CN112010940B - 抑制pd-1/pd-l1的大环化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大环类化合物及其应用，该化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体可以制备PD‑1/PD‑L1抑制剂，影响抑制生长因子的生成和细胞增殖，在制备治疗肿瘤药物中有良好的应用前景。与单抗研究开发相比，PD‑1/PD‑L1抑制剂领域的肽类抑制剂却进展缓慢，所以研究开发抑制PD‑1/PD‑L1相互作用的抑制剂具有重要的临床意义。

Description

抑制PD-1/PD-L1的大环化合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种大环类化合物或其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物在制备PD-1/PD-L1抑制剂药物中的应用。
背景技术
PD-1又称CD279，是一种相对分子量为55000～60000的I型跨膜蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，其结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水的跨膜区以及胞内区。胞内区包括C端和N端氨基酸残基，含有2个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM)。PD-1主要表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞等免疫细胞上，促进T细胞的成熟。PD-1的配体属B7家族成员，包括PD-L1(又名B7-H1，CD274)和PD-L2(又名B7-DC)，两者均高表达于胎盘组织；低表达于脾脏、淋巴结、胸腺；脑组织中无表达。其中，PD-L1同是I型跨膜蛋白，主要表达于抗原提呈细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞、肌细胞、内皮细胞等。PD-1及PD-L1共同组成PD-1/PD-L1信号通路，抑制生长因子的生成和细胞增殖，并对T细胞的活化及调控免疫应答起到重要作用。PD-1/PD-L1通路激活后，在癌症、妊娠、组织移植以及自身免疫病中抑制免疫系统。目前PD-1/PD-L1抑制剂的开发主要集中在单克隆抗体领域，已有Nivolumab，Lambrolizumab，Atezolizumab，Durvalumab，Avelumab等单抗在国内外上市，可用于治疗非小细胞肺癌，黑色素瘤等常规治疗方法效果不佳的疾病具有明显的治疗效果。与单抗研究开发相比，该领域的肽类抑制剂却进展缓慢。所以研究开发抑制PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂具有重要的临床意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种大环类化合物及其应用，该化合物为PD-1/PD-L1抑制剂，影响抑制生长因子的生成和细胞增殖，在制备治疗肿瘤药物中有良好的应用前景。
技术方案：本发明公开了一种大环类化合物及其应用。该化合物或其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物为PD-1/PD-L1抑制剂，可用于治疗恶性肿瘤。
一种大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体，该化合物结构如通式(I)所示：
Figure GDA0003702711290000021
波浪线指代连接方式，
其中，通式中的Q可独立选自于下列结构中的立体异构或消旋体中的一种；
Figure GDA0003702711290000022
其中，A为氢原子或甲基。
M可独立选自于下列结构中的立体异构或消旋体中的一种；
Figure GDA0003702711290000023
L可独立选自于下列结构中的一种；
Figure GDA0003702711290000031
其中，R1为H或CONH2。
R2为H或
Figure GDA0003702711290000032
其中Y和Z中有一个为N，其他为CH。
药物组合物，包括所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体。
药物组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体在制备PD-1/PD-L1通路抑制剂中的应用。
所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体或所述的药物组合物在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
所述预防或治疗肿瘤药物为PD-1/PD-L1通路的预防或治疗肿瘤药物。
所述肿瘤为人乳腺癌，包括其在远离肿瘤原发部位的组织或器官的转移病变。
所述的预防或治疗肿瘤药物为癌症免疫治疗药物、癌症化疗药物或癌症靶向治疗药物。
在一些实施方案中，本申请涉及的化合物或其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物选自以下化合物：
Figure GDA0003702711290000041
有益效果：本发明提供的大环类化合物，可制备PD-1/PD-L1抑制剂，影响抑制生长因子的生成和细胞增殖，并对T细胞的活化及调控免疫应答起到重要作用，在制备治疗肿瘤药物中有良好的应用前景。
具体实施方式
为了进一步对本发明进行说明，下面通过具体实例进行详细阐述。
合成一般方法：
1.固相合成一般方法
固相氨基酸的合成均在固相反应合成管中进行，使用rink amide-AM树脂(Merrifield聚合物负载(2，4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲烷，其中4-烷氧基为与树脂连接的位置和化学键类型，负载量0.7mmol/g)。使用DMF和DCM溶解反应所用试剂后，沿管壁加入到反应管中，通入氮气后振荡所需时间。之后，反应液从反应管下侧通过真空泵抽去。反应中所用的溶剂和试剂为：DMF＝N，N-二甲基甲酰胺；DCM＝二氯甲烷；HATU＝1-[二(二甲胺基)亚甲基]-3-氧代-1H-1，2，3-三氮唑并[4，5-b]吡啶六氟磷酸盐；DEPBT＝3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4-酮；TBTU＝O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼；DIPEA＝二异丙基乙胺。树脂的溶胀过程如下文“树脂溶胀步骤”所述。缩合步骤如下文“缩合步骤”所述。使用的氨基酸衍生物和末端羧酸如下所示(侧链保护基置于括号中)：Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-[N-Me]Nle-OH，Fmoc-L-Trp(CH2COOtBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH，ClCH2COOH。
Figure GDA0003702711290000051
在一些实施例中，以下氨基酸和末端羧酸也会使用：Fmoc-L-Trp(Cbz)-OH，Fmoc-L-Dab(Cbz)-OH，Fmoc-L-[O-Bn]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Cbz)-OH，Fmoc-L-[O-Bn]Tyr-OH，丙烯酸。
Figure GDA0003702711290000061
在一些实施例中，如下氨基酸衍生物也会被使用：2-芴甲氧羰基氨基-4-丁烯酸
Figure GDA0003702711290000062
2.树脂溶胀步骤
将Rink Amide-AM树脂(286mg，0.2mmol)加入到10mL的固相合成反应管中，加入8mL的DCM，静置半小时。之后将DCM经真空泵抽去即可完成树脂的溶胀。
3.缩合步骤
将6mL 20％的哌啶/DMF溶液加入到反应管中，振荡30分钟。反应液抽干，树脂用无水DMF(10mL)，无水甲醇(10mL)和无水DCM(10mL)分别洗涤3次后，取样经四氯苯醌显色，树脂呈蓝色可指示脱除保护基结束。
脱除保护基结束后，将所需氨基酸(0.6mmol)，HATU(228mg，0.6mmol)，DMF(6mL)和DIPEA(210μL，1.2mmol)依次加入到干燥的圆底烧瓶中，超声助溶使其澄清。将混合液加入到固相合成反应管中，25℃反应3小时，取样经四氯苯醌显色，树脂呈无色透明可指示缩合反应结束。树脂用无水DMF(10mL)，无水甲醇(10mL)和无水DCM(10mL)分别洗涤3次后即可进行下一次缩合。
4.肽游离步骤
完成所需直链肽合成后，将树脂再用无水DMF洗涤1次，后抽至干。向干燥的树脂加入切割液(三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶1，2-乙二硫醇∶苯甲醚＝90∶5∶2.5∶2.5，体积比)。混合物在10℃下振摇3小时。反应结束后，将切割液抽滤出来，浓缩至原体积1/2，浓缩液逐滴加入到10倍体积的-20℃无水乙醚中。抽滤形成的沉淀即得粗肽，可不经处理直接进行下一步反应。
5.RP-HPLC分离步骤
将所得的粗品肽溶于一定量的纯净水中，使用三乙胺或2M HCl调节PH至7，加入乙腈至澄清，冻干得粗品固体。加入一定量的乙腈使其完全溶解，经0.33μM滤器过滤。使用Aglient Eclipase XDB-C18柱进行分离，流动相A：0.1％TFA/H2O；流动相B：0.1％TFA/MeCN。色谱条件为10％B-100％B，60min。
实施例1
Figure GDA0003702711290000071
的制备
实施例1的总合成路线如下所示：
Figure GDA0003702711290000081
化合物1-B的合成：
Figure GDA0003702711290000082
将化合物1-A(1g，3mmol)溶于甲苯(80mL)中，加入多聚甲醛(450mg)和对甲苯磺酸(52mg，0.3mmol)中，接分水器加热至130℃，反应1h。反应结束后，旋干反应液，用乙酸乙酯复溶，饱和碳酸氢钠洗涤2次，水洗2次，饱和食盐水洗1次。浓缩至干，粗品经硅胶柱层析分离(100％DCM)可得化合物1-A(940mg，产率90％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.9，1.1Hz，2H)，7.73-7.63(m，4H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.85-5.73(m，1H)，5.19(d，J＝9.1Hz，1H)，5.12(d，J＝9.1Hz，1H)，5.02(dq，J＝12.0，0.9Hz，2H)，4.59-4.49(m，2H)，4.37(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.34-4.29(m，1H)，2.65(dddt，J＝13.6，7.1，4.4，0.9Hz，1H)，2.52-2.43(m，1H).MS(ESI)：350.1[M+H]+
化合物1-C的合成：
Figure GDA0003702711290000083
将化合物1-B(1.3g，3.7mmol)溶于21mL CHCl3中，加入三异丙基硅烷2.1mL，将反应液置于冰浴，缓慢加入21mL三氟醋酸。该反应在室温下反应24h。反应液浓缩至干，乙酸乙酯复溶，水洗2次，饱和食盐水洗1次，有机层浓缩至干，经硅胶柱层析分离可得化合物1-C(1.11g，86％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.84-7.78(m，2H)，7.70-7.62(m，4H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.85(tt，J＝9.6，7.1Hz，1H)，5.08(dt，J＝9.7，1.0Hz，2H)，4.48(d，J＝5.5Hz，2H)，4.32-4.26(m，1H)，4.16(t，J＝5.5Hz，1H)，3.09(s，3H)，2.64(dddt，J＝13.7，6.7，5.7，1.1Hz，1H)，2.47(dddt，J＝13.7，7.3，5.5，0.9Hz，1H).MS(ESI)：352.3[M+H]+
化合物1-D的合成：
Figure GDA0003702711290000091
将化合物1-C(1.11g，3.2mmol)溶于5mL THF与5mL DMF的混合溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(478mg，4.2mmol)，将反应液置于冰浴，缓慢加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1.04g，5.5mmol)。该反应在室温下反应24h。反应液浓缩至干，乙酸乙酯复溶，水洗5次，饱和食盐水洗1次，有机层浓缩至干，可不经纯化直接进行下一步反应。
化合物1-E的合成
Figure GDA0003702711290000092
将化合物1-D(1.5g，3.2mmol)溶于15mL丙酮与15mL 10％的碳酸钠水溶液中，将反应液置于冰浴，缓慢加入烯丙基甘氨酸盐酸盐(485mg，3.2mmol)。该反应在室温下反应24h。反应液浓缩至干，乙酸乙酯复溶，水洗5次，饱和食盐水洗1次，有机层浓缩至干，经硅胶柱层析分离可得目标产物1-E(1.1g，82％)。1H NMR(500MHz，Chlorofbrm-d)δ7.97(d，J＝9.2Hz，1H)，7.84-7.78(m，2H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.89-5.74(m，2H)，5.14(dq，J＝9.7，1.1Hz，2H)，5.04(dt，J＝9.7，1.0Hz，2H)，4.52-4.45(m，3H)，4.33(t，J＝5.5Hz，1H)，4.17(dt，J＝9.3，5.4Hz，1H)，2.89(s，3H)，2.61(dddt，J＝13.7，7.3，5.5，1.0Hz，1H)，2.52(ddt，J＝7.3，5.5，1.1Hz，2H)，2.41(dddt，J＝13.6，7.3，5.5，0.9Hz，1H).MS(ESI)：449.2[M+H]+
化合物1的合成：
Figure GDA0003702711290000101
将化合物1-E(1.24g，3.1mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，加入Grubbs’2nd催化剂(79mg，3mmol％)。该反应在氮气保护下，回流反应2天。反应结束后，反应液用二氯甲烷稀释，水洗3次，饱和食盐水洗1次，有机相浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝100∶1)可得化合物1(1.04g，80％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.95(d，J＝9.3Hz，1H)，7.84-7.78(m，2H)，7.71-7.61(m，4H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.70-5.58(m，2H)，4.53(dd，J＝10.7，5.4Hz，1H)，4.42(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.34-4.25(m，3H)，3.06(s，3H)，2.50-2.39(m，3H)，2.39-2.27(m，1H).MS(ESI)：421.2[M+H]+
实施例2
Figure GDA0003702711290000102
的制备
取化合物1(1.24g，3.1mmol)溶于15mL四氢呋喃中，加入124mg的10％Pd/C。该反应在氢气氛下，45℃反应8h。反应结束后，硅藻土助滤除去不溶物，滤饼用乙酸乙酯洗涤2次。合并有机相，浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝100∶1)可得化合物2(1.25g，99％)。1HNMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.6，1.2Hz，2H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.69-7.60(m，3H)，7.55(td，J＝7.6，1.3Hz，2H)，4.61(t，J＝6.0Hz，1H)，4.53(dd，J＝10.7，5.4Hz，1H)，4.42(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.28(dt，J＝9.4，5.9Hz，2H)，3.02(s，2H)，1.97-1.85(m，2H)，1.85-1.75(m，1H)，1.77-1.66(m，1H)，1.68-1.58(m，1H)，1.61-1.50(m，3H).MS(ESI)：423.2[M+H]+
实施例3
Figure GDA0003702711290000111
的制备
化合物3的总合成路线如下：
Figure GDA0003702711290000112
化合物3-B的合成：
Figure GDA0003702711290000113
化合物3-A(0.7mL，5.4mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL)中，缓慢滴加氯磺酰异氰酸酯0.52mL，该反应液在氮气氛下回流2天。反应结束后，向反应液中加入预先配好的10％亚硫酸钠和10％氢氧化钾水溶液各10mL，使反应液的pH值保持在9。混合液分液，取有机层水洗3次，饱和食盐水洗1次，并浓缩至干。粗品经乙酸乙酯重结晶可得目标产物3-B，(620mg，79％)可直接进行下一步反应。MS(ESI)：154.1[M+H]+
化合物3-C的合成：
Figure GDA0003702711290000121
取化合物3-B(190mg，1.3mmol)和四丁基溴化铵(42mg，0.13mmol)溶于5mL四氢呋喃中，加入碘甲烷(121μL，1.95mmol)和氢氧化钾(80mg，1.43mmol)。该反应液在常温下反应8小时。反应结束后，反应液用2M HCl调节pH至4，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，水洗3次，饱和食盐水洗1次，浓缩至干。粗品经乙醚重结晶可得目标产物3-C(620mg，91％)，可直接进行下一步反应。MS(ESI)：165.2[M+H]+
化合物3-D的合成：
Figure GDA0003702711290000122
取化合物3-D(190mg，1.2mmol)溶于5mL 6M盐酸中，反应液在60℃下反应8小时。反应结束后，反应液浓缩至干，加入乙醚常温搅拌。化合物3-D可从乙醚中析出。抽滤即可得化合物3-D(188mg，71％)。MS(ESI)：186.1[M-HCl+H]+
化合物3的合成：
Figure GDA0003702711290000123
取化合物3-D(190mg，0.85mmol)，溶于10mL 10％的碳酸钠和10mL丙酮的混合液中，向该混合物中加入Fmoc-OSu(344mg，1mmol)，反应在室温下反应24h。反应结束后，反应液用2M HCl调节pH至3，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，水洗3次，饱和食盐水洗1次，有机相浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝75∶1)可得化合物3(325.6mg，90％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.9，1.2Hz，2H)，7.73-7.62(m，4H)，7.56(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，4.53(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.38(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.32-4.26(m，1H)，4.06(dt，J＝6.4，5.5Hz，1H)，2.97(s，3H)，2.87(q，J＝6.3Hz，1H)，1.88-1.75(m，2H)，1.75-1.62(m，2H)，1.60-1.27(m，8H).MS(ESI)：408.5[M+H]+
实施例4
Figure GDA0003702711290000131
的制备
化合物4的总合成路线如图：
Figure GDA0003702711290000132
按照实施例1的化合物1的制备，将起始原料Fmoc-烯丙基甘氨酸(1-A)更换为Fmoc-(3-丁烯)甘氨酸(1g，3mmol)，可得目标产物化合物4-B(1.12g，84％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.9，1.2Hz，2H)，7.73-7.63(m，4H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.86(tt，J＝13.8，6.2Hz，1H)，5.18(d，J＝9.1Hz，1H)，5.11(d，J＝9.1Hz，1H)，5.05(dt，J＝14.0，1.1Hz，2H)，4.54-4.45(m，3H)，4.29(t，J＝5.5Hz，1H)，2.39-2.28(m，1H)，2.28-2.17(m，1H)，2.08(dtd，J＝12.4，7.5，4.9Hz，1H)，1.75-1.64(m，1H).MS(ESI)：362.2[M+H]+
按照实施例1中的化合物1的制备，将中间体1-B更换为4-B(1.3g，3.6mmol)，可得目标产物4-C(1.09g，84％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.9，1.1Hz，2H)，7.73-7.63(m，4H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.87(tt，J＝13.8，6.2Hz，1H)，5.05(dt，J＝13.9，1.1Hz，2H)，4.55-4.45(m，3H)，4.29(t，J＝5.5Hz，1H)，3.10(s，3H)，2.37-2.21(m，2H)，2.04(dtd，J＝11.9，7.5，6.0Hz，1H)，1.77(dtd，J＝11.9，7.5，6.0Hz，1H).MS(ESI)：364.3[M+H]+
按照实施例1中的化合物1的制备，将中间体1-C更换为4-C(1.13g，3.2mmol)，可得目标产物4-D粗品，可不经纯化直接进行下一步反应。
按照实施例1中的化合物1的制备，将中间体1-D更换为4-D(1.6g，3.2mmol)，可得目标产物3-E(1.0g，78％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ8.04(d，J＝9.3Hz，1H)，7.84-7.78(m，2H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.87(ttd，J＝13.9，6.2，3.1Hz，2H)，5.05(dq，J＝13.7，0.9Hz，4H)，4.86(t，J＝6.0Hz，1H)，4.48(d，J＝5.4Hz，2H)，4.32-4.22(m，2H)，3.00(s，3H)，2.31-2.11(m，4H)，2.02-1.89(m，2H)，1.85-1.69(m，2H).MS(ESI)：477.1[M+H]+
按照实施例1中的化合物1的制备，将中间体1-E更换为4-E(1.6g，3.2mmol)，可得目标产物化合物4(890mg，66％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.84-7.78(m，2H)，7.73-7.61(m，5H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.60(dtt，J＝10.8，4.3，0.9Hz，1H)，5.52(dtt，J＝10.8，4.5，0.9Hz，1H)，4.53(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.37(dd，J＝10.7，5.4Hz，1H)，4.29(td，J＝5.8，3.6Hz，2H)，4.14(dt，J＝9.3，6.0Hz，1H)，2.99(s，3H)，2.26-1.82(m，8H).MS(ESI)：449.2[M+H]+
实施例5
Figure GDA0003702711290000141
的制备
按照实施例2中的化合物2的制备，将起始原料化合物1更换为化合物4(1.02g，3mmol)，可得目标产物化合物5(1.01g，99％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.84-7.78(m，2H)，7.77-7.68(m，3H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，4.53(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.43-4.34(m，2H)，4.30(dt，J＝9.2，5.9Hz，2H)，2.95(s，3H)，1.89-1.78(m，3H)，1.78-1.67(m，2H)，1.57-1.43(m，3H)，1.43-1.38(m，2H)，1.38-1.28(m，3H).MS(ESI)：424.8[M+H]+
实施例6
Figure GDA0003702711290000151
的制备
化合物6的总合成方法如下所示：
Figure GDA0003702711290000152
取化合物6-1(6g，17.4mmol)溶于二氯甲烷(84mL)中，该反应液移至-60℃冷肼中，向反应液中鼓臭氧气体，1.5小时后，反应液缓慢升温至室温，向反应液中鼓入氮气以排除未反应完的臭氧。再将反应液移至冰浴下，缓慢加入二甲硫醚(101.8mmol，38mL)。反应在室温下搅拌5天。反应结束后，反应液浓缩至干，经硅胶柱色谱层析(hexane∶EA＝8∶2)可得目标产物6-2(4.53g，75％)。1H NMR(200MHz，CDCl3)：δ＝1.4-1.5(2s，9H)，1.6-2.4(m，4H)，2.4-3.2(m，2H)，4.3-4.5(m，2H)，5.15(s，2H)，7.30(m，5H)，9.8(2s，1H).MS(ESI)：347.3[M+H]+
取叔丁醇钾(825mg，7.36mmol)溶于40mL无水DCM中，-78℃下搅拌10分钟。另外将(±)苄基氧基羰基-a-膦酰甘氨酸三甲酯(2.5g，7.36mmol)溶于5mL无水DCM中，缓慢滴加入叔丁醇钾的DCM溶液中，该反应在-78℃下反应0.5h。另外将化合物6-2(2.6g，7.36mmol)溶于25mL无水DCM中，加入到前述混合液中。该反应在-78℃下反应5h。反应结束后，反应液用磷酸盐缓冲液淬灭，水相用DCM萃取3次，合并有机相，水洗3次，饱和食盐水洗1次，有机相浓缩至干，经硅胶柱层析分离(hexane∶EA＝2∶1)可得目标产物6-3(Z/E混合物，总产率98％)。MS(ESI)：552.6[M+H]+
取化合物6-3(6g，11.0mmol)溶于干燥THF(40mL)中，加入Boc2O(4.8g，22.0mmol)和催化量的DMAP，该反应在室温下反应30分钟。反应结束后，反应液加水终止反应，乙酸乙酯萃取3次，水洗1次，饱和氯化钠水溶液洗1次，有机相浓缩至干，经硅胶柱层析分离(Hexane∶EA＝7∶3)可得目标产物6-4(7.1g，98％)。δ＝1.25-1.50[3s，9H]，1.5-2.3(m，4H)，2.8-3.3(m，2H)，3.8(2s，3H)，4.1(m，1H)，4.25(m，1H)，5.15(2s，4H)，6.30(m，1H)，7.30(m，10H).MS(ESI)：652.3[M+H]+
取化合物6-4(320mg，0.49mmol)溶于5mL甲醇中，加入催化量的10％Pd/C，该反应在室温氢气氛下反应12小时。反应结束后，过滤除去催化剂，甲醇洗涤滤饼，有机相合并经硅胶柱层析分离(hexane∶EA＝7∶3)可得目标产物6-5(122mg，70％)。1H NMR(200MHz，CDCl3)：δ＝1.43-1.45(2s，18H)，1.5-2.5(m，8H)，3.69(m，1H)，4.1(m，1H)，4.38(dd，J＝7.7Hz，J＝1.8Hz，1H)，5.59(d，J＝5.4Hz，1H)。MS(ESI)：340.2[M+H]+
取化合物6-5(120mg，0.35mmol)溶于无水乙酸乙酯1mL中，加入1mL自制的4M EA/HCl，在室温下反应12小时。反应结束后抽滤，滤饼即为化合物6-6的二盐酸盐，可不经纯化直接进行下一步反应。
取化合物6-6(2HCl)粗品(约0.3mmol)溶于3mL丙酮和3mL 10％Na2CO3水溶液中，向该溶液中加入Fmoc-OSu(122mg，0.36mmol)，该反应在室温下搅拌1天。反应结束后，用2M盐酸溶液调节pH至2-3，乙酸乙酯萃取3次，水洗1次，饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝200∶1)可得目标产物化合物6(102mg)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.84-7.78(m，2H)，7.73-7.62(m，4H)，7.55(td，J＝7.7，1.2Hz，2H)，5.38(d，J＝9.7Hz，1H)，4.37(dd，J＝10.7，5.4Hz，1H)，4.30(dd，J＝10.7，5.6Hz，1H)，4.22(ddd，J＝6.0，5.5，0.8Hz，1H)，3.95-3.86(m，1H)，3.39(dd，J＝11.1，3.4Hz，1H)，3.20-3.14(m，1H)，2.98(ddt，J＝6.6，4.8，4.0Hz，1H)，2.75(dd，J＝11.1，5.8Hz，1H)，2.17-2.07(m，1H)，2.07-1.98(m，1H)，1.98-1.91(m，1H)，1.91-1.79(m，2H)，1.75-1.61(m，3H).MS(ESI)：406.3[M+H]+
实施例7
Figure GDA0003702711290000171
的制备
化合物7的总合成路线如下所示：
Figure GDA0003702711290000172
取化合物7-1(3.03g，10mmol)，N，O-二甲基羟胺盐酸盐(1.07g，11mmol)，HOBt(1.62g，12mmol)，DIPEA(5.3mL，30mmol)溶于50mL无水四氢呋喃中，反应液置于0℃下，缓慢加入EDCI(2.5g，13mmol)，反应液移至室温，反应1天。反应结束后，反应液用乙酸乙酯稀释，饱和碳酸氢钠溶液洗2次，水洗3次，饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干，可得化合物7-2粗品，无需进一步纯化直接进行下一步反应。
取化合物7-2粗品(约5mmol)，溶于50mL无水四氢呋喃中，反应液移至0℃，缓慢加入三叔丁氧基氢化铝锂(3.8g，15mmol)反应液移至室温下搅拌3小时。反应结束后，反应液用饱和硫酸氢钠溶液淬灭，乙酸移至萃取3次，水洗3次，饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干，可得化合物7-3粗品，无需进一步纯化直接进行下一步反应。
取化合物7-3粗品(约3mmol)溶于15mL无水DCM中，向该溶液中依次加入半胱氨酸乙酯盐酸盐(710mg，4.5mmol)，醋酸钠(370mg，4.5mmol)。该反应在室温下反应1天。反应结束后，二氯甲烷稀释反应液，有机相水洗3次，饱和食盐水洗1次，有机相浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝300∶1)可得目标化合物7-4(813mg)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.37-7.27(m，10H)，5.81(d，J＝9.3Hz，2H)，5.08(qt，J＝11.8，0.9Hz，4H)，4.28-4.18(m，3H)，4.18-4.11(m，3H)，3.86-3.78(m，2H)，3.68(ddd，J＝8.8，3.7，2.7Hz，2H)，3.61-3.53(m，2H)，3.02(dd，J＝14.2，2.7Hz，2H)，2.93(dd，J＝14.3，3.7Hz，2H)，1.98-1.92(m，1H)，1.92-1.85(m，4H)，1.85-1.82(m，1H)，1.75-1.64(m，2H)，1.41(s，18H)，1.26(t，J＝6.9Hz，6H).MS(ESI)：452.2[M+H]+
取化合物7-4(900mg，2mmol)溶于乙酸乙酯(2mL)中，加入2mL自制4MEA/HCl溶液，该反应在室温下反应12小时。反应结束后，抽滤可得化合物7-5的盐酸盐，可不经纯化直接进行下一步反应。
取化合物7-5的盐酸盐(约2mmol)溶于4mL DMF中，依次加入DIPEA(1mL，6mmol)和HATU(1.2g，3mmol)，该反应在室温下反应24小时。反应结束后，反应液用乙酸乙酯稀释，分别用1M盐酸溶液，1M碳酸氢钠溶液，水洗3次，饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝500∶1)可得目标产物化合物7-6(390mg)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.36-7.26(m，5H)，6.34(d，J＝9.9Hz，1H)，5.14-5.04(m，2H)，4.95(ddd，J＝6.0，4.0，2.9Hz，2H)，4.42(ddd，J＝10.1，6.7，4.4Hz，1H)，4.23(dq，J＝9.9，6.9Hz，1H)，4.08(dq，J＝10.1，6.9Hz，1H)，3.30(dd，J＝13.3，2.8Hz，1H)，3.13(dd，J＝13.3，3.8Hz，1H)，2.31-2.21(m，1H)，2.12(dddd，J＝13.2，8.2，5.9，4.3Hz，1H)，1.98(ddt，J＝12.3，8.2，6.0Hz，1H)，1.70(dddd，J＝13.2，8.2，6.6，5.9Hz，1H)，1.26(t，J＝6.9Hz，3H).MS(ESI)：379.4[M+H]+
取化合物7-6(1.1g，3mmol)溶于15mL甲醇中，加入10％(w/w)的10％Pd/C，该反应在室温氢气氛下反应12小时。反应结束后，过滤除去催化剂，甲醇洗涤滤饼，有机相合并，浓缩至干，复溶于3mL 6M稀盐酸中，该反应在60℃下反应6小时。反应结束后，反应液浓缩至干得目标产物7-7盐酸盐粗品，可不经纯化直接进行下一步反应。
取化合物7-7盐酸盐粗品(约2.5mmol)溶于25mL丙酮和25mL 10％碳酸氢钠水溶液中，加入Fmoc-OSu(1g，3mmol)。该反应在室温下反应24小时。反应结束后，用2M稀盐酸调节pH至2-3，乙酸乙酯萃取3次，水洗3次，饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干，经硅胶柱色谱层析(DCM∶MeOH＝75∶1)可得目标产物化合物7(850mg)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.7，1.2Hz，2H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，6.09(d，J＝10.0Hz，1H)，5.05-4.99(m，1H)，4.82(dd，J＝3.8，2.8Hz，1H)，4.37(dd，J＝10.7，5.4Hz，1H)，4.30(dd，J＝10.7，5.6Hz，1H)，4.22(ddd，J＝5.9，5.4，0.7Hz，1H)，4.07-3.98(m，1H)，3.43(dd，J＝13.4，2.7Hz，1H)，3.11(dd，J＝13.4，3.8Hz，1H)，2.20-2.07(m，2H)，1.96(ddt，J＝12.3，8.2，6.2Hz，1H)，1.77-1.66(m，1H).MS(ESI)：439.1[M+H]+
实施例8
Figure GDA0003702711290000191
的制备
化合物8A/8B的总合成路线如下：
Figure GDA0003702711290000192
将化合物8-1(3.27g，10mmol)，化合物8-2(2.19g，10mmol)，HOBt(1.76g，13mmol)溶于50mL THF中，反应液移至0℃，向该溶液中缓慢加入EDCI(3.26g，17mmol)。该反应液在室温下反应24小时。反应结束后，反应液用乙酸乙酯稀释，水洗3次，饱和食盐水洗1次，有机相浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM∶MeOH＝150∶1)可得目标产物化合物8-3(4.7g，90％)。1HNMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.89-7.78(m，3H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.56(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，7.38-7.27(m，5H)，6.45(d，J＝9.3Hz，1H)，5.85(tt，J＝13.9，6.2Hz，1H)，5.18(s，2H)，5.05(dt，J＝14.0，1.0Hz，2H)，4.84(dt，J＝9.3，6.4Hz，1H)，4.48-4.41(m，1H)，4.37(dd，J＝10.7，5.4Hz，1H)，4.30(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.26-4.19(m，1H)，4.08(dt，J＝9.3，6.0Hz，1H)，3.70(ddd，J＝11.7，7.1，6.4Hz，1H)，3.59(ddd，J＝11.7，7.1，6.4Hz，1H)，2.37-2.26(m，1H)，2.15-2.04(m，1H)，1.92(dtd，J＝12.6，7.5，6.0Hz，1H)，1.77-1.67(m，1H).MS(ESI)：529.2[M+H]+
将化合物8-3(9.2g，17.4mmol)溶于二氯甲烷(84mL)中，该反应液移至-60℃冷肼中，向反应液中鼓臭氧气体，1.5小时后，反应液缓慢升温至室温，向反应液中鼓入氮气以排除未反应完的臭氧。再将反应液移至冰浴下，缓慢加入二甲硫醚(101.8mmol，38mL)。反应在室温下搅拌5天。反应结束后，反应液浓缩至干，经硅胶柱色谱层析(DCM∶MeOH＝100∶1)可得目标产物8-4(6.9g，76％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ9.72(t，J＝3.8Hz，1H)，7.89-7.78(m，3H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.56(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，7.38-7.27(m，5H)，6.56(d，J＝9.3Hz，1H)，5.27-5.21(m，1H)，5.12(d，J＝11.9Hz，1H)，4.54(dt，J＝9.3，6.3Hz，1H)，4.48-4.33(m，3H)，4.31(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.22(td，J＝5.6，0.7Hz，1H)，3.68(ddd，J＝11.7，7.1，6.4Hz，1H)，3.59(ddd，J＝11.7，7.0，6.3Hz，1H)，2.60-2.43(m，2H)，2.25-2.14(m，1H)，2.03(dtd，J＝12.9，7.5，6.0Hz，1H).MS(ESI)：531.2[M+H]+
将化合物8-4(0.92g，1.73mmol)溶于10mL无水DCM中，加入1mL TFA，该反应液在40℃下回流反应1小时。反应结束后，反应液浓缩至干，经硅胶柱色谱层析(100％DCM)可得目标产物8-5A(80mg，9％)和8-5B(640mg，72％)。1H NMR(8-5A)(500MHz，Chloroform-d)δ7.84-7.78(m，2H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.56(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，7.38-7.27(m，5H)，5.94(d，J＝10.0Hz，1H)，5.39-5.34(m，1H)，5.21(d，J＝11.9Hz，1H)，5.13(dd，J＝11.9，0.9Hz，1H)，4.90(ddd，J＝9.9，6.7，4.4Hz，1H)，4.54-4.47(m，1H)，4.37(dd，J＝10.7，5.4Hz，1H)，4.31(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.22(dd，J＝5.7，5.0HZ，1H)，4.11(dd，J＝11.4，4.4Hz，1H)，3.81(dd，J＝11.3，6.8Hz，1H)，2.21-2.08(m，3H)，2.01-1.91(m，1H).
1H NMR(8-5B)(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.8，1.1Hz，2H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.56(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，7.38-7.27(m，5H)，5.94(d，J＝10.0Hz，1H)，5.37(dd，J＝3.9，3.1Hz，1H)，5.24-5.17(m，1H)，5.16-5.10(m3-，1H)，4.90(ddd，J＝10.1，6.7，4.4Hz，1H)，4.49(dd，J＝4.9，3.8Hz，1H)，4.37(dd，J＝10.7，5.4Hz，1H)，4.31(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.22(ddd，J＝6.0，5.4，0.8Hz，1H)，4.10(dd，J＝11.4，4.4Hz，1H)，3.81(dd，J＝11.3，6.7Hz，1H)，2.24-2.14(m，1H)，2.14-2.02(m，2H)，1.98-1.88(m，1H).MS(ESI)：513.2[M+H]+
将化合物8B 640mg溶于5mL三氟醋酸中，室温搅拌3天，可得化合物8A480 mg。1H-NMR和MS数据与前述8A数据完全一致。
取化合物8-5A或8-5B(640mg)溶于15mL甲醇中，加入10％(w/w)的10％Pd/C，该反应在45℃氢气氛下反应12小时。反应结束后，过滤除去催化剂，甲醇洗涤滤饼，有机相合并，浓缩至干，可得目标产物8A或8B，可不经纯化直接进行下一步反应。
实施例9
Figure GDA0003702711290000211
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用衍生物为实施例4中的化合物4，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”，可得直链肽前体粗品。取60mg该粗品溶于乙腈∶0.1M碳酸铵＝1∶1(体积比)总共60mL溶液中，该反应在室温搅拌5小时。将反应液旋干，经冷冻干燥后得到粉末状混合物。将该混合物溶于乙腈∶水＝1∶1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得大环化合物前体纯品。tR＝18.550min。
HRESIMS：[M+H]+＝1883.0002.
实施例10
Figure GDA0003702711290000212
将实施例9中的化合物9纯品5mg，溶于乙腈∶水＝1∶1(体积比)总共0.6mL中，向该溶液中加入0.07mL 30％H2O2，在室温下搅拌3小时。反应结束后，过量的双氧水用抗坏血酸破坏，溶液浓缩至干，冷冻干燥可得粗品。根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.760min。HRESIMS：[M+H]+＝1896.9560.
实施例11
Figure GDA0003702711290000221
按照实施例10的制备方法，tR＝18.800min，HRESIMS：[M+H]+＝1896.9561.
实施例12
Figure GDA0003702711290000222
按照实施例9所述合成方法，将选用的衍生物更换为实施例3中的化合物3。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.607min，HRESIMS：[M+H]+＝1801.2036.
实施例13
Figure GDA0003702711290000231
按照实施例10的合成方法，将原料更换为实施例12中的化合物12。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.637min，HRESIMS：[M+H]+＝1829.9102.
实施例14
Figure GDA0003702711290000232
按照实施例13的制备方法，tR＝18.731min，HRESIMS：[M+H]+＝1829.8996.
实施例15
Figure GDA0003702711290000241
按照实施例9的制备方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例1的化合物1，。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.642min，HRESIMS：[M+H]+＝1826.8311.
实施例16
Figure GDA0003702711290000242
按照实施例10的合成方法，将起始原料更换为实施例15中的化合物15，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.633min，HRESIMS：[M+H]+＝1856.8922.
实施例17.
Figure GDA0003702711290000251
按照实施例16的合成方法，tR＝18.666min，HRESIMS：[M+H]+＝1856.8921.
实施例18
Figure GDA0003702711290000252
根据实施例9的合成方法，将所需的氨基酸衍生物更换为实施例1中的化合物1，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝17.925min，HRESIMS：[M+H]+＝1826.8611.
实施例19
Figure GDA0003702711290000261
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将起始原料更换为实施例18中的化合物18，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.266min，HRESIMS：[M+H]+＝1856.8922.
实施例20
Figure GDA0003702711290000262
根据前述实施例19的合成方法可得，tR＝18.285min，HRESIMS：[M+H]+＝1856.8862.
实施例21
Figure GDA0003702711290000271
根据前述实施例9的合成方法，将所需的氨基酸衍生物更换为实施例4中的化合物4，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.266min，HRESIMS：[M+H]+＝1854.8922.
实施例22
Figure GDA0003702711290000272
根据前述实施例10的方法，将起始原料更换为实施例21中的化合物2。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.234min，HRESIMS：[M+H]+＝1884.9029.
实施例23
Figure GDA0003702711290000281
根据前述实施例22的合成方法可得。tR＝18.246min，HRESIMS：[M+H]+＝1884.9132.
实施例24
Figure GDA0003702711290000282
根据前述实施例9的合成方法，将氨基酸衍生物更换为实施例3中的化合物3，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.762min，HRESIMS：[M+H]+＝1813.9055.
实施例25
Figure GDA0003702711290000291
根据前述实施例10的合成方法，将起始原料更换为实施例24中的化合物2。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.633min，HRESIMS：[M+H]+＝1843.9167.
实施例26
Figure GDA0003702711290000292
根据前述实施例25的合成方法可得。tR＝18.246min，HRESIMS：[M+H]+＝1843.9333.
实施例27
Figure GDA0003702711290000301
根据前述实施例9的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例5中的化合物5。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.665min，HRESIMS：[M+H]+＝1884.9399.
实施例28
Figure GDA0003702711290000302
根据前述实施例10的合成方法，将起始原料更换为实施例27中的化合物27.所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.331min，HRESIMS：[M+H]+＝1883.9693.
实施例29
Figure GDA0003702711290000311
根据前述实施例28的合成方法可得。tR＝18.662min，HRESIMS：[M+H]+＝1883.2355.
实施例30
Figure GDA0003702711290000312
根据实施例9的合成方法，将所需的氨基酸衍生物更换为实施例2中的化合物2，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.041min，HRESIMS：[M+H]+＝1828.8622.
实施例31
Figure GDA0003702711290000321
按照实施例10的合成方法，将起始原料更换为实施例30中的化合物30，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝19.233min，HRESIMS：[M+H]+＝1858.8622.
实施例32
按照实施例31的合成方法，tR＝19.252min，HRESIMS：[M+H]+＝1858.8920.
Figure GDA0003702711290000322
实施例33
Figure GDA0003702711290000331
根据实施例9的合成方法，将所需的氨基酸衍生物更换为实施例2中的化合物2，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.041min，HRESIMS：[M+H]+＝1828.8622.
实施例34
Figure GDA0003702711290000332
按照实施例10的合成方法，将起始原料更换为实施例33中的化合物33，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.002min，HRESIMS：[M+H]+＝1834.8922.
Figure GDA0003702711290000341
按照实施例16的合成方法，tR＝18.101min，HRESIMS：[M+H]+＝1834.8999.
实施例36
根据前述实施例9的合成方法，将所需的氨基酸衍生物更换为实施例5中的化合物5，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.556min，HRESIMS：[M+H]+＝1856.8922.
Figure GDA0003702711290000342
实施例37
Figure GDA0003702711290000351
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将起始原料更换为实施例36中的化合物36，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.602min，HRESIMS：[M+H]+＝1872.8822.
实施例38
Figure GDA0003702711290000352
根据前述实施例37的合成方法可得，tx＝18.633min，HRESIMS：[M+H]+＝1872.8866.
实施例39
Figure GDA0003702711290000361
根据前述实施例9的合成方法，将所需的氨基酸衍生物更换为实施例6中的化合物6，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝22.236min，HRESIMS：[M+H]+＝1855.9444.
实施例40
Figure GDA0003702711290000362
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将起始原料更换为实施例39中的化合物39，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝22.562min，HRESIMS：[M+H]+＝1871.9122.
实施例41
Figure GDA0003702711290000371
根据前述实施例40的合成方法可得，tR＝22.585min，HRESIMS：[M+H]+＝1871.9000.
实施例42
Figure GDA0003702711290000372
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例7中的化合物7，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝22.732mm，HRESIMS：[M+H]+＝1873.9022.
实施例43
Figure GDA0003702711290000381
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将起始原料更换为实施例42中的化合物42，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝22.881min，HRESIMS：[M+H]+＝1890.0002.
实施例44
Figure GDA0003702711290000382
根据前述实施例43的合成方法可得，tR＝22.998min，HRESIMS：[M+H]+＝1889.9996.
实施例45
Figure GDA0003702711290000391
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例8中的化合物8B，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝21.011min，HRESIMS：[M+H]+＝1857.9922.
实施例46
Figure GDA0003702711290000392
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将起始原料更换为实施例45中的化合物45，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝21.025min，HRESIMS：[M+H]+＝1874.0004.
实施例47
Figure GDA0003702711290000401
根据前述实施例46的合成方法可得，tR＝21.079min，HRESIMS：[M+H]+＝1873.9981.
实施例48
Figure GDA0003702711290000402
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例8中的化合物8A，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝21.011min，HRESIMS：[M+H]+＝1857.9921.
实施例49
Figure GDA0003702711290000411
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将起始原料更换为实施例48中的化合物48，所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝21.025min，HRESIMS：[M+H]+＝1874.0003.
实施例50
Figure GDA0003702711290000412
根据前述实施例49的合成方法可得，tR＝21.079min，HRESIMS：[M+H]+＝1873.9980.
实施例51
Figure GDA0003702711290000421
根据根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-脲基丙酸可得。根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝18.033min，HRESIMS：[M+H]+＝1929.0001.
实施例52
Figure GDA0003702711290000422
的制备
化合物52的总合成路线如下所示：
Figure GDA0003702711290000431
取化合物52-1(4.26g，10mmol)溶于10mL 5％哌啶/DMF溶液中，该反应液在室温下搅拌过夜，反应结束后，反应液浓缩至干，加入正己烷搅拌过夜。所得沉淀即为目标产物52-2，可不经纯化直接进行下一步反应。
取化合物52-2(约10mmol)溶于50mL无水乙腈中，加入市售的4-(吡啶-4-基)苯甲醛(1.85g，10mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(3.2g，15mmol)。该反应在室温下搅拌过夜。反应结束后，反应液用乙酸乙酯稀释，碳酸氢钠水溶液洗3次。有机相浓缩至干，经硅胶柱色谱层析(DCM∶MeOH＝50∶1)可得目标产物52-3(3.4g，90％)。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ8.71-8.66(m，2H)，7.68-7.63(m，2H)，7.61-7.55(m，2H)，7.28(dt，J＝8.4，1.0Hz，2H)，6.40(t，J＝5.3Hz，1H)，3.91-3.68(m，5H)，3.43(dt，J＝12.7，5.1Hz，1H)，1.43(s，9H).MS(ESI)：372.2[M+H]+
取化合物52-3(3.7g，10mmol)溶于50mL丙酮和50mL 10％碳酸钠水溶液中，溶液移至0℃，加入Fmoc-OSu(4g，12mmol)。反应液移至室温并搅拌24小时。反应结束后，反应液用2M盐酸溶液调节pH至3，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，水洗3次。有机相浓缩至干，经硅胶柱色谱层析分离(DCM∶MeOH＝150∶1)可得目标产物。1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ8.70-8.65(m，2H)，7.81(dd，J＝7.7，1.2Hz，2H)，7.73-7.54(m，10H)，7.37(dt，J＝8.4，1.1Hz，2H)，6.37(t，J＝5.3Hz，1H)，5.09(t，J＝5.2Hz，1H)，4.68(dt，J＝12.6，0.9Hz，1H)，4.45(d，J＝5.5Hz，2H)，4.36-4.26(m，2H)，3.60(dt，J＝11.9，5.2Hz，1H)，3.51(dt，J＝11.9，5.2Hz，1H)，1.43(s，9H).MS(ESI)：594.9[M+H]+
实施例53
Figure GDA0003702711290000441
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例52中的化合物52，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝21.121min，HRESIMS：[M+H]+＝2084.0291.
实施例54
Figure GDA0003702711290000442
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例4中的化合物4和实施例6中的化合物6，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝19.885min，HRESIMS：[M+H]+＝1851.9633.
实施例55
Figure GDA0003702711290000451
的制备
根据前述实施8中的化合物8A的合成方法，将起始原料之一“Fmoc-L-Ser-OH”更换为“Fmoc-L-Homo-Ser-OH”。可得目标化合物55.1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.7，1.1Hz，2H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，5.90(d，J＝12.2Hz，1H)，5.44-5.38(m，1H)，4.61(ddd，J＝12.1，8.7，6.0Hz，1H)，4.53-4.47(m，1H)，4.37(dd，J＝10.6，5.3Hz，1H)，4.31(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.22(ddd，J＝6.1，5.5，0.8Hz，1H)，3.67(ddd，J＝11.7，9.3，6.8Hz，1H)，3.58(ddd，J＝11.7，9.4，6.9Hz，1H)，2.20-1.91(m，6H).MS(ESI)：437.5[M+H]+。
实施例56
Figure GDA0003702711290000452
的制备
Figure GDA0003702711290000453
根据前述实施例6中化合物6的合成方法，将起始原料化合物6-1更换为化合物56-1，可得目标产物化合物56.1H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.81(dd，J＝7.7，1.2Hz，2H)，7.70(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，7.65(td，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.55(td，J＝7.6，1.2Hz，2H)，6.19(d，J＝12.2Hz，1H)，4.61-4.46(m，3H)，4.37(dd，J＝10.6，5.3Hz，1H)，4.31(dd，J＝10.6，5.5Hz，1H)，4.26-4.19(m，1H)，2.27-2.18(m，1H)，2.09-1.97(m，2H)，1.96-1.86(m，1H)，1.87-1.62(m，6H).MS(ESI)：435.2[M+H]+。
实施例57
Figure GDA0003702711290000461
根据前述实施例9中化合物9的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例56中的化合物56，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝21.011min，HRESIMS：[M+H]+＝1869.9542.
实施例58
Figure GDA0003702711290000462
根据前述实施例10中化合物10的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例56中的化合物56，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝21.024min，HRESIMS：[M+H]+＝1898.9611.
实施例59
Figure GDA0003702711290000471
根据前述实施例59的合成方法可得，tR＝21.052min，HRESIMS：[M+H]+＝1898.6623.
实施例60
Figure GDA0003702711290000472
根据前述实施例9中化合物9的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例55中的化合物55，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝20.002min，HRESIMS：[M+H]+＝1871.9665.
实施例61
Figure GDA0003702711290000481
根据前述实施例9中化合物9的合成方法，将所需氨基酸衍生物更换为实施例60中的化合物60，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR＝20.863min，HRESIMS：[M+H]+＝1887.9212.
实施例62
Figure GDA0003702711290000482
根据前述实施例61的合成方法可得，tR＝21.996min，HRESIMS：[M+H]+＝1887.9291.
体外抑制活性的测定
1.均相时间荧光法测定实施例抑制PD-1/PD-L1相互作用的评估：
PD-1和PD-L1的相互作用可使用两种蛋白的胞外域部分的重组蛋白测定。PD-1和PD-L1蛋白质细胞外结构域表达为具有检测标签的融合蛋白，对于PD-1，标签是免疫球蛋白(PD-1-Ig)的Fc部分，对于PD-L1，它是6组氨酸基序(PD-L1-His)。人PD-1(25-167)，具有免疫球蛋白G(Ig)表位标签[hPD-1(25-167)-3S-IG]的C末端人Fc结构域和人PD-L1(18-239)具有C末端His表位标签[hPD-L1(18-239)-TVMV-His1]在HEK293T细胞中表达，并通过蛋白A亲和层析和尺寸排阻层析依次纯化。
相互作用研究均在由额外添加0.1％(含)牛血清白蛋白和0.05％(v/v)Tween-20的dPBS组成的HTRF测定缓冲液中进行。对于hPD-L1-His结合测定，将抑制剂与PD-L1-His(终浓度10nM)在4ul测定缓冲液中预孵育15分钟，然后加入PD-1-Ig(终浓度20nM)。在1uL测定缓冲液中并进一步培养15分钟。使用铕钙磷酸盐标记的抗Ig(终浓度1nM)和异烟酞菁(APC)标记的抗His(最终20nM)实现HTRF检测。将抗体在HTRF检测缓冲液中稀释并取5ul。使反应混合物平衡30分钟，并使用EnVision荧光计获得所得信号(665nm/620nm)。
各个大环类化合物抑制PD-1/PD-L1相互作用测定结果如下表所示。
A：IC50＜100nM；B：100nM＜IC50＜10μM；C：10μM＜IC50＜100μM
实施例 IC<sub>50</sub> 实施例 IC<sub>50</sub> 实施例 IC<sub>50</sub> 实施例 IC<sub>50</sub>
9 A 22 A 35 A 48 A
10 A 23 A 36 A 49 A
11 A 24 A 37 A 50 A
12 A 25 A 38 A 51 A
13 A 26 A 39 A 53 A
14 A 27 A 40 A 57 A
15 A 28 A 41 A 58 A
16 A 29 A 42 A 59 A
17 A 30 A 43 A 60 A
18 A 31 A 44 A 61 A
19 A 32 A 45 A 62 A
20 A 33 A 46 A
21 A 34 A 47 A
如上表所示，实施例中的大环化合物均有一定的抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。
2.实施例刺激脾细胞增殖作用的评估：
人乳腺癌细胞MDA-MB-231表面表达有PD-L1蛋白，会激活PD-1/PD-L1通路，进而抑制T细胞的激活，引起T细胞增殖变缓，并减少IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子的释放。本实验的目的是检测化合物阻断MDA-MB-231细胞抑制人T细胞增殖的能力。
具体操作方法为：小鼠脾细胞是将小鼠脾脏在40um细胞滤网中捣碎后，在室温下用1mL ACK裂解缓冲液进一步处理5分钟得到。用9mL RPMI完全培养基洗涤后，将细胞重悬于15mL管中的3mL 1xPBS中。小心地将3mL Histopaque加入管底部，不干扰覆盖的脾细胞悬浮液。在室温下以800×g离心20分钟后，收集不透明的脾细胞层。得到的脾细胞再用冷PBS溶液冲洗两次，使用台盼蓝染色计数总细胞数用于之后的细胞层面测试。脾细胞在RPMI完全培养基(RPMI+10％胎牛血清+1mM丙酮酸钠+10,000u/mL青霉素和10,000ug/mL链霉素)中培养，并保持在37℃下含5％CO2的CO2培养箱中。
CFSE是一种被动扩散到细胞内并与细胞内蛋白结合的染料。1×106细胞/mL的脾细胞用5uM CFSE在预热的1x PBS/0.1％BSA溶液中于37℃处理10分钟。过量CFSE将5倍体积的0℃培养基淬灭至细胞中并在冰上孵育5分钟。用0℃完全RPMI培养基进一步洗涤CFSE标记的脾细胞三次。将CFSE标记的1×105脾细胞加入到含有MDA-MB-231细胞(在高葡萄糖DMEM培养基中培养1×105个细胞)或重组人PD-L1(100ng/mL)和测试化合物的孔中。用抗小鼠CD3和抗小鼠CD28抗体(各1ug/mL)刺激脾细胞，并将培养物在37℃，5％CO2下进一步培养72小时。收获细胞并用冰冷的FACS缓冲液洗涤三次，并通过流式细胞术用488nm激发和521nm发射滤光片分析百分比增殖。
使用FACS程序分析脾细胞增殖百分比，并且在扣除背景增殖值(％)并将刺激的脾细胞增殖(％，阳性对照)标准化为100％后以计算化合物回复脾细胞增殖百分比。
刺激的脾细胞：脾细胞+anti-CD3/CD28
刺激背景增殖：脾细胞+anti-CD3/CD28+PD-L1
化合物增殖：脾细胞+anti-CD3/CD28+PD-L1+化合物
通过添加所需浓度来检测化合物效果。在配体(PD-L1)存在下化合物对anti-CD3/CD28刺激的脾细胞的表达。
各个大环类化合物在5nM浓度下抑制PD-1/PD-L1相互作用测定结果如下表所示。
A：＞90％；B：70％＜IC50＜90％；C：50％＜IC50＜70％；D：＜50％
Figure GDA0003702711290000501
Figure GDA0003702711290000511
如上表所示，实施例中的大环化合物在人乳腺癌细胞MDA-MB-231存在下，均有一定的恢复被抑制的T细胞活性的能力和抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。

Claims (8)

1.一种大环类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于该化合物结构如通式(I)所示：
Figure FDA0003702711280000011
波浪线指代连接方式，
其中，通式中的Q可独立选自下列结构中的立体异构或消旋体中的一种；
Figure FDA0003702711280000012
A为氢原子或甲基；
M可独立选自于下列结构中的立体异构或消旋体中的一种；
Figure FDA0003702711280000021
L可独立选自于下列结构中的一种；
Figure FDA0003702711280000022
其中，R1为H或CONH2；
R2为H或
Figure FDA0003702711280000023
其中Y和Z中至少有一个为N，其它为CH。
2.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求1所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于药物组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
4.如权利要求1所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐在制备PD-1/PD-L1通路抑制剂中的应用。
5.如权利要求1所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐或权利要求2所述的药物组合物在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述预防或治疗肿瘤药物为PD-1/PD-L1通路的预防或治疗肿瘤药物。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述肿瘤为人乳腺癌，包括其在远离肿瘤原发部位的组织或器官的转移病变。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的预防或治疗肿瘤药物为癌症免疫治疗药物、癌症化疗药物或癌症靶向治疗药物。
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