CN114096554A - 肽及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在侧链上具有氟烷基的肽。本发明为含有氟烷基的肽的制造方法，其中，使通式(6‑2)或(6‑4)(*表示标有*的不对称碳原子的绝对构型为S或R，Rf为被至少2个氟原子取代的、任选还被除氟原子以外的卤原子取代的C1‑30烷基(在该C1‑30烷基为C2‑30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子)，R2为氨基的保护基团)所示的化合物与羧基受保护的含氟氨基酸、羧基受保护的氨基酸、C末端受保护的含氟肽或C末端受保护的肽缩合。
Description
技术领域
本发明涉及包含在侧链上导入了氟烷基的氨基酸残基的肽及其制造方法。
本申请基于2019年7月2日在日本申请的特愿2019-124016号和2019年11月20日在日本申请的特愿2019-209908号主张优先权，将其内容援用至此。
背景技术
抗体药物、肽药物、核酸药物等具有对靶分子的特异性高、副作用少这样的优点。然而，均存在难以到达存在于细胞内的靶分子这样的问题。为了解决该问题，研究了各种方法。其中，细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides:CPP)很有前景。作为CPP，可列举出源自HIV病毒的TAT蛋白质的肽(专利文献1)、polyArg序列的肽(专利文献2)作为代表例。使其与药用肽结合，能将药用肽输送至细胞内(例如，专利文献3、非专利文献1)。
另一方面，报道了含氟氨基酸显示出特异性的生理活性，含氟氨基酸已备受关注。例如报道了：3,3,3-三氟丙氨酸及其衍生物作为吡哆醛酶的自杀性抑制剂(suicideinhibitor)发挥作用(非专利文献2)。另外报道了：革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)和革兰氏阳性菌嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的丙氨酸消旋酶被3,3,3-三氟丙氨酸灭活(非专利文献3)。期待含氟氨基酸和含有其的肽作为生理活性物质用于医药领域中。
已知：具有多氟结构的化合物在生物体内稳定且毒性低、且在向细胞内的摄取及从内涵体(endosome)脱离方面优异(非专利文献4)。报道了：利用该性质，能够将使用侧链的氨基被全氟酰化的赖氨酸作为构成氨基酸的肽树枝状大分子用于基因的递送(非专利文献5)。然而，由于为树枝状大分子，因此无法如CPP那样形成与作为药用活性肽、核酸、抗体药物的蛋白质结合的杂合体(hybrid)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第6,316,003号说明书
专利文献2：美国专利第6,306,993号说明书
专利文献3：国际公开第2008/089491号
非专利文献
非专利文献1：Miyaji et.al.,Drug Metabolism and Disposition,2011,vol.39,p.1946-1953.
非专利文献2：Sakai et al.,Tetrahedron,1996,vol.52(1),p.233-244.
非专利文献3：Faraci and Walsh,Biochemistry,1989,vol.28(2),p.431-437.
非专利文献4：Zhang et al.,MRS Communications,2018,vol.8,p.303-313.
非专利文献5：Cai et al.,ACS Applied Materials and Interfaces,2016,vol.8,p.5821-5832.
发明内容
发明要解决的问题
专利文献1等中记载的CPP存在向细胞内的输送效率、在生物体内被肽酶分解等各种问题。
本发明的目的在于，提供包含在侧链上导入了氟烷基的氨基酸残基的肽及其制造方法。
用于解决问题的方案
本发明人等制造了包含在侧链上导入了氟烷基的氨基酸残基的肽，发现该肽的细胞膜穿透性优异，并完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种含有氟烷基的肽的制造方法，其中，使下述通式(6-2)或(6-4)所示的化合物与羧基受保护的含氟氨基酸、羧基受保护的氨基酸、C末端受保护的含氟肽或C末端受保护的肽缩合，
式中，星号表示标有星号的不对称碳原子的绝对构型为S或R，
Rf为被至少2个氟原子取代的、任选还被除氟原子以外的卤原子取代的C1-30烷基，在该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子，
R2为氨基的保护基团。
[2]一种含有氟烷基的肽的制造方法，其中，使下述通式(6-1)或(6-3)所示的化合物与氨基受保护的含氟氨基酸、氨基受保护的氨基酸、N末端受保护的含氟肽或N末端受保护的肽缩合，
式中，星号表示标有星号的不对称碳原子的绝对构型为S或R，
Rf为被至少2个氟原子取代的、任选还被除氟原子以外的卤原子取代的C1-30烷基，在该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子，
R1为选自下述通式(p-1)所示的基团、2-(9,10-二氧代)蒽基甲基、苄基氧基甲基和苯甲酰甲基中的保护基团，
式中，R3为任选被取代的C6-14芳基，R4和R5各自独立地为氢原子或任选被取代的C6-14芳基，黑圆点表示原子键。
[3]一种含有氟烷基的肽的制造方法，其中，使下述通式(7)或(7-1)所示的化合物
在用保护基团保护氨基后，与羧基受保护的含氟氨基酸、羧基受保护的氨基酸、C末端受保护的含氟肽或C末端受保护的肽缩合，或者，
在用保护基团保护羧基后，与氨基受保护的含氟氨基酸、氨基受保护的氨基酸、N末端受保护的含氟肽或N末端受保护的肽缩合，
式中，星号表示标有星号的不对称碳原子的绝对构型为S或R，
Rf为被至少2个氟原子取代的、任选还被除氟原子以外的卤原子取代的C1-30烷基，在该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子。
[4]根据前述[1]～[3]中任一项的含有氟烷基的肽的制造方法，其中，进而将所制造的含有氟烷基的肽的氨基或羧基的保护基团脱保护。
[5]一种肽，其是2个以上的氨基酸通过肽键结合而成的肽，
构成该肽的氨基酸残基中的至少1个在侧链上具有被至少2个氟原子取代的C1-30烷基，在该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子。
[6]根据前述[5]的肽，其中，前述被至少2个氟原子取代的C1-30烷基任选还被除氟原子以外的卤原子取代。
[7]根据前述[5]或[6]的肽，其中，具有前述被至少2个氟原子取代的C1-30烷基的侧链为下述通式(f-1)或(f-2)所示的基团，
式中，RfP表示包含至少2个以上的氟原子的全卤化C1-10烷基，在该C1-10烷基的碳原子为2个以上时，任选在碳原子之间具有醚键性的氧原子，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数，黑圆点表示原子键。
[8]根据前述[5]～[7]中任一项的肽，其中，C末端或N末端任选被保护基团保护。
[9]根据前述[5]～[8]中任一项的肽，其为下述通式(101)或(102)所示的三肽，
式中，RfP表示包含至少2个以上的氟原子的全卤化C1-10烷基，在该C1-10烷基的碳原子为2个以上时，任选在碳原子之间具有醚键性的氧原子，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数，R11和R12各自独立地为C1-6烷基或苄基，X为9-芴基甲氧基羰基或叔丁氧羰基，Z为C1-6烷氧基。
[10]根据前述[5]～[9]中任一项的肽，其具有细胞膜穿透性。
发明的效果
根据本发明的制造方法，能够制造在侧链上导入了氟烷基的肽。
另外，本发明的肽由于在侧链上导入了氟烷基，因此细胞膜穿透性优异。因此，可期待该肽作为生理活性物质用于医药领域中。
附图说明
图1是示出试验例1中用肽荧光缀合物1(Alexa-Ala-RFAA-Phe-OMe)、肽荧光缀合物3(Alexa-Ala-Nle-Phe-OMe)或肽荧光缀合物4(Alexa-Ala-Ala-Phe-OMe)处理的HeLa细胞的流式细胞仪的结果的图。
图2是示出在试验例2中用肽荧光缀合物1(Alexa-Ala-RFAA-Phe-OMe)、肽荧光缀合物2(Alexa-Ala-RFAA(C8)-Phe-OMe)、肽荧光缀合物3(Alexa-Ala-Nle-Phe-OMe)或肽荧光缀合物4(Alexa-Ala-Ala-Phe-OMe)处理的HeLa细胞的流式细胞仪的结果的图。
具体实施方式
本发明和本申请说明书中，“含氟氨基酸”是指侧链含有至少2个氟原子的氨基酸。“含氟肽”是指具有在侧链上含有至少2个氟原子的氨基酸的肽。
本发明和本申请说明书中，“Cp1-p2”(p1和p2为满足p1<p2的正整数)是指碳数为p1～p2的基团。
本发明和本申请说明书中，“C1-10烷基”为碳数1～10的烷基，可以为直链或支链。“C2-10烷基”为碳数2～10的烷基，可以为直链或支链。作为C1-10烷基的例子，可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。
本发明和本申请说明书中，“C1-30烷基”为碳数1～30的烷基，可以为直链或支链。“C2-30烷基”为碳数2～30的烷基，可以为直链或支链。作为C1-30烷基的例子，可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。
本发明和本申请说明书中，“C1-6烷基”为碳数1～6的烷基，可以为直链或支链。作为C1-6烷基的例子，可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基等。
本发明和本申请说明书中，“C6-14芳基”为碳数6～14的芳香族烃基，特别优选C6-12芳基。作为C6-14芳基的例子，可列举出苯基、萘基、蒽基、9-芴基等，特别优选苯基。
本发明和本申请说明书中，“任选被取代的C6-14芳基”是与C6-14芳基的碳原子键合的氢原子的1个或多个、优选为1～3个被其它官能团取代的基团。具有2个以上的取代基时，取代基彼此可以互为相同种类，也可以为不同种类。作为该取代基，可列举出硝基、卤原子(氟原子、氯原子、溴原子或碘原子)、C1-6烷基、C1-6烷氧基和亚甲基二氧基(-O-CH2-O-)等。作为“任选被取代的C6-14芳基”的例子，可列举出苯基、萘基、蒽基、4-硝基苯基、4-甲氧基苯基、2,4-二甲氧基苯基、3,4-二甲氧基苯基、4-甲苯基、2,6-二甲苯基、3-氯苯基、1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基等。
本发明和本申请说明书中，“C6-14芳基-C1-6烷基”是C1-6烷基的碳原子上所键合的1个氢原子被C6-14芳基取代的基团。作为C6-14芳基-C1-6烷基中的C6-14芳基，可以示例出苯基、萘基、蒽基、9-芴基等，特别优选苯基或9-芴基。作为C6-14芳基-C1-6烷基中的C1-6烷基，优选C1-4烷基。作为C6-14芳基-C1-6烷基的例子，可列举出苄基、二苯基甲基、三苯基甲基、2-苯基乙基、9-蒽基甲基、9-芴基甲基等。
本发明和本申请说明书中，“卤原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。“除氟原子以外的卤原子”是指氯原子、溴原子或碘原子。作为“除氟原子以外的卤原子”的例子，优选氯原子或溴原子，特别优选氯原子。
本发明和本申请说明书中，“C1-6烷氧基”是指碳数1～6的C1-6烷基的键合末端键合有氧原子的基团。C1-6烷氧基可以为直链或支链。作为C1-6烷氧基的例子，可列举出甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
本发明和本申请说明书中，“醚键性的氧原子”是连接碳原子间的氧原子，不包括氧原子彼此串联连接的氧原子。碳数Nc(Nc为2以上的整数)的烷基可以具有的醚键性的氧原子最多为Nc-1个。
另外，以下，“化合物n”是指式(n)所示的化合物。
<含有氟烷基的氨基酸的合成反应>
作为在侧链上导入了氟烷基的氨基酸的含有氟烷基的氨基酸例如可以通过下述的合成反应而制造。
Rf为C1-30烷基中与碳原子键合的氢原子的至少2个被氟原子取代的基团，与碳原子键合的1个以上的氢原子任选还被除氟原子以外的卤原子取代。此处，作为Rf的C1-30烷基，优选C1-20烷基，更优选C1-10烷基，进一步优选C2-10烷基，更进一步优选C2-8烷基。该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子。Rf中被氟原子取代的氢原子的数目只要为2个以上就没有特别限定，例如，优选3个以上，更优选6个以上，进一步优选7个以上。
作为Rf的例子，可列举出三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基、全氟癸基、二氟甲基、1,1-二氟乙基、2,2-二氟乙基、1,1,2,2-四氟乙基、1,1,2,2,3,3-六氟丙基、1,1,2,3,3,3-六氟丙基、1,1,2,2,3,3-六氟己基、1,1,2,2,3,3-六氟辛基、1,1,2,2,3,3-六氟癸基、1,1,2,2,3,3-六氟十八烷基、1,1,2,2,3,3-六氟二十六烷基等。
Rf为碳数2的基团时，作为化合物2中的Rf，与1,1,1-三氟乙基(CF3-CH2-)相比，优选如五氟乙基那样与碳原子键合的氢原子的至少4个以上被氟原子取代的基团。另外，Rf为碳数3的基团时，作为化合物2中的Rf，优选直链状的基团，为支链状的基团时，与如1,1,1,3,3,3-六氟丙烷-2-基((CF3)2-CH-)那样具有2个三氟甲基的基团相比，优选三氟甲基为0个或1个的基团。Rf为碳数4的基团时，作为化合物2中的Rf，优选直链状的基团，为支链状的基团时，优选与构成亚烷基部分的碳原子键合的氢原子被氟原子取代的基团或完全氟化的基团。
作为Rf，具体而言，优选后述的通式(f-1)或(f-2)所示的基团。
R1为羧基的保护基团，具体而言，为选自下述通式(p-1)所示的基团、2-(9,10-二氧代)蒽基甲基、苄基氧基甲基和苯甲酰甲基中的保护基团。通式(p-1)中，R3为任选被取代的C6-14芳基，R4和R5各自独立地为氢原子或任选被取代的C6-14芳基。另外，黑圆点表示原子键。
作为R1所示的羧基的保护基团，可列举出苄基、二苯基甲基、三苯基甲基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、2,4-二甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、4-甲基苄基、2,6-二甲基苄基、3-氯苄基、9-蒽基甲基、胡椒基、2-(9,10-二氧代)蒽基甲基、苄基氧基甲基、苯甲酰甲基等。从能够在温和的条件下脱保护的方面考虑，R1优选为苄基、三苯基甲基，更优选为苄基。
该制造方法具有如下优点：通过使用苄基、三苯基甲基等芳烷基保护基团作为羧基的保护基团R1，从而能在温和的条件下将R1脱保护，能够在不使氨基酸的官能团分解的情况下进行含氟氨基酸的合成、含氟肽的合成。
R6为甲硅烷基保护基团。作为R6，可列举出三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)等。R6优选为三甲基甲硅烷基(TMS)。
R2为氨基的保护基团。作为R2，若为肽合成中使用的氨基的保护基团，则没有特别限定。作为氨基的保护基团，可列举出叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、苄基氧基羰基(Cbz)、烯丙基氧基羰基(Alloc)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)等氨基甲酸酯系保护基团。从能够在温和的条件下脱保护的方面考虑，R2优选为叔丁氧羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
[工序1]
通过在金属氟化物的存在下使化合物2和化合物8反应，从而可以得到化合物2-2。作为通式(8)的Rf-R6所示的化合物8能够由容易获得的Rf-I(氟烷基碘)通过1个工序合成，能导入的Rf基团的范围广。
作为金属氟化物，可以使用氟化铯、氟化锂、氟化钠等碱金属氟化物，优选氟化铯。
反应可以在对反应而言为惰性的溶剂中进行。作为溶剂，可列举出四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、乙腈、苯、甲苯、乙醚、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等惰性溶剂，优选四氢呋喃。
化合物8的量相对于1摩尔的化合物2优选0.5～10摩尔。金属氟化物的量相对于1摩尔的化合物2优选0.01～2摩尔。工序1的反应优选在10℃以下的温度下进行。通过在10℃以下的温度下进行反应，从而能够以高收率制造化合物2-2。反应温度优选为-78℃～10℃、更优选为-50℃～-10℃、特别优选为-40℃～-20℃。反应时间优选为1～48小时，更优选为6～36小时。
化合物2可以通过利用公知的方法使草酸二酯化而制造，或者也可以使用市售品。
[工序1-1]
工序1的反应中，有时得到化合物2-1(羟基的一者被R6保护的化合物)、或化合物2-2与化合物2-1的混合物。在此情况下，通过对化合物2-1的甲硅烷基保护基团R6进行脱保护，从而可以得到化合物2-2。
工序1-1的反应可以通过与工序1同样的方法进行。
[工序1-2]
通过对化合物2-1的甲硅烷基保护基团R6进行脱保护，从而可以得到化合物2-2。
脱保护可以在四丁基氟化铵(TBAF)、氟化铯、氢氟酸盐等氟化物盐或盐酸、乙酸、对甲苯磺酸等酸的存在下进行。
反应可以在对反应而言为惰性的溶剂中进行。作为溶剂，可列举出四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈、苯、甲苯、乙醚、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等惰性溶剂，优选四氢呋喃。优选添加乙酸来进行。
氟化物盐的量相对于1摩尔的化合物2-1(化合物2-2与化合物2-1的混合物的情况下，相对于混合物1摩尔)优选0.1～10摩尔。酸的量相对于1摩尔的化合物2-1(化合物2-2与化合物2-1的混合物的情况下，相对于混合物1摩尔)优选0.1～10摩尔。工序1-2的反应优选在50℃以下的温度下进行。通过在50℃以下的温度进行反应，从而能够以高收率制造化合物2-2。反应温度优选为-80℃～50℃、更优选为-40℃～30℃、特别优选为-20℃～30℃。反应时间优选为1～48小时，更优选为6～36小时。
[工序2]
通过使化合物2-2供于脱水反应，从而可以得到化合物3。
脱水反应可以在五氧化二磷、浓硫酸、氯化钙、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钙、分子筛(合成沸石)、硅胶等脱水剂的存在下进行。作为脱水剂，优选五氧化二磷。脱水剂的量相对于化合物2-2的100重量％优选10～100重量％。脱水反应可以通过在脱水剂的存在下将化合物2-2蒸馏而进行。蒸馏优选在30℃～150℃的温度下进行。蒸馏温度过高时，化合物3有可能分解。蒸馏温度过低时，无法将化合物3冷凝，回收率有可能降低。蒸馏可以在减压、常压、加压的任意压力下实施，可以进行适宜确定以使化合物3的沸点在上述的优选的温度范围内。压力优选为0.1mmHg至5个大气压(3800mmHg)。
[工序3]
通过使化合物3与化合物9或化合物10反应，从而可以得到化合物4。
通式(9)中，如前所述，R2为氨基的保护基团。R7、R8和R9各自独立地为C6-14芳基。作为R7、R8或R9所示的C6-14芳基，可列举出苯基、萘基等。优选R7、R8和R9分别为苯基。
反应可以在对反应而言为惰性的溶剂中进行。作为溶剂，可列举出乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈、苯、甲苯、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等惰性溶剂，优选乙醚。
化合物9或化合物10的量相对于1摩尔的化合物3优选0.5～10摩尔。反应温度优选为-78℃～100℃、更优选为0℃～40℃。反应时间优选为1分钟～24小时，更优选为10分钟～4小时。
适合的方式中，通过使用叔丁氧羰基、9-芴基甲氧基羰基等氨基甲酸酯系保护基团作为氨基的保护基团R2，从而可以在温和的条件下将R2脱保护，能够在抑制化合物的分解、外消旋化的同时进行含氟氨基酸的合成。
[工序4]
通过使化合物4供于还原反应，从而可以得到化合物5。
还原反应可以利用使用还原剂的方法或在金属催化剂的存在下还原的方法来进行。
(1)使用还原剂的方法
作为还原剂，可以使用硼氢化钠、硼氢化锌、氰基硼氢化钠、三乙基硼氢化锂、三(仲丁基)硼氢化锂、三(仲丁基)硼氢化钾、硼氢化锂、三乙酰氧基硼氢化钠等硼氢化物试剂。作为还原剂，优选硼氢化钠或硼氢化锌，更优选硼氢化钠。还原剂的量相对于1摩尔的化合物4优选0.5～10摩尔。
反应可以在对反应而言为惰性的溶剂中进行。作为溶剂，可列举出乙醚、四氢呋喃、氢氯氟烃(HCFC)(例如，Asahiklin(注册商标)AK-225(3,3-二氯-1,1,1,2,2-五氟丙烷和1,3-二氯-1,1,2,2,3-五氟丙烷的混合物、AGC株式会社))、二氯甲烷、乙腈、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等惰性溶剂，优选乙醚。
反应温度优选为-78℃～100℃、更优选为-10℃～40℃。反应时间优选为1～48小时，更优选为6～36小时。
(2)在金属催化剂的存在下还原的方法
作为金属催化剂，可列举出钯催化剂(例如，钯碳、氢氧化钯、Pearlman’s催化剂、林德拉催化剂、硅胶负载钯催化剂、氧化铝负载钯催化剂、氧化钯)、镍催化剂(例如，雷尼镍)、铂催化剂(例如，铂碳、氧化铂、硅胶负载铂催化剂、氧化铝负载铂催化剂)、铑催化剂(例如，铑碳、氧化铝负载铑催化剂、氧化铑)、钌催化剂(例如，钌碳、氧化铝负载钌催化剂、氧化钌)、钴催化剂(例如，雷尼钴)等，优选钯催化剂。金属催化剂的量相对于1摩尔的化合物4优选0.0001～0.1摩尔，更优选0.0005～0.02摩尔。
反应可以在对反应而言为惰性的溶剂中进行。作为溶剂，可列举出甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等惰性溶剂。
还原反应在氢气的存在下进行。还原反应可以在常压进行，也可以在加压下进行。氢气的压力优选为0.5个大气压～10个大气压。反应温度优选为0℃～100℃、更优选为10℃～50℃。反应时间优选为1～48小时，更优选为6～36小时。
[工序5-1]
通过对化合物5的保护基团R2进行脱保护，从而可以得到化合物6-1。
脱保护可以根据保护基团R2的种类进行。
R2为Boc基团时，可以在酸性条件下进行脱保护。作为所使用的酸，可列举出三氟乙酸(TFA)、盐酸等。酸的量相对于1摩尔的化合物5优选1～1000摩尔。
反应可以在对反应而言为惰性的溶剂中进行。作为溶剂，可列举出乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈、苯、甲苯、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等惰性溶剂，优选二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺。也可以使用酸作为溶剂。作为溶剂，可列举出盐酸、乙酸、三氟乙酸等无机酸、有机酸，优选三氟乙酸。反应温度优选为-78℃～50℃、更优选为0℃～40℃。反应时间优选为1～48小时，更优选为6～36小时。
R2为Fmoc基团时，可以在碱性条件下进行脱保护。作为所使用的碱，可列举出哌啶、吗啉、吡咯烷等仲胺。碱的量相对于1摩尔的化合物5优选1～100摩尔。
反应可以在对反应而言为惰性的溶剂中进行。作为溶剂，可列举出乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈、苯、甲苯、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等惰性溶剂。反应温度优选为-20℃～80℃、更优选为0℃～40℃。反应时间优选为1分钟～24小时，更优选为5分钟～2小时。
[工序6-1]
通过对化合物6-1的保护基团R1进行脱保护，从而可以得到化合物7。
脱保护可以根据保护基团R1的种类来进行。R1为苄基、三苯基甲基、9-蒽基甲基、胡椒基、2-(9,10-二氧代)蒽基甲基、苄基氧基甲基、苯甲酰甲基时，可以利用在金属催化剂的存在下还原的方法进行脱保护。还原反应可以利用与工序4的在金属催化剂的存在下还原的方法同样的方法来进行。
[工序5-2]
通过对化合物5的保护基团R1进行脱保护，从而可以得到化合物6-2。脱保护可以利用与工序6-1同样的方法进行。
[工序6-2]
通过对化合物6-2的保护基团R2进行脱保护，从而可以得到化合物7。脱保护可以利用与工序5-1同样的方法进行。
通过进行通式(4)所示的亚胺(化合物4)的不对称还原，从而能够合成光学活性含氟氨基酸(含有氟烷基的化合物)。下述反应式中，星号(*)表示标有星号的不对称碳原子的绝对构型为S或R。另外，Rf、R1和R2如前述所定义。
该制造方法中，通过使用苄基、三苯基甲基等芳烷基保护基团作为羧基的保护基团R1，从而能在温和的条件下将R1脱保护，能够在保持光学活性的状态下进行含氟氨基酸的合成、含氟肽的合成，在这方面是有利的。
[工序7]
通过使化合物4供于不对称还原反应，从而可以得到化合物5-1。
不对称还原反应可以通过在不对称还原催化剂的存在下将化合物4还原而进行。
作为不对称还原催化剂，可以使用不对称配体与过渡金属配位的过渡金属络合物。作为过渡金属，可列举出钯、铑、钌、铱、镍、钴、铂、铁等。作为过渡金属络合物，可列举出钯络合物、铑络合物、钌络合物、铱络合物、镍络合物等。
作为不对称配体，可列举出dpen(1,2-二苯基乙二胺)、daipen(1,1-二(4-茴香基)-2-异丙基-1,2-乙二胺)、光学活性膦配体。作为光学活性膦配体，可列举出2,2’-双(二苯基膦基)-1,1’-联萘(BINAP)、2,2’-双(二苯基膦基)-5,5’,6,6’,7,7’,8,8’-八氢-1,1’-联萘(H8-BINAP)、2,2’-双(二-对甲苯基膦基)-1,1’-联萘(Tol-BINAP)、2,2’-双[双(3,5-二甲苯基)膦基]-1,1’-联萘(Xyl-BINAP)、2,2’-双[双(3,5-二叔丁基-4-甲氧基苯基)膦基]-1,1’-联萘(DTBM-BINAP)、1,2-双(茴香基膦基)乙烷(DIPAMP)、2,3-双(二苯基膦基)丁烷(CHIRAPHOS)、1-环己基-1,2-双(二苯基膦基)乙烷(CYCPHOS)、1,2-双(二苯基膦基)丙烷(PROPHOS)、2,3-双(二苯基膦基)-5-降冰片烯(NORPHOS)、2,3-O-亚异丙基-2,3-二羟基-1,4-双(二苯基膦基)丁烷(DIOP)、1-[1’,2-双(二苯基膦基)二茂铁基]乙胺(BPPFA)、1-[1’,2-双(二苯基膦基)二茂铁基]乙醇(BPPFOH)、2,4-双-(二苯基膦基)戊烷(SKEWPHOS)、1,2-双(取代磷杂环戊基)苯(DuPHOS)、5,5’-双(二苯基膦基)-4,4’-双-1,3-苯并间二氧杂环戊烯(SEGPHOS)、5,5’-双[二(3,5-二甲苯基)膦基]-4,4’-双-1,3-苯并间二氧杂环戊烯(DM-SEGPHOS)、5,5’-双[双(3,5-二叔丁基-4-甲氧基苯基)膦基]-4,4’-双-1,3-苯并间二氧杂环戊烯(DTBM-SEGPHOS)、1-[2-(2取代膦基)二茂铁基]乙基-2取代膦(Josiphos)、1-[2-(2’-2取代膦基苯基)二茂铁基]乙基-2取代膦(Walphos)等。
不对称还原催化剂的量相对于1摩尔的化合物4优选0.0001～0.1摩尔，更优选0.0005～0.02摩尔。
反应可以在对反应而言为惰性的溶剂中进行。作为溶剂，可列举出甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等惰性溶剂。
还原反应在氢气的存在下进行。还原反应可以在常压进行，也可以在加压下进行。氢气的压力优选为0.5个大气压～10个大气压。反应温度优选为0℃～100℃、更优选为10℃～50℃。反应时间优选为1～48小时，更优选为6～36小时。
[工序8-1]
通过对化合物5-1的保护基团R2进行脱保护，从而可以得到化合物6-3。脱保护可以利用与工序5-1同样的方法进行。
[工序9-1]
通过对化合物6-3的保护基团R1进行脱保护，从而可以得到化合物7-1。脱保护可以利用与工序6-1同样的方法进行。
[工序8-2]
通过对化合物5-1的保护基团R1进行脱保护，从而可以得到化合物6-4。脱保护可以利用与工序6-1同样的方法进行。
[工序9-2]
通过对化合物6-4的保护基团R2进行脱保护，从而可以得到化合物7-1。脱保护可以利用与工序5-1同样的方法进行。
光学活性含氟氨基酸(含有氟烷基的化合物)的合成也可以通过下述反应来进行。下述反应式中，星号表示标有星号的不对称碳原子的绝对构型为S或R。另外，Rf、R1和R2如前述所定义。
[工序10-1]
通过对化合物6-1进行光学拆分，从而可以得到化合物6-3。
光学拆分可以利用公知的方法进行。例如可以利用使用手性柱的方法、基于结晶化的方法、非对映体法等来进行。
(1)使用手性柱的方法
可以通过使用手性柱的液相色谱、超临界流体色谱(SFC)将外消旋体拆分成光学活性体。手性柱可以使用CHIRALPAK(注册商标)(Daicel Corporation)、CHIRALCEL(注册商标)(Daicel Corporation)等。
(2)基于结晶化的方法
形成外消旋体与光学活性胺或光学活性酸的盐，衍生为结晶性的非对映异构体盐进行分级结晶。通过重复重结晶，从而可以得到单一的非对映异构体盐。根据需要将非对映体盐中和，而得到游离体的光学活性体。作为光学活性胺，可列举出马钱子碱(brucine)、辛可尼丁(cinchonidine)、辛可宁、1-苯乙胺等。作为光学活性酸，可列举出樟脑磺酸、酒石酸、扁桃酸等。
(3)非对映体法
使外消旋体与光学活性试剂反应，得到非对映体的混合物，通过对其进行分级结晶、色谱，从而将单一的非对映体分离。从得到的单一的非对映体中去除光学活性试剂部分，得到目标光学异构体。
[工序11-1]
通过对化合物6-3的保护基团R1进行脱保护，从而可以得到化合物7-1。脱保护可以利用与工序6-1同样的方法进行。
[工序10-2]
通过对化合物6-2进行光学拆分，从而可以得到化合物6-4。光学拆分可以利用与工序10-1同样的方法进行。
[工序11-2]
通过对化合物6-4的保护基团R2进行脱保护，从而可以得到化合物7-1。脱保护可以利用与工序5-1同样的方法进行。
[工序12]
通过对化合物7进行光学拆分，从而可以得到化合物7-1。光学拆分可以利用与工序10-1同样的方法进行。
<含有氟烷基的肽的制造方法>
含有氟烷基的肽可以将侧链导入了氟烷基的氨基酸作为原料而制造。例如，将化合物6-1、化合物6-2、化合物6-3或化合物6-4作为原料，由此能够制造含有氟烷基的肽。
例如，使化合物6-2或6-4与羧基受保护的含氟氨基酸、羧基受保护的氨基酸、C末端受保护的含氟肽或C末端受保护的肽缩合，由此能够制造含有氟烷基的肽。另外，使化合物6-1或化合物6-3与氨基受保护的含氟氨基酸、氨基受保护的氨基酸、N末端受保护的含氟肽或N末端受保护的肽缩合，由此能够制造含有氟烷基的肽。
另外，使化合物7或化合物7-1的氨基或羧基受保护后，同样地能够制造含有氟烷基的肽。具体而言，氨基被保护基团保护后，与羧基受保护的含氟氨基酸、羧基受保护的氨基酸、C末端受保护的含氟肽或C末端受保护的肽缩合。另外，也可以在用保护基团保护羧基后，与氨基受保护的含氟氨基酸、氨基受保护的氨基酸、N末端受保护的含氟肽或N末端受保护的肽缩合。
肽的制造可以利用通常的肽合成法来进行。例如，可以利用肽固相合成法来进行。含有氟烷基的肽可以通过将侧链导入了氟烷基的氨基酸作为原料，使用肽自动合成机来容易地合成。
可以通过使氨基受保护的氨基酸跟C末端与固相结合的氨基酸依次缩合，使肽从固相脱离，由此能够制造肽。氨基酸原料优选使用氨基被Boc基团或Fmoc基团保护者。优选使用氨基酸原料的侧链官能团被保护基团保护者。作为侧链官能团的保护基团，可列举出Boc基团、三苯基甲基、苄基、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)基团等。
作为形成肽键的缩合剂，例如可列举出N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(WSC)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(pyBOP)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐等。另外，也可以以适合的比例将N-羟基苯并三唑(HOBt)和上述缩合剂混合而使用。
肽键的形成中，可以使用活化羧基末端的方法，作为其活化剂，例如可列举出N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯、五氟苯酯等。作为形成肽键时所使用的碱，例如可列举出三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)等。作为肽键形成反应中使用的溶剂，例如可列举出氯仿、二氯甲烷、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜等。
作为肽或氨基酸的氨基末端氨基的保护基团的Boc基团和Fmoc基团可以分别通过三氟乙酸或哌啶而去除。肽的氨基酸残基的侧链官能团的保护基团例如可以通过三氟乙酸、氟化氢(HF)、三氟甲磺酸等而去除。
另外，肽固相合成法中，作为使在肽或氨基酸残基的侧链官能团上带有保护基团的肽从肽固相合成树脂中脱离的方法，例如可以使用TFA。肽从肽固相树脂上的脱离、及氨基酸残基的侧链官能团的保护基团的脱离也可以分别在同一反应体系内同时进行。或者也可以分别独立地进行。作为肽固相合成用的肽固相合成树脂，例如可以使用4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸-二苯甲胺-聚苯乙烯树脂、对苄氧基苄醇-聚苯乙烯树脂、肟树脂等通常市售者。
目标肽或其中间体例如可以利用离子色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、正相色谱、重结晶、萃取、分级结晶化等各种方法进行分离、纯化。另外，如此得到的肽可以利用常规方法转化为各自的盐。
所制造的含有氟烷基的肽的氨基或羧基的保护基团也可以根据需要进行脱保护。脱保护可以根据保护基团的种类利用常规方法来进行。
<含有氟烷基的肽>
本发明的含有氟烷基的肽是由2个以上的氨基酸组成的肽，构成该肽的氨基酸残基中的至少1个在侧链上具有被至少2个氟原子取代的C1-30烷基。被至少2个氟原子取代的C1-30烷基任选还被除氟原子以外的卤原子取代。另外，在该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子。
作为本发明的含有氟烷基的肽，可列举出具有侧链为前述Rf的氨基酸残基的肽。构成该肽的氨基酸残基中的至少1个的侧链为Rf即可，也可以全部氨基酸残基的侧链为Rf。在一分子的肽中具有2个以上侧链为Rf的氨基酸残基时，这些多个Rf相互可以为相同种类，也可以为不同种类。另外，肽中，侧链为Rf的氨基酸残基可以存在于N末端，可以存在于C末端，也可以不存在于末端。
作为Rf，优选下述通式(f-1)或(f-2)所示的基团。此处，RfP表示包含至少2个以上的氟原子的全卤化C1-10烷基。RfP是C1-10烷基的全部氢原子被卤原子取代、这些卤原子中的至少2个以上为氟原子的基团。在RfP的碳数为2个以上时、即全卤化C2-10烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子。通式(f-2)中，2个RfP相互可以为相同种类的基团，也可以为不同种类的基团。
下述通式(f-1)或(f-2)中，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数。n1和n2为0时，均表示单键。即，n1为0时，通式(f-1)所示的基团为RfP-，n2为0时，通式(f-2)所示的基团为(RfP)2-CH-。
Rf为通式(f-1)所示的基团时，Rf优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n1为0～4的整数的基团，更优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n1为0～2的整数的基团，进一步优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基或全氟己基且n1为0～2的整数的基团(其中，n1为1、RfP为三氟甲基的基团除外)。
Rf为通式(f-2)所示的基团时，Rf优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n2为0～4的整数的基团，更优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基或全氟癸基且n2为0～2的整数的基团，进一步优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基或全氟己基且n2为0～2的整数的基团(其中，n2为0或1、RfP为三氟甲基的基团除外)。
作为Rf的例子，也可以为二氟甲基、1,1-二氟乙基、2,2-二氟乙基、1,1,2,2-四氟乙基、1,1,2,2,3,3-六氟丙基、1,1,2,3,3,3-六氟丙基等。
作为由2个以上的氨基酸组成的肽，优选由3个以上的氨基酸组成的肽。优选由2～40个氨基酸组成的肽，更优选由3～20个氨基酸组成的肽。
本发明的含有氟烷基的肽的C末端可以被R1所示的保护基团保护。R1优选为苄基。另外，本发明的含有氟烷基的肽的N末端可以被R2所示的氨基的保护基团保护。R2优选为Boc基团或Fmoc基团。
作为本发明的含有氟烷基的肽，例如可列举出下述通式(101)或(102)所示的三肽。通式(101)和(102)中，R11和R12各自独立地为C1-6烷基或苄基，优选各自独立地为甲基或苄基，特别优选R11为甲基、R12为苄基。X为Fmoc或Boc。Z为C1-6烷氧基，特别优选为甲氧基。
通式(101)和(102)中，RfP、n1和n2与通式(f-1)和(f-2)中同样。作为前述通式(101)或(102)所示的基团，优选RfP为全氟化C1-10烷基、n1或n2为0～4的整数，更优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基或全氟辛基且n1或n2为0～2的整数，进一步优选RfP为九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基或全氟辛基且n1或n2为0～2的整数。
氟烷基对细胞膜的亲和性高。因此，本发明的含有氟烷基的肽的细胞膜穿透性优异。另外，由于结构与天然肽有明显不同，因此不易被肽酶降解。利用这些性质，可期待本发明的含有氟烷基的肽作为生理活性物质用于医药领域中。例如，本发明的含有氟烷基的肽能够期待用作将药效成分输送至靶细胞的DDS载体。例如，通过以不损害其功能的方式在通过被摄入生物体内的靶细胞内而表现出某些生理活性的功能性肽上连接本发明的含有氟烷基的肽，由此能够改善该功能性肽在靶细胞中的摄取效率。另外，通过将表现出生理活性的功能性肽的疏水性氨基酸残基中的一部分侧链在不损害该功能性肽的功能的范围内置换为Rf、优选置换为前述通式(101)或(102)所示的基团，从而能够改善该功能性肽的细胞膜穿透性、在细胞内的停留时间。
实施例
以下通过实施例对本发明进行说明，但本发明不限定于这些实施例。
实施例、比较例的分析中使用的NMR装置为日本电子制JNM-ECZ400S(400MHz)，1HNMR中，将四甲基硅烷作为0PPM的基准值，19F NMR中，将C6F6作为-162PPM的基准值。
本申请说明书中，使用以下的简写。
Bn：苄基
Boc：叔丁氧羰基
All：烯丙基
Et2O：乙醚
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
THF：四氢呋喃
TMS：三甲基甲硅烷基
C4F9：1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基
C8F17：1,1,2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十七氟辛基
[制造例1]
由三甲基(九氟丁基)硅烷和草酸二苄酯合成了2-((叔丁氧羰基)氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酸。
[工序1]
在用烘箱干燥后的100mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，在氮气气氛下加入草酸二苄酯(5.41g,20.0mmol)、氟化铯(255mg,1.68mmol)和THF(54mL)并进行搅拌，冷却至-30℃后加入三甲基(九氟丁基)硅烷(4.50mL,20.2mmol)并在-30℃下持续搅拌24小时。在反应液中加入饱和氯化铵水溶液(30mL)，用乙酸乙酯(3×50mL)进行萃取。对于合并后的有机相，用硫酸钠干燥后进行过滤，对滤液进行减压蒸馏，得到2-(苄氧基)-3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-2-((三甲基甲硅烷基)氧基)己酸苄酯和3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-2,2-二羟基己酸苄酯的混合粗产物。将得到的粗产物直接用于接下来的工序而不进行纯化。
[工序1-2]
在用烘箱干燥后的100mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，在氮气气氛下加入工序1中得到的粗产物总量和四丁基氟化铵(TBAF)1mol/L THF溶液(10.5mL,10.5mmol)、乙酸(1mL)和THF(50mL)并在0℃下搅拌。然后，升温至室温并搅拌24小时后，加入饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)进行淬灭，用乙酸乙酯(3×50mL)进行萃取。对于合并后的有机相，用水(50mL)和饱和食盐水(50mL)清洗后，用硫酸钠干燥后进行过滤，减压馏去滤液，得到3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-2,2-二羟基己酸苄酯的粗产物。将得到的粗产物直接用于接下来的工序而不进行纯化。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39(brs,5H),5.37(s,2H).
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-80.79(brs,3F),-121.09(brs,2F),-121.24-121.26(m,2F),-126.12-126.21(m,2F).
[工序2]
在用烘箱干燥后的20mL容积的烧瓶中放入搅拌子，在氮气气氛下加入工序2中得到的粗产物总量和五氧化二磷(粗产物的22重量％)，进行减压蒸馏。收集在2mmHg、77℃下得到的馏分，以无色的液体形式得到3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-2-氧代己酸苄酯(从工序1至工序3为止的收率为73％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41(brs,5H),5.40(s,2H).
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-80.79(brs,3F),-117.78-117.850(t,2F,JF-F＝13Hz),-122.01(brs,2F),-125.58(brs,2F).
将工序1的温度变更为0℃，除此以外与工序1～工序2同样地以无色的液体形式得到3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-2-氧代己酸苄酯。从工序1至工序2为止的收率为69％。
[工序3]
在用烘箱干燥后的30mL容积的舒伦克烧瓶中放入搅拌子，在氮气气氛下加入3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟-2-氧代己酸苄酯(1g,2.6mmol)、三苯基膦基亚氨基甲酸叔丁酯(2.6mmol)和Et2O(10mL)。将反应液在室温下搅拌1小时后进行过滤，用Et2O(2×2mL)清洗滤出物。对合并的有机相进行减压蒸馏，得到2-((叔丁氧羰基)亚氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酸苄酯的粗产物。将得到的粗产物利用硅胶色谱(Et2O/己烷＝1/4)进行纯化，以无色液体形式得到2-((叔丁氧羰基)亚氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酸苄酯(收率87％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.410-7.352(m,5H),5.350(s,2H),1.504(s,9H).
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-80.76-80.78(t,3F,JF-F＝9Hz),-112.37(brs,2F),-121.0(brs,2F),-125.36(brs,2F).
[工序4]
在用烘箱干燥后的30mL容积的舒伦克烧瓶中放入搅拌子，在氮气气氛下将2-((叔丁氧羰基)亚氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酸苄酯(0.2g,0.42mmol)溶解于Et2O(15mL)中并在0℃下搅拌。在0℃下分3次加入硼氢化钠(0.46mmol)，然后，升温至室温并搅拌24小时。加入冰水进行淬灭，加入1mol/L的盐酸使pH小于7。用Et2O(2×10mL)萃取水相，对合并的有机相进行减压蒸馏，得到2-((叔丁氧羰基)氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酸苄酯的粗产物。将得到的粗产物利用硅胶色谱(乙酸乙酯/己烷＝1/4)进行纯化，以无色液体形式得到2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3，4，4，5，5，6，6，6-九氟己酸苄酯(收率61％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.40-7.33(m，5H)，5.41-5.39(d，2H，JH-H＝10Hz)，5.28-5.20(m，3H)，1.45(s，9H).
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ-80.86-80.89(t，3F，JF-F＝9Hz)，-115.36-118.55(m，2F)，-121.50-123.17(m，2F)，-125.00-126.77(m，2F).
代替Et2O和硼氢化钠，使用表1记载的溶剂和还原剂(当量)，进行与前述工序4同样的反应。将收率示于表1。表中，“AK225”为“Asahiklin(注册商标)AK-225”(3，3-二氯-1，1，1，2，2-五氟丙烷和1，3-二氯-1，1，2，2，3-五氟丙烷的混合物、AGC株式会社)。
[表1]
| 溶剂 | 还原剂(当量) | 收率(％) |
| Et<sub>2</sub>O | NaBH<sub>4</sub>(1.1) | 61 |
| THF | Zn(BH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(1.0) | 37 |
| AK225 | NaBH<sub>4</sub>(1.1) | 35 |
| THF | NaBH<sub>4</sub>(1.1) | 19 |
[工序5-2]
在用烘箱干燥后的25mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，加入2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3，4，4，5，5，6，6，6-九氟己酸苄酯(73.6mg，0.15mmol)、钯/碳(Pd5％、约55％水湿润品、20mg)、乙酸乙酯(1mL)和乙醇(7mL)，在常压的氢气气氛下、在室温下进行搅拌。在室温下搅拌24小时后，用硅藻土进行过滤，用乙醇(3×5mL)清洗滤出物，对合并的有机相进行减压蒸馏，得到2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3，4，4，5，5，6，6，6-九氟己酸的粗产物。将得到的粗产物利用硅胶色谱(乙酸乙酯/己烷＝1/1)进行纯化，以无色液体形式得到2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3，4，4，5，5，6，6，6-九氟己酸(收率86％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.72(br，1H)，5.49-5.47(d，2H，JH-H＝10Hz)，5.24-5.15(m,1H),1.45(s,9H).
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-80.30(brs,3F),-114.64-118.03(m,2F),-120.70-122.40(m,2F),-124.52-126.22(m,2F).
[工序5-1]
在用烘箱干燥后的25mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，在0℃下加入Boc-RFAA-OBn(376mg,0.78mmol)、4M HCl、1,4-二氧杂环己烷溶液(3mL)。在室温下搅拌18小时后加入饱和碳酸钠水溶液调节pH，使pH大于7，用乙酸乙酯进行萃取。用饱和食盐水清洗有机相并用硫酸钠进行干燥。将有机相过滤，对滤液进行减压蒸馏，以白色固体形式得到H-RFAA-OBn的盐酸盐(收率78％)。
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.31(brs,2H),6.81-6.77(m,5H),5.27(m,1H),3.71-3.67(m、2H).
19F NMR(376MHz,D2O)δ-80.38(t,3F),-118.29-121.00(m,2F),-121.00-123.80(m,2F),-126.12-128.12(m,2F).
以下，有时用三个字母表示氨基酸。例如，“Phe”为苯丙氨酸、“Gly”为甘氨酸。另外，肽表示为(N侧保护基团)-氨基酸三个字母缩写-(C侧保护基团)。“H-AA-OMe”是指N末端侧未保护、C末端侧为甲基酯。C末端侧未保护时，表示为“OH”而不是“OMe”。
[实施例1]
合成了具有九氟丁基的二肽。
在用烘箱干燥后的25mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，在室温下加入2-((叔丁氧羰基)氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酸(33.4mg,0.085mmol)、DIPEA(0.13mmol)、DCM(3mL)、L-苯丙氨酸甲酯(0.13mmol)和苯并三唑-1-醇·一水合物(0.085mmol)，冷却至0℃后加入BOP(0.085mmol)。在室温下搅拌24小时后，减压馏去溶剂，用乙酸乙酯稀释，用饱和柠檬酸水溶液、饱和碳酸钠水溶液和饱和食盐水清洗有机相并用硫酸钠进行干燥。将有机相过滤，对滤液进行减压蒸馏，得到Boc-RFAA-Phe-OMe的粗产物。利用硅胶色谱(乙酸乙酯/己烷＝1/4)将得到的粗产物纯化，分别以无色液体形式得到2种Boc-RFAA-Phe-OMe非对映体(2种非对映体合计收率为22％)。
非对映体A
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.31-7.25(m,5H),6.41-6.40(d,N-H,JH-H＝7Hz),5.48-5.46(d,1H,JH-H＝9Hz),4.99-4.91(m,1H),4.91-4.86(m,1H),3.75(s,3H),3.23-3.10(m,2H),1.47(s,9H).
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-80.98(t,3F,JF-F＝7Hz),-114.56-119.80(m,2F),-121.40-123.22(m,2F),-125.03-127.15(m,2F).
非对映体B
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30-7.07(m,5H),6.42-6.40(d,N-H,JH-H＝9Hz),5.51-5.48(d,1H,JH-H＝8Hz),5.00-4.95(m,1H),4.93-4.88(m,1H),3.74(s,3H),3.15-3.13(m,2H),1.44(s,9H).
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-80.77(t,3F,JF-F＝9Hz),-113.74-119.30(m,2F),-121.22-122.94(m,2F),-124.82-127.05(m,2F).
代替L-苯丙氨酸甲酯使用表2所示的氨基酸甲酯，进行同样的反应。将收率示于表2。表中，“DCM”表示二氯甲烷、“BOP”表示苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐、“EDC”表示1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
[表2]
| H-AA-OMe | 溶剂 | 缩合剂 | 收率(％) |
| Phe | DCM | BOP | 22 |
| Gly | DCM | EDC | 35 |
[实施例2]
将实施例1中合成的肽的N末端侧的保护基团脱保护。
在用烘箱干燥后的25mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，加入Boc-RFAA-Gly-OMe(21.2mg，0.05mmol)、DCM(1.5mL)和TFA(0.4mL)。在室温下搅拌24小时后，加入饱和碳酸钠水溶液调节pH，使pH大于7，用DCM进行萃取。用饱和食盐水清洗有机相并用硫酸钠进行干燥。将有机相过滤，对滤液进行减压蒸馏，得到H-RFAA-Gly-OMe的粗产物(收率66％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.08(brs，1H)，4.15-4.07(m，2H)，3.79(s，3H).
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ-80.71(t，3F，JF-F＝7Hz)，-115.13-119.94(m，2F)，-119.94-121.93(m，2F)，-125.02-126.82(m，2F).
[实施例3]
合成了具有九氟丁基的三肽。
在用烘箱干燥后的NMR试管中，在室温下加入H-RFAA-Gly-OMe(10.9mg,0.03mmol)、DCM(0.5mL)、DIPEA(0.13mmol)、Fmoc-Gly-OH(0.03mmol)和苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻盐(0.085mmol)。在室温下静置24小时后减压馏去溶剂，用乙酸乙酯稀释，用饱和柠檬酸水溶液、饱和碳酸钠水溶液和饱和食盐水清洗有机相并用硫酸钠进行干燥。将有机相过滤，对滤液进行减压蒸馏，得到Fmoc-Gly-RFAA-Gly-OMe的粗产物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78-7.27(m,8H),δ7.30(brs,1H),7.13(brs,1H),5.63-5.61(d,1H,JH-H＝7Hz),5.64-5.54(m,1H),4.42-4.41(d,2H,JH-H＝7Hz),4.24-4.20(m,1H),4.08-3.98(m,4H),3.74(s,3H).
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-80.78(t,3F,JF-F＝10Hz),-114.61-118.74(m,2F),-121.22-123.09(m,2F),-124.89-126.90(m,2F).
[实施例4]
合成了具有九氟丁基的三肽(Boc-Ala-RFAA-Phe-OMe)。
在25mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，另一方面加入Boc-RFAA-Phe-OMe非对映体A(DR>95,0.11mmol)和DCM(5mL)。将该反应混合物冷却至0℃后，添加TFA(1.25mL)，加热至室温。搅拌4小时后，添加碳酸氢钠水溶液使反应结束。用DCM萃取水相，对合并的有机相进行减压蒸馏，利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯：三乙胺＝2：1：1％)进行纯化，得到H-RFAA-Phe-OMe(33.9mg、收率70.0％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝1.77(br s,2H),3.10-3.14(m,2H),3.74(s,3H),3.93-3.99(dd,1H),4.90-4.95(dd,1H),6.81-6.83(d,NH),7.27(m,5H)
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ＝-126.2-125.7(m,2F),-121.2-119.7(m,2F),-120.5-114.4(m,2F),-80.7(t,3F)
在25mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，另一方面在3mL的DCM中添加Boc-Ala-OH(1.1当量)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt、1.1当量)、DIPEA(1.3当量)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并〔4,5-b〕吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU、1.1当量)和二肽(H-RFAA-Phe-OMe、dr>95：5,38μmol)，设为0℃。将该混合物加热至室温后，搅拌1.5小时。然后，添加HCl(1N)使反应结束。用HCl(1N)和DCM将反应液分液，对合并的有机相进行减压蒸馏，接着用乙酸乙酯进行稀释。用HCl(1N)、饱和NaHCO3水溶液和盐水清洗有机相，用Na2SO4进行干燥，使其蒸发而得到白色固体。利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯＝2：1)将粗混合物纯化，得到三肽(dr>95：5、18.2mg、收率75.1％)。
1H NMR(400MHz,Acetone d6)δ＝1.30(d,3H),1.38(s,9H),3.04-3.16(m,2H),3.66(s,3H),4.26-4.29(m,1H),4.68-4.77(m,1H),5.53-5.61(m,1H),6.23(d,N-H),7.19-7.29(m,5H),7.82(d,N-H),8.30(d,N-H).
19F NMR(376MHz,Acetone d6)δ＝-126.9-126.3(m,2F),-123.1-121.9(m,2F),-120.1-115.0(m,2F),-81.5(t,3F)
[实施例5]
合成了具有九氟丁基的三肽(H-Ala-RFAA-Phe-OMe)。
在25mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，另一方面加入Boc-RFAA-Phe-OMe非对映体A(DR>95,29μmol)和DCM(2mL)。将该反应混合物冷却至0℃后，添加TFA(0.4mL)，加热至室温。搅拌4小时后，添加碳酸氢钠水溶液使反应结束。用DCM萃取水相，对合并的有机相进行减压蒸馏，利用硅胶柱色谱(CHCl3：MeOH＝10：1)进行纯化，得到H-Ala-RFAA-Phe-OMe(dr>95、13.8mg、收率90.6％)。
1H NMR(400MHz,Acetone d6)δ＝1.16(d,3H),2.81(br s,2H),3.00-3.14(m,2H),3.67(s,3H),3.94-3.99(m,1H),4.68-4.74(m,1H),5.49-5.56(m,1H),7.19-7.27(m,5H),8.16(d,N-H),8.33(d,N-H).
19F NMR(376MHz,Acetone d6)δ＝-126.9-125.6(m,2F),-123.1-122.1(m,2F),-120.0-115.3(m,2F),-81.7(t,3F)
[实施例6]
将荧光物质Alexa Fluor 647融合在实施例5中合成的具有九氟丁基的三肽(H-Ala-RFAA-Phe-OMe)的N末端。
在1.5mL容积的黑色管中加入溶解于干燥DMSO(15μL)中的Alexa Fluor 647(250μg)、溶解于干燥DMSO(15μL)中的H-Ala-RFAA-Phe-OMe(1.5当量)和DIPEA(1.5当量)。将混合物在室温下持续搅拌一夜。利用反相色谱(乙腈/水/TFA＝30：70：0.1～95：5：0.1)将该混合物纯化，进行冷冻干燥，以蓝色固体形式得到荧光缀合物1(用荧光计计算，收率为32.3％)。需要说明的是，荧光使用Nano Drop(注册商标)分光光度计ND-1000并以发光波长＝650nm进行测定。
MALDI-TOF MS
[M]-：m/z计算值.基于C55H63F9N5O17S4 -1364.2964，实测值1364.7252
[实施例7]
合成了具有十七氟辛基的三肽(H-Ala-RFAA(C8)-Phe-OMe)。
依据已经报道的(Journal of Fluorine Chemistry,1984,vol.26,p.341-358)实施全氟烷基化反应。
通过升华(72℃、0.5mmHg)将得到的粗产物纯化。将得到的白色固体直接移至100mL容积的三颈圆底烧瓶中，用Et2O(10mL)溶解，在室温下与三苯基膦基亚氨基甲酸叔丁酯(5.5mmol)反应1小时。将粗产物过滤，将滤液蒸发。利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯＝10：1w/0.4％NEt3)将得到的白色固体纯化，得到α-亚氨基酯(311mg、3步收率：8.2％)。
1H NMR(400MHz、CDCl3)δ＝1.50(s,9H),5.36(s,2H),7.36-7.38(m,5H)
19F NMR(376MHz,CDCl3)δ＝-126.3(m,2F),-122.8(m,2F),-121.8-122.0(m,4F),-121.2(m,2F),-120.2(m,2F),-112.6(m,2F),-81.0(t,3F)
在25mL容积的双颈圆底烧瓶中放入搅拌子，加入α-亚氨基酯(311mg、0.47mmol)和THF(5mL)。在0℃下在该反应混合物中加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.59mmol)，接着在室温下搅拌24小时。将反应混合物直接蒸发，在水和DCM之间进行分配。对合并的有机相进行减压蒸馏，得到粗混合物。利用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷＝1：10)将粗混合物纯化，得到白色固体(Boc-RFAA(C8)-OBn)(收率49.6％)。
1H NMR(400MHz CDCl3)δ＝1.28(s,9H),5.07(s,2H),5.137(m,1H),7.18(m,5H)
19F NMR(376MHz CDCl3)δ＝-126.3(m,2F),-122.9(m,2F),-121.5-122.1(m,8F),-115.3-118.8(m,2F),-81.0(t,3F)
针对三肽的步骤与上述相同。由利用HPLC进行了纯化的0.23mmol的Boc-RFAA(C8)-OBn，与制造例1的工序5-2同样地得到Boc-RFAA(C8)-OH，接着与实施例1同样地由Boc-RFAA(C8)-OH得到Boc-RFAA(C8)-Pne-OMe，进而与实施例4同样地由Boc-RFAA(C8)-Pne-OMe得到46mg的三肽(H-Ala-RFAA(C8)-Phe-OMe)(总收率27.8％)。
ESI-MS
[M+H]+：m/z计算值726.13，实测值726.52
[实施例8]
将荧光物质Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific公司制)融合在实施例7中合成的具有十七氟辛基的三肽(H-Ala-RFAA(C8)-Phe-OMe)的N末端。
在1.5mL容积的黑色管中加入溶解于干燥DMSO(15μL)中的Alexa Fluor 647(125μg)、溶解于干燥DMSO(15μL)中的H-Ala-RFAA(C8)-Phe-OMe(1.5当量)和DIPEA(1.5当量)。将混合物在室温下持续搅拌一夜。利用反相色谱(乙腈/水/TFA＝5：95：0.1～10：95：0.1)将该混合物纯化，进行冷冻干燥而以蓝色固体形式得到荧光缀合物2(用荧光计计算，收率为5.7％、发光波长＝650nm)。
MALDI-TOF MS
[M]-：m/z计算值C55H72N5O17S4 -1564.2836，实测值1564.5701
[比较例1]
合成了具有丁基的二肽(H-Nle-Phe-OMe)。
依据已经报道的(Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1987,vol.35,p.468)，合成了Boc-Nle-Phe-Ome(收量556mg、收率40.2％)。
在25mL容积的双颈烧瓶中放入搅拌子，另一方面加入Boc-Nle-Phe-OMe(1.42mmol)和DCM(10mL)。将该反应混合物冷却至0℃后，添加TFA(2mL)，加热至室温。搅拌4小时后，添加碳酸氢钠水溶液使反应结束。用DCM萃取水相，对合并的有机相进行减压蒸馏，得到化学计量的H-Nle-Phe-OMe。产物未进行进一步纯化而直接使用。
1H NMR(400MHz,ACETONE-D6)
旋转异构体A
Δ8.09-7.88(m,1H),7.42-7.04(m,5H),4.67(dd,J＝11.0,4.6Hz,1H),4.59(t,J＝7.5Hz,1H),3.69(s,3H),3.22(dd,J＝13.7,4.6Hz,1H),3.00(dd,J＝14.0,10.7Hz,1H),2.00-1.80(m,2H),1.48-1.18(m,2H),0.83-0.73(m,3H)
旋转异构体B
7.60(t,J＝7.8Hz,1H),7.42-7.04(m,5H),4.75(t,J＝6.9Hz,1H),4.25(t,J＝6.4Hz,1H),3.64(s,3H),3.10(t,J＝7.3Hz,2H),2.00-1.80(m,2H),1.48-1.18(m,2H),0.86(t,J＝7.3Hz,3H)
[比较例2]
合成了具有丁基的三肽(H-Ala-Nle-Phe-OMe)。
在50mL容积的双颈圆底烧瓶中加入Fmoc-Ala-OH(1.1当量)、HOAt(1.1当量)和DIPEA(1.3当量)。在0℃下向混合物中添加溶解于20mL的DCM中的HATU(1.1当量)和二肽(H-N1-Phe-OMe、1.42mmol)。将该混合物加热至室温，接着搅拌1.5小时后，加入HCl(1N)使反应停止。将该混合物在HCl(1N)与DCM之间分配。对合并的有机相进行减压蒸馏，接着用乙酸乙酯进行稀释。用HCl(1N)、饱和NaHCO3水溶液和盐水清洗有机相，用Na2SO4进行干燥，使其蒸发而得到白色固体。在粗混合物中加入25mL的20％哌啶DMF溶液，在室温下搅拌1小时。通过真空干燥去除溶剂而得到白色固体，利用硅胶柱色谱(Et2O：DCM＝1：3)将其纯化，得到H-Ala-Nle-Phe-OMe(dr>95、116mg、收率23.0％)。
MALDI-TOF MS
[M+H]+：m/z计算值364.22，实测值364.07
[M+H]+：m/z计算值386.21，实测值386.06
[比较例3]
将荧光物质Alexa Fluor 647融合在比较例2中合成的具有丁基的三肽(H-Ala-Nle-Phe-OMe)的N末端。
在1.5mL容积的黑色管中加入溶解于干燥DMSO(15μL)中的Alexa Fluor 647(250μg)、溶解于干燥DMSO(15μL)中的H-Ala-Nle-Phe-OMe(1.5当量)和DIPEA(1.5当量)。将混合物在室温下持续搅拌一夜。利用反相色谱(乙腈/水/TFA＝30：70：0.1～95：5：0.1)将该混合物纯化，进行冷冻干燥而以蓝色固体形式得到荧光缀合物3(用荧光计计算，收率为74.5％、发光波长＝650nm)。
MALDI-TOF MS
[M]-：m/z计算值C55H72N5O17S4 -1202.3812，实测值1202.1449
[试验例1]
使实施例6中合成的肽荧光缀合物1(Alexa-Ala-RFAA-Phe-OMe)和比较例3中合成的肽荧光缀合物3(Alexa-Ala-Nle-Phe-OMe)与培养细胞接触，研究了细胞内的摄取效率。进而，作为比较对象，还使用了将荧光物质Alexa Fluoro 647融合在不具有丁基的三肽(H-Ala-Ala-Phe-OMe)的N末端而得到的肽荧光缀合物4(Alexa-Ala-Ala-Phe-OMe)。
在肽处理前24小时将HeLa细胞接种在腔室盖玻片上(0.5×105细胞/孔)。
细胞摄取检测通过如下方式进行：用在培养基(含有10％FBS和1％青霉素-链霉素溶液的DMEM低葡萄糖培养基)中以最终浓度为3.3μM的方式添加了肽荧光缀合物1或2的0.4％DMSO培养基(无添加剂)进行培养基更换。在37℃下将更换培养基后的细胞孵育1小时，用细胞培养用培养基和PBS(磷酸生理盐水)进行清洗。
将细胞用TrypLETM Express(Gibco公司制)处理后进行回收，接着通过流式细胞仪(guava easyCyte(商标)8)进行分析。测定了红色2荧光(661/19nm)。将结果示于图1。纵轴为细胞数(计数)，横轴为各细胞的荧光强度。如图1所示，肽荧光缀合物1(Alexa-Ala-RFAA-Phe-OMe)发出Alexa Fluor 647的荧光的细胞的比例比肽荧光缀合物3多约2倍以上。由该结果启示出：作为具有氟烷基的肽的Alexa-Ala-RFAA-Phe-OMe与不具有氟烷基的肽相比，细胞内的摄取效率高、细胞膜穿透性优异。
[试验例2]
研究了实施例8中合成的肽荧光缀合物2(Alexa-Ala-RFAA(C8)-Phe-OMe)的细胞内的摄取效率。作为比较对象，还使用了肽荧光缀合物1(Alexa-Ala-RFAA-Phe-OMe)、肽荧光缀合物3(Alexa-Ala-Nle-Phe-OMe)和肽荧光缀合物4(Alexa-Ala-Ala-Phe-OMe)。
在肽处理前24小时将HeLa细胞接种在12孔腔室盖玻片上(1.0×105细胞/孔)。
细胞摄取检测中，在培养基中以最终浓度为1.5μM的方式添加肽荧光缀合物1、2、3或4，除此以外与试验例1同样地进行。接着，与试验例1同样地回收细胞并通过流式细胞仪进行分析。
将结果示于图2。纵轴为细胞数(计数)，横轴为各细胞的荧光强度。如图2所示，肽荧光缀合物2(Alexa-Ala-RFAA(C8)-Phe-OMe)发出Alexa Fluor 647的荧光的细胞的比例比肽荧光缀合物3和4多约16倍以上。另外，肽荧光缀合物2与肽荧光缀合物1相比，发出Alexa Fluor 647的荧光的细胞的比例也多约6倍以上。由该结果启示出：作为具有氟烷基的肽的Alexa-Ala-RFAA-Phe-OMe与不具有氟烷基的肽相比，细胞内的摄取效率高、细胞膜穿透性优异。
[实施例9]
合成了具有十三氟己基的三肽(H-Ala-RFAA-Phe-OMe)。
将溶解于THF(1mL)中的化合物1(200mg)添加至LDA(2.2当量)中，在氩气、-78℃下在干燥THF(1mL)中保持30分钟。接着，将RFCH2CH2I(1.1当量)添加至混合物中，搅拌3小时。然后，将混合物缓慢地调至-30℃，搅拌一夜后，在0℃下在该混合物中加入水(5mL)使反应停止。接着，用CH2Cl2(200mL×3)萃取该混合物。将产物在氧化铝上利用柱而得到白色的固体(收率54.1％)。
1H NMR(400MHz CDCl3)δ＝1.45(s,9H),2.78-2.66(m,2H),3.23-3.27(m,2H),4.03(t,1H),7.2-7.7(m,10H)
19F NMR(376MHz CDCl3)δ＝-126.2(m,2F),-123.4(m,2F),-122.9(m,2F),-121.9(m,2F),114.9(m,1F),114.2(m,1F),-80.8(t,3F)
将溶解于HCl(6M、50mL)和1,4-二氧杂环己烷(200mL)中的化合物2(50.8mmol)的溶液在80℃下加热24小时。将该溶液过滤，用丙酮将沉淀物清洗数次。得到的白色固体是足矣用于接下来的工序而无需进一步纯化的纯度(收率50.2％)。
1H NMR(400MHz MeOH-d4)δ＝2.11(m,2H),2.35(m,1H),、2.52(m,1H),3.68(m,1H)
19F NMR(376MHz MeOH-d4)δ＝-127.2(m,2F),-124.4(m,2F),-123.8(m,2F),-122.8(m,2F),-115.7(m,2F),-82.3(t,3F)
在50mL容积的双颈圆底烧瓶中添加搅拌子，加入化合物3(100mg、0.22mmol)和DCM(10mL)。在室温下加入Fmoc-OSn(0.24mmol)和DIPEA(1.3当量)，接着将反应混合物在室温下搅拌20小时。将反应混合物直接蒸发，利用硅胶柱色谱(MeOH/CHCl3＝1/9)纯化为白色固体形式(收率64.2％)。
在25mL容积的双颈圆底烧瓶中加入Fmoc-RFAA-OH(90.4mg、0.14mmol)、HOAt(1.2当量)和DIPEA(1.3当量)。在该混合物中在0℃下添加溶解于DCM(5mL)中的HATU(1.2当量)和H-Phe-OMe(HCl盐、1.2当量)，将该混合物加热至室温，接着搅拌4小时。接着，加入HCl(1N)使反应停止后，将混合物在HCl(1N)和DCM之间分配。使合并的有机相蒸发，接着用乙酸乙酯进行稀释。用HCl(1N)、饱和NaHCO3水溶液和盐水清洗有机相，用Na2SO4进行干燥，使其蒸发而得到白色固体。在粗混合物中加入20％哌啶DMF溶液(25mL)，在室温下搅拌1小时。通过真空干燥去除溶剂而得到白色固体，将其利用硅胶柱色谱(CHCl3：MeOH＝10：1)进行纯化而得到H-RFAA-Phe-OMe(41.4mg、收率64.8％)。
1H NMR(400MHz Acetone-d6)δ＝1.96(m,2H),2.32(m,2H),2.81(br s,NH2)，2.99-3.15(m,2H),3.15(s,3H),4.05(t,1H),4.71(m,1H)7.2-7.7(m,5H)
19F NMR(376MHz Acetone-d6)δ＝-126.7(m,2F),-123.8(m,2F),-123.4(m,2F),-122.4(m,2F),-114.6(m,2F),-81.4(t,3F)
在25mL容积的双颈圆底烧瓶中加入Fmoc-RFAA-OH(44.8μmol)、HOAt(1.2当量)和DIPEA(1.3当量)。在0℃下在混合物中添加溶解于DCM(5mL)中的HATU(1.2当量)和Fmoc-AlaOH(1.2当量)后，将混合物加热至室温，接着搅拌4小时。加入HCl(1N)使反应停止后，将该混合物在HCl(1N)和DCM之间分配。使合并的有机相蒸发，接着用乙酸乙酯进行稀释。用HCl(1N)、饱和NaHCO3水溶液和盐水清洗有机相，用Na2SO4进行干燥，使其蒸发而得到白色固体。在粗混合物中加入5mL的20％哌啶DMF溶液，在室温下搅拌1小时。减压馏去溶剂而得到白色固体，利用HPLC将其纯化。
ESI-MS
[M+H]+：m/z计算值754.16，实测值654.52
[比较例4]
合成了具有辛基的三肽(Boc-nOctyl-Phe-OMe)。
Boc-nOctyl-Phe-Ome利用现有报道(Liebigs Annalen der Chemie,1990,12p,p.1175-1183)中记载的方法进行制造。该二肽的Boc脱保护按照与上述相同的标准性步骤进行(产率100％)。另外，三肽的合成依据前述的步骤进行。
ESI-MS
[M+H]+：m/z计算值420.29，实测值420.72
[实施例10]
合成了具有十七氟辛基的二肽(Boc-RFAA(C8)-Gly-OMe)。
使用草酸二烯丙酯(3.4g)代替草酸二苄酯，除此以外与实施例7同样地进行，以收率80.9％得到3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-十七氟-2,2-二氢癸酸烯丙酯的粗产物。将得到的产物用于接下来的工序而无需进行纯化。
1H NMR(400MHz Acetone-d6)δ＝6.25-5.71(m,1H),5.65-5.03(m,2H),4.97-4.52(m,2H)
19F NMR(400MHz Acetone-d6)δ＝81.72(m,3F),-120.30(s,4F),-122.24(s,6F),-123.26(s,2F),-126.79(d,J＝54.5Hz,2F)
将得到的粗产物以64℃、2.2mmHg进行升华纯化，除此以外与实施例7同样地进行，以收率60.3％得到3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-十七氟-2-氧代癸酸烯丙酯。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.08-5.79(m,1H),5.59-5.13(m,2H),4.89-4.80(m,2H)
19F NMR(400MHz,CDCl3)δ＝-81.03(t,J＝10.0Hz,3F),-117.88(t,J＝12.9Hz,2F),-121.25(m,4F),-121.96(m4F),-122.85(s,2F),-126.31(d,J＝5.7Hz,2F)
接着，在硅胶色谱中，以在己烷：乙酸乙酯＝9：1中加入1％的三乙胺而成者作为洗脱液，除此以外与实施例7同样地进行，以收率95.1％得到α-亚氨基酯。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.01-5.82(m,1H),5.49-5.30(m,2H),4.81(d,J＝5.9Hz,2H),1.63-1.49(m,9H)
19F NMR(400MHz,CDCl3)δ＝-79.98～-82.00(m,3F),-112.58(m,2F),-120.10(s,2F),-121.11(s,2F),-121.80(m,4F),-122.71(s,2F),-126.38(m,2F)
在得到的亚氨基酯(2.0g,3.2mmol)的干燥乙醚(30mL)溶液中边搅拌边在0℃下加入2-甲基吡啶硼烷(1当量)。将反应混合物在室温下搅拌1.5小时后，用HCl(1N)(20mL)进行稀释。用HCl(1N)将有机相清洗2次，减压浓缩，将得到的粗产物利用硅胶柱色谱(己烷：乙酸乙酯＝9：1)纯化，以黄色固体形式得到α-丁氧基羰基氨基酯(收率54％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.01-5.79(m,1H),5.51-4.97(m,4H),4.84-4.62(m,2H),1.57-1.35(m,9H)
19F NMR(400MHz,CDCl3)δ-80.96(t,J＝10.0Hz,3F),-115.81(d,J＝280Hz,1F),-118.10(d,J＝281Hz,1F),-120.88～-123.39(m,10F),-126.23(m,2F)
在得到的α-丁氧基羰基氨基酯(1.2g、1.9mmol)的THF(18mL)溶液中在0℃下加入苯基硅烷(2当量)和四(三苯基膦)钯(5mol％)，在室温下搅拌2小时。将反应混合物用HCl(1N)(10mL)进行稀释，用DCM萃取2次。将有机相减压浓缩，将得到的粗产物利用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇＝6：1/1％乙酸)纯化，以淡黄色液体形式得到2-((叔丁氧羰基)氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-十七氟十二酸(收率74％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝5.03(m,J＝8.4Hz,1H),1.38(s,9H)
19F NMR(400MHz,CDCl3)δ＝-80.87(t,J＝10.0Hz,3F),-115.78(d,J＝281.1Hz,1F),-118.12(d,J＝281.1Hz,1F),-120.16～-123.43(m,10F),-126.19(s,2F)
在干燥的25mL容积的双颈茄形烧瓶中，将2-((叔丁氧羰基)氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-十七氟十二酸(15.4mg、26.0μmol)、DCM(2mL)、DIPEA(57μmol)、甘氨酸甲酯盐酸盐(29μmol)和(羟基亚氨基)氰基乙酸乙酯(oxyma)(CAS RN：3849-21-6)(29μmol)混合并搅拌。将反应混合物冷却至0℃，加入(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳鎓六氟磷酸盐(COMU)(CAS RN：1075198-30-9)(29μmol)，在室温下搅拌1.5小时。然后，用HCl(1N)将反应混合物淬灭，用DCM萃取3次。将合并的有机相减压浓缩后，用乙酸乙酯稀释，用HCl(1N)、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗。用硫酸钠将清洗后的有机相干燥，过滤后减压浓缩，得到Boc-RFAA(C8)-Gly-OMe的粗产物。利用硅胶色谱(乙酸乙酯/己烷＝1/3)将粗产物纯化，得到Boc-RFAA(C8)-Gly-OMe。(收率92％)
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ＝8.25(t,J＝5.3Hz,1H),6.66(d,J＝9.6Hz,1H),5.44-5.19(m,1H),4.07(d,J＝5.5Hz,2H),3.68(s,3H),1.42(s,9H)
19F NMR(400MHz,Acetone-d6)δ＝-81.53(s,3F),-115.31(d,J＝281.1Hz,1F),-119.15～-120.92(m,1F),-120.92～-124.38(10F),-125.54～-127.82(m,2F)
[实施例11]
合成了具有十七氟辛基的二肽(Boc-RFAA(C8)-Ala-OMe)。
使用丙氨酸甲酯盐酸盐代替甘氨酸甲酯盐酸盐，除此以外与实施例10同样地进行，由2-((叔丁氧羰基)氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-十七氟十二酸(15μmol)得到Boc-RFAA(C8)-Ala-OMe(非对映体的47：53混合物)(收率74％)。
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ＝8.22-8.27(d,J＝7.1Hz,1H),6.82-6.43(m,1H),5.44-5.19(m,1H),4.64-4.40(m,1H),3.68(s,3H),1.42(s,9H),1.38-1.40(d,3H)
19F NMR(400MHz,Acetone-d6)δ＝-80.91(t,J＝10.0Hz,3F),-113.87～-115.77(m,1F),-119.22～-119.98(m,1F),-120.67～-121.35(m,2F),-121.48(m,6F),-122.03～-122.81(m,2F),-126.00(m,2F)
[实施例12]
合成了具有十七氟辛基的二肽(Boc-RFAA(C8)-Leu-OMe)。
使用亮氨酸甲酯盐酸盐代替甘氨酸甲酯盐酸盐，且未进行硅胶色谱，除此以外与实施例10同样地进行，由2-((叔丁氧羰基)氨基)-3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-十七氟十二酸(15μmol)得到Boc-RFAA(C8)-Leu-OMe(非对映体的49：51混合物)(收率83％)。
1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ＝8.19(d,J＝7.5Hz,1H),6.64(d,J＝10.1Hz,1H),5.45-5.13(m,1H),4.68-4.47(m,1H),3.68(s,3H),1.81-1.66(m,1H),1.42(s,9H),0.96-0.88(m,6H)
19F NMR(400MHz,Acetone-d6)δ＝-81.56(t,J＝10.0Hz,3F),-115.49(m,J＝272.51F),-119.40～-120.88(m,1F),-121.33～-123.04(m,10F),-126.63(m,2F)
[实施例13]
合成了具有十七氟辛基的二肽(Boc-RFAA(C8)-Lys(Boc)-OMe)。
使用赖氨酸(Boc)甲酯盐酸盐代替甘氨酸甲酯盐酸盐，除此以外与实施例10同样地进行，得到Boc-RFAA(C8)-Lys(Boc)-OMe(收率69％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(d,J＝3.7Hz,1H),7.51-7.54(m,1H),6.94(d,J＝8.2Hz,1H),5.67(d,J＝10.1Hz,1H),5.13(s,1H),4.57-4.62(m,2H),3.75(s,3H),1.45(s,18H),1.10-1.90(m,6H)
19F NMR(400MHz,CDCl3)δ-80.63(s,3F),-114.56(d,J＝281.1Hz,1F),-119.10(d,J＝284.0Hz,1F),-122.61--120.86(m,10F),-126.02(s,2F)
LRMS(ESI-TOF)
[M+Na]+：计算值C27H34F17N3NaO7 858.20，实测值858.03
[比较例5]
合成了Ac-L-Ala-L-Ala-NHBn。
将化合物220(61mg、0.32mmol)和化合物222(68mg)溶解于3mL的甲醇中，在该溶液中加入DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物)·3.2H2O(135mg)。将该反应混合物在室温下搅拌12小时，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用1M Na2CO3水溶液、水、1M HCl水溶液、水和盐水清洗该溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发，得到化合物240(92mg、收率83％)。
将化合物240(92mg、0.26mmol)溶解于DCM 4mL和THF 1mL中。在该溶液中在0℃下加入1.25mL的TFA，将该混合物搅拌15分钟。接着，将反应混合物加热至室温并搅拌3小时。在该反应混合物中加入1M NaHCO3水溶液，将得到的溶液搅拌2小时。用DCM将该混合物萃取4次。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发，得到化合物241。
在3mL DCM中的化合物241(73mg、0.29mmol)中加入乙酸酐(33μL)。将该反应混合物在室温下搅拌24小时，接着在真空下使其蒸发。将残渣溶解于10mL的40％乙腈水溶液中，使用HPLC反相柱进行纯化，得到化合物242(9mg、收率11％)。
1H NMR(CD3OD,400MHz)：δ7.33-7.20(m,5H),4.42-4.33(m,3H),4.29(q,J＝6.9Hz,1H),1.96(s,3H),1.38(d,J＝6.87Hz,3H),1.33(d,J＝7.3Hz,3H).
MS(MALDI-TOF MS.m/z)
[M+Na]+：计算值C15H21N3O3Na 314.15，实测值313.88.
[实施例14]
合成了Ac-D,L-Ala(F3)-L-Ala-NHBn。
将D,L-三氟丙氨酸盐酸盐(化合物243)(52mg、0.28mmol)溶解于3mL的乙腈中。在该溶液中在0℃下加入DIPEA(57μL)和二碳酸二叔丁酯(77μL)。用21小时将该反应混合物加热至室温。使该溶液在真空下蒸发，在残渣中加入水。用乙醚将该溶液萃取3次。在水相中加入1M HCl水溶液，用乙醚将该溶液萃取3次。用Na2SO4将合并的有机相干燥，在真空中使其蒸发，以白色的固体形式得到化合物244(62mg、收率91％)。
将化合物244(40mg、0.16mmol)和化合物222(29mg)溶解于1.5mL的甲醇中，在该溶液中加入DMTMM·3.2H2O(62mg)。将反应混合物在室温下搅拌11.5小时，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用1M Na2CO3水溶液、水、1M HCl水溶液、水和盐水清洗得到的溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发，得到化合物245(45mg、收率68％)。
将化合物245(45mg、0.11mmol)溶解于DCM 4mL和THF 1mL中。在该溶液中在0℃下加入1.25mL的TFA，将混合物搅拌15分钟。接着，将反应混合物加热至室温并搅拌3小时。在该反应混合物中加入1M NaHCO3水溶液，将得到的溶液搅拌2小时。用DCM将该混合物萃取4次。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发，得到化合物246(41mg、定量性收率)。
在3mL DCM中的化合物246(41mg、0.14mmol)中加入乙酸酐(67μL)。将该反应混合物在室温下搅拌24小时，接着在真空下使其蒸发。将残渣溶解于10mL的46％乙腈水溶液中，使用HPLC反相柱进行纯化，以白色的固体(0.3mg、收率1％)形式得到化合物247。该分子以非对映体混合物形式得到，直接用于穿透性检测。
1H NMR(CD3OD,400MHz)：δ7.33-7.22(m,5H),5.37-5.29(m,1H),4.45-4.38(m,3H),2.66(s,3H),1.40-1.38(m,3H).
MS(MALDI-TOF MS.m/z)
[M+Na]+：计算值C15H18F3N3O3Na 368.12，实测值367.92.
[比较例6]
合成了Ac-L-Ala-L-Phe-iBu。
将化合物201(700mg、2.34mmol)和异丁胺(181μL)溶解于23mL的甲醇中，在该溶液中加入DMTMM·1.3H2O(838mg)。将该反应混合物在室温下搅拌5小时，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用1M Na2CO3水溶液、水、1M HCl水溶液、水和盐水清洗得到的溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发。利用硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯＝4：6)将残渣纯化，得到化合物248(523mg、收率65％)。
在回收烧瓶中加入化合物248(523mg、1.48mmol)、钯碳10％(55mg)和7.4mL甲醇。将H2导入该烧瓶中，将该混合物在室温下搅拌15小时。用硅藻土将该反应混合物过滤。在减压下去除溶剂，得到化合物249(319mg、收率98％)。
将化合物205(45mg、0.2mmol)和化合物249(53mg)溶解于2mL的甲醇中，在室温下搅拌该溶液。在该溶液中加入DMTMM·1.3H2O(74mg)。将该反应混合物在室温下搅拌23小时，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用1M Na2CO3水溶液、水、1M HCl水溶液、水和盐水清洗得到的溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发。利用硅胶柱色谱(DCM/甲醇＝19：1)将残渣纯化，得到化合物250(9.1mg、收率11％)。
在回收烧瓶中加入化合物250(9.1mg、21μmol)、10％钯碳(2.8mg)、2mL的甲醇。将H2导入该烧瓶中，将混合物在室温下搅拌22小时。用硅藻土将该反应混合物过滤。在减压下去除溶剂，得到化合物251(7.4mg、定量性收率)。
在1mL DCM和0.2mL NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的化合物251(4mg、14μmol)中加入乙酸酐(23μL)。将该反应混合物在室温下搅拌1.5小时，接着在真空下使其蒸发。将残渣溶解于3.5mL的14％乙腈水溶液中，使用HPLC反相柱进行纯化，得到化合物252(2.0mg、收率43％)。
1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ7.32-7.19(m,10H),6.62(d,J＝7.7Hz,1H),5.90-5.86(m,2H),4.57(q,J＝7.7Hz,1H),4.39(dq,J＝6.9,7.1Hz,1H),3.14(dd,J＝6.4,13.9Hz,1H),3.06-2.98(m,3H),1.94(s,3H),1.70-1.62(m,1H),1.33(d,J＝7.1Hz,3H),0.79(t,J＝6.3Hz,6H).
MS(MALDI-TOF MS.m/z)
[M+Na]+：计算值C18H27N3O3Na 356.20，实测值356.23.
[实施例15]
合成了Ac-D,L-Ala(F3)-L-Phe-iBu。
将化合物244(41mg、0.17mmol)和化合物249(45mg)溶解于1mL的甲醇和0.7mL的DCM中，在该溶液中加入DMTMM·1.3H2O(59mg)。将该反应混合物在室温下搅拌一夜，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用1M NaHCO3水溶液、饱和NH4Cl水溶液和盐水清洗得到的溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发。利用硅胶柱色谱(DCM/甲醇＝19：1)将残渣纯化，得到化合物253(47mg、收率63％)。
在乙酸乙酯3mL中的化合物253(47mg、0.11mmol)中，加入乙酸乙酯中的4M HCl(3mL)，接着将该溶液在室温下搅拌20分钟。在真空下使该溶液蒸发，得到化合物254(45mg、定量性收率)。
在2mL DCM中的化合物254(30mg、79μmol)中加入乙酸酐(45μL)。将该反应混合物在室温下搅拌3小时，接着在真空下使其蒸发。将残渣溶解于乙腈/H2O/MeOH(＝2.4mL：3.6mL：2mL)中，使用HPLC反相柱进行纯化，得到化合物255(9.4mg、收率30％)。该分子以非对映体混合物形式得到，直接用于穿透性检测。
1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ7.34-7.21(m,5H),6.82-6.76(m,1H),6.41(d,J＝6.4Hz,1H),5.3(s,1H),5.17(q,J＝7.3Hz,1H),4.59-4.53(m,1H),3.21-3.12(m,1H),3.01-2.92(m,3H),1.42(dd,J＝6.9,12.4Hz,1H),0.76(dd,J＝6.4,10.5Hz,6H).
MS(MALDI-TOF MS.m/z)
[M+Na]+：计算值C18H24F3N3O3Na 410.17，实测值410.19.
[比较例7]
合成了Ac-L-Val-L-Ala-NMe2。
将N-苄氧羰基-L-缬氨酸(化合物256)(60mg、0.24mmol)和化合物213(33mg)溶解于2.2mL的甲醇中，在该溶液中加入DMTMM·1.3H2O(91mg)。将该反应混合物在室温下搅拌一夜，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用1M Na2CO3水溶液、水、1M HCl水溶液、水和盐水清洗得到的溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发，得到化合物257(75mg、收率89％)。
在回收烧瓶中加入化合物257(773mg、3.10mmol)、钯碳10％(7.5mg)和2.1mL的甲醇。将H2导入该烧瓶中，将该混合物在室温下搅拌18小时。用硅藻土将该反应混合物过滤。在减压下去除溶剂，得到化合物258(35mg、收率76％)。
在0.8mL DCM中的化合物258(35mg、0.16mmol)中加入乙酸酐(18μL)。将该反应混合物在室温下搅拌20小时，接着在真空下使其蒸发。将残渣溶解于4mL的10％乙腈水溶液中，使用HPLC反相柱进行纯化，以白色固体(27mg、收率65％)形式得到化合物259。
1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ7.10(d,J＝7.3Hz,1H),6.41(d,J＝8.7Hz,1H),4.87(quin,J＝6.9,1H),4.37(dd,J＝6.1,2.6Hz,1H),3.09(s,3H),2.99(s,3H),2.10-2.02(m,4H),1.34(d,J＝6.9Hz,3H),0.94(d,J＝6.0Hz,3H),0.92(d,J＝5.5Hz,3H).
MS(MALDI-TOF MS.m/z)
[M+Na]+：计算值C12H23N3O3Na 280.16，实测值280.05.
[实施例16]
合成了Ac-D,L-Val(F6)-L-Ala-NMe2。
将D,L-六氟缬氨酸(化合物260)(50mg、0.22mmol)溶解于2.5mL的乙腈中。在该溶液中在0℃下加入二碳酸二叔丁酯(49μL)。用11.5小时将该反应混合物加热至室温。在该溶液中加入DIPEA(38μL)，将该反应混合物在室温下搅拌6.5小时。使该溶液在真空下蒸发，在残渣中加入水。用乙醚萃取该溶液。在水相中加入1M HCl水溶液，用乙醚将得到的溶液萃取3次。用Na2SO4将合并的有机相干燥，在真空下使其蒸发，得到化合物261(63mg、收率87％)。
将化合物261(50mg、0.15mmol)和化合物213(21mg)溶解于0.7mL的甲醇中，在该溶液中加入DMTMM·1.3H2O(56mg)。将该反应混合物在室温下搅拌17小时，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用1M Na2CO3水溶液、水、1M HCl水溶液、水和盐水清洗得到的溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发，得到化合物262(50mg、收率77％)。
在化合物262(50mg、0.12mmol)中，加入乙酸乙酯中的4M HCl(2.5mL)后，将该溶液在室温下搅拌2小时。在该反应混合物中加入乙酸乙酯，用1M HCl水溶液将得到的溶液萃取2次。在水相中加入1M NaOH水溶液以使pH为11。用DCM将该溶液萃取3次，用Na2SO4将有机相干燥。在减压下去除溶剂，得到化合物263(38mg、定量性收率)。
在DCM(1.2mL)中的化合物263(38mg、0.12mmol)中加入乙酸酐(13μL)。将该反应混合物在室温下搅拌13小时，接着在真空下使其蒸发。将残渣溶解于8mL的30％乙腈水溶液中，使用HPLC反相柱进行纯化，以白色固体(27mg、收率63％)形式得到化合物264。该分子以非对映体混合物形式得到，直接用于穿透性检测。
1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ7.57(d,J＝6.4Hz,0.5H),7.39(d,J＝6.9Hz,0.5H),6.22(d,J＝9.6Hz,0.5H),6.08(d,J＝9.6Hz,0.5H),5.41(t,J＝9.2Hz,1H),4.86-4.75(m,1H),4.35-4.22(m,1H),3.07(d,J＝5.0Hz,3H),2.98(d,J＝3.2Hz,3H),2.14(d,J＝2.14Hz,3H),1.32(t,J＝7.3Hz,3H).
MS(MALDI-TOF MS.m/z)
[M+Na]+：计算值C12H17F6N3O3Na 388.11，实测值388.18.
[比较例8]
合成了Ac-L-Val-L-Phe-iBu。
将化合物256(52mg、0.2mmol)和化合物249(53mg)溶解于2mL的甲醇中，在室温下搅拌溶液。在该溶液中加入DMTMM·1.3H2O(72mg)。将该反应混合物在室温下搅拌23小时，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用1M Na2CO3水溶液、水、1M HCl水溶液、水和盐水清洗得到的溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发。利用硅胶柱色谱(DCM/甲醇＝19：1)将残渣纯化，得到化合物265(60mg、收率67％)。
在回收烧瓶中加入化合物265(60mg、0.13mmol)、钯碳10％(6mg)和1.3mL的甲醇。将H2导入该烧瓶中，将混合物在室温下搅拌22小时。用硅藻土将该反应混合物过滤。在减压下去除溶剂，得到化合物266(39mg、收率92％)。
将化合物266(15mg、47μmol)溶解于1mL DCM、0.4mL NMP和0.2mL THF中。在该溶液中加入乙酸酐(23μL)。将该反应混合物在室温下搅拌1.5小时，接着在真空下使其蒸发。将残渣溶解于乙腈/H2O/MeOH(＝1.8mL：2.9mL：1.5mL)中，使用HPLC反相柱进行纯化，得到化合物267(7.2mg、收率43％)。
1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ7.30-7.18(m,5H),6.51(d,J＝7.3Hz,1H),5.92(d,J＝7.8Hz,1H),5.75(s,1H),4.58(dt,J＝6.0,8.2Hz,1H),4.20(dd,J＝6.0,8.2Hz,1H),3.11(dd,J＝6.0,13.7Hz,1H),3.02-2.92(m,3H),2.10-2.03(m,1H),1.97(s,3H),1.66-1.59(m,1H),0.88(dd,J＝6.9,11.5Hz,6H),0.76(t,J＝7.3Hz,6H).
MS(MALDI-TOF MS.m/z)
[M+Na]+：计算值C20H31N3O3Na 384.23，实测值384.13.
[实施例17]
合成了Ac-D,L-Val(F6)-L-Phe-iBu。
将化合物261(70mg、0.22mmol)和化合物249(57mg)溶解于1.2mL的甲醇中，在该溶液中加入DMTMM·1.3H2O(83mg)。将该反应混合物在室温下搅拌5小时，在真空下使其蒸发。在该反应混合物中加入DCM，用饱和NaHCO3水溶液、1M HCl水溶液和盐水清洗得到的溶液。用Na2SO4将有机相干燥，在真空下使其蒸发。利用硅胶柱色谱(DCM/甲醇＝19：1)将残渣纯化，得到化合物268(79mg、收率69％)。
在3mL的乙酸乙酯中的化合物268中，加入乙酸乙酯中的4M HCl(3mL)。将该溶液在室温下搅拌1.5小时。在减压下去除溶剂，得到化合物269(53mg、收率76％)。
在2mL DCM中的化合物269(40mg、86μmol)中，加入DIPEA(16μL)和乙酸酐(45μL)。将该反应混合物在室温下搅拌8.5小时，接着在真空下使其蒸发。将残渣溶解于乙腈/H2O/MeOH(＝3mL：3mL：8mL)中，使用HPLC反相柱进行纯化，以白色固体形式得到化合物270(5.7mg、收率13％)。该分子以非对映体混合物形式得到，直接用于穿透性检测。
1H NMR(CD3OD3,400MHz)：δ7.29-7.17(m,5H),5.29(dq,J＝7.8,23.8Hz,1H),4.63-4.58(m,1H),3.15-3.05(m,1H),3.01-2.86(m,3H),2.01(d,J＝4.6hz,3H),1.72-1.62(m,1H),0.82-0.78(m,6H).
MS(MALDI-TOF MS.m/z)
[M+Na]+：计算值C20H25F6N3O3Na 492.17，实测值491.97.
[试验例3]
对实施例15～17和比较例6～8中合成的肽进行了PAMPA检测。另外，对实施例14、15、17和比较例5、6、8中合成的肽进行了MDCK-II检测。MDCK-II检测中，使用普萘洛尔(CASNo：318-98-9)作为阳性对照(“PC”)，使用诺氟沙星(CAS No：70458-96-7)作为阴性对照(“NC”)。
<PAMPA(平行人工膜穿透性检测)检测>
肽的穿透性通过PAMPA而测定。PAMPA检测中，将300μL的含有5％DMSO的PBS加入接收板(MultiScreen 96孔转运接收板、Merck公司制)的各孔中。接着，将溶解于5％DMSO/PBS中的150μL的肽溶液(20μM)加入供体板(MultiScreen-IP过滤板、0.45μm、Merck公司制)的各孔中。将1％卵磷脂(大豆来源)的十二烷溶液在使用前进行30分钟超声波处理，将5μL的该溶液涂布于供体板的各孔的膜支撑体(PVDF)上。将供体板置于接收板上，将该孔板在恒温箱内、在25℃下放置18小时。使用LC/MS确定了肽的浓度。实验重复实施了3次。使用下式计算出穿透率值(Pe)。
A：过滤器面积(0.3cm2)
VD：供体孔的体积(0.15cm3)
VA：受体孔的体积(0.3cm3)
t：孵育时间(s)(18小时＝64800s)
CD(t)：时间t时的供体孔的化合物浓度
CA(t)：时间t时的受体孔的化合物浓度
<MDCK-II检测>
在细胞培养插板(Falcon公司制)中以5.04×104细胞/mL接种MDCK-II细胞，5天后实施了细胞单层检测(MDCK-II检测)。在DMSO溶液中以2mM制备肽的贮备溶液，通过包含20mM HEPES、pH7.5的HBSS进行稀释，作为供体溶液，制备了将0.1％DMSO/HBSS(+)作为溶剂的2μM肽溶液。受体溶液制成将包含20mM HERES、pH 7.5的HBSS(+)作为溶剂的0.1％DMSO溶液。表观穿透性(Papp)通过在37℃、5％CO2中2小时、在肽溶液中从顶端至侧底的孵育中来确定。肽浓度利用LC/MS进行分析。实验重复实施了3次。使用下式计算出穿透率值(Papp)。
Q(t)＝CB(t)×VB
A：过滤器面积(0.3cm2)
VB：侧底孔容积(0.75cm3)
t：孵育时间(s)(2小时＝7200s)
C0：顶端腔室的初始浓度(2μM)
CB(t)：时间t时的侧底的化合物浓度
将PAMPA检测的结果示于表3，将MDCK-II检测的结果示于表4。根据该结果，与比较例5～8的肽相比，那些侧链中导入了氟原子的实施例14～17的含氟肽改善了细胞膜穿透性。
[表3]
[表4]
产业上的可利用性
本发明提供具有在侧链上具备氟烷基的氨基酸残基的肽及其制造方法。本发明的肽的细胞膜穿透性优异，因此可期待例如作为用于将药效成分导入靶细胞中的载体等生理活性物质用于医药领域中。
Claims (10)
1.一种含有氟烷基的肽的制造方法，其中，使下述通式(6-2)或(6-4)所示的化合物与羧基受保护的含氟氨基酸、羧基受保护的氨基酸、C末端受保护的含氟肽或C末端受保护的肽缩合，
式中，星号表示标有星号的不对称碳原子的绝对构型为S或R，
Rf为被至少2个氟原子取代的、任选还被除氟原子以外的卤原子取代的C1-30烷基，在该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子，
R2为氨基的保护基团。
2.一种含有氟烷基的肽的制造方法，其中，使下述通式(6-1)或(6-3)所示的化合物与氨基受保护的含氟氨基酸、氨基受保护的氨基酸、N末端受保护的含氟肽或N末端受保护的肽缩合，
式中，星号表示标有星号的不对称碳原子的绝对构型为S或R，
Rf为被至少2个氟原子取代的、任选还被除氟原子以外的卤原子取代的C1-30烷基，在该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子，
R1为选自下述通式(p-1)所示的基团、2-(9,10-二氧代)蒽基甲基、苄基氧基甲基和苯甲酰甲基中的保护基团，
式中，R3为任选被取代的C6-14芳基，R4和R5各自独立地为氢原子或任选被取代的C6-14芳基，黑圆点表示原子键。
3.一种含有氟烷基的肽的制造方法，其中，使下述通式(7)或(7-1)所示的化合物
在用保护基团保护氨基后，与羧基受保护的含氟氨基酸、羧基受保护的氨基酸、C末端受保护的含氟肽或C末端受保护的肽缩合，或者，
在用保护基团保护羧基后，与氨基受保护的含氟氨基酸、氨基受保护的氨基酸、N末端受保护的含氟肽或N末端受保护的肽缩合，
式中，星号表示标有星号的不对称碳原子的绝对构型为S或R，
Rf为被至少2个氟原子取代的、任选还被除氟原子以外的卤原子取代的C1-30烷基，在该C1-30烷基为C2-30烷基时，任选在碳原子之间具有1～5个醚键性的氧原子。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的含有氟烷基的肽的制造方法，其中，进而将所制造的含有氟烷基的肽的氨基或羧基的保护基团脱保护。
5.一种肽，其是2个以上的氨基酸通过肽键结合而成的肽，
构成该肽的氨基酸残基中的至少1个在侧链上具有被至少2个氟原子取代的C1-30烷基，在该C1-30烷基的碳原子为2个以上时，任选在碳原子之间具有醚键性的氧原子。
6.根据权利要求5所述的肽，其中，所述被至少2个氟原子取代的C1-30烷基任选还被除氟原子以外的卤原子取代。
7.根据权利要求5或6所述的肽，其中，具有所述被至少2个氟原子取代的C1-30烷基的侧链为下述通式(f-1)或(f-2)所示的基团，
式中，RfP表示包含至少2个以上的氟原子的全卤化C1-10烷基，在该C1-10烷基的碳原子为2个以上时，任选在碳原子之间具有醚键性的氧原子，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数，黑圆点表示原子键。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的肽，其中，C末端或N末端任选被保护基团保护。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的肽，其为下述通式(101)或(102)所示的三肽，
式中，RfP表示包含至少2个以上的氟原子的全卤化C1-10烷基，在该C1-10烷基的碳原子为2个以上时，任选在碳原子之间具有醚键性的氧原子，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数，R11和R12各自独立地为C1-6烷基或苄基，X为9-芴基甲氧基羰基或叔丁氧羰基，Z为C1-6烷氧基。
10.根据权利要求5～9中任一项所述的肽，其具有细胞膜穿透性。
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-
2021
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Patent Citations (1)
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