれらの作用を発揮できる前に細胞から抗生物質を追
い出す流出ポンプをコードすることである（Ｌｅｖｙ、１９９８）。

【０００４】抗生物質耐性病原菌の出現のために、新規治療戦術に対しては継続的な必要が
ある。耐性遺伝子によって惹起される問題を回避するための１つの戦術は、それ
に対して特異的耐性特性が存在しない新規の化学クラスから抗感染薬を開発する
ことである。

【０００５】アンチセンス物質は、疾患と戦うときの新規戦術、並びにドラッグデザインに
おいて新規化学クラスを使用する機会を提供する。

【０００６】オリゴヌクレオチド類は数種の方法で天然ＤＮＡおよびＲＮＡと相互作用する
ことができる。これらの方法の１つは、オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との間
の二重鎖形成である。もう１つは、三重鎖構造を形成するためにオリゴヌクレオ
チドと二本鎖ＤＮＡとの間の三重鎖構成である。

【０００７】これまでに基礎研究から得られた結果は前途有望であり、さらにウイルスおよ
び疾患惹起するヒト遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド医薬調製物
は臨床試験を通して進展しつつある。細菌遺伝子の効果的なアンチセンス阻害も
また幅広い用途を有しているであろうと思われるが、しかし細菌に対してアンチ
センステクノロジーを拡大しようとする試みは、これまでほとんど行われていな
い。

【０００８】ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、一定事項においてはオリゴヌクレオチド類および
それらのアナログと類似であり、従ってＤＮＡおよびＲＮＡに似ている可能性が
ある。ＰＮＡにおいては、オリゴヌクレオチド類のデオキシリボース骨格は擬ペ
プチド骨格に取って代わられている（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）（図１）。
各サブユニット、もしくはモノマーはこの骨格に付着した天然型または非天然型
核酸塩基を有している。そのような骨格の１つは、アミド結合を通して連結され
たＮ−（２−アミノエチル）グリシンの反復単位から構成されている。ＰＮＡは
ワトソンクリック（ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ）塩基対合およびへリックス
構造を通して相補的核酸とハイブリダイズする（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。
擬ペプチド骨格は、優れたハイブリダイゼーション特性（Ｅｇｈｏｌｍら、１９
９３）、酵素による分解への抵抗性（Ｄｅｍｉｄｏｖら、１９９４）および様々
な化学修飾へのアクセス（接近）（ＮｉｅｌｓｅｎおよびＨａａｉｍａ、１９９
７）を提供する。

【０００９】ＰＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方と結合してＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ
／ＲＮＡ二重鎖を形成する。結果として生じたＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／Ｒ
ＮＡ二重鎖はＴｍによって決定されるような対応するＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮ
Ａ／ＲＮＡ二重鎖より大きな親和性で結合している。この高い熱安定性の理由は
、おそらくＰＮＡにおける中性骨格を原因とする電荷反発の欠如にあると思われ
る。親和性の増加に加えて、ＰＮＡはさらにまた高い特異性でＤＮＡに結合する
ことが証明されている。ＰＮＡ／ＤＮＡ二重ミスマッチがＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖
に比較して融解しているときには、Ｔｍにおける８〜２０℃の低下が見られる。

【００１０】さらにその上、ホモピリミジンＰＮＡオリゴマーはＤＮＡもしくはＲＮＡオリ
ゴマー内の配列相補的標的と一緒に極めて安定性のＰＮＡ₂−ＤＮＡ三重鎖を形
成する。最後に、ＰＮＡはヘリックス侵入によって二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ
に結合する可能性がある。

【００１１】オリゴヌクレオチド類と比較したＰＮＡの長所は、それらのポリアミド骨格（
適切な核酸塩基類またはそれらに付着した他の側鎖基を有する）はヌクレアーゼ
類またはプロテアーゼ類のどちらかによって認識され、分割されないことである
。その結果として、ＰＮＡは核酸およびペプチドとは相違して酵素による分解に
対して抵抗性である。

【００１２】アンチセンス適用のために、標的結合ＰＮＡはＤＮＡおよびＲＮＡポリメラー
ゼ類、逆転写、テロメラーゼおよびリボソーム類（Ｈａｎｖｅｙら１９９２；Ｋ
ｎｕｄｓｅｎら、１９９６；ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９８）等の立
体障害を惹起することができる。

【００１３】アンチセンス物質を使用するときの一般的困難は細胞取り込みである。取り込
みを改良するための様々な戦術は想定することができ、脂質（Ｌｅｗｉｓら、１
９９６）、カプセル化（Ｍｅｙｅｒら、１９９８）および担体戦術（Ｎｙｃｅお
よびＭｅｔｚｇｅｒ１９９７；Ｐｏｏｇａら、１９９８）を使用した真核細胞
内への取り込み改良についての報告書がある。

【００１４】ＷＯ第９９／０５３０２号はＰＮＡおよび輸送体ペプチドからなるＰＮＡコン
ジュゲートを開示しており、そのペプチドは脂質膜を貫通する輸送のためおよび
ＰＮＡを細胞内ポリヌクレオチド類と相互作用的に接触するように送達するため
に使用できる。

【００１５】米国特許第Ａ−５，７７７，０７８号は、標的細胞を認識して細菌外毒素のよ
うな孔形成物質に連結される送達物質を備える孔形成化合物を開示している。こ
の化合物は例えばＰＮＡのような薬剤と一緒に投与される。

【００１６】微生物に対するアンチセンス物質として、ＰＮＡはユニークな長所を有してい
る可能性がある。細菌適用のためのＰＮＡを基剤とするアンチセンス物質は、大
腸菌ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを標的とする場合は細胞増殖および増殖表現型を制
御することができる（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９８ａ、ｂおよびＷ
Ｏ第９９／１３８９３号）。

【００１７】しかし、これらの開示はいずれも高度に有効なＰＮＡ配列を入手する方法を考
察してはいない。

【００１８】さらにその上、細菌適用のためには細菌が異物分子に対して厳しい障壁を有し
ており、核酸塩基を含有するアンチセンスオリゴマーは効果的取り込みのために
は大き過ぎると思われるので、不良な取り込みが予想される。ＧｏｏｄおよびＮ
ｉｅｌｓｅｎ（１９９８ａ、ｂ）が入手した結果は、ＰＮＡオリゴマーが脂質二
重層を貫通する受動的拡散によって細菌細胞内に不良にしか入り込めないことを
示している。

【００１９】米国特許第Ａ−５，８３４，４３０号は、増強剤、例えば抗生物質を増強させ
るときの短い陽イオンペプチド類の使用を開示している。この物質と抗生物質は
同時投与される。

【００２０】ＷＯ第９６／１１２０５号はＰＮＡコンジュゲートを開示しているが、このと
き共役結合部分はＰＮＡを機能的にするためにＰＮＡの骨格の末端または非末端
部分に置くことができる。共役結合部分はレポーター酵素もしくは分子、ステロ
イド類、炭水化物、テルペン類、ペプチド類、タンパク質類等であってよい。コ
ンジュゲートの特性は特に細胞膜を貫通するための改良された移動特性を有して
いる可能性があることが示唆されている。しかし、ＷＯ第９６／１１２０５号は
細菌膜を貫通するコンジュゲートを開示してはいない。

【００２１】ＷＯ第９８／５２６１４号は、生体膜、例えば細菌細胞壁を貫通する輸送を増
強する方法を開示している。この特許公開に従うと例えばＰＮＡのような生物学
的に活性な物質は膜貫通輸送を増強するために輸送体ポリマーへ共役結合させる
ことができる。輸送体ポリマーは６〜２５サブユニットから構成され、少なくと
もそれの５０％はグアニジノもしくはアミジノ側鎖部分を含有しており、さらに
このとき少なくとも６個の隣接サブユニットはグアニジノおよび／またはアミジ
ノ側鎖を含有している。好ましい輸送体ポリマーは９個のアルギニンを含有する
ポリペプチドである。しかし、ＷＯ第９８／５２６１４号は細菌遺伝子を標的と
する可能性のあるＰＮＡ配列を開示していない。

【００２２】従って、これまでに入手されたＰＮＡテクノロジーの使用における前途有望な
結果にもかかわらず、微生物と戦うときに有効である新規のＰＮＡアンチセンス
薬を開発する大きな必要がある。

【００２３】［発明の概要］本発明は、細菌と戦うための新規戦術に関する。これまでに、アンチセンスＰ
ＮＡが細菌の増殖を阻害できることは証明されている。しかし、細菌細胞壁を貫
通するＰＮＡの緩徐な拡散が効果の低い標的配列と結び付き、抗生物質としての
ＰＮＡの実用的な適用はこれまで可能ではなかった。本発明によれば、許容濃度
での実用的な適用は、標的として１種以上の正確な遺伝子を選択し、さらにその
ような１種以上の遺伝子を標的とするＰＮＡ配列と細胞膜を貫通する輸送効率を
増強するペプチドもしくはペプチド様配列とを結合することによって達成できる
可能性がある。

【００２４】本発明の第１態様では、本発明は微生物と戦うときに使用できる特定の有用な
アンチセンスＰＮＡ配列を同定する方法に関する。

【００２５】従って、本発明は、抗感染治療のための基礎となりうるある微生物中の１種以
上の標的遺伝子を同定する方法に関し、ａ）微生物中に存在することが知られている潜在的標的遺伝子を選択するステ
ップと、ｂ）選択した潜在的標的遺伝子各々に対する１種以上の相補的（アンチセンス
）ＰＮＡ配列を入手するステップと、ｃ）増殖培地中で１種以上のアンチセンスＰＮＡ配列を個別にもしくは微生物
と結合して混合するステップと、ｄ）アンチセンスＰＮＡの存在下および非存在下でその微生物の増殖をモニタ
リングするステップと、ｅ）標的遺伝子を、対応するアンチセンスＰＮＡによるそれの遮断がアンチセ
ンスＰＮＡの非存在下での増殖と比較してその微生物の制限された増殖を生じさ
せる遺伝子として同定するステップとを含む。

【００２６】ある好ましい実施形態では、本方法は活性増強部分に連結されたＰＮＡ配列の
使用を備える。より好ましくは、活性増強部分は、例えばその微生物の細胞壁を
貫通するＰＮＡの横断を増強することによる、その微生物中の遺伝子標的へのＰ
ＮＡの接近を増強するペプチドである。

【００２７】驚くべきことに、陽イオンペプチドを組み込むことによって抗感染作用の増強
を観察できることが発見されている。そのような修正ＰＮＡ分子の重要な特徴は
正荷電の脂肪親和性アミノ酸またはアミノ酸アナログを備えるパターンであると
思われる。抗感染作用は、ＰＮＡ配列に関連したペプチドの様々な配向とともに
所見される。

【００２８】ある好ましい方法では、ペプチドは（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ）₃である。

【００２９】本発明の別の態様は、ある微生物中の標的遺伝子の少なくとも１部分に対して
相補的（アンチセンス）であるＰＮＡ配列を備えるＰＮＡ分子に関するが、その
標的遺伝子は上記の本発明の第１態様で定義された方法に従って同定可能である
。

【００３０】ＲＮＡ分子はさらにまた、陽イオンペプチドのような活性増強部分を備えるこ
とができる。

【００３１】さらにまた本発明の別の態様では、ＰＮＡ分子は感染性疾患の治療もしくは予
防のためまたは非生物的物体を消毒するための薬剤の製造において使用される。

【００３２】さらに別の態様では、本発明は感染性疾患の治療もしくは予防のためまたは非
生物的物体を消毒するための組成物に関する。

【００３３】さらに別の態様では、本発明は感染性疾患の治療もしくは予防のためまたは非
生物的物体を治療することに関する。

【００３４】［発明の詳細な説明］アンチセンスＰＮＡは遺伝子および配列特異的に細菌遺伝子発現を阻害するこ
とができる（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ１９９８ａ、ｂおよびＷＯ第９９
／１３８９３号）。このアプローチは機能的ゲノミクスのためのツールとしてお
よび新規抗菌薬の源として実用的であることを証明できる。しかし、標準的ＰＮ
Ａを改良するためにはアンチセンス効力を増加させる必要がある。活性について
の１つの限界は正確な標的遺伝子の選択であると思われる。もう１つの限界は細
胞侵入である。細胞は分子量の大きい異物化合物の侵入を排除し、さらにインビ
トロおよび細胞アッセイについての以前の結果は細胞障壁がアンチセンス作用を
制限することを示していると思われる。従って、本発明は標的遺伝子を選択して
アンチセンス効力の活性を改善する戦術に関する。

【００３５】理論に縛られなくとも、短い陽イオンペプチドは細菌細胞壁を貫通するＰＮＡ
取り込みの改善をもたらす可能性があると考えられる。短いペプチドは細胞壁に
浸透することによって機能し、例えばゲノム、ｍＲＮＡｓ、リボソーム等のよう
な細胞内部の構造へ接近するために修正ＰＮＡ分子が細胞壁および膜を横断する
ことを可能にすると考えられている。しかし、核酸標的への接近可能性の改善ま
たはＰＮＡの結合の改善もまた観察された総合的作用に付け加わる可能性がある
。

【００３６】しかし、接近可能性の改善は効果的な抗感染性ＰＮＡ分子を提供するには不十
分である。高度に重要な特徴は正確なＰＮＡ配列への接近であり、これは宿主微
生物の増殖のために不可欠である遺伝子標的の同定に左右される。

【００３７】本発明に従うと、ＰＮＡ分子を合成することができ、その分子はナノモル濃度
で細菌遺伝子の特異的かつ効果的阻害に使用することができる。この濃度でのア
ンチセンス効力はテクノロジーの実用化と一致している。従って、本発明は患者
にとっても容認可能である効果的濃度でＰＮＡを投与することを可能にした。

【００３８】従って、本発明は、抗感染治療のための基礎となることができる、ある微生物
中の１種以上の標的遺伝子を同定する方法に関し、ａ）微生物中に存在することが知られている潜在的標的遺伝子を選択するステ
ップと、ｂ）選択した潜在的標的遺伝子各々に対する１種以上の相補的（アンチセンス
）ＰＮＡ配列を入手するステップと、ｃ）増殖培地中で１種以上のアンチセンスＰＮＡ配列を個別にもしくは微生物
と結合して混合するステップと、ｄ）アンチセンスＰＮＡの存在下および非存在下でその微生物の増殖をモニタ
リングするステップと、ｅ）標的遺伝子を、対応するアンチセンスＰＮＡによるそれの遮断がアンチセ
ンスＰＮＡの非存在下での増殖と比較してその微生物の制限された増殖を生じさ
せる遺伝子として同定するステップとを含む。

【００３９】潜在的遺伝子標的の選択および結果として生じるＰＮＡ構成体の試験は、微生
物中の遺伝子標的の選択の例として大腸菌を用いて実施されてきた。しかし、他
のあらゆる微生物、特に細菌群にこの原理を適用できることは明白である。

【００４０】微生物の大腸菌Ｋ１２株ＭＧ１６５５はエール大学（コネチカット州、米国）
の大腸菌遺伝材料センターから入手された。この微生物のゲノムは完全に配列決
定されており、計４，６３９，２２１ｂｐ（塩基対）および４，２８９個のオー
プンリーディングフレームを含んでいる。

【００４１】潜在的標的遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋで完全大腸菌ゲノムから取り出された。
１２塩基の長さを備える標的配列は各オープン・リーディング・フレームの開始
コドン領域の周囲から選択された。細菌ゲノムおよびヒトゲノム中の相同遺伝子
および標的配列の存在はＮＣＢＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ，ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎ
ｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：全
米バイオテクノロジー情報センター）ｗｗｗＢＬＡＳＴサーバーでＢＬＡＳＴ２．０プログラムを使用することによって解析された。

【００４２】本発明のまた別の態様では、標的遺伝子は例えば細菌のような微生物の増殖を
阻害するために使用できる化合物を同定するために使用することができる。

【００４３】選択基準の定義潜在的遺伝子標的を選択する場合には下記の一般的検討事項に従うことができ
よう。

【００４４】１．活性の範囲広域抗生物質はしばしば詳細な診断がなくとも直ちに使用することができる。
病原菌に命中する可能性は高いが、他方では、常在微生物叢もまた影響を受ける
可能性があり、従って治療後に新規病原菌が発生する機会が増加する。これらお
よび耐性関連性の理由から、制限範囲を備えたＰＮＡ抗菌薬をデザインすること
を目標とすることが好都合な可能性がある。

【００４５】２．殺菌作用正常免疫状態を有する患者に対しては、多くの場合に静菌性抗菌薬で十分であ
る。静的作用は、免疫系が侵入者に追いつくための、従って残りの仕事を行うた
めの時間を与える。しかし、免疫状態が弱い、または免疫抑制状態の患者のため
には静菌性作用では不十分である。このため、殺菌性ＰＮＡ抗菌薬をデザインす
ることがさらに好都合である。

【００４６】３．選択的毒性抗菌性ＰＮＡ構成体は微生物標的に対して特異的でなければならない、つまり
高い配列特異性を有していなければならない。

【００４７】細菌生理学に関する知識に基づき、本発明者らは潜在的遺伝子標的の評価の焦
点を下記の３種の主要プロセス複合体に集中してきた。細胞壁合成、タンパク質合成（翻訳）、および核酸合成

【００４８】各プロセス内の各潜在的遺伝子標的に対しては、評価中に下記の４つのポイン
トを取り扱う。その遺伝子は細菌生存にとって必須でなければならない。その遺伝子は単一コピーとしてのみ発生しなければならない。その微生物は標的のノックアウトに対して補償できる生理学的経路を有してい
てはならない。標的遺伝子配列はヒトゲノムとの相同性を有していてはならない。

【００４９】さらにもう１つの検討事項は、一部の生理学的プロセスは主として細胞を分割
するときに活性であるが、他のプロセスは非分割状況下で同様に機能する点にあ
る。本発明者らは両方の群から標的を選択する方法を示した。

【００５０】１．細胞壁生合成細胞壁生合成における抗生物質に対する標的領域は、グラム陰性菌では単一層
およびグラム陽性菌では多膜層であるペプチドグリカン層、いわゆるムレイン球
形嚢の重合である。これらの標的は細胞壁の少ない細菌（マイコプラズマ種）に
おいては存在せず、非浸透性壁を有する細菌（マイコバクテリア）においてはほ
とんど接近不能である。一部の細菌細胞壁生合成においては一部の化合物は標的
に接近不能であり、例えばグリコペプチドであるバンコマイシンはグラム陰性菌
の壁に浸透することができない。

【００５１】細胞壁生合成が妨害される場合は、標的は細胞を分割することにのみ有効であ
る。さらに、その作用は細胞溶解をもたらすムレイン加水分解酵素の引続いての
活性化に左右される。さらにその上、さもないと細胞壁の少ないＬ形が形成され
るので、低浸透圧培地が必要とされる。

【００５２】細胞壁生合成における標的タンパク質は、例えばβラクタム抗菌性ペニシリン
の標的であるペニシリン結合タンパク質のＰＢＰである。それらはムレイン球形
嚢の架橋結合の最終段階に含まれている。基質アナログとして機能するペニシリ
ンの結合によって、ＰＢＰは阻害され、さらに引続いてペプチドグリカン中間物
の蓄積によって加水分解酵素が活性化され、従ってペプチドグリカン層を加水分
解して溶解を惹起する。

【００５３】大腸菌は、高分子量ＰＢＰのＰＢＰ１ａ、ＰＢＰ１ｂ、ＰＢＰ１ｃ、ＰＢＰ２
およびＰＢＰ３並びに７種の低分子量ＰＢＰのＰＢＰ４−７、ＤａｃＤ、Ａｍｐ
ＣおよびＡｍｐＨを含む１２種のＰＢＰを有している。増殖にとって不可欠であ
ることが知られているのは高分子量ＰＢＰだけであるので、このためそれらがＰ
ＮＡアンチセンスの標的として選択された。

【００５４】２．タンパク質合成（翻訳）タンパク質合成の領域における標的は、主として原核生物７０Ｓリボソーム、
即ち３０Ｓもしくは５０Ｓサブユニットにおいて所見される。タンパク質生合成
は細菌増殖サイクルを通しての重要なプロセスであるので、これらの標的に打撃
を与える作用は細胞分割には左右されない。

【００５５】選択された標的、即ち翻訳開始因子、伸長因子および終結因子は天然型抗生物
質にとっての標的であるとは知られていない。

【００５６】３．核酸合成ＤＮＡおよびＲＮＡ合成はどちらも抗生物質にとっての標的である。ＤＮＡ合
成において知られている標的タンパク質はジャイレースである。ジャイレースは
細菌染色体のネガティブスーパーコイル化を触媒するトポイソメラーゼである。
この酵素が例えばキノロン系のような抗菌薬によって阻害されると、スーパーコ
イル化は発生せず、この結果として染色体を新しい細胞内に封入できなくなる。
ジャイレースは複製、転写、修復および制限において機能する。この酵素は２種
のサブユニットから構成されるが、それらはどちらもＰＮＡの標的候補である。

【００５７】いかなる意味でも本発明を決して制限することのない上記の考察に従って、本
発明者らは例として下記のタンパク質標的を選択した。

【００５８】

【表１】

【００５９】

【表２】

【００６０】標的遺伝子選択のために使用されるＰＮＡ標的配列の選択は、その後のｍＲＮＡとＰＮＡとの複合体の安定性に関する化
学的考察を含んでいる。

【００６１】最初は核標的遺伝子に対してＡＵＧ開始コドンを含む２つの重複配列が合成さ
れた。最適な作用のためには均衡の取れたプリン対ピリミジン比が不可欠である
。低プリン含量は低親和性を生じさせるが、他方高プリン含量はしばしばＰＮＡ
凝集を生じさせる。

【００６２】細菌取り込みを容易にするために、全ＰＮＡはカルボキシ末端に連結されたデ
カペプチドを用いて合成された。ペプチド−ＰＮＡ構成体の全体構造は、例えば
ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ−Ａｄｏ−ＰＮＡ−ＮＨ２である。その代わりに細胞壁を
貫通するＰＮＡの輸送増強のために適切なその他のペプチド類もまた使用するこ
とができる。

【００６３】表１は、標的遺伝子選択実験のために使用されたペプチド−ＰＮＡを表わして
いる（開始コドンは強調表示されている）。

【００６４】

【表３】

【００６５】

【表３（つづき）】

【００６６】Ｋはリシン（Ｌｙｓ）に対する１文字コードであり、Ｆはフェニルアラニン（
Ｐｈｅ）に対する１文字コードである。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはＰＮＡ配列中の塩
基であるアデニン、シトシン、グアニンおよびチミンを意味する。

【００６７】ペプチドＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫは細胞壁を貫通するＰＮＡの輸送を増強できる
多数の可能性のあるペプチドの１つであることを強調しておく。その他のペプチ
ドは同時係属の特許出願第号に記載されている。

【００６８】その他の潜在的標的遺伝子は抗生物質耐性遺伝子である。当業者であればそれ
らからどの遺伝子を選択すべきかが容易に分かるであろう。２つの例はβラクタ
ム系抗生物質を不活化するβラクタマーゼ類をコードする遺伝子、およびクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。

【００６９】そのような耐性遺伝子に対するＰＮＡは耐性細菌に対して使用することができ
よう。

【００７０】感染性疾患は極めて広範囲の細菌、ウイルス、原虫、寄生虫および節足動物に
属する微生物によって惹起され、理論的観点からは抗生物質に対して感受性もし
くは耐性であるそのような微生物における全種類のＲＮＡに対してＰＮＡを修飾
かつ使用することができる。

【００７１】本発明に従って治療できる微生物の例は、たとえばストレプトコッカス属、ス
タフィロコッカス属、ペプトコッカス属、バシラス属、リステリア菌、クロスト
リジウム属、プロピオン酸菌属のようなグラム陽性菌、バクテロイデス属、フゾ
バクテリウム属、エシェリキア属、クレブシエラ属、サルモネラ属、シゲラ属、
プロテウス属、シュードモナス属、ビブリオ属、レジオネラ菌、ヘモフィルス属
、ボルデテラ属、ブルセラ菌、カンピロバクター菌、ナイセリア菌、ブランハメ
ラ亜属のようなグラム陰性菌、および例えばマイコバクテリウム属、トレポネー
マ属、レプトスピラ属、ボレリア属、マイコプラズマ属、クラミジア属、リケッ
チア属およびコクシエラ属のようなグラム染色液で僅かに染色するまたは全く染
色しない微生物である。

【００７２】細菌増殖を阻害するＰＮＡの能力は多くの方法で測定することができる。当業
者であれば容易に実施方法がわかるであろう。例として、本発明者らはＮＣＣＬ
Ｓ（米臨床研究所規格委員会）ガイドラインに従った微量希釈ブロス法の使用に
よって増殖を測定することを選択した。

【００７３】１つの例は下記であろう。細菌菌株：大腸菌Ｋ１２ＭＧ１６５５培地：無菌水を用いて希釈した１０％ミュラー・ヒントンブロス。トレイ：９６ウェル型トレイ、Ｃｏｓｔａｒ＃３４７４、バイオテックライン
ＡＳ社製、コペンハーゲン。（トレイ表面へのＰＮＡ付着を防止する／最小限に
抑えるために超低吸着性トレイを使用する）

【００７４】予備加温した新鮮培地を用いて大腸菌の対数期培養を希釈し、各ウェル中で２
００μｌの細菌培養を含有する５×１０⁵および５×１０⁴細菌／ｍｌ（培地）の
最終濃度を生じさせるために一定ＯＤ（ここでは：６００ｎｍでの光学密度）に
調整する。３００ｎｍから１，０００ｎＭの範囲内の最終濃度を生じさせるため
にウェル内の細菌培養にＰＮＡを添加する。しかし、初期合成の数回については
我々は限られた材料という問題に直面したため、このため試験濃度の理想数より
少ない数を選択することが必要になった。トレイはロボット分析装置のＰｏｗｅ
ｒＷａｖｅ_x、ソフトウエアＫＣ⁴、Ｋｅｂｏ．Ｌａｂ（コペンハーゲン）中で攪
拌することによって３７℃で１６時間に渡って培養し、増殖曲線を記録するため
にインキュベーション時間中に６００ｎｍで光学密度を測定する。正確な接種サ
イズおよびインキュベーション中の細菌増殖を確認するためのコントロールとし
てＰＮＡを含まない細菌培地を含有するウェルを使用する。汚染を検出するため
に培養を試験する。

【００７５】個々のペプチド−ＰＮＡ構成体は、組成に依存しておよそ４，２００から５，
０００の間の分子量を有している。このため、全試験は重量／体積ベースではな
くむしろモルベースで実施した。しかし、５００ｎＭの濃度４５００の構成体の
平均ＭＷの推定は、２．２５マイクログラム／ｍｌに等しい。

【００７６】相違するペプチド−ＰＮＡ構成体、例えばより大きなペプチド類および／また
はより大きなＰＮＡを使用しなければならない場合は、それに従って分子量を計
算して使用しなければならない。

【００７７】ＰＮＡ構成体の増殖阻害作用の定義ウェル内の細菌増殖は、誘導期、即ち増殖が開始する（前）までの期間、対数
期、即ち最高増殖率を伴う期間、定常状態期、その後の死滅期によって説明され
る。これらのパラメーターは、ＰＮＡを含むおよび含まない増殖曲線を比較する
ことによって、細菌増殖にＰＮＡが及ぼす阻害作用を評価するときに使用する。
ＯＤ測定値へのアッセイ内およびアッセイ間変動係数は各々４．５％および８％
であった。

【００７８】細菌増殖の全阻害は下記のように定義することができる。ＯＤ（１６時間）＝ＯＤ（０時間）＋／−８％

【００７９】ペプチドは、通常はアミノ末端もしくはカルボキシル末端を通してＰＮＡ配列
に連結されている。しかし、ＰＮＡ配列はまたペプチドの内側部分へ連結させる
こともできる。好ましくは、ＰＮＡ配列はペプチドのＣ末端へ連結させることが
できる。

【００８０】ＰＮＡ分子は直接結合を通して、またはリンカーを通してペプチド部分へ結合
することができる。ＰＮＡをペプチドと結合するためには様々な連結基を使用す
ることができる。本発明のためには連結基の選択は重要ではない。しかし、ＰＮ
Ａおよびペプチドの特定の組み合わせと結合すると一部の連結基が有益な可能性
がある。当業者であれば正しいリンカーを容易に選択することができるであろう
。一部の連結基については、それらの内容がこれにより参照して組み込まれるＷ
Ｏ第９６／１１２０５号およびＷＯ９８／５２６１４号に記載されている。

【００８１】連結基の例は、Ａｄｏ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）、ｃｍｃ
ｃ（システイン−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン
酸）、ａｈｅｘ（６−アミノヘキサン酸）、４−アミノブチル酸、４−アミノシ
クロヘキシルカルボン酸、ポリエチレングリコール類およびアミノ酸類である。
これらの基はいずれも単一連結基として、または適切なリンカー群を作り出すと
きに複数の基と一緒に使用することができる。さらに、リンカー群において様々
な機能性を入手するためにあらゆる順序および数で様々な連結基を組み合わせる
ことができる。

【００８２】本発明に従った修飾ＰＮＡ分子は、例えば細菌のような微生物中の少なくとも
１つの標的ヌクレオチド配列に相補的である配列のＰＮＡオリゴマーを備える。
標的は、その細菌の増殖および／または複製のために不可欠なあらゆるＲＮＡの
ヌクレオチド配列であってよい。あるいはまた、標的は抗生物質類に耐性である
原因となる因子をコードする遺伝子であってもよい。ある好ましい実施形態では
、標的ヌクレオチド配列の機能化は細菌の生存にとって必須であり、標的核酸の
機能化はアンチセンス方法でＰＮＡ配列によって遮断される。

【００８３】ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖へのＰＮＡ鎖の結合は、アンチパラレル（逆平行）また
はパラレル（平行）の２種の配向の１つで発生する可能性がある。本発明で使用
するように、ＰＮＡに適用される用語の相補的はそれ自体ではパラレルまたはア
ンチパラレルの配向を特定しない。ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡの最も
安定した配向がアンチパラレルであることが重要である。ある好ましい実施形態
では、一本鎖ＲＮＡを標的とするＰＮＡはアンチパラレル配向において相補的で
ある。

【００８４】本発明のまた別の好ましい実施形態では、相互に共有的に連結した２個のＰＮ
Ａオリゴマーから構成されるビスＰＮＡは、それと一緒にＰＮＡ₂−ＲＮＡ（Ｐ
ＮＡ₂−ＤＮＡ）三重ヘリックスを形成することができるＲＮＡ（もしくはＤＮ
Ａ）中のホモプリン配列（アデニンおよび／またはグアニンヌクレオチドのみか
ら成る）を標的とする。

【００８５】本発明のある好ましい実施形態では、ＰＮＡは５〜２０核酸塩基、特に７〜１
５核酸塩基、および最も好ましくは９〜２０核酸塩基を含有する。

【００８６】ペプチド核酸については、それらの内容がこれにより参照して組み込まれるＷ
Ｏ第９２／２０７０２号およびＷＯ９２／２０７０３号に記載されている。

【００８７】修飾ＰＮＡ分子は最初は感受性１０％培地アッセイでスクリーニングすること
ができる。陽性結果が出た場合は、その後より「現実的」環境において阻害作用
を検証するために１００％培地アッセイにおいて実行する（米国のガイドライン
（ＮＣＣＬＳ）を参照）。

【００８８】最初のスクリーニング方法の後、最初に同定したものよりいっそう良好な標的
を探索するのが有益な可能性がある。ヒットからのこの最適化は多数の形態を取
る可能性がある。１つの方法は潜在的標的であると同定された遺伝子中でより良
好な標的を探索することであろう。これは無作為試行錯誤法またはより系統的な
遺伝子歩行によって実施できる。遺伝子歩行法を使用するときの利点は、ほぼす
べての可能性が試される点である。他方、遺伝子をカバーするためには多数の構
成体が必要とされる。

【００８９】本発明に従うと、ＰＮＡのために好ましい標的を同定するために修飾ＰＮＡ分
子を使用できる。例えばゲノムシークエンシングもしくはｃＤＮＡライブラリー
からの標的微生物の知られている、もしくは部分的に知られているゲノムに基づ
いて、様々なＰＮＡ配列を構成して効果的な抗感染性増強ペプチドに連結させ、
その後その抗感染活性を試験することができる。できる限り多数の微生物と共有
する、または例えばグラム陰性菌もしくはグラム陽性菌のような別個のサブセッ
トと共有する、または選択された別個の複数の微生物と共有する、または単一微
生物に対して特異的なＰＮＡ配列を選択することが有益な可能性がある。

【００９０】本発明のまた別の態様では、本発明は例えば輸送を増強するペプチド類のよう
な活性増強部分に接合されたアンチセンスＰＮＡ配列の形で静菌剤のような新規
の抗感染薬を作製するときに有用である遺伝子標的を選択する可能性を提供する
。そのようなコンジュゲートは感染性微生物の増殖または複製を阻害することに
使用するための組成物において調製することができる。ある実施形態では、微生
物の増殖の阻害は修飾ＰＮＡ分子単独または抗生物質もしくは他の抗感染薬と組
み合わせてのいずれかを用いる治療を通して入手される。また別の実施形態では
、本組成物は２種以上の相違する修飾ＰＮＡ分子を備える。第２修飾ＰＮＡ分子
は第１修飾ＰＮＡ分子と同一の細菌を標的とするため、または相違する細菌を標
的とするために使用することができる。後者の形態では、治療に対して特異的な
標的細菌の組み合わせを選択することができる。あるいはまた、標的は１種以上
の細菌に対する１種以上の抗生物質に耐性を付与する１種以上の遺伝子であって
よい。そのような治療においては、その組成物またはその治療はさらに前記抗生
物質（類）の使用を備える。

【００９１】組成物は製薬学的に容認可能な担体および／または希釈剤を含むことができる
。そのような担体および希釈剤は技術において知られている。活性組成物は、錠
剤、注射、粉末、溶液、スプレー剤、ドレッシング類等の形で投与することがで
きる。

【００９２】動物において感染性疾患を治療または予防するための調製物においては、使用
される活性修飾ＰＮＡ分子の量は特定活性薬、治療すべき微生物およびその微生
物の担体に従って決定される。

【００９３】本発明のさらにまた別の態様では、本発明は例えば手術用道具類、病院在庫品
、歯科用道具類、屠殺場在庫品および道具類、酪農業在庫品および道具類、理容
および美容用道具類その他のような生物以外の物体を消毒するときに使用するた
めの修飾ＰＮＡ分子の供給に関する。

【００９４】下記の実施例は本発明の単なる具体例であって、いかなる意味においても本発
明の範囲を限定すると見なすべきではない。本発明の原理は試験微生物としての
大腸菌を使用して示されている。しかし、実施例１８に示されているように、有
益な作用は他の細菌に対しても同様に当てはまる。

【００９５】実施例１一次スクリーンの説明細菌増殖アッセイは、細菌増殖を阻害または完全に廃止させるＰＮＡを同定す
るために設計されている。増殖阻害は標的とされた遺伝子のｍＲＮＡへのＰＮＡ
のアンチセンス結合の結果として生じる。試験化合物（ＰＮＡ）は全アッセイ中
に存在する。

【００９６】構成要素本プロトコルのための実験的細菌菌株は、大腸菌Ｋ１２ＭＧ１６５５（大腸
菌遺伝材料センター、エール大学、ニューヘーブン）である。増殖用培地は１０
％無菌ＬＢ（ＬｕｒｅａＢｅｒｔａｎｉ）培地である。大腸菌試験細胞は、３
７℃で一晩かけてＬＢ培地中で予備培養する（オーバーナイト培養）。スクリー
ニングは、３７℃での定速振とう下で９６ウェル型マイクロタイタープレート内
で実施する。ＰＮＡは４０×濃縮保存溶液としてのＨ₂Ｏ中に溶解させる。

【００９７】アッセイ条件オーバーナイト培養から新鮮培養（試験培養）を中対数期（ＯＤ₆₀₀＝１０⁷ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌに対応する０．１）へ３７℃で増殖させる。試験培養は１０％Ｌ
Ｂ培地を用いて１０⁵〜１０¹の範囲内で段階的に希釈する。希釈培地１９５μｌ
に４０×濃縮ＰＮＡ保存溶液５μｌを加えたものを各試験ウェルに添加する。９６ウェル型マイクロタイタープレートを３７℃での定速振とう下でマイクロ
プレート走査型分光光度計中でインキュベートする。ＯＤ₆₀₀測定は３．１９分
毎に自動的に実施され、同時に記録される。

【００９８】標的遺伝子ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）ＰＢＰはグラム陽性菌およびグラム陰性菌のエンベロープの一部であるムレイ
ン（ペプチドグリカン）の生合成において機能する。基質アナロゴンとして機能
するペニシリンの結合によって、ＰＢＰは阻害され、さらにその結果として加水
分解酵素がペプチドグリカン中間物の蓄積によって活性化され、従ってペプチド
グリカン層を加水分解して溶解を惹起する。

【００９９】ＰＮＡデザイン第１号ＰＮＡ＃ＰＮＡ２６は、ＰＢＰ１Ａをコードする大腸菌のｍｒｃＡ（ｐｏｎ
Ａ）遺伝子の配列に従ってデザインされている。ｍｒｃＡ遺伝子の配列（アクセ
ッション番号Ｘ０２１６４）はＥＭＢＬ配列データベースから入手された（ハイ
デルベルク、ドイツ）（Ｂｒｏｏｍｅ−Ｓｍｉｔｈら、１９８５，ＥｕｒＪ
Ｂｉｏｃｈｅｍ１４７：４３７−４６）。ｍｒｃＡ遺伝子の配列は図３に示さ
れている。

【０１００】＃ＰＮＡ２６の標的領域は下記の通りである。

【化５】ＧＴＧ開始コドン領域のコーディングおよび非コーディング（アンチセンス）鎖
の両方が示されている。アンチセンス鎖およびＰＮＡ２６のＧＴＧ開始コドン領域の配列は５’から３’
の方向で示されている。

【化６】ＰＮＡ２６は１０アミノ酸ペプチドへ結合した１２ｍｅｒのＰＮＡ分子（ボール
ド体で示されている）である。

【０１０１】ＰＮＡ２６を用いた増殖アッセイこのアッセイは下記の通りに実施した。ＰＮＡ２６を１．５、２．０、２．５、３．０および３．５μＭの最終濃度で
含有する１０⁵、１０⁴、１０³、１０²および１０¹ｃｅｌｌｓ／ｍｌに対応する
試験培養の希釈液を定速振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートする。
増殖の全阻害は、１０⁴〜１０¹ｃｅｌｌｓ／ｍｌおよび少なくとも２．５μＭの
ＰＮＡ濃度を有する培養において所見できる（表２）。

【０１０２】ＰＮＡデザイン第２号ＰＮＡ＃ＰＮＡ１４はＰＢＰ２をコードするｍｒｄＡ遺伝子の配列に従って
デザインされている。この配列（アクセッション番号ＡＥ０００１６８、塩基４
０５１〜５９５２）はＮＣＢＩの大腸菌ゲノムデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ，
ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＢｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（全米バイオテクノロジー情報センター）、米国）から入
手した。

【０１０３】ｍｒｄＡ遺伝子の配列は図４に示されている。ＰＮＡ１４の標的領域は下記の通りである。

【化７】ＧＴＧ開始コドン領域のコーディング（センス）および非コーディング（アンチ
センス）鎖の両方が示されている。下記ではアンチセンス鎖およびＰＮＡ２６のＡＴＧ開始コドン領域の配列が５’
から３’の配向で示されている。

【化８】ＰＮＡ１４は、１０アミノ酸ペプチドへ結合した１２ｍｅｒのＰＮＡ分子（ボー
ルド体で示されている）である。

【０１０４】ＰＮＡ１４を用いた増殖アッセイこのアッセイは下記の通りに実施した。ＰＮＡ１４を１．３、１．４および１．５μＭの最終濃度で含有する１０⁵、
１０⁴、１０³、１０²および１０¹ｃｅｌｌｓ／ｍｌに対応する試験培養の希釈液
を定速振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートする。増殖の全阻害は、
１０⁴〜１０¹ｃｅｌｌｓ／ｍｌおよび少なくとも１．４μＭのＰＮＡ濃度を有す
る培養において所見できる（表３）。

【０１０５】実施例２表１から取り出した多数の構成体を第２０頁で検討した実験セットアップに従
って試験した。図５および６において例示したように、ＰＮＡ構成体の試験に選
択した細菌増殖条件を使用すると様々なＰＮＡ特異性によって示される阻害作用
の直接比較を行うことができた。どちらの図もＰＮＡ−ペプチドを含まずに、お
よび２００ｎＭ〜１，０００ｎＭで相違する最終濃度で存在するＰＮＡ−ペプチ
ドを含んで入手した細菌増殖曲線を示している。

【０１０６】図５におけるＰＮＡ＃１０９は、細胞分割タンパク質をコードするｆｔｓＺ遺
伝子に対して向けられている。図６におけるＰＮＡ＃１１１は、細菌細胞分割中
の隔壁形成プロセスに含まれるＡＴＰ結合タンパク質をコードするｆｔｓＡ遺伝
子に向けられている。阻害作用は、どちらの構成体についても用量依存性である
。細菌増殖の完全な阻害はＰＮＡ＃１０９については６００ｎＭで、ＰＮＡ＃１
１１については１，０００ｎＭで観察された（１．５×１０⁵細菌／ｍｌ）。

【０１０７】下記の表４および５は、標的遺伝子を選択する目的で実施された細菌増殖阻害
アッセイの要約である。

【０１０８】

【表４】

【０１０９】

【表５】

【０１１０】

【表６】

【０１１１】

【表７】

【０１１２】上記の表４および５に略述したように、選択した潜在的標的遺伝子中の数種に
対するＰＮＡ−ペプチド構成体は選択した濃度範囲内で細菌増殖を阻害すること
ができた。

【０１１３】「ナンセンス」ＰＮＡ、即ち＃１３６は微生物中のいずれのゲノム領域とも完
全には適合しなかったので、このため全長塩基対合を許容しなかった。この対照
を使用してペプチド−ＰＮＡ構成体の一般毒性を調査した。選択した濃度範囲内
では細菌増殖阻害は検出されなかった。

【０１１４】細菌細胞分割に含まれる標的１，０００ｎＭの濃度で、潜在的標的に対する数種のＰＮＡ構成体は細菌増殖
阻害を示した。これらの一部は、例えばジャイレースＡ、ジャイレースＢ、ＰＢ
Ｐ２およびＰＢＰ３と同様の方法で機能した。ＰＢＰ１ａ２およびｆｔｓＡを比
較すると、後者は２種のＰＮＡの増殖への作用を示したが、前者は唯一のＰＮＡ
による影響しか受けなかった。ｆｔｓＡはσ７０より強力な標的であった。ｆｔ
ｓＡ並びにｆｔｓＺはＰＢＰ１ｂ１ａｔｇｌより強力な標的であった。ｆｔｓＡ
とｆｔｓＺとの直接比較は、それらがどちらも適切な標的であるが、ｆｔｓＺに
対するＰＮＡ構成体を用いて所見される阻害作用の方がｆｔｓＡに対するより強
力であることを示した（表５並びに図４および５を参照）。この方法で、細胞分
割タンパク質をコードする一次標的ｆｔｓｚを選択した。

【０１１５】非分割細菌細胞において活性な標的５００ｎＭへ低下させた濃度で、数種の潜在的標的、即ちＩＦ１、ＩＦ３、Ｅ
Ｆ−ＧおよびＲＦ２に対するＰＮＡ構成体は細菌増殖阻害を示した。しかし、５
００ｎＭの濃度ではいずれのＰＮＡも細菌増殖を完全には阻害しなかった。７０
０ｎＭの濃度では３種の標的、即ちＩＦ１、ＩＦ２βおよびＥｆ−Ｔｓに対する
ＰＮＡは細菌増殖の完全な阻害を示した。１，０００ｎＭのＰＮＡを用いて試験
した標的の内では、１種（ＲＦ２）は１種のＰＮＡによってのみ阻害され、２種
（ＩＦ１およびＥＦ−Ｇ）は試験した両方のＰＮＡによって阻害された。ＩＦ１
およびＥＦ−Ｇは、細菌増殖阻害実験から判定されたようにどちらも適切な遺伝
子標的であろう。しかし、引続いての遺伝子歩行を心に留めて、我々は一次標的
として長い遺伝子（ＥＦ−ＧをコードするｆｕｓＡ、２キロベース）より短い遺
伝子（ＩＦ１をコードするｉｎｆＡ、２３０塩基）を選択した。

【０１１６】実施例３大腸菌のＩＦ−１をコードする遺伝子上の遺伝子歩行選択した標的遺伝子は、さらに各遺伝子内の最適標的配列を選択するために遺
伝子歩行によって分析することができる。これらの配列に向けられたＰＮＡ’ｓ
は適切な細菌取り込みを増強する化合物をデザインすることを目的とした実験内
にある可能性がある。

【０１１７】大腸菌のＩＦ−１をコードする遺伝子に対してＰＮＡ＃１３０を用いると好都
合な細菌増殖阻害が得られるために、手作業による遺伝子歩行を実施した。表６
は、ｉｎｆＡ遺伝子からデザインされた相違するＰＮＡ配列を示している。実験
セットアップは、上記で説明した通りに１０％ミュラー・ヒントンブロス中に入
れた大腸菌Ｋ１２ＭＧ１６５５の使用を備えるセットアップであった。

【０１１８】

【表８】

【０１１９】結果は表７に示されており、この表は大腸菌遺伝子ｉｎｆＡを標的とするとき
に使用するためにはおそらく構成体ＰＮＡ２６７が最高の化合物であることを示
している。

【０１２０】

【表９】

【０１２１】文献＊ Davies, J. et al. (1994) Science 264, 375-82. ＊ Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H. and Buchardt, O. Science (19
91) 254, 1457-1500. ＊ Egholm, M, Buchardt, O, Christensen, L, Behrens, C, Freier, S. M.
Driver, D.A., Berg, R.H., Kim, S.K., Norden, B. and Nielsen, P.E. Natur
e (1993) 365, 566-568. ＊ Demidov, V., Potaman, V.N., Frank-Kamenetskii, M.D., Egholm, M., B
uchardt, O. Sonnichsen, H. S. and Nielsen, P.E. Biochem. Pharmacol. (199
4) 48, 1310-1313. ＊ Nielsen, P.E. and Haaima, G. Chemical Society Reviews (1997) 73-7
8. ＊ Hanvey et al. Science (1992) 258,1481-5. ＊ Knudsen, H. and Nielsen, P.E. Nucleic Acids Res. (1996) 24, 494-50
0. ＊ Lewis, L.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 3176-81. ＊ Meyer, O. et al. J. Biol. Chem. (1998) 273, 15621-7. ＊ Nyce, J.W. and Metzger, W.J. Nature (1997) 385 721-725. ＊ Pooga, M. et al, Nature Biotechnology (1998) 16, 857-61. ＊ Good, L. & Nielsen, P.E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95, 207
3-2076. ＊ Good, L. & Nielsen, P.E. Nature Biotechnology (1998) 16, 355-358. ＊ Broome-Smith et al. 1985, Eur J Biochem 147:437-46. ＊ Egholm,M.; Dueholm,K. L.; Buchardt, O.;Coull, J.; Nielsen, P. E.;
Nucleic Acids Research 1995, 23,217-222.

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＮＡおよびＰＮＡオリゴマーの化学構造を示している。

【図２】ｓｍｃｃを使用した共役結合における原理を示している。

【図３】ＰＢＰ１ＡをコードするｍｒｃＡ（ｐｏｎＡ）遺伝子のヌクレオチド配列を示
している。遺伝子（アクセッション番号Ｘ０２１６４）の配列はＥＭＢＬ配列デ
ータベース（ハイデルベルク、ドイツ）から入手した（Ｂｒｏｏｍｅ−Ｓｍｉｔ
ｈら、１９８５、ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１４７：４３７−４６）。２個
の可能性ある開始コドンは同定されている（強調表示されている）。塩基１〜２
６８８が示されている（停止コドンで終了する）。

【図４】ＰＢＰ２をコードするｍｒｄＡ遺伝子のヌクレオチド配列を示している。この
配列（アクセッション番号ＡＥ０００１６８、塩基４０５１〜５９５２、番号１
−２０００）はＮＣＢＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ，ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅ
ｆｏｒＢｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（全米バイオ
テクノロジー情報センター）、米国）の大腸菌ゲノムデータベースから入手した
。開始コドンは強調表示されている。

【図５】ＰＮＡ特異性ＰＮＡ１０９によって呈示される阻害作用を示している。この図
はＰＮＡペプチドを含まずに、および２００ｎＭ〜１，０００ｎＭで相違する最
終濃度で存在するＰＮＡペプチドを含めて入手された細菌増殖曲線を示している
。

【図６】ＰＮＡ特異性ＰＮＡ１１１によって呈示される阻害作用を示している。この図
はＰＮＡペプチドを含まずに、および２００ｎＭ〜１，０００ｎＭで相違する最
終濃度で存在するＰＮＡペプチドを含めて入手された細菌増殖曲線を示している
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウィッセンバッハ，マルギットデンマーク国，ディーケイ‐2200 コペンハーゲンエヌ、ステンガーザ 52ビー，１Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA06 DA06 EA04 GA11 HA11 4B063 QA01 QA06 QQ41 QR31 QR55 QR62 QS34 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA17 BA23 BA35 CA04 DC50 NA14 ZB351 ZC412 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 NA14 ZB35 ZC41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物中における抗感染治療のための基礎なりうる１種以上の
標的遺伝子を同定する方法であって、ａ）微生物中に存在することが知られている潜在的な標的遺伝子を選択するス
テップと、ｂ）選択された潜在的な標的遺伝子各々に対する１種以上の相補的（アンチセ
ンス）ＰＮＡ配列を入手するステップと、ｃ）増殖培地中で１種以上のアンチセンスＰＮＡ配列を別々にもしくは微生物
と組み合わせて混合するステップと、ｄ）アンチセンスＰＮＡの存在下および非存在下でその微生物の増殖をモニタ
リングするステップと、ｅ）標的遺伝子を、アンチセンスＰＮＡの非存在下での増殖と比較して、対応
するアンチセンスＰＮＡによる遮断によってその微生物の増殖が制限される遺伝
子として同定するステップとを含む方法。
【請求項２】ＰＮＡ配列が活性増強部分を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】活性増強部分がペプチドである請求項２に記載の方法。
【請求項４】活性増強部分が微生物中の遺伝子標的へのＰＮＡの接近を増
強する部分である請求２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】活性増強部分が微生物の細胞壁を貫通するＰＮＡの交叉を増
強する請求項４に記載の方法。
【請求項６】ペプチドが（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ）₃−Ｌｙｓである請
求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】抗感染薬を調製するための基礎としての標的遺伝子または標
的遺伝子産物の使用であって、前記標的遺伝子が請求項１〜６のいずれかに記載
の方法によって同定可能である使用。
【請求項８】抗感染薬が標的遺伝子の少なくとも１部分に対して相補的な
ヌクレオチド配列である請求項７に記載の使用。
【請求項９】ヌクレオチド配列がアンチセンスＰＮＡである請求項８に記
載の使用。
【請求項１０】ＰＮＡが活性増強部分をさらに含む請求項９に記載の使用
。
【請求項１１】活性増強部分がペプチドである請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】活性増強部分が微生物中の遺伝子標的へのＰＮＡの接近を
増強する部分である請求項１０または請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】活性増強部分が微生物の細胞壁を貫通するＰＮＡの交叉を
増強する請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】ペプチドが（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ）₃−Ｌｙｓである
請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】結果として生じたアンチセンスＰＮＡがいずれのヒトまた
は動物ＤＮＡ配列に対しても相補的ではない請求項９〜１４のいずれかに記載の
使用。
【請求項１６】標的遺伝子が単一コピー遺伝子である請求項７〜１５のい
ずれかに記載の使用。
【請求項１７】アンチセンスＰＮＡが１つ以上の標的部位に対して相補的
ではない請求項９〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】微生物が大腸菌である請求項７〜１７のいずれかに記載の
使用。
【請求項１９】標的遺伝子がｆｔｓＡ、ｉｎｆＡ、ｉｎｆＢ、ｉｎｆＣ、
ｔｓｆ、ｆｕｓＡおよびｐｒｆＢからなる群から選択される請求項１８に記載の
使用。
【請求項２０】微生物中の標的遺伝子の少なくとも１部分に対して相補的
（アンチセンス）であるＰＮＡ配列を含み、前記標的遺伝子が請求項１〜６のい
ずれかに記載の方法によって同定可能であるＰＮＡ分子。
【請求項２１】ＰＮＡが活性増強部分をさらに含む請求項２０に記載のＰ
ＮＡ分子。
【請求項２２】活性増強部分がペプチドである請求項２１に記載のＰＮＡ
分子。
【請求項２３】活性増強部分が微生物中の遺伝子標的へのＰＮＡの接近を
増強する部分である請求項２１または請求項２２に記載のＰＮＡ分子。
【請求項２４】活性増強部分が微生物の細胞壁を貫通するＰＮＡの交叉を
増強する請求項２３に記載のＰＮＡ分子。
【請求項２５】ペプチドが（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ）₃−Ｌｙｓである
請求項２２〜２４のいずれかに記載のＰＮＡ分子。
【請求項２６】ＰＮＡがいずれのヒトまたは動物ＤＮＡ配列に対しても相
補的ではない請求項２０〜２５のいずれかに記載のＰＮＡ分子。
【請求項２７】標的遺伝子が単一コピー遺伝子である請求項２０〜２６の
いずれかに記載のＰＮＡ分子。
【請求項２８】アンチセンスＰＮＡが１つ以上の標的部位に対して相補的
ではない請求項２０〜２７のいずれかに記載のＰＮＡ分子。
【請求項２９】微生物が大腸菌である請求項２０〜２８のいずれかに記載
のＰＮＡ分子。
【請求項３０】標的遺伝子がｆｔｓＡ、ｉｎｆＡ、ｉｎｆＢ、ｉｎｆＣ、
ｔｓｆ、ｆｕｓＡおよびｐｒｆＢからなる群から選択される請求項２９に記載の
ＰＮＡ分子。
【請求項３１】ＰＮＡ配列が下記から選択される請求項３０に記載のＰＮ
Ａ分子。【化１】
【請求項３２】ＰＮＡ配列が下記から選択される請求項３１に記載のＰＮ
Ａ分子。【化２】
【請求項３３】下記からなる群から選択されるＰＮＡ分子。【化３】
【請求項３４】下記から選択される請求項３３に記載のＰＮＡ分子。【化４】
【請求項３５】請求項１〜６のいずれかに記載の方法により同定可能な遺
伝子断片。
【請求項３６】ストリンジェントな条件下で請求項３１に記載のＰＮＡ配
列にハイブリダイズする請求項３５に記載の遺伝子断片。
【請求項３７】微生物の増殖を阻害することのできる化合物の同定におい
て請求項１〜６のいずれかに記載の方法に従って同定可能な遺伝子標的の使用。