KR20050032110A - 신규의 효능을 갖는 탁산을 포함하는 세포독성제 및 그치료용도 - Google Patents

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Abstract

[22]본 발명의 첫번째 실시예에서, 많은 질병들의 치료에 여전히 효과적으로 사용될 수 있고 또 높은 독성을 갖는 새로운 탁산이 공개된다.
[23]본 발명의 두번째 실시예에서, C-10 위치에서 자유 수산기기를 생성하고 C-7위치에서 연결기를 생성하며 여전히 높은 효능을 유지하는 새로운 탁산이 공개된다.
[24]본 발명의 세번째 실시예에서, C-3‘N 또는 C-3'에서 다양한 서로 다른 치환기를 생성하고, C-7, C-10, C-2' 또는 C'N 또는 C-3'에서 연결기를 생성하며 여전히 높은 효능을 유지하는 새로운 탁산이 공개된다.
[25]본 발명의 네번째 실시예에서, 연결기를 통하여 세포-결박 약제에 공유결합된 하나 또는 그 이상의 새로운 탁산을 포함하는 독성제가 공개된다.
[26]본 발명의 다섯번째 실시예에서, 다음을 포함하는 치료합성물이 공개된다.
(a)세포-결박약제에 연결된 하나 또는 그 이상 갯수의 새로운 탁산의 치료적 효능이 발현될 수 있는 양 및
(b)투약이 받아들여질만한 운반자, 희석제, 또는 첨가제
[27]본 발명의 여섯번째 실시예에서, 세포-결박 약제에 연결된 하나 또는 그 이상 개수의 새로운 탁산을 포함하는 독성제의 효과적인 용량으로, 표적세포를 접촉하거나 표적세포를 함유하고 있는 조직을 포함하는 선택된 세포 집단에서 세포죽음을 유발하는 방법이 공개된다.

Description

신규의 효능을 갖는 탁산을 포함하는 세포독성제 및 그 치료용도{CYTOTOXIC AGENTS CONTAINING NOVEL POTENT TAXANES AND THEIR THERAPEUTIC USE}
본 발명은, 여기서 참고문헌에 의해 구체화되는, 2002년 8월2일 출원된 USAN 10/210,112 발명의 계속출원발명이다.
본 발명은 새로운 독성인자 및 그 치료효능에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 새로운 탁산 및 그 치료효능을 포함하는 새로운 탁산, 새로운 독성인자에 관한 것이다. 선택된 세포 집단을 표적으로 삼을 능력을 갖는 세포-결합 인자에 탁산을 화학적으로 결합시킴에 의해서, 표적으로 된 부류내에서 선택된 세포집단에 전달되는 탁산에서 이 새로운 독성인자들은 치료효능을 갖고 있다.
독성 인자를 세포-결합 인자에 결합시킴으로써 표적전달에 의해서 독성인자들의 특이성은 크게 개선될 수 있다.
단일복제 항체-약제 종양세포에 대한 특정표적공격에 대한 많은 발표가 있어 왔다(Sela et al, in Immunoconjugates189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al, in Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, in Antibody mediated delivery systems 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al, in Antibody mediated delivery systems 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol et al, in Antibody mediated delivery systems 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988). 상기 언급된 모든 문헌 및 특허는 참고문헌에 의해 구체화된다.
methotrexate, daunorubicin, doxorubicin, vincristine, vinblastine, melphalan, mitomycin C, and chlorambucil과 같은 독성약제들은 다양한 설치류 단일복제항체에 결합되어왔다. 몇몇 경우에, 약제분자는 serum albumin (Garnett et al, Cancer Res. 46: -2412 (1986); Ohkawa et al, Cancer Immunol. Immunother. 23: 86 (1986); Endo et al, Cancer Res. 47: 1076-1080 (1980)), dextran (Hurwitz et al, Appl. Biochem. 2: 25-35 (1980); Manabi et al, Biochem. Pharmacol. 34: 289-291 (1985); Dillman et al, Cancer Res. 46: 4886-4891 (1986); Shoval et al , Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8276-8280 (1988)), or polyglutamic acid (Tsukada et al, J. Natl. Canc. Inst. 73: 721-729 (1984); Kato et al, J. Med. Chem. 27: 1602-1607 (1984); Tsukada et al, Br. J. Cancer 52: 111-116 (1985))과 같은 운반매개분자를 통하여 항체분자에 결합되었다.
많은 결합기술들이 그러한 면역결합을 준비하는데 이용되어 왔고, 분열 및 비분열 결합자들이 조사되어 왔다. 그러나, 대부분의 경우에, 약제분자들이 표적위치에서 가공되지 않은 형태로 결합으로부터 놓여질 수 있을 때에만 약제의 완전한 독성잠재성이 관측될 수 있다.
항체-약제 결합 준비를 위해 이용되어 왔던 분열가능한 결합자 중 하나는 리셉터가 엔도시토시스와 리소좀을 중재하는 동안에 마주치게 되는 엔도좀같은 서로 다른 세포내(intracellular) 구역에서의 산성조건에 대하여 유리한 입장에 있는 시스-아코니틴산(cis-aconitic acid)에 기초한 산 반응성(acid-labile) 결합자이다. 센과 라이저는 이 방법을 도입하여 다우노루비신(daunorubicin)과 고분자 운반자와의 결합을 준비했으며 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048-1054 (1981)). 양과 라이스펠트는 똑같은 기술을 사용하여 다우노루비신(daunorubicin)을 항-흑색종 항체와 결합시켰다(J. Natl. Canc. Inst. 80: 1154-1159 (1988)). 딜만 또한 비슷한 부류에서 산 반응성(acid-labile) 결합자를 사용하여 다우노루비신(daunorubicin)과 항-T세포 항체의 결합을 준비했다 (Cancer Res. 48: 6097-6102 (1988)).
뜨루에(Trouet)에 의해 탐색된 대안적인 접근은, 다우노루비신(daunorubicin)을 peptide spacer arm을 거쳐서 항체에 결합시키는 것을 수반한다(Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 626-629 (1982)). 이것은 속박되지 않은 약제가 lysosomal peptidases 의 작용에 의해 그러한 결합으로부터 놓여날 수 있다는 전제하에 이루어진다. 그러나, 생체 밖에서의 독성시험은, 결합없이 자유로운 약제와 동일한 정도의 독성 잠재성을 항체-약제 결합이 거의 달성하지 못한다는 것을 나타내왔다. 이것은 약제분자가 항체로부터 놓여지는 구조는 대단히 비효율적이라는 것을 암시한다.
면역독소영역에서, 이황화물을 거쳐 형성되는 결합들은 단일복제 항체들 사이에서 중개역할을 하고, 촉매로서 작용하는 단백질 독소들이 다른 결합자들을 포함하고 있는 결합들보다 더욱 독성이 있는 것으로 보여진다. Lambert et al, J. Biol. Chem. 260: 12035-12041 (1985); Lambert et al, in Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al, Cancer Res. 48: 2610-2617 (1988)을 보라.
이것은 항체분자와 독소 사이의 이황화결합의 효율적인 분열에 기여하는 세포내의 높은 글루타티온(glutathione)농도에 기여한다. 이것에도 불구하고, 약제와 고분자 사이의 결합 제조를 위한 이황화매개의 사용에 대한 보고예는 단지 몇몇개 뿐이다. 션(Shen et al, J. Biol. Chem. 260: 10905-10908 (1985))은 메토트렉사트(methotrexate)가 메르캅토에틸라미드(mercaptoethylamide) 파생물로 전환되고 이어서 이황화 결합을 거쳐 폴리-D-라이신과 결합하는 것을 기술했다. 또다른 보고는 항체와 함께 독성약제 칼리체아마이신(calicheamycin)을 포함하고 있는 3황화물 결합의 제조에 대하여 기술하고 있다 (Hinman et al, Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993)).
항체-약제 결합에 연결된 이황화물이 부족한 한가지 이유는 약제를 이황화물 다리를 경유하여 항체에 즉각 연결시킬 수 있는 부분을 포함하고 있는 황 원자를 갖고 있는 독성약제의 비이용성 때문이다.
항체-약제 결합의 존재를 방해하는 또다른 중요한 장애는 그것들이 표적위치에 약제의 충분한 농도를 공급할 능력이 없다는 것인데, 이는 표적으로 된 항원의 제한된 숫자 및 메토트랙세이트(methotrexate), 다우노루비친(daunorubicin), 및 빈크리스틴(vincristine) 같은 종양정지약제의 상대적으로 미약한 독성때문이다. 현저한 독성을 달성하기 위하여, 직접적으로 항체에 또는 중합체 전달 분자를 통하여 많은 개수의 약제분자의 결합이 필요해진다. 그러나, 그렇게 심각하게 변형된 항체들은 종종 표적항원에 결합하는 것을 약화시키고 생체내에서 혈류로부터의 빠른 제거를 저하시킨다.
이상 기술된 어려움에도 불구하고, 세포-결박부분 및 마이탄시노이드(maytansinoids)라고 알려진 독성약제기를 포함하는 유용한 독성제가 보고되어왔다(USP 5,208,020, USP 5,416,064, and R. V. J. Chari, Advanced Drug Delivery Reviews 31: 89-104 (1998)). 유사하게, 세포-결박부분 및 효능있는한 항종양 항생물질CC-1065의 유사물질 및 파생물질을 포함하는 유용한 독성제들이 또한 보고되어왔다(USP 5,475,092 and USP 5,585,499).
또한, 이황화결합과 같은 분열가능한 결합을 사용하여 항체에 높은 독성을 나타내는 약제의 결합은 세포내에서 완전히 활동적인 약제의 방출을 확신시킨다는 것을 보여주어 왔다.
탁산은 팍리탁셀(paclitaxel, Taxol 택솔), 자연발생적 독성, 그리고 도스탁셀(docetaxel, Taxotere), 세미-신세틱 파생물 (semi-synthetic derivative)(도 1을 보라),암 치료에 널리 사용되는 두개의 복합물을 포함하는 복합물 족이다.(E. Baloglu and D. G.I. Kingston, J. Nat. Prod.62: 1448-1472 (1999)). 탁산은 세포를 죽게하는 튜불린(tubulin)의 분해를 방지하는 유사분열방추독성이다. 도스탁셀 및 팍리탁셀이 암치료에 유용한 약제인 반면에, 그들의 항 종양활동은 제한되는데, 그들이 정상세포에 대해서도 가리지 않고 독성을 갖기 때문이다. 더욱이, 팍리탁셀 및 도스탁셀 자신과 같은 합성물은 세포-결박 약제의 결합에 사용될 수 있을 정도로 충분히 강력하지 않다.
최근에, 도스탁셀 또는 팍리탁셀보다 훨씬 더 효능있는 몇몇 새로운 도스탁셀 유사물들이 기술되어 왔다 (I. Ojima et al, J. Med. Chem., 39: 3889-3896 (1996)). 그러나, 이들 복합물들은 분열가능한 결합을 경유하여 세포-결박약제에 연결시키는 적절한 기능이 부족하다.
높은 독성을 보유하고 효과적으로 세포-결박약제에 연결될 수 있는 새로운 탁산 합성물이 최근에 기술되어 왔다(USP 6,340,701, USP 6,372,738 및 USP 6,436,931, 그리고 도 2 및 도 4). 이들 공개에서, 탁산, 특히 티올(thiol) 또는 이황화물 기를 포함하는 탁산은 화학적 부분이 수정되었는데, 이들 탁산에 적절한 세포-결박 약제들이 연결될 수 있다. 그 결과, 이들 새로운 탁산들은 알려진 탁산의 독성효능을 유지하고, 몇몇 경우에는 더욱 증가시킨다.
상기 특허들에 기술된 탁산에서, 연결기가 탁산의 C-10, C-7 또는 C-2'위치에 삽입되었다.
연결기가 C-7에 위치해 있는 경우에, C-10 위치는 자유 치환 수산기가 아니라 오히려 에스테르(ester), 에테르(ether) 또는 카르밤산염 치환기를 가졌다. C-10에 에스테르(ester) 또는 카르밤산염 치환기가 존재하면 고효능의 탁소이드를 생산해낸다는 것이 이전부터 알려져왔다(I. Ojima et al, J. Med Chem., 39: 3889-3896 (1996)). 그러나, C-10에서 자유수산기 기를 생성하고 C-7에서 연결기를 생성하는 탁산의 효능에 대한 연구는 없었다.
여기에서 기술되는 것처럼, C-10에서 자유수산기 기를 생성하고 C-7에서 연결기를 생성하는 탁산의 효능은, C-10에서 에스테르, 에테르, 또는 카르밤산염 치환기를 생성하고 C-7에서 연결기를 생성하는 탁산의 효능과 대등하거나 능가한다는 것이 발견되었다. 그리하여, 첫번째 실시예로, 본 발명은 C-10에서 자유수산기 기를 생성하고 C-7에서 연결기를 생성하고, 효능있는 독성 작용을 갖는 이들 새로운 탁산을 제공한다.
더욱이, 상기 특허들에서 기술된 탁산에 있어서, 연결기가 탁산의 C-10, C-7 또는 C-2' 위치에 삽입되었다. 모든 탁산에서, C-3'N 및 C-3' 치환기는 각각 -NHCOR4 및 R3라고 명명되었다. 더욱이, C-3'N에서의 치환기, -NHCOR4는 팍리탁셀에서처럼, 벤자미도 기(R4=phenyl), 또는 도스탁셀에서처럼, 테르트-부틸 옥시 카보닐 아미노 부분(-NH-t-BOC, R4 = t-BOC)이었다. 출판된 데이터에 기초하여, 이들 치환기를 교체하는 것은 효능에 있어서 손실을 야기하리라고 예상되었다. C-3'(R3)에서의 치환기는 아릴(aryl) 또는 직선형, 가지모양 또는 하나에서 열까지의 탄소원자를 갖는 원형 알킬기이었다. 출판된 데이터에 기초하여, C-3'N 및 C-3'에서 치환기들의 변경은 약제효능에 있어서 손실이라고 생각되었기때문에, 연결기는 언제나 탁산의 다른 위치, 즉, C-7, C-10, 또는 C-2' 에 삽입되었다. 또한, C-3' 또는 C-3'N에서 치환기를 교체할 수 없어서, 이황화물을 함유한 합성가능한 탁산을 함유하는 다양한 이황화물의 제조를 대단히 제한했다.
두 번째 실시예에서, 본 발명은 또한 C-3' 및 C-3'N 둘 모두에서 치환기는 공지의 탁산에 존재하는 치환기에 제한될 필요가 없다. 여기서 기술된 대로, C-3'N에서 다양한 서로 다른 치환기를 생성하는 탁산의 효능은 이 위치에서 벤자미도 또는 NH-t-BOC 치환기를 생성하는 탁산의 효능과 대등하거나 능가한다. C-3' 또는 C-3'N에서의 새로운 치환기는 또한 세포-결박약제에 연결을 가능케하는 연결기를 포함할 수 있다. 본 발명은 C-3' 및 C-3'N에서 다양한 서로다른 치환기를 생성하는 이들 새로운 고효능 탁산을 공개한다. 이제 다음 5곳; C-3', C-3'N, C-10, C-7 또는 C-2' 중 하나의 어느 위치에서도 연결기가 합체될 수 있다.
도 1은 Ojima et al., supra에 의해 기술된 더욱 효능있는 탁산의 일부를 포함하여, 다양한 탁산의 구조를 나타내는 화학식
도 2는 C-10 위치에서 자유 수산기 기를 생성하고 C-7에서 연결기를 생성하는 본 발명에 따라 이황화물을 함유하는 몇몇 탁산의 구조를 나타내는 화학식
도 3은 세 개의 탁산구조를 나타낸다. 탁산1은 C-10에서 에스테르 기를 생성하고 C-7에서 연결기를 생성한다. 탁산2‘ 및 탁산3’ 둘 모두 C-10에서 자유수산기기를 생성하고 C-7에서 연결기를 생성한다.
도 4는 USP 6,340,701, USP 6,372,738 및 USP 6,436,931에서 기술된 더욱 효능있는 몇몇 탁산을 포함하여, 다양한 탁산의 구조를 나타내는 화학식이다.
도 5는 이전 발명에서는 기술되지 않은 R3 및/또는 R4에서의 치환기를 갖는 본 발명에 따른 몇몇 새로운 탁산의 구조를 나타내는 화학식이다.
도 6은 이전 발명에서는 기술되지 않은 R3 및/또는 R4에서의 치환기를 갖는 본 발명에 따른 이황화물을 함유하는 탁산의 구조를 나타내는 화학식이다.
도 7은 탁산을 제조하기 위한 시작물질인 10-디아세틸바카틴 III의 구조를 보여준다.
도 8은 탁산2‘의 생산에 있어서 합성단계를 보여준다.
도 9는 탁산3‘의 생산에 있어서 합성단계를 보여준다.
도 10은 A431세포들에 대한 탁산 1 및 2‘의 생체 밖에서의 효능을 비교한 것을 보여준다.
도 11은 A549 및 MCF-7세포들에 대한 탁산 3‘의 생체 밖에서의 독성을 보여준다.
도 12는 SCID생쥐에서 인간 비늘모양 암(A431) 이종이식에 대한 항-EGF 수용체항체-탁산 결합의 항-종양 효과를 보여준다.
도 13은 예8에서 기술된 실험에서 사용된 SCID생쥐의 몸무게변화를 보여준다.
도 14는 표적 항원-양성 세포 계열 A431에 대한 항-EGF 수용체항체-탁산 결합을 위한 독성측정결과 및 A431 세포계열이 표적항원을 나타내지 않은 N901-탁산결합을 위한 독성측정결과를 보여준다.
도 15는표적 항원-양성 세포계열 SK-BR-3 및 표적되지 않은 항원-음성 세포계열 A431에서의 TA1-탁산결합의 독성강도 및 선택도를 보여준다.
도 16a, 16b, 16c는 본 발명의 두 번째 실시예에 따른 새로운 탁산의 생산에 있어서 합성단계들을 보여준다.
도 17a 및 17b는 본 발명의 두 번째 실시예에 따른 탁산을 함유한 새로운 이황화물의 생산에 있어서 합성단계들을 보여준다.
도 18은 본 발명의 두 번째 실시예에 따른 새로운 탁산의 생체내 독성을 보여준다.
도 19a 및 19b는 본 발명의 두 번째 실시예에 따른 탁산을 함유한 이황화물의 생체내 독성을 보여준다.
실시예
실시예(1)부터(4)에서 R1은 H, 또는 F, NO2, CN, Cl, CHF2, 및 CF3와 같은 전자수용기, 또는 -OCH3, -OCH2CH3, -NR7R8, -OR9과 같은 전자공여기이다. R1', R1"는 서로 같거나 다르고, H, 또는 F, NO2, CN, Cl, CHF2, 및 CF3와 같은 전자수용기, 또는 -OCH3, -OCH2CH3, -NR7R8, -OR9과 같은 전자공여기이다.
R7,R8은 서로 같거나 다르고, 선형, 가지형, 또는 1 내지 10개까지의 탄소원자 또는 간단하거나 치환된 아릴을 갖는 원형 알킬기이다. 바람직하게는 R7,R8을 위한 탄소원자의 개수는 1개 내지 4개이다. 또한, 바람직하게는 R7,R8은 똑같다. 바람직한 -NR7R8기 의 예는 dimethyl amino, diethyl amino, di-isopropyl amino 그리고 dibutyl amino를 포함하는데, 부틸 부분은 1차,2차,3차 또는 이소부틸 중의 어느 것이다.
R9는 1내지 10개의 탄소원자를 갖는 선형, 가지형, 또는 원형 알킬이다. R1은 바람직하게는 -OCH3, C1, F, NO2, 그리고 CF3이다.
더욱 바람직하게는, R1은 -OCH3이고, 메타위치에 있고, R1' 및R1"중의 하나는 -OCH3이고 나머지 하나는 H이다
실시예 (1), (2) 그리고 (4)에서, R2는 H, 헤테로 싸이클릭 또는 아릴에테르, 에스테르 또는 카르밤산 또는 , 1내지 10개의 탄소원자를 갖는 선형,가지형 또는 원형 알킬 또는 알케닐 에스테르 또는 에테르, 또는 화학식이 -COX이고 상기 X는 piperidino, morpholino, piperazino 및 N-methyl-piperazino과 같은 헤테로 싸이클릭을 갖는 니트로젠인 카르밤산, 또는 화학식이 -CONR10R11이고 상기 R10 및 R11은 서로 같거나 다르고 H, 1내지 10개의 탄소원자를 갖는 선형, 가지형 또는 원형 알킬 또는 간단하거나 치환된 아릴인 카르밤산이다.
아릴 에테르,에스테르 및 카르밤산의 바람직한 실시예는 페닐 및 나프틸을 포함한다.
알킬 그리고 알케닐 에스테르의 바람직한 실시예는 -COCH3, -COCH2CH3, 크로토닐 및 디메틸아크릴오일을 포함한다. 알킬 및 알케닐 에테르의 바람직한 실시예는 메틸, 에틸, 프로필, 크로토닐, 그리고 디메틸 아크릴 오일을 포함한다. 카르밤산의 바람직한 실시예는 -CONHCH2CH3, -CONHCH2CH2CH3, -CO-morpholino, -CO-piperazino, -CO-piperidino 또는 -CO-N-methylpiperazino을 포함한다. 바람직하게는 R2는 H이다.
실시예(3)에서, R2는 연결기이다.
실시예(1),(3), 그리고(4)에서, R3은 1개 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 또는 알케닐이거나, 3개 내지 10개의 탄소원자를 갖는 싸이클로 알킬 또는 싸이클로 알케닐이거나, 아릴, 또는 헤테로 싸이클이다.
바람직하게는 R3은 crotonyl, dimethylacryloyl, isobutenyl, hexenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, furyl, pyrollyl, thiopheneyl, thiazolyl, imidazolyl, pyridyl, morpholino, piperidino, piperazino, oxazolyl, indolyl, benzofuranyl 또는 benzothiopheneyl 이다.
더욱 바람직하게는 R3은 t-BOC, iso-butenyl, crotonyl, dimethylacryloyl, thiophenyl, thiazolyl or furyl 이다.
실시예(2)에서, R3은 -CH=C(CH3)2 이다.
실시예 (1) 내지 (4)에서, R4는 1개 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 또는 알케닐이거나, 3개 내지 10개의 탄소원자를 갖는 싸이클로 알킬 또는 싸이클로 알케닐이거나, 아릴, 헤테로 싸이클, -OC(CH3)3 또는 상기 알킬, 알케닐, 싸이클로 알킬, 또는 싸이클로 알케닐, 아릴, 또는 니트로젠을 함유하는 헤테로 싸이클 중의 어느 하나로부터 형성되는 카르밤산이다.
바람직하게는 R4는 crotonyl, dimethylacryloyl, isobutenyl, hexenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, furyl, pyrollyl, thiopheneyl, thiazolyl, imidazolyl, pyridyl, morpholino, piperidino, piperazino, oxazolyl, indolyl, benzofuranyl 또는 benzothiopheneyl 이다.
더욱 바람직하게는, R4는 t-BOC, iso-butenyl, crotonyl, dimethylacryloyl, thiophenyl, thiazolyl 또는 furyl 이다.
실시예 (1) 및 (2)에서, R5는 연결기 이고, R6는 상기 실시예(1),(2)그리고(4)에서의 R2와 동일한 정의를 갖는다.
실시예 (3)에서, R5는 상기 실시예(1),(2)그리고(4)에서의 R2와 동일한 정의를 갖는다.
실시예 (3)에서, R6는 상기 실시예 (1),(2) 그리고 (4)에서의 R2와 동일한 정의를 갖는다.
실시예 (4)에서, R6는 연결기이고, R5는 상기 실시예 (1),(2) 그리고 (4)에서의 R2와 동일한 정의를 갖는다.
적절한 연결기는 본 발명의 기술분야에서 잘 알려져 있고, 이황화기, 티오에테르기, 산 반응성 기, 빛 반응성 기, 펩티다제 반응성 기, 그리고 에스테라제 반응성 기를 포함한다. 바람직하게는 이황화기 및 티오에테르기 이다.
연결기가 티올기- 또는 이황화기- 를 포함하는 경우에는, 티올기- 또는 이황화기-를 운반하는 측면 사슬은 선형, 가지형, 방향족 또는 헤테로 싸이클릭일 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 즉시 적절한 측면사슬을 구별할 수 있다.
티올기 또는 이황화기를 포함하는 치환기의 특별한 예는
-(CR13R14)m(CR15R16)n(OCH2CH2)ySZ, -CO(CR13R14)m(CR15R16)n (OCH2CH2)ySZ, -(CR13R14)m(CR17=CR18)(CR15R16)mOCH2CH2)ySZ,-CO-(CR13R14)m (CR17=CR18)(CR15R16)m(OCH2CH2)ySZ,-CONR12(CR13R14)m(CR15R16)n (OCH2CH2)ySZ, furyl-XSZ, oxazolyl-XSZ, thiazolyl-XSZ, thiopheneyl-XSZ, imidazolyl-XSZ, morpholino-XSZ, -piperazino-XSZ, -piperidino-XSZ,CO-furyl-XSZ, CO-thiopheneyl-XSZ,CO-thiazolyl-XSZ 그리고 -CO-N-methylpiperazino-XSZ, -CO-morpholino-XSZ, -CO-piperazino-XSZ, -CO-piperidino-XSZ, 또는 -CO-N-methylpiperazino-XSZ을 포함하며, 상기에서 Z는 H 또는 SR 이다.
X는 선형 알킬 또는 1개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 가지형 알킬 또는 2개 내지 20개의 반복하는 에틸렌 옥시유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 스페이서이다. R 및 R12는 서로 같거나 다르고, 1개 내지 10개의 탄소원자를 갖는 선형 알킬, 가지형 알킬 또는 원형 알킬, 또는 단순거나 치환되는 아릴 또는 헤테로 싸이클릭이고, 그에 더하여 R12는 H일 수 있고,
R13, R14, R15 및 R16은 동일하거나 다르며 H 또는 1개 내지 4개의 탄소원자를 갖는 선형 또는 가지형 알킬이고,
R17 및 R18은 H 또는 methyl이고,
n 은 정수 1 내지 10 이고,
m 은 정수 1 내지 10 이고, 또한 0일 수 있으며,
y 는 정수 1 내지 20 이고, 또한 0일 수 있다.
본 발명의 첫 번째 측면의 바람직한 탁산은 C-10(즉, R2) 및 C-7(즉, R5)에서 자유 수산기를 생성하는 탁산이다. 본 발명의 가장 바람직한 탁산은 도 3에서 보여지는 탁산 2‘ 및 3’ 이다.
실시예(5)내지(9)에서, R1은 H, 또는 F, NO2, CN, Cl, CHF2, 및 CF3와 같은 전자수용기, 또는 -OCH3, -OCH2CH3, -NR7R8, -OR9과 같은 전자공여기이다. R1', R1"는 서로 같거나 다르고, H, 또는 F, NO2, CN, Cl, CHF2, 및 CF3와 같은 전자수용기, 또는 -OCH3, -OCH2CH3, -NR7R8, 그리고 -OR9과 같은 전자공여기이다.
R7 및 R8은 서로 같거나 다르고, 선형, 가지형, 또는 1 내지 10개까지의 탄소원자 또는 간단하거나 치환된 아릴을 갖는 원형 알킬기이다. 바람직하게는 R7 및 R8을 위한 탄소원자의 개수는 1개 내지 4개이다. 또한, 바람직하게는 R7 및 R8은 똑같다. 바람직한 -NR7R8기 의 예는 dimethyl amino, diethyl amino, dipropyl amino, di-isopropylamino 그리고 dibutyl amino를 포함하는데, 부틸 부분은 1차,2차,3차 또는 이소부틸 중의 어느 하나이다.
R9는 1내지 10개의 탄소원자를 갖는 선형, 가지형, 또는 원형 알킬이다.
바람직하게는, R1은 -OCH3, Cl, F, NO2 and CF3이다
더욱 바람직하게는, R1은 -OCH3이고, 메타위치에 있고, R1' 및R1"중의 하나는 -OCH3이고 나머지 하나는 H이다.
실시예 (5), (6) 그리고 (7)에서, R3 및 R4는 서로 같거나 다르고, 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 갖는 싸이클로 알킬 또는 싸이클로 알케닐, 아릴, 또는 헤테로 싸이클이고, 이에 더하여 R4는 -OC(CH3)3, 또는 상기 알킬, 알케닐,싸이클로 알킬 또는 싸이클로 알케닐, 아릴, 또는 니트로겐을 함유하는 헤테로 싸이클 중의 어느 하나로부터 형성되는 카르밤산이다.
바람직하게는 R3 및 R4 중 하나 또는 둘 모두는 crotonyl, dimethylacryloyl, isobutenyl, hexenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, furyl, pyrollyl, thiopheneyl, thiazolyl, imidazolyl, pyridyl, morpholino, piperidino, piperazino, oxazolyl, indolyl, benzofuranyl 또는 benzothiopheneyl 이다.
더윽 바람직하게는, R3 및 R4 중 하나 또는 둘 모두는 t-BOC, iso-butenyl, crotonyl, dimethylacryloyl, thiopheneyl, thiazolyl, 또는 furyl 이다.
실시예 (8), (9)에서, R2, R5, R6은 서로 같거나 다르고, H, 헤테로 싸이클릭 또는 아릴에테르, 에스테르 또는 카르밤산 또는 , 1내지 10개의 탄소원자를 갖는 선형,가지형 또는 원형 알킬 또는 알케닐 에스테르 또는 에테르, 또는 화학식이 -COX이고 상기 X는 piperidino, morpholino, piperazino 및 N-methyl-piperazino과 같이 니트로겐을 함유하는 헤테로 싸이클인 카르밤산, 또는 화학식이 -CONR10R11이고 상기 R10 및 R11은 서로 같거나 다르고 H, 1내지 10개의 탄소원자를 갖는 선형, 가지형 또는 원형 알킬 또는 단순하거나 치환된 아릴인 카르밤산이다.
아릴 에테르, 에스테르 및 카르밤산의 바람직한 실시예는 phenyl 및 naphthyl을 포함한다.
알킬 그리고 알케닐 에스테르의 바람직한 실시예는 -COCH3, -COCH2CH3, crotonyl 및 dimethylacryloyl을 포함한다. 알킬 및 알케닐 에테르의 바람직한 실시예는 methyl, ethyl, allyl, propyl, crotonyl 그리고 dimethylacryloyl 을 포함한다. 카르밤산의 바람직한 실시예는 -CONHCH2CH3, -CONHCH2CH2CH3, -CO-morpholino, -CO-piperazino, -CO-piperidino 또는 -CO-N-methylpiperazino을 포함한다.
바람직하게는 R6는 H이고 R2 와 R5 중 하나는 H이다.
실시예(5)에서, R2는 연결기이고, R5 및 R6는 실시예(8)및(9)에서의 정의와 동일하다.
실시예(6)에서, R5는 연결기이고, R2 및 R6는 실시예(8)및(9)에서의 정의와 동일하다.
실시예(7)에서, R6는 연결기 또는 H이고, R2 및 R5는 실시예(8) 및 (9)에서의 정의와 동일하다.
실시예(8)에서, R3은 연결기이고, R4는 실시예(5),(6) 및 (7)에서의 정의와 동일하다.
실시예(9)에서, R4은 연결기이고, R3은 실시예(5),(6) 및 (7)에서의 정의와 동일하다.
적절한 연결기는 본 발명의 기술분야에서 잘 알려져 있고, 이황화기, 티오에테르기, 산 반응성 기, 빛 반응성 기, 펩티다제 반응성 기, 그리고 에스테라제 반응성 기를 포함한다. 바람직하게는 이황화기 및 티오에테르기 이다.
연결기가 티올기- 또는 이황화기- 를 포함하는 경우에는, 티올기- 또는 이황화기-를 운반하는 측면 사슬은 선형, 가지형, 방향족 또는 헤테로 싸이클릭일 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 즉시 적절한 측면사슬을 구별할 수 있다.
티올기 또는 이황화기를 포함하는 치환기의 특별한 예는
-(CR13R14)m(CR15R16)n(OCH2CH2)ySZ, -CO(CR13R14)m(CR15R16)n (OCH2CH2)ySZ, -(CR13R14)m(CR17=CR18)(CR15R16)mOCH2CH2)ySZ,-CO-(CR13R14)m (CR17=CR18)(CR15R16)m(OCH2CH2)ySZ,-CONR12(CR13R14)m(CR15R16)n (OCH2CH2)ySZ, furyl-XSZ, oxazolyl-XSZ, thiazolyl-XSZ, thiopheneyl-XSZ, imidazolyl-XSZ, morpholino-XSZ, -piperazino-XSZ, -piperidino-XSZ,CO-furyl-XSZ, CO-thiopheneyl-XSZ,CO-thiazolyl-XSZ 그리고 -CO-N-methylpiperazino-XSZ, -CO-morpholino-XSZ, -CO-piperazino-XSZ, -CO-piperidino-XSZ, 또는 -CO-N-methylpiperazino-XSZ을 포함하며, 상기에서 Z는 H 또는 SR 이다.
X는 1-10 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 가지형 알킬 또는 2-20 리피트단위를 가지는 폴리에틸렌 글리콜 스페이스;
R 그리고 R12 는 동형또는 이형이고 1-10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬, 가지형 알킬 또는 시클릭 알킬, 또는 단일 또는 치환된 아릴 또는 헤테로시클릭이고, 그리고 R12 는 H에 첨가될수 있다,
R13, R14, R15 그리고 R16 는 동형 또는 이형이고 H 또는 1-4의 탄소원자를 가지는 선형 또는 가지형 알킬이다,
R17 과 R18 는 H 또는 메틸,
n 은 1 에서 10의 정수,
m 은 1 에서 10의 정수이고 0이 될 수 있다,
y 는 1에서 20의 정수이고 또한 0이 될 수 있다.
본 발명의 탁산은 알려진 방법에 의해 합성될 수 있다. 합성을 위한 출발물질은 도 7에서 보는 바와 같이, 상업적으로 사용가능한 10-디아세틸바카틴III 이다.다양한 기환기를 얻기위한 화학법은 여러 간행물에 기재되어있다(Ojima et al, J. Med. Chem. 39: 3889-3896 (1996), Ojima et al., J. Med. Chem. 40: 267-278 (1997); I. Ojima et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 4256-4261 (1999); I. Ojima et al., USP 5,475,011 and USP 5,811,452). 본 발명의 대표적인 탁산 준비는 아래 실시예에 기술되어 있다.
페닐고리의 치환기 R1과 치환기 R1 의 위치는 바람직한 독성을 가지는 화합물이 얻어질 때 까지 변화할 수 있다. 더욱이, 페닐고리의 치환정도는 바람직한 독성을 얻기위해 변화될 수 있다. 즉, 페닐고리는 바람직한 독성을 얻기위한 다른 수단을 제공하는 하나 또는 그 이상의 치환기(e.g., mono-, di-, or tri-substitution of the phenyl ring)를 가질 수 있다. 약으로 72시간의 노출시간에 따라 배양된 암 세포를 통해 생체내에서 측정할 때, 높은 세포독성는 1 x 10-12 to 3 x 10-9 M 범위에서 IC50 를 가지는 독성을 보여줌으로써 정의된다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진자는 통상의 실험을 통하여 R1 의 정확한 위치와 R1의 정확한 화학적 일부분을 측정할 수 있다.
예를 들어 메타 포지션에서 전자 공여기는, 부 탁산과 비교할때 파라 포지션에서 치환이 효능을 증가시키는 것을 기대하지 않는 것과 달리, 세포독성 표능을 증가시키는 것으로 기대된다. 전형적으로 다른 위치(ortho, meta and para)에서의 치환기를 가지는 몇몇 대표적인 탁산은 초기 준비될 것이고 생체내 세포독성가 평가될 것이다.
도 5와 도 16에서 표시된 신규의 택소이드는 출발물질로써 적합하게 제거된 바카틴III 아날로그(7)와 b-락탐을 사용하여 b-락탐 신톤법에 의해 준비될 수 있다(Ojima, I.; Habus, I.; Zhao, M.; Zucco, M.; Park, Y.H.; Sun, C.M.; Brigaud, T. Tetrahedron, 48: 6985 (1992); Holton, R.A.; Biediger, R.J.; Boatman, P.D. in Taxol: Science and Applications; Suffness, M., Ed.; CRC: Boca Raton, 1995, p. 97) b-락탐 4-6d, 19-25 그리고 38-44는 이미 알려진 방법에 의해 준비될 수 있다(Brieva, R. Crich, J.Z.; Sih, C.J. J. Org. Chem., 58: 1068 (1993); Palomo, C.; Arrieta, A.; Cossio, F.; Aizpurua, J.M.; Mielgo, A.; Aurrekoetxea, N. Tetrahedron Lett., 1990, 31, 6429). 바카틴 III 아날로그 (7) 는 출발물질로써 상업적으로 사용가능한 10-디아세틸바카틴 III (10-DAB) (도. 7)을 사용하여 준비될 수 있다.
β-탁담 6a-d, 21-25 그리고 40-44는 보호된 택소이드 8-11, 26-30 그리고 45-49를 얻기위해 NaH 또는 LiHMDS의 현존하에서 baccatin III 아날로그 (7)와 연결될 수 있다. 실릴 보호기는 바람직한 탁산 12-15, 31-35, 그리고 50-54 (도 16a, 16b 그리고 16c)을 산출하기위해 HF-피리딘의 현존하에서 최종적으로 재보호될 수 있다.
본발명의 택소이드를 함유하는 2황화물(도6,그리고 도 17)은 위의(8-11, 26-30, 45-49)에 기술된 중간물로 부터 합성될 수 있다. C-10 아세테이트는 히드라진 단일수산기를 가지고 성공적으로 제거될 수 있다. C-10 위치의 재에스테르화(reesterification)는 이후 카르복실산의 필요한 2황화 유도물을 사용하는 결합 프로토콜에 기초한 카르보디이드를 사용한 EDC (1-[3-(디메틸마미노)프로필-3-에틸카보디미드 하이드로클로라이드) 의 현존 하에서 수행될 수 있다. 결합된 산물은 택소이드(도 17a 그리고 17b)를 함유하는 2황화물을 얻기위해 HF-피리딘을 사용하여 재보호될 수 있다.
2황화물 또는 치환기를 가지는 티올은 또한 하이드록실기가 이미 존재하는 다른 위치의 어느 하나로 생성될 수 있다. 바람직한 반응이 되는 동안, 여러 하이드록실기를 보호하기위한 화학은 이미 알려져오고 있다(예를들어 supra를 참고). 중간물은 유기 하이드록실기의 에테르를 함유하는 이황화물, 에스테르를 함유하는 이황화물, 또는 카바마이트를 함유하는 이황화물에의 간단한 변화에 의해 만들어진다. 양자택일로, 폴리에틸렌 글리콜 스페이스는 이황화물 또는 티올중간물 그리고 유도된 하이드록시기사이에서 생성될 수 있다.(예를 들어,USAN 10/144,042, filed May 14, 2002) 이 형질전환은 다음에 의해 얻어진다. 바람직한 하이드록시기는 I. Ojima et al, supra에 기재된 것과 같이 -40℃에서 테트라하이드로퓨런(tetrahydrofuran)에서 상업적으로 사용가능한 리튬 헥사메틸디실라잔(1.2equivalents) 시약을 사용하여 재프로톤(deprotonated)되었다. 알콕사이드 음이온 결과물은 할로 에테르를 얻기위해 이후 디브로모에탄과 같은 과량의 디할로 화합물(dihalo compound)로 반응한다. 티올(티오아세테이트칼륨과의 반응과 약염기 또는 하이드록실아민으로 처리함에 의한)을 사용한 할로겐의 치환은 바람직한 탁산을 함유하는 티올을 제공할 것이다. 티올기는 메틸 메탄 티올술론네이트 또는 디티오디피리딘 각각을 사용한 반응에 의해 메틸 또는 피리딜 2황화물로 변환될 수 있다. 이 방법은 USP 5,416,064에 소개되어 있다.
바람직한 하이드록시기는 또한 브로모에스테르를 얻기위해 3-브로모프로피오닐 클로라이드와 같은 알킬 할라이드를 사용한 반응에 의해서 직접적으로 에스테르화 될 수 있다. 위에 기재된 과정에 더하여 그리고 티오아세테이트 칼륨을 사용한 처리에 의해 브로모기의 치환은 티올 또는 택사인 에스테르를 함유하는 2황화물을 제공할 것이다. 카바마이트를 함유하는 2황화물을 준비하기 위해, 하이드록시기는 파라-니트로페닐 클로로포르메이트와 같은 상업적으로 사용가능한 클로로포르메이트를 사용하여 반응될 수 있고, 이후 아미노 알킬 2황화물을 사용한 반응이 이루어진다(예, 메틸디티오 시스테아민).
양자택일로, 티올 또는 2황화 중간물은 b-락탐 서비유닛에 병합될 수 있고, 티올 또는 C-3′위치의 2황화물 연관기를 가진 바람직한 탁산을 얻기위해 이후 대략 보호된 10-디아세틸 바카틴III로 반응된다.
본 발명에 의한 새로운 탁산 그리고 탁산 약을 함유하는 2황화물은 생체내에서 인간의 종양세포의 증식억제 능력으로 평가될 수 있다. 인간 종양세포선 A-549 (인간 폐암) 그리고 MCF-7 (인간 유방암)은, 이들 화합물의 세포독성의 평가로 사용된다. 세포는 72시간동안 화합에 노출되고 세포의 생존 단편들은 이미 기술된 분석법(Goldmacher et al, J. Cell. Biol. 102: 1312-1319 (1986)에 의해 직접적인 배양효울로 측정되고 IC50 값은 이후 이들 데이타로 부터 계산된다.
본 발명의 두 번째 측면에 따른 택소이드를 함유한 2황화물 그리고 택소이드의 생체내 세포독성 측정의 결과는 도 18 과 도 19에서 보여준다. 도18은 본 발명의 12개 새로운 탁산의 세포독성 측정의 결과를 보여준다. R4 에서 페닐치환기를 가진 탁산 52를 제외하고, 모든 다른 탁산은 10-10 to 10-1l M 범위의 값을 갖는 IC50 를 가지는 A-549 와 MCF-7 방면으로 극도로 효능이 있다. 탁산 52 는 처리되어진 세포선 양쪽으로 3 x 10-9 M의 값을 갖는 IC50 으로 덜 세포독성되었다. 유사하게, 본 발명에 의한 택소이드를 함유하는 2황화물은 또한 A-549 와 MCF-7세포 모두에게 극도록 효과적이고 급격한 사멸곡선(도 19)을 보인다.
치료적 인자로써 본 발명 화합물의 유용성은 정확한 세포-결합인자의 선별에 좌우된다. 세포-결합 인자는 현재까지 알려진 어떤 종류의 것이 될 수 있고, 또는 알게된것과 펩티드와 비펩티드를 포함한다. 일반적으로 이들은 항체, 또는 그들의 단편, (특히 단일클론 항체), 림포카인, 호르몬, 성장인자, 비타민, 영양소-수송 분자(트랜스페린과 같은), 또는 다른 세포-결합 분자 또는 물질이 될 수 있다.
사용될수 있는 세포-결합인자의 보다 특이한 예들은 다음을 포함한다:
-sFv, Fab, Fab′ and F(ab′)2 와 같은 항체들 단편(Parham, J. Immunol.131: 2895-2902 (1983); Spring et al, J. Immunol. 113: 470-478 (1974); Nisonoff et al, Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960));
-인터페론 (예.α,β,r);
-IL-2, IL-3, IL-4, IL-6와 같은 림포킨;
-인슐린, TRH (thyrotropin releasing hormones), MSH (melanocyte-stimulating hormone), 안드로젠과 에스트로겐과 같은 스테로이드 호르몬과 같은 호르몬;
-폴산과 같은 비타민;
-성장인자와 EGF, TGF-a, G-CSF, M-CSF 그리고 GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5: 155-158 (1984))와 같은 클로닝-자극 인자; 그리고
-트랜스페린 (O′Keefe et al, J. Biol. Chem. 260: 932-937 (1985)).
단일클론 항체기술은 특이 단일클론 항체 또는 그들의 단편의 형태에서 극도의 특이 세포-결합인자의 생성을 고려한다. 이 기술분야에서 특별히 잘 알려진 것은 또는 변질되지 않은 표적 세포와 같은 중요 항원, 표적세포로부터 격리된 항원, 모든 바이러스, 독성이 감소된 모든 바이러스, 그리고 바이러스막을 가진 단백질과 같은 바이러스 단백질을 가진 면역된 마이스(mice), 쥐, 햄스터,다른 표유류에 의해, 단일클론항체, 또는 그들의 단편을 생성하는 기술이다. 감작된 인간 세포 또한 사용된다. 단일클론 항체 또는 그들의 단편을 생성하기 위한 다른 방법은 sFv (단일 사슬 변위부),특히 인간의 sFv,의 파지도서관의 사용이다. (예를 들어 다음을 보라, Griffiths et al., USP 5,885,793; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587.)
적합한 세포-결합인자의 선별은 표적화되기 위한 특이 세포 군집에 좌우되는 선택의 문제이나, 그러나 일반적으로 적합한 것이 가능하다면 단일클론 항체가 선호된다.
예를들어, 단일클론항체 MY9는 특히 CD33항원에 결합되는 뮤린(murine) IgG1 항체 (J.D. Griffin et al Leukemia Res., 8: 521 (1984))로, AML(acute myelogenous leukemia )의 질병에서와 같은, 만약 표적세포가 CD33을 발현하면 사용될 수 있다. 유사하게, 단일클론 항체 항-B4 는 B 세포(Nadler et al, J. Immunol. 131: 244-250 (1983))에서 CD19항원에 연관되는 뮤린 IgG1 이고 만약 표적세포가 non-Hodgkin′s lymphoma 또는 chronic lymphoblastic leukemia에서와 같이, 이들 항원을 발현시키는 질병세포 또는 B세포이면 사용될 수 있다. 유사하게, 항체 N901은 뮤린 단일클론 IgG1항체로 폐암세포의 작은 세포와 신경내분비 발생의 다른 종양 세포에서 발견된 CD56 에 연관된다(Roy et al. J. Nat. Cancer Inst. 88:1136-1145 (1996)).
다음과 같은 표적 고체 종양의 항원들은 유용하다, 췌장과 직장암에 있는 MUC1에서 발견된 탄수화물 항원에 연관된 C242항체 (USP 5,552,293); 전립선암 세포에서 그리고 종양 신맥관구조( neovasculature)의 내피 세포에서 과다발현된 PSMA (prostate specific membrane antigen)와 연관된, 항체J591(USP 6,107,090, He Liu et al. Cancer Res. 57: 3629-3634 (1997); 그리고 어떤 유방암에서 과다 발현된, HER-2에 항체들. 항-HER-2항체의 예들은 TA1항체 (L.A. Maier et al. Cancer Res. 51: 5361-5369 (1991)) 와 4D5 항체(USP 6,387,371 and 6,399,063)이다.
게다가, 골수종세포에 연관된, GM-CSF는 심한 골수백혈병으로 부터 질병세포에의 세포-결합인자로써 사용될 수 있다. 활성 T-세포에 연결된 IL-2는 이식결합반응의 방지, 치료및 호스트에 대한 결합 질병(graft-versus-host disease)의 방지, 그리고 심각한 T-세포 백혈병의 치료에 사용될 수 있다. 멜라노시테와 연결된 MSH는 흑색종의 치료에 사용될 수 있다. 자궁암 그리고 다른 암에서 발현된 엽산 수용체가 표적인 폴산은 또한 적합한 세포-결합인자이다.
유방암과 테스트는 세포-결합 인자로써 에스트로겐(또는 에스트로겐 아날로그) 또는 안드로겐(또는 안드로겐 아날로그), 각각, 성공적으로 표적될 수 있다.
본발명의 탁산과 세포-결합인자의 접합은 현재 알려지거나 이후에 개발될 어떠한 기술을 사용하여서 이루어질 수 있다. 수많은 접합방법이 USP 5,416,064 와 USP 5,475,092에 기술되어 있다. 탁산 에스테르는 유기 아미노기를 산출하도록 변형될 수 있고 이후 산성의 불안정안 링크 또는 광불안정 링크를 경유하여 항체 또는 다른 세포-결합 인자와 연관된다. 탁산 에스테르는 펩티트로 응축될 수 있고 결과적으로 펩티다이제 불안정 링크를 생성하기 위해 세포- 결합 인자와 연관될 수 있다. 탁산 에스테르에의 하이드록시기는 프리드러그를 자유롭게 하기위해 세포내 에스테라제에 의해 쪼개질수 있는 접합을 만들기 위한 세포-결합 인자에 연관되고 썩시닐화 될 수 있다. 가장 바람직하게, 탁산 에스테르, 에스테르, 또는 카바마이트는 유기 또는 방어 티올기를 생성하는데 처리된다, 그리고 이후 디설파이드- 또는 탁산을 함유하는 티올-은 2황화결합을 통해 세포-결합 인자에 연관된다.
본발명의 대표적인 접합은 항체-탁산, 항체단편-EGF(taxane epidermal growth factor)-탁산, MSH(melanocyte stimulating hormone)-탁산, TSH(thyroid stimulating hormone)-탁산, 에스트로겐-탁산, 에스트로겐 아날로그-탁산, 안드로겐-탁산, 안드로겐 아날로그-탁산, 그리고 엽산-탁산이다.
항체, 항체 단편, 단백질 또는 텝티드 호츠몬, 단백질 또는 펩티드 성장 인자 그리고 다른 단백질의 탁산 접합은 알려진 방법과 같은 방법에 의해 만들어진다. 예를 들어, 텝티드와 항체는 교차연관 시약, N-썩시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, N-썩시니미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트 (SPP), 4-썩시니미딜-옥시카보닐-a-메틸-a-(2-피리딜 디티오)-톨루엔 (SMPT), N-썩시니미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트(SDPB), 2-이미노티올랜, 또는 S-아세틸썩시닉 안하이드라이드, 으로 변형될 수 있다. See, Carlsson et al, Biochem. J. 173: 723-737 (1978); Blattler et al, Biochem. 24: 1517-1524 (1985); Lambert et al, Biochem. 22: 3913-3920 (1983); Klotz et al, Arch. Biochem. Biophys. 96: 605 (1962); and Liu et al, Biochem. 18: 690 (1979), Blakey and Thorpe, Antibody, Immunoconjugates & Radiopharmaceuticals, 1: 1-16 (1988), Worrell et al Anti-Cancer Drug Design 1: 179-184 (1986). 이와같이 제거된 유기또는 보호된 세포-결합 인자를 함유하는 티올은 접합을 생성하기위해서 디설파이드- 또는 탁산을 함유하는 티올-로 반응된다. 접합물은 HPLC 또는 겔 필터화에 의해 정제될 수 있다.
유사하게, 예를 들어서, 에스트라디올과 안드로스타네디올과 같은 에스트로겐과 안드로겐 세포-결합인자는 농출인자로써 예를들어 디시클로헥실카보디미드를 사용하여 카르복실산을 함유하는적합한 2황화물을 사용하여 C-17 하이드록시기에서 에스테르화될 수있다. 생성될 수 있는 카르복실산과 같은 예들은 3-(2-피리딜디티오) 프로파놀산, 3-메틸디티오프로판놀산, 4-(2-피리딜디티오) 펜타놀산, 그리고 3-페닐디티오프로판놀산이다. C-17 하이드록시기의 에스테르화는 3-S-아세틸프로판올 클로라이드와같은 카르복실산 클로라이드를 함유하는 정확히 보호된 티올기의 반응에 의해 얻어질 수 있다. 에스테르화의 다른 방법은 또한 문헌에 기술된 것대로 실행될 수 있다.(Haslam, Tetrahedron 36: 2409-2433 (1980)) 안드로겐 또는 에스트로겐을 함유하는 보호된 또는 유기 티올은 접합물을 얻기위해 디설파이트-또는 탁산을 함유하는 티올-과 반응 할 수 있다. 접합물은 HPLC에 의하거나 실리카겔에서 콜롬 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 엽산은 디시클로엑실 카보디미디드와 같은 농축인자의 존재하에서 활성 2황화물을 함유하는 하이드라존을 얻기위해 하이드라존4-(2-피리딜디티오) 펜타놀산 하이드라지드와 같은 적합한 하이드라지드로 농축될 수 있다. 엽산을 함유하는 2황화물은 이후 접합물을 얻기위해 탁산을 함유하는 티올과 반응할수 있고 HPLC에 의하거나 실리카겔에서 콜롬 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
아마도, 단일클론 항체- 또는 세포-결합인자-탁산 접합물은, 위에 기술된 바에 의해, 탁산 분자의 운반이 가능하도록 하는 2황화결합을 통해 연결된다. 이러한 세포-결합 접합은 SPDP(succinimidyl pyridyl-dithiopropionate)을 가지고 단일클론 항체를 변형함과 같은 알려진 방법에 의해 준비된다 (Carlsson et al, Biochem. J. 173: 723-737 (1978)). 결과 티오피리딜기는 이후 2황화 연결 접합물을 얻기위해 탁산을 함유하는 티올로 처리함으로써 치환된다. 양자택일로, 아릴디티오-탁산의 경우, 세포-결합 접합의 형성은 항체분자로 삽입된 설피드릴기에 의해 탁산의 아릴티올의 직접적 치환에 의해 영향을 받는다. 2황화 가지를 통해 연결된 1-10 탁산약을 함유하는 접합물은 이들 방법을 통해 쉽게 준비된다.
더욱 자세히는, 1 mM EDTA를 함유하고 있는 pH 6.5의 10.1M 인산칼륨버퍼에 1 mg/ml 농도의 디티오피리딜 변형 항체 용액은 탁산(1.25 molar eq. /dithiopyridyl group)을 함유하는 티올과 함께 처리한다. 변형 항체로 부터 떨어져나온 티오피리딘은 343nm에 측광기로 모니터되고 약 20 h에 완료된다. 항체-탁산 접합은 Sephadex G-25 또는 Sephacryl S300의 콜롬을 통한 젤 필터작용에 의해 정제되고 미반응된 약과 다른 저분자량 물질이 제거된다. 항체분자마다 연결된 탁산 일분분의 수는 230 nm 와 275 nm에 흡수율을 측정함으로써 결정될 수 있다. 1~ 10 탁산 분자/항체분자의 평균은 이 방법에 의해 2황화결합을 통해 연결될 수 있다.
쪼갤수없는 연결을 가진 항체-탁산 접합이 또한 준비될 수 있다. 1-10 반응 그룹을 소개하는 다음의 문헌에 설명된 바와 같이, 항체는 N-sucinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), sulfo-SMCC, N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate (SMB), sulfo-SMB, N-succinimidyl 6-maleimidocaproate (SMC), sulfo-SMC, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), sulfo-MBS 또는 succinimidyl-iodoacetate와 같은 교차결합 반응물과 반응될 수 있다. 다음의 문헌들,Yoshitake et al, Eur. J. Biochem. 101: 395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem. 6: 56-63 (1984); and Liu et al, Biochem. 18: 690-697 (1979). 변형된 항체는 이후 접합을 만들기 위해 탁산 유도체를 함유하고 있는 티올과 반응하게 된다. 접합은 Sephadex G-25콜롬을 통해 젤 필터화로 정제된다.
변형된 항체, 또는 이들의 단편들은 탁산(1.25 molar equivalent /maleimido group)을 함유하는 티올로 처리된다. 혼합물은 약 4oC에서 밤동안 배양된다. 항체-탁산 접합물은 Sephadex G-25 를 통해 젤필터화로 정제된다. 전형적으로, 1~10 탁산의 평균은 항체마다 연결되어진다.
말레미도 그룹(maleimido groups)을 만들어내기 위한 바람직한 방법은 항체, 그리고 이들의 단편들을 썩시니미딜-4-(말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)로 변형하는 것이고 접합물과 연결된 티오에테르를 얻기 위해 변형된 항체나 단편들과 탁산을 함유한 티올을 반응시킨다. 다시, 항체분자 결과마다 1~10 약 분자로 접합한다.
Namalwa 와 HL-60과 같은 비점착성 세표선에 톡소이드의 항체 접합물의 세포독성는 Goldmacher et al, J. Immunol. 135: 3648-3651 (1985)에 설명되어진 세포 분열증식 곡선의 외삽법(back-extrapolation)에 의해 측정될수 있다. SKBR3와 A431과 같은 점착성 세포선에 이들 조성물의 세포독성는 Goldmacher et al, J. Cell Biol. 102: 1312-1319 (1986)에 설명되어 있는 클로노제닉(clonogenic) 분석법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 다음으로 구성된 치료적 조성물을 제공한다;
(a) 세포-결합 인자에 연결된 하나 또는 그 이상의 탁산의 유효량, 그리고
(b) 약리학적으로 수용가능한 케리어, 희석제, 또는 첨가제.
이와 유사하게, 본 발명은 접촉하는 표적 세포 또는 세포결합인자와 연결된 하나 또는 그 이상의 탁산을 구성하는 세포독성인자 유효량을 가진 표적세포를 함유하는 조직을 구성하는 선택된 세포 군집에서 세포사멸을 유도하기위한 방법을 제공한다.
세포독성 인자는 위에 설명된 바에 의해 준비되어진다.
적합한 약리학적으로 수용가능한 케리어, 희석제, 그리고 첨가제는 잘 알려져 있으며 임상근거로 본 발명이 속한 기술분야에서의 숙련된 자에 의해 측정될 수 있다.
케리어, 희석제 및/또는 첨가제로 적합한 예들은 다음을 포함한다; (1) 약 pH 7.4이고, 1 mg/ml 내지 25 mg/ml의 인간의 혈청 알부민을 포함하거나 포함하지 않는 둘베코의 인산염 버퍼 염수(Dulbecco′s phosphate buffered saline), (2) 0.09% 염수(0.9% w/v NaCl),그리고 (3) 5% (w/v) 덱스트로스; 그리고 또한 트립타민과 같은 산화방지제와 Tween 20과 같은 안정화제를 포함할 수 있다.
선택된 세포군집에서 세포사멸을 유도하기위한 방법은 in vitro, in vivo, ex vivo에서 실행될 수 있다.
생체내의 실시예는 병에걸리거나 또는 해로운 세포를 죽이기 위해 동일한 환자에게 이식하는 것에 앞서 자가이식한 뼈 골수의 치료를 포함한 치료에 사용된다: 항체반응하는 T세포를 죽이기 위해서 그리고 GVHD(graft-versus-host-disease)를 방지하기 위한 자가이식에 앞서 뼈 골수의 치료; 표적항체를 발현시키지 않는 바람직한 변형을 제외한 모든 세포를 죽이기 위한 세포 배양의 치료; 또는 바람직하지 않은 항체를 발현시키는 변형체를 죽이기 위하여 사용된다.
생체내에서 반 임상의 상태는 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된자에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
임상의 ex vivo 실시예는 자가면역 질병의 치료에서 또는 암 치료에서 자가이식에 앞서 뼈골수로부터 종양세포 또는 임파세포를 제거하기 위한것이고, 또는 GVHD를 예방하기 위한 이식에 앞서 자가이식하거나 또는 동종이계의 뼈골수 또는 조직으로 부터 T세포와 다른 임파세포를 제거하기 위한것이다. 치료는 다음과 같이 수행될 수 있다. 뼈골수는 환자 또는 다른 개인으로부터 추출하고 그리고 본 발명에 의한 10 mM 내지 1 pM의 세포독성 인자가 첨가된 혈청을 포함하는 배지에서 약 37oC에서 30분에서 48시간 동안배양되어진다. 배양의 정확한 농도와 시간은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진자에의해 쉽게 측정되어진다. 뼈골수세포의 배양이후에 혈청을 포함하는 배지로 세척하고 알려진 방법에 따라 정맥주사로 환자에 재투입한다. 탈격의 화학치료 또는 골수의 수거시간과 치료된 세포의 재주입사이의 전신 방사선치료와 같은 다른 치료를 받는 환자의 상황에서는, 치료된 골수 세포는 표준 의학 장치를 사용하여 액체질소에서 동결보관된다.
생체내 사용 임상을 위해, 본 발명에 의한 세포독성 인자는 새균내 독성 수치 그리고 불임을 분석하는 동결건조 파우더 또는 용액으로 제공되어진다. 적합한 접합 투여의 프로토콜의 예는 다음과 같다. 접합은 매주 정맥내 환약으로 4주동안 투여된다. 환약은 인간의 혈청 알부민의 50 내지 100ml가 첨가될 수 있고 일반적인 염의 50 내지 100ml로 주어진다. 알약은 정맥내로(1일 마다 100 ng 내지 20 mg/kg 범위로) 매 투여에 10 mg 내지 2000 mg이 될것이다. 치료 4주후에, 화자는 주간단위로 치료를 계속해서 받을 수 있다. 투여, 첨가제, 희석제, 알약, 횟수, 등의 루트에 관한 특별한 임상 프로트콜은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자에의해 측정되어질 수 있다.
선택된 세포 군집에서 세포사멸을 포함하는 생체내 또는 ex vivo 방법에 따라 치료될 수 있는 의학 상태의 예들은 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 난소암,임파 기관암을 포함한 암; 전신 낭창, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 신장이식거부, 간장이식거부, 폐이식거부, 심장이식거부 그리고 뼈골수이식거부와 같은 이식 거부반응과 같은 자가면역 질병; 호스트질병에 대한 이식; CMV 감염, HIV 감염, AIDS 등과 같은 바이러스 감염; 그리고 지알디아증, 아메바증, 주혈흡충병과 같은 기생충 감염; 그리고 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자에게 알려진 다른 여러 타입의 질병을 포함한다.
본 발명은 높은 독성을 유지하고 효과적으로 세포결박약제에 연결될 수 있는 새로운 탁산을 기술한다. 이전에 C-10에서 보호받는 수산기 기를 포함하는 탁산이 높은 효능이 있다는 것이 알려져왔다(USP 6,340,701, USP 6,372,738 and USP 6,436,931).본 발명의 첫 번째 실시예는 C-10위치에서 높은 효능을 유지하기 위해서는 보호될 필요가 없다는 예상치 못한 발견에 기초하고 있다. C-10에서 자유수산기기를 생성하는 탁산은 연결기와 마찬가지로, C-7에서 보호되는수산기 기가 존재하는 한 여전히 높은 효능을 유지한다.
본 발명은 더 나아가 C-10에서 자유수산기를 생성하고 C-7에서 연결기를 생성하는 탁산의 합성 및 생체내 측정을 기술한다.
또한, C-3N'에서 벤자미도 혹은 테르트-부틸 옥시 카보닐 아미노(-NH-t-BOC)치환기를 갖는 탁산이 아릴 또는 선형가지 또는 원형 알킬기인 또다른 수산기와 함께 하면 효능이 높다는 것이 이전부터 알려져 왔다.
탁산의 합성에 있어서의 선구물질은 자연적으로 발생하는 합성물 10-디 아세틸 바카틴 III (10-DAB) (도 7)이다. 연결기를 생성하는 많은 다양한 탁산이 제조될 수 있다. 더 나아가, 이 합성물은 C-10위치에서 자유 수산기기를 갖는다. 따라서, 본 발명의 첫 번째 실시예에 따라 독성탁산의 생산을 위하여 요구되는 합성단계의 개수는 감소될 수 있는데 왜냐하면 수산기 기가 에스테르, 에테르, 또는 카바메이트(carbamate)로 전환될 필요가 없기 때문이다. 또한 연결기를 생성하는 탁산의 발생이 증가될 수 있다.
본 발명은 더 나아가 C-7, C-10, C-2'에서 또는 C-3', C-3'N에서 연결기와 함께 또는 연결기없이, C-3' 또는 C-3'N에서 새로운 치환기를 생성하는 대표적인 탁산의 합성 및 생체내 측정을 기술한다.
본 발명의 기술분야에서는 현존하는 약제의 독성효능을 감소시키지 않고서 현존하는 약제를 수정하는 것은 지극히 어렵다고 알려져있다. 공개되는 본 발명은 화학적 부분을 갖는 공개된 탁산을 수정함으로써 이 문제를 극복하는데, 이러한 탁산에는 적절한 세포-결박약제가 연결될 수 있는 티올 또는 이황화물 기를 함유하는 탁산이 포함된다. 그 결과, 공개된 새로운 탁산은 이미 공지된 탁산의 독성효능을 유지하고 심지어 몇몇 경우에는 독성을 증가시킬 수 있다. 세포-결박 약제- 탁산 복합물은 결함있는 세포에만 대항하여 표적으로 된 부류에 적용될 탁산의 완전한 독성기능측정을 가능케하고, 따라서, 표적으로 되지 않은 건강한 세포에 해를 끼치게 되는 부작용을 피하게 된다. 본 발명은 탁산이 원하는 지점에서 표적이 되도록 하는데. 이것은 이전에는 불가능한 일이었다. 그리하여, 본 발명은, 부작용을 최소화하면서, 병든 또는 비정상적인 세포, 예를들어, 종양세포(특히 고형(solid) 종양세포), 바이러스에 의해 손상된 세포, 미생물에 의해 손상된 세포, 기생생물에 의해 손상된 세포, 자가면역세포(자가항체를 생산하는 세포 또는 자가항체의 생산을 조절하는 세포), 활성화 된 세포(이식거부 또는 이식 vs 숙주 질병을 수반하는 세포) ,또는 어떤 유형으로든지 병들었거나 비정상적인 세포들을 제거하는데 유용한 약제를 제공한다.
본 발명에 따른 독성제는 연결기를 경유하여 세포-결박 약제에 연결되는 하나 또는 그 이상의 탁산을 포함한다. 연결기는 종래의 방법을 통하여 탁산에 공유결합된 화학적 부분의 링부분이다. 바람직한 실시예에서는, 세포-결박 약제는 이황화물 또는 티오에테르 결합을 경유하여 탁산에 공유결합될 수 있다.
실시예 (1)부터 (9)까지에 대한 이하의 기술에서, 다음 사항이 적용된다.
알킬이라는 용어는 별다른 특정이 없다면, 선형, 가지형, 또는 원형을 의미한다.
선형 알킬의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 및 헥실을 포함한다.
가지형 알킬의 예로는 이소프로필, 이소부틸, 섹-부틸(sec.-butyl),테르트-이소펜틸(tert.isopentyl) 및 2-에틸-프로필(2-ethyl-propy)을 포함한다.
원형 알틸의 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 포함한다.
알케닐 및 사이클로알케닐의 예로는 디메틸 아크릴 오일, 이소부테닐, 헥세닐,사이클로펜테닐 및 사이클로헥세닐을 포함한다.
간단한 아릴의 예로는 페닐 및 나프틸을 포함한다.
치환된 아릴의 예로는 위에서 알킬기, 염소,붕소, 플루오르와 같은 할로겐, 니트로기,아미노기, 황산기, 카르복실산기,수산기 그리고 알콕시기로 치환된 것으로 기술된 것들과 같이 아릴을 포함한다.
헤테로사이클릭은 복합물이며, 그 복합물의 산소,질소, 및 황으로부터 헤테로원자가 선택되고, morpholino, piperidino, piperazino, Npyrrollyl, pyridyl, furyl, imidazolyl, oxazolyl, thiazolyl, 그리고 thiopheneyl, indolyl, benzofuranyl, 그리고 benzothiopheneyl을 포함한다.
카르밤산의 예로는 알킬,알케닐, 싸이클로 알킬, 싸이클로 알케닐, 또는 methyl, ethyl, crotonyl, cyclohexyl, cyclohexenyl, phenyl과 같은 아릴부분들로부터 형성된 것들이거나, morpholino, piperidino, piperazino, N-methyl piperazino와 같은 헤테로 싸이클릭을 포함하는 니트로겐으로부터 형성된 것들이다.
아릴 에스테르,에테르, 및 카르밤산의 예로는 페닐 및 나프틸 에테르,에스테르 그리고 카르밤산을 포함한다.
선형, 가지형, 또는 원형 알킬 도는 알케닐 에스테르의 예로는 메틸,에틸,이소프로필,알릴,크로토닐, 그리고 싸이클로 헥실 에스테르를 포함한다.
선형, 가지형, 또는 원형, 알킬 또는 아케닐 에스테르는 메틸, 에틸, 이소프로필,알릴, 크로토닐, 그리고 싸이클로 헥실 에테르를 포함한다.
본 발명에서 유용한 탁산은 아래에서 보여지는 구조식을 갖는다.
(I)
이러한 신규의 탁산은 (1)부터 (9)까지 명시된 9개의 실시예로 나누어질수 있다. 실시예(1)부터(4)까지는 도 2에서 보여진다. 실시예 (1)부터(4)까지는 도 6에서 보여진다.
본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1
탁산(Taxane)2′의 준비
탁산2′(3′-디페닐-3′-(이소부테닐)-7-(메틸디술포닐-프로파놀)-도세텍셀) 을 도8 에 도시한 다음의 표인 상업적으로 활용가능한 10-디아세틸바카틴 Ⅲ(도7)로 부터 준비하였다.
4-6′화합물은 Greene et al. in J. Am. Chem. Soc. 110: 5917-5919 (1988) 그리고 Ojima et al, J. Med. Chem. 39: 3889-3896 (1996) 그리고 이들 자료에 참조된 자료들에 기술되어진대로 준비되었다.
화합물 7'(7-(트리에틸시릴)-2′(트리이소프로필시릴옥시)-3'-디페닐-3'-(이소부테닐)-도세텍셀)은 상온에서 에탄올(2ml)에 6' (65 mg, 0.059 mmol)의 용액을 만들기 위해 하이드라진 모노하이드레이트(1 mL)을 첨가하여 준비하였다. 상온에서 반응하였고 헥산용액에 40% 에틸 아세테이트를 사용하는 엷은 레이어 크로마토그래피에 의해 측정되었다. 수용층은 에틸아세테이트(10 ml x 3)를 사용하여 추출하였다. 화합 추출물은 무수 황산마그네슘에서 건조되고 진공에서 농축되었다. 잔류물은 흰색 고체(42mg, 69%)인 7′을 생산할 수 있는 용리제로써 헥산용액에 40% 에틸아세테이트을 사용한 실리카겔 콜롬에서 정류되었다: 1H NMR ( CDCl3) 0.53 (m, 6 H), 0.92 (t, J = 8.0 Hz, 9 H), 1.11 (m, 24 H), 1.20 (s, 3 H), 1.23 (s, 3 H), 1.32 (s, 9 H), 1.71 (s, 3 H), 1.72 (m, 3 H), 1.78 (s, 3 H), 1.92 (m, 4 H), 2.35 (m, 5 H), 3.89 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 4.18 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.23 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 4.28 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.37 (dd, J = 6.4, 10.4 Hz, 1 H), 4.41 (d, J = 3.2 Hz, 1 H), 4.80 (m, 2 H), 4.91 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.10 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 5.31 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 5.63 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 6.13 (t, J = 9.0 Hz, 1 H), 7.43 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.57 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.07 (d, J = 8.0 Hz 2 H). m/z LC/MS for C56H89NO14Si2Na +: calcd: 1078.58; found: 1078.40.
화합물 8' (2′-(트리이소프로필실리옥시)-3'-디페닐-3'-(이소부테닐)-독세탁셀)은 다음 단계에 의해 준비되었다. 화합물 7' (35 mg, 0.029 mmol)의 용액은 0℃에서 에탄올(5ml)에 0.1 N HCl를 녹인 용액을 첨가하여 만들었다. 용액은 상온에 이르도록 점진적으로 데워주며 저어주었고 16hrs동안 저어주었다. 반응은 포화 수용성 중탄산나트륨(10ml)로 식혀졌고, 수용성층은 에틸 아세테이트(15 ml x 3)로 추출되었다. 화합추출물은 무수 황산 마그네슘에서 건조되었고, 진공에서 응축되었다. 잔류물은 흰색 고체(20mg, 64%)인 8′을 생산할 수 있는 용리제로써 헥산용액에 50% 에틸아세테이트을 사용한 실리카겔 콜롬에서 정류되었다: 1.11 (m, 24 H), 1.23 (s, 3 H), 1.26 (s, 3 H), 1.30 (s, 9 H), 1.74 (s, 6 H), 1.79 (s, 3 H), 1.84 (m, 1 H), 1.92 (s, 3 H), 2.36 (s, 3 H), 2.38 (m, 1 H), 2.57 (m, 1 H), 3.92 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 4.17 (d, J = 1.2 Hz, 1 H), 4.22 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.23 (m, 1 H), 4.31 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.42 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 4.75 (m, 1 H), 4.85 (m, 1 H), 4.95 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 5.20 (s, 1 H), 5.33 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 5.68 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 6.14 (t, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.46 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.60 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 1 H).
화합물 9' (2′-(트리이소프로필실리옥시)-3'-디페닐-3'-(이소부테닐)-7-(메틸디술파밀-프로판올)-독세탁셀)은 다음 단계에 의해 준비되었다. 화합물 8' (20 mg, 0.020 mmol)의 용액은 메틸렌 클로라이드(3ml)에 DAMP(3mg, 0.02mmol), 디티오산(3mg, 0.018mmol) 그리고 EDC(8mg, 0.042mmol)을 첨가하여 만들었다. 결과 혼합물은 밤동안 저어졌다. 헥산용액에 25% 에틸아세테이트를 사용하여 얇은 층 클로마토그래피 분석은 본질적으로 모든 출발물질이 소비되어지고 새로운 점이 생성된다는 것을 보여주었다. 반응은 포화 수용성 염화암모늄(10ml)로 식혀졌고, 수용성층은 염화메틸렌(10 ml x 3)으로 추출되었다. 화합추출물은 무수 황산 마그네슘에서 건조되었고, 진공에서 응축되었다. 잔류물은 흰색 고체(9mg, 41%)인 9′을 생산할 수 있는 용리제로써 헥산용액에 25% 에틸아세테이트을 사용한 실리카겔 콜롬에서 정류되었다: 1H NMR ( CDCl3) 1.11 (m, 24 H), 1.22 (s, 3 H), 1.34 (s, 9 H), 1.76 (s, 3 H), 1.80 (s, 3 H), 1.85 (s, 3 H), 1.95 (m, 4 H), 2.36 (s, 3 H), 2.41 (m, 1 H), 2.42 (s, 3 H), 2.54 (m, 1 H), 2.70 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.88 (m, 2 H), 3.93 (br s , 1 H), 4.04 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 4.24 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.33 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.43 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 4.77 (m, 1 H), 4.86 (m, 1 H), 4.94 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.32 (m, 2 H), 5.54 (dd, J = 6.8, 10.4 Hz, 1 H), 5.69 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 6.13 (t, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.47 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.61 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.10 (d, J = 8.0 Hz 1 H). m/z LC/MS for C54H81NO15S2SiNa+: calcd: 1098.48; found: 1098.28.
탁산 2' (3'-디페닐-3'-(이소부테닐)-7-(메틸디술포닐-프로판올)-독세탁셀)은 다음 단계에 의해 준비되었다. 화합물 9' (9mg, 0.008 mmol)의 용액은 0℃에서 피리딘 아세토니트릴(1/2, 2ml)에 HF/피리딘(70:30, 0.1 ml)를 첨가하여 만들었고 혼합물은 상온으로 데워져 24hrs 동안 저어졌다. 반응 첨가물은 이후 에틸 아세테이트(5ml x 3)로 희석되어졌고, 혼합 유기층은 물(5ml)로 세척되고, 무수 황산 마그네슘에서 건조되었고, 진공에서 응축되었다. 잔류물은 최종산물인 흰색고체 (5mg, 64%)인 2′을 생산할 수 있는 용리제로써 헥산용액에 60% 에틸아세테이트를사용한 실리카겔 콜롬에서 정류되었다: 1H NMR (CDCl3) 1.10 (s, 3 H), 1.21 (s, 3 H), 1.36 (s, 9 H), 1.56 (s, 3 H), 1.77 (s, 6 H), 1.86 (s, 3 H), 1.94 (m, 1 H), 1.97 (s, 3 H), 2.35 (m, 1H), 2.37 (s, 3 H), 2.42 (s, 3 H), 2.56 (m, 1 H), 2.70 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.88 (dd, J = 2.4, 6.8 Hz, 2 H), 3.36 (br d, J = 4.8 Hz , 1 H), 3.95 (d, J = 3.2 Hz, 1 H), 4.01 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 4.23 (m, 2 H), 4.33 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.77 (m, 2 H), 4.94 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 5.31 (m, 1 H), 5.32 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 5.51 (dd, J = 7.2, 10.8 Hz, 1 H), 5.68 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 6.16 (t, J = 9.0 Hz, 1 H), 7.48 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.62 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.11 (d, J = 8.0 Hz 1 H). m/z LC/MS for C45H61NO15S2Na+: calcd: 942.35; found: 942.47.
실시예2
탁산(Taxane)3′의 준비
탁산3′(3′- 디페닐- 3′- (이소부테닐)-2- 디벤졸 - 2- (2,5-디메톡시벤졸)-7-(메틸디술포닐-프로판올)-독세탁셀) 을 도9 에 도시한 다음의 화합물 10′로 부터 준비하였다.
화합물 10' (7- (트리에틸실릴)-2′- (트리이소프로필실리옥실)-3′- 디페닐 -3′-(이소부테닐)- 2- 디벤졸-2-(2,5-디메톡시벤졸)-독세탁셀) 은 다음 단계에 의해 준비되었다. 9' (36 mg, 0.031 mmol)의 용액은 상온에서 에탄올(1.5ml)에 하이드라진모노하이드래이트 (1 ml)를 첨가하여 만들었다. 반응물은 상온에서 저어주었고 (두번 개발된) 헥산에 40% 에틸 아세테이트를 녹인 용액을 사용하여 엷은 층 크로마토그래피 분석에 의해 측정되어졌다. 1시가 후에, 반응물은 엷은 층 크로마토그래피에 의해 완전히 이루어졌고 포화 수용성 염화암모늄(10ml)로 식혀졌다. 수용성층은 에틸 아세테이트(10 ml x 3)로 추출되었다. 화합 추출물은 무수 황산 마그네슘에서 건조되었고, 진공에서 응축되었다. 잔류물은 흰색 고체(19mg, 57%)인 10′을 생산할 수 있는 용리제로써 헥산용액에 35% 에틸아세테이트을 사용한 실리카겔 콜롬에서 정류되었다:1H NMR ( CDCl3) 0.56 (m, 6 H), 0.92 (t, J = 8.0 Hz, 9 H), 1.11 (m, 27 H), 1.22 (s, 3 H), 1.23 (s, 3 H), 1.38 (m, 10 H), 1.69 (s, 3 H), 1.72 (m, 3 H), 1.78 (s, 3 H), 1.89 (s, 3 H), 1.93 (m, 1 H), 2.18 (s, 3 H), 2.32 (m, 1H), 2.44 (m, 2 H), 3.81 (s, 3 H), 3.82 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 3.96 (s, 3 H), 4.25 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 4.29 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.34 (dd, J = 6.4, 10.4 Hz, 1 H), 4.39 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 4.42 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.76 (t, J = 9.2 Hz, 1 H), 4.89 (m, 2 H), 5.11 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 5.34 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 5.64 (d, J = 6.4 Hz, 1 H), 6.13 (t, J = 9.0 Hz, 1 H), 6.94 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 7.06 (dd, J = 9.2, 3.2 Hz, 1 H), 7.29 (d, J = 2.8 Hz 1 H). m/z LC/MS for C58H93NO16Si2Na+: calcd: 1138.60; found: 1138.43.
화합물 11' (2′-(트리이소프로필실리옥시)-3'-디페닐-3'-(이소부테닐)-2- 디벤졸-2-(2,5-디메톡시벤졸)-독세탁셀)은 다음 단계에 의해 준비되었다. 0℃에서 에탄올 (9.0 ml) 에 5% 염화수소산' (35 mg, 0.029 mmol)을 녹인 용액에 10′(86.4mg, 0.0774 mmol)를 첨가하여 만들었다. 혼합물은 N2하에서 상온으로 데워주며 저어주었다. 5시간이후에 반응물은 포화 수용성 중탄산나트륨(10ml)로 식혀졌고, 에틸 아세테이트(25 mL x 2)로 추출되었다. 수용성층은 에틸 아세테이트(15 ml x 3)로 추출되었다. 화합추출물은 무수 황산 마그네슘에서 건조되었고, 진공에서 응축되었다. 잔류물은 흰색 고체(20mg, 64%)인 8′을 생산할 수 있는 용리제로써 헥산용액에 50% 에틸아세테이트을 사용한 실리카겔 콜롬에서 정류되었다: 1H NMR ( CDCl3) 1.08 (s, 27 H), 1.23 (s, 3H), 1.36 (s, 9 H), 1.58 (m, 1 H), 1.67 (s, 3 H), 1.70 (s, 3 H), 1.76 (s, 3 H), 1.82 (m, 2 H), 1.88 (s, 3 H), 2.16 (s, 3 H), 2.31 (m, 1 H), 2.50 (m, 2 H), 3.17 (br s, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.85 (d, J = 6.4 Hz, 1 H), 3.95 (s, 1 H), 4.18 (m, 2 H), 4.29 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.37 (d, J = 2 Hz, 1 H), 4.41 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.74 (t, J = 9 Hz, 1 H), 4.90 (t, J = 9.8 Hz, 2 H), 5.17 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 5.32 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 5.65 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 6.10 (t, J = 8.8 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 7.05 (dd, J = 9.2, 3.0 Hz, 1 H), 7.28 (d, J = 3.0 Hz, 1 H). m/z LC/MS for C52H79NO16SiNa+: calcd: 1024.52; found: 1024.31.
화합물 12' (2′-(트리이소프로필실리옥시)-3'-디페닐-3'-(이소부테닐)-2- 디벤졸-2-(2,5-디메톡시벤졸)-7-(메틸이술포닐-프로파놀)- 독세탁셀)은 다음 단계에 의해 준비되었다. 염화메틸렌 (0.8 ml)에 11'(25mg, 0.025 mmol), EDC(10mg, 0.05mmol)과 DMAP(3mg, 0.025 mmol)의 용액을, 염화메틸론(4.0ml)에 메틸디티오프로프리오닉산(3.6mg, 0.024mmol)을 녹인 용액이 첨가되었다. 반응물은 N2하에서 상온에서 5시간동안 저어주었다. 반응물은 포화 수용성 중탄산나트륨(10ml)로 식혀졌고, 염화메틸렌(25 mL x 2)로 추출되었다. 결합된 유기층은 물(15 ml x 1)로 세척되었고, 무수 황산 마그네슘에서 건조되었고, 진공에서 응축되었다. 잔류물은 다량의 산물 12′(21.3mg, 75%) 용리제로써 헥산용액에 30% 에틸아세테이트을 사용한 실리카겔 콜롬에서 정류되었다:1H NMR ( CDCl3) 1.12 (s, 27 H), 1.23 (s, 6 H), 1.37 (s, 9 H), 1.68 (s, 3 H), 1.72 (s, 3 H), 1.88 (s, 3 H), 1.93 (s, 3 H), 2.17 (s, 3 H), 2.41 (s, 3 H), 2.69 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.86 (m, 2 H) 3.22 (br s, 1 H), 3.80 (s, 3 H), 3.95 (m, 4 H), 4.31 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.38 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.45 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.76 (t, J = 9.8 Hz, 1 H), 4.90 (m, 2 H), 5.29 (s, 1 H), 5.34 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 5.48 (dd, J = 7.2, 10.8 Hz, 1 H), 5.66 (d, J = 6.4 Hz, 1 H), 6.11 (t, J = 8.8 Hz, 1 H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 7.06 (dd, J = 3.2, 9.2 Hz, 1 H), 7.28 (d, J = 3.2 Hz, 1 H). m/z LC/MS for C56H85NO17S2SiNa+: cacld: 1158.50; found: 1158.33.
탁산3' (3′-디페닐-3'-(이소부테닐)-2-디벤졸-2-(2,5-디메톡시벤졸)-7-(메틸디술포닐-프로파놀)-독세탁셀)은 다음 단계에 의해 준비되었다. N2하에서, 혼합물 12′(27.6mg, 0.0243mmol)을 피리딘-아세토니트릴(1/1, 2.0ml)에 녹였다. 0℃에서 HF/피리딘(70:30, 0.28ml)이 첨가되었고 반응물은 상온으로 데워져 24시간동안 저어졌다. 반응물은 포화 수용성 중탄산나트륨으로 식혀졌고, 에틸 아세테이트(30 mL x 3)로 추출되었다. 연결된 유기층은 추가적인 포화 수용성 중탄산나트륨(25mL x 1)로 세척되고, 무수 황산 마그네슘에서 건조되었고, 진공에서 응축되었다. 미정제된 잔류물은 다량의 3′(19.7mg, 82.8%), 용리제로써 헥산용액에 50% 에틸아세테이트를 사용한 실리카겔 콜롬에서 정류되었다:1H NMR ( CDCl3) 1.25 (s, 6 H), 1.38 (s, 9 H), 1.69, (s, 3 H), 1.74 (s, 3 H), 1.87 (s, 3 H), 1.94 (s, 3 H), 2.18 (s, 3 H), 2.41 (s, 3 H), 2.68 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.86 (m, 2 H), 3.12 (br s, 1 H), 3.29 (d, J = 6.4 Hz, 1 H), 3.80 (s, 3 H), 3.92 (m, 4 H), 4.16 (d, J = 2.0, 6.4 Hz, 1 H), 4.30 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.43 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.75 (m, 2 H), 4.90 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.29 (s, 1 H), 5.33 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.46 (dd, J = 7.2, 10.8 Hz, 1 H), 5.65 (d, J = 6.4 Hz, 1 H), 6.14 (t, J = 8.8 Hz 1 H), 6.95 (t, J = 9.2 Hz, 1 H), 7.06 (dd, J = 3.2, 9.2 Hz, 1 H), 7.28 (d, J = 3.2 Hz, 1 H). m/z LC/MS for C47H65NO17S2Na +: calcd: 1002.37; found 1001.99.
실시예3
생체내 세포독소의 분석
본 발명에 의한 탁산을 함유하는 황화물, 2황화물,그리고 술프히드릴기는 생체내 다양한 인간의 종양 세포선의 분열증식을 억제하는 그들의 능력으로 평가될 수 있다. 4개의 점착성 세포선, A431(인간의 표피성 암), SKBR3 (인간의 유방종양), A549 (인간 폐암) 그리고 MCF-7 (인간의 유방종양), 그리고 비점착성 세포선, Namalwa (Burkitt's lymphoma)는 이들 화합물의 세포독성를 평가하는데 사용된다. 세포들은 72시간동안 화합물에 노출되어지고 세포의 생존 단편들은 직접분석에 의해 측정되었다. A431, SKBR3, A549 그리고 MCF-7 는 플래이팅 효율로 분석되고 (Goldmacher et al, J. Cell. Biol. 102: 1312-1319 (1986) 그리고 Namalwa는 성장 백 외삽법(growth back extrapolation)에 의해 분석되었다(Goldmacher et al, J. Immunol. 135: 3648-3651 (1985). IC50 값은 이 데이타로 부터 계산된다.
탁산 2′와 3′의 세포독성는 다음과 같이 측정되었다.
A431, A549 그리고 MCF-7세포는 10%의 태아상태의 송아지 혈청으로 보충된 DMEM 배지에 6-웰 티슈- 배양 플래이트에서 다른 농도로 평판배양 되었다. 다양한 농도에서, 탁산 2′가 첨가되고 세포는 37℃의 축축한 대기와 6% CO2 에서 대략 20 개 또는 그 이상의 세포 집합이 형성되었을 때까지(6 내지 10일간) 배양되었다. 통제 플래이트는 탁산을 함유하지 않았다. 세포들은 이후 포름알데히드로 고정되었고, 크리스탈 바이올렛으로 염색되었고, 그리고 낮은 광학 현미경으로 세어졌다. 배양 효율성은 집합군의 수로 측정되었고 세포의 생존 단편들은 통제의 배양 효율성과 처리 시약의 배양 효율성의 비율로 계산되어졌다.
도 10 에서는 세포독성 측정의 결과를 보여준다. C-10에서 유기 수소 기와 C-7에서 연결기를 지닌 탁산 2′는 A431세포방면으로 8 x 10-10 M 의 값을 가진 IC50 을 다량 함유하고 있다. 반대로, C-10에서 에스터기를 지니는 대응하는 탁산 1′(도 3)은 심지어 3 x 10-9 M 세포에도 무독성이다. 이들 결과는 탁산의 C-10 포지션은 높은 효능을 유지하기위해 보호되어질 필요가 없다는 것을 말한다.
탁산 3′의 세포독성 효능은 유사하게 확인되었다. A549 와 MCF-7 세포는 10%의 태아상태의 송아지 혈청으로 보충된 DMEM 배지에 6-웰 티슈- 배양 플래이트에서 다른 농도로 평판배양 되었다. 다양한 농도로 탁산 2′가 첨가되고 세포는 37℃의 축축한 대기와 6% CO2 에서 대략 20 개 또는 그 이상의 세포 집합이 형성되었을 때까지(6 내지 10일간) 배양되었다. 통제 플래이트는 탁산을 함유하지 않았다. 세포들은 이후 포름알데히드로 고정되었고, 크리스탈 바이올렛으로 염색되었고, 그리고 낮은 광학 현미경으로 세어졌다. 배양 효율성은 집합군의 수로 측정되었고 세포의 생존 단편들은 통제의 배양 효율성과 처리 시약의 배양 효율성의 비율로 계산되어졌다.
도 11 에서는 세포독성 측정의 결과를 보여준다. C-10에서 유기 수소 기와 C-7에서 연결기를 지닌 탁산 3′는 1.8 x 10-10 M 그리고 6.3 x 10-11 M의 값을 가지는 IC50 로 테스트된 2개의 종양세포방면으로 그리고 A549와 MCF-7 세포 방면으로 각각 더 큰 효능을 보여준다. 이들 결과는 탁산의 C-10 포지션은 높은 효능을 유지하기위해 보호되어질 필요가 없다는 것을 말한다.
실시예4
항체에의 접합
2황화연관을 통한 항체와 탁산을 함유하는 티올의 접합
2황화물 연계를 통하여 항체, 또는 그 단편에 탁산을 함유하는 티올의 접합은 2단계로 이루어진다. 첫번째 과정은 Carlsson et al. 에 의해 기술되어진 SPP(succinimidyl pyridyldithiopentanoate ) 을 사용하여 디티올피리딜기를 항체 또는 항체단편에 삽입하는 것이다. 티오피리딜기는 이후 접합을 생성하기위해 탁산을 함유하는 티올과의 반응에 의해 제거되어진다.
항체-SS-탁산 접합의 준비
항-B4, 항-EGF수용체 그리고 N901 항체들, 또는 그들의 단편들은 문헌에 기재된 SPDP 또는 SPP에 의해 변형된다. 1에서 10사이의 디티오피리딜기는 평균적으로 항체분자마다 삽입된다.
25℃에서 1 mM EDTA를 함유하는 pH 6.5 의 0.1 M 인산칼륨에 1 mg/ml의 농도 디티오피리딜 변형 항체의 용액은 탁산(1.25 molar equivalent/dithiopyridyl group)을 함유하는 티올로 처리된다. 변형된 항체 또는 그들의 단편으로부터 티오피리딘의 부유물은 343nm에서 측광기로 측정되고 20시간내에 완료되었다. 항체-탁산 접합물은 정제되고 미반응 약과 저분자 물질은 Sephadex G-25의 콜롬을 통해 겔필터로 제거된다. 항체분자마다 결합된 탁산 분자의 수는 230nm 와 275nm에서의 흡수 비율의 측정에 의해 결정된다. 항체분자마다 1-10 탁산 분자의 평균은 이 방법에 의한 2황화물을 통해 연결될 수 있다.
쪼갤수 없는 티오에테르 연결을 통한 탁산을 함유하는 티올의 항체에의 접합
탁산을 함유하는 티올의 접합물은 2단계로 이루어진다. 항체, 또는 그들의 단편들은 말레이미도기를 생성하기위해 SMCC(succinimidyl maleimidomethylcyclohexane carboxylate)로 처음 반응된다. 변형된 항체는 이후 티오에테르 링크를 형성하는 탁산을 함유하는 티올로 반응된다.
(쪼개지지 않는) 항체- 탁산 접합의 준비
항체, 항-B4, 항-EGF 수용체 그리고 N901, 또는 그들의 단편들은 문헌에 기재된것과 같이 SMCC로 변형된다.
변형된 항체 또는 항체 단편들은 텍사(1.25 molar equivalent/maleimido group)인을 함유하는 티올로 처리된다 . 혼합물은 4℃에서 한밤동안 배양된다. 항체-탁산 접합물은 위에 기재된 것에 의해 정제된다. 전형적으로, 항체 분자마다 1-1- 탁산 분자가 연관된다.
실시예5
항체-탁산 접합의 특별한 준비
인간의 EGF 수용체(EGFR)에 반대로 향하는 뮤린(Murine) 단일클론 항체들이 발현되었다. EGF수용체는 머리 와 목, 폐와 가슴과 같은 여러 인간의 편형세포암 (squamous cell cancers)에서 과다발현되는 것으로 알려져 있다. KS-61 (IgG2a), KS-77 (IgG1), KS-78 (Ig2a), 그리고 KS-62 (IgG2a)의 4개의 다른 항체들은 2황화물결합을 통해 탁산에 연결되었다. 인간의 유방암과 자궁암에서 과다발현된 종양형성유전자에 반대로 향하는 뮤린단일클론항체 TA1는 TA1-탁산 접합물의 준비에 사용되었다. 이들 특이접합물의 준비는 아래에 기술되어 있다.
항-EGFR 항체 KS-61-탁산 접합물의 준비
항-EGFR 항체 KS-61은 처음 디티오피리딜기를 생성하기위해 N-썩시니미딜-4-[2-피리딜디티오] 프나토에이트(SPP)를 사용하여 변형되었다. pH 6.5, NaCl (50 mM)와 EDTA (2 mM)50를 함유하는 50 mM 인산칼륨버퍼에서 항체(2.3 mg/mL) 는 SPP (11 molar equivalents in ethanol)를 사용하여 처리되었다. 최종 에탄올 농축은 1.4% (v/v)였다. 대기중에서 90분후에,쪼개지지않는 SPP결합의 제거를 돕기위해 리신(50 mM)를 첨가하였다. 2시간동안 반응하도록 하고, 이후 위의 버퍼와 평형하게된 Sephadex G25 콜롬을 통한 겔필터화를 통해 정제되었다. 단편을 함유하는 항체가 모아졌고 변형정도는 디티오트레이톨을 사용한 표본처리와 343nm(release of pyridine-2-thione with 343 = 8,080 M-1 cm-1)에서 흡수의 변화를 측정함으로써 판별되었다. 항체분자마다 연관된 5.0 피리딜디티오기를 가지는 항체의 복원은 약 90%였다.
변형된 항체는 pH 6.5,NaCl (50 mM)와 EDTA (2 mM) 최종 농도가 1.28 mg/mL인 50mM 인산칼륨 버퍼로 희석되었다. 항체용약을 변형하기위해 에탄올(10 % v/v in final reaction mixture)에 녹인 탁산-SH (1.7 eq. per dithiopyridyl group)을 첨가하였다. 하르곤하에서 24시간동안 대기에서 반응이 계속되었다. 반응과정은 항체에서 탁산-SH 와 디티오피리딜기사이에 2황화물의 변화에 의해 야기되는, 피리딘-2-티온의 유기를 위한 343nm에서 측광기로 관찰되었다. 343nm 에서 흡수의 증가는 탁산이 항체에 연관되었다는 것을 보여준다. 반응 혼합물은 이후 20% 프로필렌 글리콜을 함유하는 PBS(phosphate-buffered saline, pH6.5)로 형평화되어진 Sephadex G25 SF 겔필터 콜롬에 넣어졌다. 주요 피크는 모노머 KS-61-탁산으로 구성되었다. 접합물의 농도는 280nm에서 흡수측정으로 판별되었다. 접합물은 Tween 80 (0.05%) 과 인간의 혈청알부민(HSA, 1 mg/mL)으로 공식화되었다.
항-EGFR 항체 KS-77-탁산 접합의 준비
항-EGFR 항체 KS-77 는 디티오피리딜기를 얻기위해 N-썩시니미딜 4-[2-피리딜디티오] 펜타노에이트 (SPP)로 변형되었다 . pH 6.5, 50 mM 인산칼륨 버퍼에서 항체(5.0 mg/mL)는 SPP (11 molar equivalents in ethanol)로 처리되었다. 최종 에탄올 농도는 2 % (v/v)였다. 대기에서 90 분후에, 쪼개지지않는 SPP 결합을 제거하는 것을 용이하게 하기위해 리신 (50 mM)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 2시간동안 배양되었고, 이후 위의 버퍼와 형평이 이루어진 Sephadex G25콜롬을 통한 겔필터화로 정제되었다. 단편을 함유한 항체가 모아졌고 변형정도는 디티오트레이톨을 사용한 표본측정과 343nm(release of 2-mercaptopyridine with 343 = 8,080 M-1 cm-1)에서의 흡수변화를 측정함으로써 판별되어졌다. 항체분자마다 연관된 4.24 피리딜디티오기를 가지는 항체회복은 약 90%였다.
변형된 항체는 pH 6.5, NaCl (50 mM)와 EDTA (2 mM) 최종 농도가 1.4 g/mL인 50mM 인산칼륨 버퍼로 희석되었다. 항체용액을 변형하기 위해 에탄올(10 % v/v in final reaction mixture)에 녹인 탁산-SH (1.7 eq. per dithiopyridyl group)을 첨가하였다. 아르곤하에서 24시간동안 대기에서 반응이 계속되었다. 343nm에서 흡수의 증가는 피리딘-2-티온이 유기되었고 탁산이 항체에 연관되었다는 것을 말해준다. 반응 혼합물은 PBS(phosphate-buffered saline , pH 6.5)로 형평화되어진 Sephacryl S300HR겔필터화콜롬에 넣어졌다. 주요 피크는 모노머 KS-77-탁산으로 구성되었다. 항체 KS-77의 농도는 280nm에서 흡수측정으로 판별되었다. 접합물은 Tween 80 (0.06%) 과 HSA(1 mg/mL)으로 공식화되었다.
항-EGFR 항체 KS-62 탁산 복합체의 제조
항-EGF 항체-탁산 복합체(KS-62-탁산)가 상기 항-EGFR 항체 KS-77-탁산 복합체의 제조를 위하여 설명된 유사한 방법으로 제조된다. 변형된 항체는 NaCl(50mM) 및 EDTA(2mM)를 포함하는 pH 6.5의 50mM 인산칼륨 완충액으로 희석하여 최종농도를 2.5mg/ml로 한다. 항체는 항체분자 당 5.25 피리딜디티오 그룹을 도입하여 SPP로 변형시킨다. 그 다음 에탄올(최종 반응 혼합물 10% v/v)에 있는 탁산-SH(1.7 eq.)를 변형 항체 용액에 첨가한다. 상기 반응은 24시간 동안 아르곤하에서 대기 온도에서 진행된다. 복합체는 인산 버퍼용액(PBS, pH 6.5)과 평형을 이룬 세파크릴 S300HR 겔 여과 컬럼을 통과하여 정제된다. 주요 피크는 모노머릭 KS-62-탁산을 포함한다. 그 복합체는 트윈 80(0.01%, w/v) 및 HSA(1mg/ml)를 포함하는 PBS에서 제조된다.
항-EGFR 항체 KS-78-탁산 복합체의 제조
항-EGFR 항체-탁산 복합체인 KS-78-탁산은 상기 항-EGFR 항체 KS-77-탁산 복합체의 제조를 위하여 설명된 유사한 방법으로 제조된다. 변형된 항체는 NaCl(50mM) 및 EDTA(2mM)를 포함하는 pH 6.5의 50mM 인산칼륨 완충액으로 희석하여 최종농도를 1.6mg/ml로 한다. 항체는 항체 분자 당 4.0 피리딜디티오 그룹을 도입하여 변형시킨다. 그 다음 에탄올(최종 반응 혼합물 15% v/v)에 있는 탁산-SH(1.7 eq.)를 변형 항체 용액에 첨가한다. 상기 반응은 24시간 동안 아르곤하에서 대기 온도에서 진행된다. 상기 용액은 그 다음 배치 A 및 배치 B의 2개의 배치로 분리되어 별도로 처리된다. 배치 A는 2 mM CHAPS (3-[(cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate) 및 20% (v/v) 프로필렌 글리콜를 함유하는 PBS, pH 6.5에서 투석된다. 최종 농도의 pH는 6.0이다. 배치 B는 20%(v/v) 프로필렌 글리콜을 함유하는 PBS, pH 6.5에서 투석된다. 투석후 HSA(1mg/ml)가 양 배치에 투입된다. 배치 B는 추가로 트윈 80(0.05%, w/v)로 처리된다.
TA1-탁산 복합체의 제조
유방암 및 난소암에서 발현되는 neu 원암에 결합한 서치류 모노클로날 항체 TA1가 탁산 복합체의 제조에 사용된다. NaCl(50mM) 및 EDTA(2mM)를 포함하는 pH 6.5의 50mM 인산칼륨 완충액에 있는 TA1(3.2 mg/ml)을 SPP(에탄올에서 8.0 몰 당량)으로 처리한다. 최종 에탄올 농도는 5%(v/v)이다. 대기 온도에서 90분 후, 라이신(50mM)이 비-공유결합 SPP의 제조를 돕기 위하여 첨가된다. 반응 혼합물은 2시간 동안 배양되고, 그 다음 상기 완충액과 평형된 세파덱스 G25 컬럼을 통하여 겔 여과된다. 항체를 포함하는 분획이 분리되고 변형 정도가 디티오쓰레이톨(dithiothreitol)로 샘플을 처리하고 343 nm의 흡광도( e343 = 8,080 M-1 cm-1으로 피리딘-2-티온( pyridine-2-thione)의 방출 )에서 그 변화를 측정함으로써 결정된다. 항체의 회수율은 항체분자 당 4.9 피리딜디티오( pyridyldithio) 그룹으로 약 90%이다.
변형 항체는 NaCl(50mM) 및 EDTA(2mM)을 함유하는 pH 6.5의 50mM 인산칼륨 완충액으로 희석하여 최종 농도를 1.0mg/ml로 한다. 그 다음 에탄올(최종 혼합물 농도가 10% v/v)에 있는 탁산-SH(피리딜디티오 그룹 당 1.7 eq. 투입)이 변형 항체 용액에 첨가된다. 상기 반응은 24시간 동안 아르곤하에서 대기온도에서 진행된다. 피리딘-2-씨온(pyridine--thione)(343nm에서 모니터)의 방출은 탁산-SH와 항체에 대한 피리딜디티오 대체물 간의 디설피드 교환이 완벽하다는 것을 나타낸다.
반응 혼합물(4.0mg)의 일부가 그 다음 인산 완충 용액(PBS, pH 6.5)과 평형을 이룬 세파크릴 S300HR 겔 여과 컬럼에 장착된다. 주요 피크는 모노머릭 TA1-탁산을 포함한다. 잔여 복합체는 0.5mg/ml로 희석되고 NaCl(50mM), EDTA(2mM) 및 20% 프로필렌 글리콜을 포함하는 pH 6.5의 50mM 인산칼륨 완출액으로 투석한다. 항체 TA1의 농도는 280nm의 흡광도에서 측정함으로써 두가지 종을 결정한다. 그 복합체는 트윈 80(0.01%) 및 HSA(1mg/ml)를 포함하는 PBS에서 제조된다.
실시예 6
탁산을 결합하는 다른 방법들
산에 민감한 링커(Acid Labile Linkers)
탁산을 화학 문헌에 기재된 표준 방법으로 DMAP(dicyclohexyl-carbodiimide and dimethylaminopyridine ) 존재하에서 N-tboc-L-알라닌과 같은 N-보호된 아미노산으로 가수분해할 수 있다. 트리플루오로아세트 산을 가지고 있는 t-boc 보호 그룹의 분해는 터미널 아미노산 그룹을 포함하는 탁산 에스테르를 생성한다. 탁산을 포함하는 아미노 그룹은 종래 기술된 대로 산에 민감한 링커를 경유하여 항체 또는 그 단편과 다른 세포 결합제를 결합시킬 수 있다(Blattler et al, Biochemistry, 24: 1517-1524 (1985), U.S. Patent Nos. 4,542,225, 4,569,789 and 4,764,368).
광에 민감한 링커
상기 기술된 탁산 유도체를 포함한 아미노 그룹은 종래 기술에 언급된 대로 광에 민감한 링커를 경유하여 세포 결합제에 결합될 수 있다( Senter et al, Photochemistry and Photobiology, 42: 231-237 (1985), U.S. Patent 4,625,014).
펩티다제에 민감한 링커
상기 기술된 탁산을 함유하는 아미노 그룹은 또한 펩타이드 스페이서 링커를 경유하여 세포 결합제에 결합될 수 있다. 약과 매크로분자 단백질 캐리어간의 짧은 펩타이드 스페이서가 이미 혈청에 안정하나 쉽게 세포내 리소좀 펩티다제에 의해 가수분해된다는 것이 알려져 있다(Trouet et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 79: 626-629 (1982)). 탁산을 포함하는 아미노 그룹은 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide-HCl과 같은 응축제를 사용하여 Ala-Leu, Leu-Ala-Leu 또는 Ala-Leu의 다이머와 같은 펩티드로 응축될 수 있고 세포 결합제에 결합될 수 있는 탁산의 펩티드 유도체를 생성한다.
에스터라제에 민감한 링커
탁산은 수산화물이 숙신 무수물과 반응함으로써 가수분해 될 수 있고 그 다음 세포내 에스터라제에 의해 분해되어 약제를 방출할 수 있는 복합체를 생성한다.(For examples see: Aboud-Pirak et al, Biochem. Pharmacol., 38: 641-648 (1989), Laguzza et al, J. Med. Chem., 32: 549-555 (1989)).
실시예 7
생체내 항암 활성도
SCID 마우스의 인간 편평상피암(squamous cancer, A431) 이종이식에 관한 항-EGF 수용체 항체-탁산 복합체의 항암효과가 다음과 같이 확립되었다. 2개의 다른 항-인간 표피 성장 인자 수용체-탁산 복합체(항-EGFR-탁산 복합체)인 KS-61-탁산 및 KS-77-탁산의 항암 효과가 SCID 마우스의 인간 암 이종이식 모델에서 전개되었다.
5 주된 암컷 SCID 마우스(25 마리)가 0.1ml의 무혈청 배지에서 A-431의 인간 편평상피암 세포(1.5 x 106 세포/마우스)의 오른쪽 측면 피하부위에 접종되었다. 암은 평균 크기 100.0 mm3(54-145 mm3의 범위)로 11일 동안 성장하였다. 그 다음 동물은 암크기에 따라 4개의 그룹(그룹 당 3 내지 5 마리)으로 랜덤하게 구분한다. 첫번째 그룹은 KS-61-탁산 복합체(10mg/kg, qd x 5)를 정맥에 주사하였다. 두번째 그룹은 KS-77-탁산 복합체(10mg/kg, qd x 5)를 정맥에 주사하였다. 세번째 그룹은 복합체에 존재하는 동일한 양으로 접합되지 않은 프리(free) 탁산(0.24 mg/kg, qd x 5, 정맥)을 받았다. 대조구인 네번째 그룹은 그룹 1-3과 동일한 처리 스케쥴을 사용하여 PBS를 받았다.
암의 크기는 매주 2번 측정되었고 암부피는 1/2(길이 x 넓이 x 높이)의 식을 이용하여 계산되었다. 동물의 체중은 또한 매주 2번 측정되었다. 도 12 및 13에 그 결과가 도시되었다. 마우스의 대조구 그룹에 있는 암은 31에 거의 1000 mm3 크기로 성장하였다.
프리(free) 탁산의 처리는 어떠한 치료 효과를 보이지 않았으며, 이 그룹에서 암은 필수적으로 PBS를 받은 동물의 대조구 그룹과 동일한 율로 성장하였다.
반면, 항-EGFR-탁산 복합체 모두 현저한 항암 활성도를 보여 KS-61-탁산 복합체에 대하여 실험-34일 동안 및 KS-77-탁산 복합체에 대하여 27일동안 모든 처리된 동물의 암 성장을 완벽하게 저해 하였다. 이 모델에서 접합되지 않은 탁산의 등가량이 어떠한 항암 효과를 나타내지 못하므로, 상기 데이터는 암-특이 항체를 사용한 탁산의 목표 전달이 항암 활성도를 위해 필수적임을 보인다. 중요한 점은 항체-탁산 복합체의 사용량이 체중감량이 없는 상태에서 동물에게 비독성이라는 점이다(도 13).
실시예 8
생체외에서 항체-탁산 복합체의 세포독성
항-EGFR-탁산 복합체, KS-78 탁산의 세포독성가 EGF-수용체-양성 인간 A431 세포주(cell line)(ATCFC CRL 1555)를 사용한 클로노제닉(clonogenic) 정량법으로 측정되었다. A431세포가 목표 항원을 발현하지 못하므로, 인간 CD56에 대한 마우스 모노클로날 항체 N901로 제조된 유사 복합체인 N901-탁산 복합체가 특정 대조구로서 사용되었다. 인간 Neu 항원에 대한 마우스 모노클로날 항체 TA1으로 제조된 복합체인 TA1-탁산 복합체의 세포독성는 항원-양성 인간 세포주 SK-BR-3(ATCC HTB 30) 및 항원-음성 A431 세포주에 대하여 측정되었다. 세포는 10% 태아 우 혈청으로 보완된 DMEM 배지에서 상이한 농도로 6-웰 조직 배양 플레이트에서 플레이팅 되었다.
다양한 농도의 면역복합체가 첨가되었고 세포는 거의 20 세포 이상이 콜로니가 형성될 때까지(6 내지 10일) 37oC 및 6% C02의 습기 있는 환경에서 보존되었다. 대조구 플레이트는 어떠한 면역복합체를 포함하지 않는다. 그 다음 세포는 포름알데히드로 고정되고 크리스탈 비올렛으로 염색되고 저배율 현미경으로 계수되었다. 플레이팅 효과는 콜로니 수로부터 결정되고 생존한 세포율이 처리 샘플의 플레이팅 효율 및 대조구의 플레이팅 효율의 비로서 계산되었다.
도 14는 목표 항원-양성 세포주 A431에 대한 KS-78 탁산 복합체의 2개의 배치에 대하여 세포독성 측정 결과를 나타낸다. 2개 배치의 복합체는 목표 세포에 대한 유사한 독성을 나타낸다. 10-8 M의 농도에서 6일동안의 처리는 10-2 이하의 생존율에 이른다(1% 이하의 생존율). 대조구 복합체인 N901-탁산은 A431 세포의 표면에 어떠한 항원도 존재하지 않고 3×10-8M까지의 농도에서 세포에 어떠한 독성도 나타내지 않는다. 접합하지 않는 KS-78 항체는 또한 매우 적은 세포독성 효과를 나타낸다. 이 결과는 KS-78-탁산 복합체의 목표 항원-특이 세포독성 성향을 나타낸다.
TA1-탁산 복합체의 세포독성능 및 선택성은 목표 항원-양성 세포주 SK-BR-3 및 목표 항원-음성 세포주 A431로 정량되었다. 그 결과가 도 15에 보여진다. 10-9의 복합체 농도에서, 90% 이상의 목표 SK-BR-3 세포가 사멸된 반면(0.1 이하의 생존율), 목표가 아닌 A431 세포에 대한 독성은 관찰되지 않았다. 이 결과는 항원-양성 세포의 선택적 사멸을 나타내며 복합체의 세포독성효과는 항체 성분을 통한 특이적 결합에 의존한다는 것을 나타낸다.
실시예 9 및 10
일반 제법:
약품은 알드리히 케미컬사 또는 다른 상업적 경로를 통하여 구입하였고 특별한 주의사항이 없으면 추가의 정제없이 사용되었다. 모든 무수반응은 아르곤하의 오븐-건조 유리제품으로 수행되었다. 테트라하이드로퓨란(THF)은 나트륨/벤조페논하에서 증류되었다. 모든 반응은 E.머크 분석 박막 크로마토그래피(TLC) 플레이트(실리카겔 60 GF, 알루미늄 백)에 의해 관찰되었고 254nm UV 광 및/또는 바닐린/황산 분무 및/또는 포스포몰리브딕 산/에탄올 분무로 분석되었다. 컬럼 크로마토그래피를 위한 실리카겔이 E.머크(230-400메시)로부터 구입되었다. 제조된 박막 크로마토그래피(PTLC) 플레이트(실리카 겔 60 GF)는 아날테크로부터 구입되었다. 1H 및 13C NMR 스펙트라는 브루커 400MHz 스펙트로미터의 CDCL3에서 구입되었고 관련된 화합물들의 화학적 이동 및 커플링 상수의 비교로 할당되었다. 화학적 이동은 δ-값으로서 보고되었고 커플링 상수는 헤르쯔로 보고되었다. 질량 스펙트라는 아질런트 에스콰이어 3000 일렉트로스프레이 질량 스펙트로미터에서 얻어졌다. "일반적인 방법으로 워크업"이라는 구절은 과량의 유기 용매로 반응 혼합물을 희석하고 물과 브라인으로 세척하고 소디움 설페이트로 건조하고 진공에서 용매를 증발하는 것을 말한다.베타-락탐 4, 19 및 38과 바카틴 Ⅲ 유도체 7이 문헌에 보고된 절차에 따라 제조되었다(Brieva, R. Crich, J.Z.; Sih, C.J. J. Org. Chem., 58: 1068-1075 (1993); Holton, R. A.; Zhang, Z.; Clarke, P.A.; Nadizadeh, H.; Procter, J.D. Tetrahedron Lett. 39: 2883-2886 (1998); Chen, S-H.; Vittorio, F.; Wei, J-M.; Long, B.; Fairchild, C.; Mamber, S.W.; Kadow, J.F.; Vyas, D.; Doyle, T.W. Bioorganic Med. Chem. Lett., 4(3): 479-482 (1994)). 이들 화합물의 NMR 데이타는 문헌의 것과 동일하다.
실시예 9
본 발명의 신규 택소이드 12-15, 31-35 및 50-54(도 5 및 16)의 합성이 아래에 기술되어 있다.
바카틴 Ⅲ 유도체 7을 β 락탐 6a-d 21-25 및 40-44의 커플링을 위한 일반적인 절차.
실릴(silyl)기로 보호된 택소이드 8-11, 26-30 및 45-49의 합성. THF(2mL)에서 바카틴 유도체 7(0.04mmol)의 휘젓는 용액에 NaH(2mmol)을 첨가한다. 그 반응 혼합물을 15분동안 섞고, 6a-d 21-25 또는 40-44(0.08mmol)과 같은 β 락탐이 도입되고 그 반응 혼합물은 추가로 4-6h 섞는다. 반응은 EtOAc로 희석하고 아세트산으로 멈추게하며 일반적인 방법으로 워크업한다. 마지막으로 조생성물은 PTLC 플레이트(30% EtOAc/Hexane)상에서 적용하고 목적산물을 분리한다.
실릴기로 보호된 그룹의 제거를 위한 일반적인 절차; 택소이드 12-15, 31-35 및 50-54의 합성
THF(0.5ml)에서 보호된 택소이드 8-11, 26-30 또는 45-49의 매 10mg의 섞인 용액에 0.15ml의 피리딘을 0o C에서 첨가한다. 그 다음 5분 이상, 0.15ml의 HF-피리딘을 섞인 용액에 도입한다. 반응 혼합물을 실온으로 되도록 한 다음 추가로 24h 동안 휘젓는다. 상기 반응 혼합물은 그 다음 EtOAc로 희석하고 포화 NaHCO3용액으로 세척하고 일반적인 방법으로 워크업한다. 마지막으로 조생성물은 PTLC 플레이트(60% EtOAc/Hexane)에 적용하고 목적산물을 분리한다.
본 발명의 대표적인 디설피 함유 택소이드(도 6, 17)의 합성
C-10 아세테이트 그룹의 제거. 16의 합성.
에탄올(1.5ml)에서 택소이드 10(~70mg)의 섞인 용액에 실온에서 하이드라진 모노하이드레이트(0.6ml)를 첨가한다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 1h동안 휘젓고 그 다음 에틸 아세테이트로 희석하고 포화 암모늄 클로라이드 수용액으로 세척하고 일반적인 방법으로 워크업한다. 조생성물은 PTLC 플레이트(10% EtOAc/CH2Cl2)에 적용하고 목적산물을 분리한다
택소이드의 C-10 수산기의 가수분해. 17 및 36의 합성.
디클로로메탄(매 30mg의 산에 대해 2ml)에서 카복실산 산의 휘젓는 용액에 EDC(1-[3-(dimethylamino)propyl-3-ethylcarbodiimide hydrochloride) (1 당량)를 실온에서 첨가하고 상기 반응 혼합물을 15분간 휘젓는다. DMAP(4-(dimethylamino)pyridine)(촉매량)을 그 다음 첨가하고 상기 반응 혼합물을 5분 더 휘젓는다. 그 다음 C-10 디아세틸(deacetyl) 택소이드 16(1/15 당량)을 실온에서 추가하고 반응 혼합물을 4h동안 추가로 휘젓는다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 물, 포화 NaHCO3용액으로 세척하고 일반적인 방법으로 워크업한다. 마지막으로 조생성물은 PTLC 플레이트(10% EtOAc/Hexane)에 적용하고 목적산물을 분리한다.
디설피드를 포함하는 택소이드 18 및 37의 합성
0.15ml의 피리딘을 0o C에서 THF(0.5mL)의 보호된 택소이드 17 또는 36의 매 10mg의 혼합용액에 첨가한다. 그 다음 5분이상, 0.15mL의 HF-피리딘이 상기 혼합용액에 도입된다. 그 반응 혼합물은 실온이 되도록 하고 추가로 24시간동안 섞는다. 상기 반응 혼합물은 그 다음 EtOAc로 희석하고 포화 수용액 NaHCO3로 세척하고 일반적인 방법으로 워크업한다. 마지막으로 조생성물을 PTLC 판(60% EtOAc/Hexane)에 적용하고 목적산물 18 및 37을 수득한다.
화합물 6a.
1H NMR ( CDCl3) d 7.03 (m, 1 H), 5.26 (dt, 1H), 4.96 (t, 1H), 4.94 (t, 1H), 1.82 (s, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.63 (m, 8 H), 1.06 (m, 21 H)
화합물 6b.
1H NMR ( CDCl3) d 7.31 (m, 1 H), 5.26 (dt, 1H), 4.96 (t, 1H), 4.92 (t, 1H), 2.6 (m, 6H), 1.82 (s, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.06 (m, 21 H)
화합물 6c.
1H NMR ( CDCl3) d 7.1 (m, 1H), 6.74 (dd, 1H), 5.24 (dt, 1H), 5.02 (d, J = 6 Hz, 1H), 4.85 (m, 1H), 1.91 (dd, 3H), 1.81 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.06 (m, 21 H); 13C NMR ( CDCl3) d 166.93, 162.99, 145.98, 140.20, 124.01, 117.68, 76.89, 55.77, 26.05, 18.33, 18.28, 17.66, 17.50, 17.46; C20H35NO3SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 388.23, 검출된 값은 388이다.
화합물 6d.
1H NMR ( CDCl3) d 6.55 (m, 1H), 5.24 (dt, 1H), 4.98 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 4.85 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.81 (s, 3H), 1.77 (s, 3H) 1.06 (m, 21 H); 13C NMR ( CDCl3) d 166.65, 163.29, 159.81, 139.58, 126.15, 118.27, 117.45, 76.59, 55.71, 27.92, 26.07, 21.25, 18.34, 17.50, 17.46; C21H37NO3SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 402.24, 검출된 값은 402.1이다.
화합물 8.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.58 (bs, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.12 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.03 (t, 1H), 5.67 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.09 (t, 1H), 4.89 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.47 (s, 1H), 4.42 (m, 2H), 4.28 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.74 (m, 1H), 2.48 (m, 1H), 2.36 (d, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.17 (s, 6H), 2.08 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.89 (m, 2H), 1.72 (s, 9H), 1.60 (m, 5H), 1.22 (s, 3H), 1.21 (s, 3H), 1.11 (s, 21H), 0.91 (t, 9H), 0.56 (m, 6H).
화합물 9.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.47 (bs, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.07 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.4 (t, 1H), 5.68 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.09 (t, 1H), 4.89 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.47 (s, 1H), 4.42 (m, 2H), 4.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 2.45 (m, 5H), 2.35 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.89 (m, 4H), 1.72 (s, 9H), 1.24 (s, 3H), 1.22 (s, 3H), 1.11 (s, 21H), 0.90 (t, 9H), 0.55 (m, 6H).
화합물 10.
1H NMR ( CDCl3) d 7.29 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.05 (dd, 1H), 6.94 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.71 (m, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.05 (t, 1H), 5.74 (m, 2H), 5.67 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.37 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.10 (t, 1H), 4.88 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.25-4.47 (m, 5H), 4.10 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.73 (m, 1H), 2.48 (m, 1H), 2.36 (bs, 1H), 2.33 (bs, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.79 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.71 (s, 9H), 1.21 (m, 7H), 1.10 (s, 21H), 0.90 (t, 12H), 0.55 (m, 6H); 13C NMR ( CDCl3) d 201.97, 171.67, 169.68, 169.27, 166.77, 164.65, 153.40, 152.83, 140.51, 139.82, 136.79, 133.72, 124.99, 121.57, 120.26, 119.93, 115.91, 113.54, 84.35, 81.00, 77.22, 76.44, 76.24, 75.27, 74.72, 72.19, 71.91, 58.62, 56.78, 55.81, 50.16, 46.54, 42.86, 37.30, 36.47, 26.55, 25.59, 22.54, 21.13, 20.82, 18.47, 18.01, 17.93, 17.63, 14.37, 12.53, 9.98, 6.68, 5.27; C59H91NO16Si2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1148.58, 검출된 값은 1148.5이다.
화합물 11.
1H NMR ( CDCl3) d 7.29 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.05 (dd, 1H), 6.94 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.04 (t, 1H), 5.65 (m, 2H), 5.49 (s, 1H), 5.38 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.13 (t, 1H), 4.89 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.45 (s, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.27 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.74 (m, 1H), 3.14 (s, 1H), 2.48 (m, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.71 (s, 9H), 1.21 (s, 3H), 1.10 (s, 3H), 1.10 (s, 21H), 0.90 (t, 9H), 0.55 (m, 6H); 13C NMR ( CDCl3) d 203.94, 202.03, 171.80, 169.66, 169.28, 166.86, 165.62, 153.42. 152.75, 151.23, 150.56, 140.71, 136.39, 136.17, 133.64, 132.41, 121.83, 120.35, 119.96, 118.46, 115.84, 113.58, 113.49, 106.05, 84.37, 81.03, 77.18, 76.45, 76.40, 75.32, 74.90, 72.20, 72.06, 60.88, 58.64, 56.74, 55.82, 49.78, 46.55, 45.82, 42.84, 37.32, 36.51, 26.96, 26.47, 25.59, 22.55, 21.12, 20.83, 19.68, 18.02, 17.85, 14.40, 12.54, 9.98, 6.69, 5.28; C60H93NO16Si2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1162.59, 검출된 값은 1162.3이다.
화합물 12.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.07 (dd, 1H), 6.94 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 6.29 (s, 1H), 6.18 (t, 1H), 5.89 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.66 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.38 (d, 1H), 5.10 (t, 1H), 4.93 (d, 1H), 4.40 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.27 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.24 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.61 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.00 (s, 1H), 2.58-2.30 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.13 (m, 4 H), 1.86 (s, 3H), 1.75 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.63 (s, 6H), 1.60 (m, 2H), 1.29 (s, 3H), 1.15 (s, 3H); C47H61NO16Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 918.39, 검출된 값은 918.3이다.
화합물 13.
1H NMR ( CDCl3) d 7.33 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.06 (dd, 1H), 6.94 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.29 (s, 1H), 6.19 (t, 1H), 5.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.66 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.08 (t, 1H), 4.93 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.39 (m, 2H), 4.29 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.25 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.64 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.00 (s, 1H), 2.41-2.56 (m, 7H), 2.32 (m, 1H), 2.23 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 1.98 (m, 2H), 1.86 (s, 3H), 1.75 (m, 11H), 1.29 (s, 3H), 1.15 (s, 3H); 13C NMR ( CDCl3) d 203.90, 172.88, 171.24, 170.21, 166.63, 164.86, 153.39, 153.03, 142.25, 139.02, 138.93, 138.60, 133.33, 120.24, 120.14, 119.90, 115.93, 113.55, 84.51, 81.04, 77.74, 76.47, 76.10, 75.77, 73.56, 72.23, 72.17, 58.83, 56.69, 55.86, 49.95, 45.56, 42.88, 36.56, 35.74, 33.14, 31.48, 26.90, 25.67, 23.25, 22.42, 21.72, 20.86, 18.55, 14.97, 9.53; C46H59NO16Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 904.37, 검출된 값은 904.4이다.
화합물 14.
1H NMR ( CDCl3) d 7.33 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.07 (dd, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.29 (s, 1H), 6.19 (t, 1H), 5.74 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.67 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.09 (t, 1H), 4.93 (d, 1H), 4.40 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.37 (m, 1H), 4.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.24 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.59 (d, J = 6 Hz, 1H), 2.97 (s, 1H), 2.31-2.56 (m, 5H), 2.23 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.84 (s, 3H), 1.82 (m, 3H), 1.75 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.60 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.15 (s, 3H); C44H57NO16Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 878.36, 검출된 값은 878.3이다.
화합물 15.
1H NMR ( CDCl3) d 7.33 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.07 (dd, 1H), 6.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.29 (s, 1H), 6.18 (t, 1H), 5.67 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.52 (m, 2H), 5.40 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.05 (t, 1H), 4.93 (d, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.29 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.23 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.75 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 2.97 (s, 1H), 2.33-2.58 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.81 (s, 3H), 1.75 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.40 (t, 1H), 1.29 (s, 3H), 1.15 (s, 3H); 13C NMR ( CDCl3) d 203.95, 196.43, 173.15, 171.25, 170.08, 166.71, 166.28, 153.41, 152.97, 152.13, 151.25, 142.50, 138.44, 136.19, 133.19, 120.45, 120.19, 119.96, 117.80, 115.85, 113.53, 106.08, 94.84, 91.01, 84.52, 81.01, 77.71, 76.45, 76.24, 75.79, 73.61, 72.50, 72.18, 58.82, 56.64, 55.86, 49.85, 45.84, 45.55, 42.86, 36.63, 35.71, 27.12, 26.80, 25.60, 22.41, 21.75, 20.85, 19.73, 18.48, 14.95, 9.52; C45H59NO16Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 892.37, 검출된 값은 892.3이다.
화합물 16.
1H NMR ( CDCl3) d 7.30 (t, 1H), 7.06 (dm, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.72 (m, 1H), 6.12 (q, 1H), 5.75 (m, 2H), 5.64 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.37 (m, 1H), 5.10 (m, 2H), 4.89 (d, 1H), 4.26-4.47 (m, 5H), 3.97 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (d, 1H), 3.10 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 2.31-2.44 (m, 3H), 2.18 (d, 3H), 2.09 (t, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.69-1.82 (m, 12H), 1.57 (m, 1H), 1.25 (s, 3H), 1.12 (m, 25H), 0.9 (m, 12H), 0.5 (m, 6H).
화합물 17.
1H NMR ( CDCl3) d 7.30 (t, 1H), 7.06 (dm, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.72 (m, 1H), 6.47 (s, 1H), 6.05 (t, 1H), 5.72 (m, 2H), 5.38 (m, 1H), 5.10 (m, 1H), 4.89 (d, 1H), 4.40-4.48 (m, 3H), 4.28 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.13 (d, J = 12 Hz, 1H), 2.82-3.15 (m, 4H), 2.43 (s, 3H), 2.35-2.51 (m, 3H), 2.18 (d, 3H), 2.09 (m, 1H), 1.99 (s, 3H), 1.79-1.93 (m, 2H), 1.71 (m, 9H), 1.56 (s, 3H), 1.22 (s, 6H), 1.11 (s, 21H), 0.9 (m, 12H), 0.5 (m, 6H).
화합물 18.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (t, 1H), 7.06 (dm, 1H), 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.72 (m, 1H), 6.33 (s, 1H), 6.05 (q, 1H), 5.67 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.60 (d, 1H), 5.39 (m, 1H), 5.07 (m, 1H), 4.93 (d, 1H), 4.20-4.42 (m, 4H), 3.95 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 2.91-3.04 (m, 5H), 2.42 (s, 3H), 2.31-2.53 (m, 3H), 2.18 (d, 3H), 2.10 (m, 1H), 1.87 (s, 3H), 1.79-1.93 (m, 2H), 1.75 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.67 (d, 3H), 1.51-1.64 (m, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.15 (s, 3H), 0.9 (t, 2H); C46H61NO16S2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 970.33, 검출된 값은 970.2이다.
화합물 19.
1H NMR ( CDCl3) d 7.41 (s, 1H), 7.30 (m, 2H), 6.80 (m, 2H), 6.38 (m, 2H), 5.24 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 1.03 (s, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 165.33, 156.24, 148.27, 142.83, 130.91, 118.45, 114.29, 110.64, 110.26, 77.94, 57.06, 55.41, 17.55, 17.49, 11.80; C23H33NO4SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 438.21, 검출된 값은 438.1이다.
화합물 20.
1H NMR ( CDCl3) d 7.39 (s, 1H), 6.54 (bs, 1H), 6.35 (m, 2H), 5.15 (m, 1H), 4.81 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 0.98 (s, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 169.81, 150.49, 142.53, 110.48, 109.09, 80.03, 53.52, 17.49, 17.43, 11.73; C16H27NO3SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z 는 332.17, 검출된 값은 332.0이다.
화합물 21.
1H NMR ( CDCl3) d 7.38 (s, 1H), 7.13 (m, 1H), 6.80 (dd, 1H), 6.35 (m, 2H), 5.25 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 1.93 (dd, 3H), 0.98 (m, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 166.40, 162.72, 147.47, 146.94, 142.79, 123.57, 110.43, 109.82, 77.51, 54.96, 18.35, 17.45, 17.38, 11.71; C20H31NO4SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 400.19, 검출된 값은 400.0이다.
화합물 22.
1H NMR ( CDCl3) d 7.38 (s, 1H), 6.61 (m, 1H), 6.34 (m, 2H), 5.23 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.15 (d, J = 6 Hz, 1H), 2.18 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 0.98 (m, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 166.08, 162.86, 160.95, 147.82, 142.67, 120.73, 117.02, 115.12, 110.40, 109.62, 77.11, 54.80, 27.96, 27.53, 21.33, 17.44, 17.37, 11.70; C21H33NO4SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 414.21, 검출된 값은 414.0이다.
화합물 23.
1H NMR ( CDCl3) d 8.00 (m, 2H), 7.58 (tt, 1H), 7.42-7.48 (m, 3H), 6.45 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.38 (m, 1H), 5.47 (d, J = 6 Hz, 1H), 5.23 (d, J = 6 Hz, 1H), 0.99 (s, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 166.22, 164.95, 147.77, 142.93, 133.34, 131.96, 129.89, 128.13, 110.47, 110.00, 76.81, 55.17, 17.48, 17.41, 11.73; C23H31NO4SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 436.19, 검출된 값은 436.0이다.
화합물 24.
1H NMR ( CDCl3) d 7.40 (s, 1H), 6.36 (m, 2H), 5.14 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 1.43 (s, 9H), 0.96 (m, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 165.76, 147.97, 147.75, 142.73, 110.45, 109.72, 83.46, 77.83, 56.16, 27.87, 17.44, 17.38, 11.69; C21H35NO5SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 432.22 , 검출된 값은 432.1이다.
화합물 25.
1H NMR ( CDCl3) d 8.03 (d, 1H), 7.65 (m, 1H), 7.39 (m, 1H), 6.56 (m, 1H), 6.42 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.34 (m, 1H), 5.45 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.23 (d, J = 6 Hz, 1H), 0.99 (s, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 164.52, 154.39, 147.56, 147.48, 145.45, 142.88, 120.86, 112.10, 110.44, 110.08, 76.56, 17.45, 17.38, 11.71; C21H29NO5SiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 426.17, 검출된 값은 426.0이다.
화합물 26.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (s, 1H), 7.04 (dd, 1H), 6.93 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.31 (m, 1H), 6.16 (m, 2H), 5.86 (dd, 1H), 5.68 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.56 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.00 (s, 1H), 4.89 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.46 (m, 1H), 4.10 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.28 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.76 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 2.48 (m, 1H), 2.25 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.87 (m, 4H), 1.74 (s, 3H), 1.22 (s, 6H), 1.10 (s, 21H), 1.03 (t, 12H), 0.55 (m, 6H).
화합물 27.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (s, 1H), 7.04 (dd, 1H), 6.93 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.31 (m, 1H), 6.16 (m, 2H), 6.05 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.57-5.69 (m, 3H), 4.99 (s, 1H), 4.91 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.44 (m, 2H), 4.28 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.76 (m, 1H), 2.31 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.22 (s, 6H), 1.10 (s, 21H), 1.03 (t, 12H), 0.55 (m, 6H); C60H89NO17Si2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1174.56, 검출된 값은 1174.3이다.
화합물 28.
1H NMR ( CDCl3) d 7.76 (d, 1H), 7.43-7.56 (m, 3H), 7.04 (dd, 1H), 6.93 (dd, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.22 (m, 1H), 5.69 (m, 1H), 4.90 (m, 1H), 4..44 (m, 2H), 4.30 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.76 (m, 1H), 2.31 (s, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.02 (m, 2H), 1.74 (s, 3H), 0.88-1.13 (m, 33H), 0.58 (m, 6H); C62H87NO17Si2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1196.54, 검출된 값은 1196.3이다.
화합물 29.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (s, 1H), 7.04 (dd, 1H), 6.92 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.32 (m, 1H), 6.22 (s, 1H), 6.18 (t, 1H), 5.67 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.25 (q, 2H), 4.94 (s, 1H), 4.91 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.44 (m, 2H), 4.29 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.76 (m, 1H), 2.50 (m, 1H), 2.37 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.38 (m, 2H), 1.22 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 1.06 (m, 6H), 0.83-0.98 (m, 30H), 0.55 (m, 6H); C60H91NO18Si2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1192.57 , 검출된 값은 1192.3이다.
화합물 30.
1H NMR ( CDCl3) d 7.48 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.27 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 9.6 Hz), 7.06 (d, 1H), 7.04 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.51 (m, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.33 (m, 1H), 6.24 (s, 1H), 6.20 (t, 1H), 5.69 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.64 (d, J = 9.2 Hz), 5.06 (s, 1H), H), 4.91 (d, 1H), 4.44 (m, 2H), 4.29 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.79 (m, 1H), 3.18 (s. 1H), 2.50 (m, 1H), 2.37 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.92 (m, 1H), 1.74 (s, 3H), 1.25 (s, 3H), 1.23 (s, 3H), 0.88-1.02 (m, 27H), 0.55 (m, 6H); C60H85NO18Si2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1186.52, 검출된 값은 1186.3이다.
화합물 31.
1H NMR ( CDCl3) d 7.39 (s, 1H), 7.30 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.07 (dd, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.84 (m, 1H), 6.35 (m, 1H), 6.32 (m, 1H), 6.29 (s, 1H), 6.23 (t, 1H), 6.05 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.83 (dd, 1H), 5.65 (m, 2H), 4.92 (d, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.30 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.73 (d, 1H), 3.40 (m, 1H), 3.06 (s, 1H), 2.56 (m, 1H), 2.34 (m, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 1.85 (s, 6H), 1.70 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.25 (s, 1H), 1.16 (s, 3H); C44H53NO17Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 890.32, 검출된 값은 890.2이다.
화합물 32.
1H NMR ( CDCl3) d 7.39 (s, 1H), 7.30 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.07 (dd, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.36 (m, 1H), 6.31 (m, 2H), 6.22 (t, 1H), 5.92 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.59-5.67 (m, 3H), 4.92 (d, 1H), 4.71 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.30 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.74 (d, 1H), 3.35 (d, 1H), 3.10 (s, 1H), 2.95 (s, 1H), 2.34-2.58 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 1.86 (s, 3H), 1.85 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.25 (s, 1H), 1.16 (s, 3H); C45H55NO17Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 904.34, 검출된 값은 904.2이다.
화합물 33.
1H NMR ( CDCl3) d 7.75 (d, 1H), 7.43-7.56 (m, 4H), 7.29 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.06 (dd, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.38 (s, 1H), 6.29 (m, 2H), 5.83 (d, 1H), 5.66 (d, 1H), 4.91 (d, 1H), 4.79 (m, 1H), 4.41 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.40 (m, 1H), 4.33 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.77 (m, 1H), 3.12 (s, 1H), 2.42 (m, 1H), 2.25 (s, 3H), 2.24 (s, 3H), 1.86 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.25 (s, 3H); C47H53NO17Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 926.32, 검출된 값은 926.2이다.
화합물 34.
1H NMR ( CDCl3) d 7.39 (s, 1H), 7.28 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.07 (dd, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.36 (m, 1H), 6.31 (m, 2H), 6.21 (t, 1H), 5.67 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.26 (d, 1H), 5.19 (d, 1H), 4.93 (d, 1H), 4.68 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.30 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.74 (d, 1H), 3.17 (m, 2H), 2.38-2.57 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.29 (s, 3H), 1.25 (s, 3H) 1.16 (s, 3H); C45H57NO18Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 922.35, 검출된 값은 922.2이다.
화합물 35.
1H NMR ( CDCl3) d 7.47 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.30 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.05-7.09 (m, 2H), 6.94-6.99 (m, 2H), 6.51 (m, 1H), 6.38 (m, 2H), 6.28 (m, 2H), 5.75 (dd,, 1H), 5.68 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.93 (d, 1H), 4.77 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.31 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.74 (d, 1H), 3.46 (d, 1H), 3.08 (s, 1H), 2.55 (m, 1H), 2.36-2.43 (m, 3H), 2.23 (s, 6H), 1.85 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.16 (s, 3H); 13C NMR ( CDCl3) d 204.21, 172.66, 171.62, 170.70, 167.21, 157.98, 153.84, 153.23, 151.08, 147.39, 144.88, 143.11, 142.26, 134.01, 120.59, 120.40, 116.10, 115.69, 113.95, 112.73, 111.16, 108.33, 84.95, 81.51, 78.01, 76.89, 76.61, 76.11, 73.14, 72.58, 72.03, 59.28, 57.11, 56.28, 49.81, 45.99, 43.26, 36.97, 36.15, 27.36, 22.97, 22.10, 21.25, 15.33, 9.94; C45H51NO18Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 916.30, 검출된 값은 916.2이다.
화합물 36.
1H NMR ( CDCl3) d 7.30 (t, 1H), 7.05 (dm, 1H), 6.95 (dd, 1H), 6.72 (m, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.05 (bt, 1H), 5.76 (d, 1H), 5.67 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.38 (m, 1H), 5.09 (m, 1H), 4.88 (d, 1H), 4.39-4.48 (m, 3H), 4.27 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.64-3.80 (m, 22H), 3.56 (d, 1H), 2.90 (t, 2H), 2.74 (m, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.16 (d, 3H), 2.10 (m, 1H), 2.00 (s, 3H), 1.90 (m, 1H), 1.81 (m, 1H), 1.71 (s, 6H), 1.69 (d, 3H), 1.61 (m, 2H), 1.21-1.31 (m, 14H), 1.21 (s, 21H), 0.92 (m, 16H), 0.58 (m, 6H).
화합물 37.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (t, 1H), 7.07 (dm, 1H), 6.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.31 (s, 1H), 6.16 (q, 1H), 5.66 (d, 1H), 5.61 (d, 1H), 5.39 (m, 1H), 5.06 (m, 1H), 4.93 (d, 1H), 4.39 (m, 2H), 4.25 (d, 1H), 4.21 (ddd, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.85 (d, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.73 (t, 3H), 3.64-3.65 (m, 13H), 2.98 (d, 1H), 2.90 (t, 2H), 2.80 (t, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.21 (d, 3H), 2.06 (m, 1H), 1.86 (s, 3H), 1.84 (m, 2H), 1.75 (s, 3H), 1.71 (s, 3H), 1.69 (d, 3H), 1.61 (m, 2H), 1.27 (s, 3H), 1.14 (s, 3H), 0.89 (t, 2H); 13C NMR ( CDCl3) d 203.72, 173.09, 172.89, 172.28, 171.68, 170.16, 170.04, 166.74, 166.69, 165.27, 153.42, 153.01, 152.94, 142.36, 142.32, 140.84, 138.82, 138.63, 133.27, 124.49, 120.38, 120.26, 120.19, 115.88, 115.85, 113.57, 84.52, 81.03, 77.74, 77.63, 76.46, 75.79, 73.49, 73.28, 72.46, 72.24, 72.17, 70.64, 70.62, 70.56, 70.51, 70.40, 69.76, 66.36, 58.82, 56.70, 56.66, 55.86, 50.08, 49.76, 45.58, 42.84, 38.39, 37.59, 36.58, 35.76, 35.01, 26.93, 26.86, 25.64, 25.59, 23.47, 22.43, 21.77, 19.14, 18.51, 18.46, 17.74, 14.97, 14.94, 13.58, 9.54
화합물 38.
1H NMR ( CDCl3) d 7.31 (m, 3H), 7.10 (d, 1H), 6.99 (dd, 1H), 6.78 (m, 2H), 5.41 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.23 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 1.01 (s, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 165.34, 156.22, 137.45, 130.81, 127.49, 126.64, 126.15, 118.65, 114.26, 78.02, 59.28, 55.37, 17.55, 17.46, 11.79; C23H33NO3SSiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 454.18, 검출된 값은 454.0이다.
화합물 40.
1H NMR ( CDCl3) d 7.28 (dd, 1H), 7.11 (m, 2H), 6.98 (dd, 1H), 6.78 (dd, 1H), 5.50 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 6 Hz, 1H), 1.93 (dd, 3H), 1.01 (s, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 166.40, 162.70, 147.00, 136.39, 127.61, 126.54, 125.88, 123.61, 77.39, 57.01, 18.35, 17.67, 17.47, 17.37, 12.26, 11.72; C20H31NO3SSiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 416.17, 검출된 값은 416.1이다.
화합물 41.
1H NMR ( CDCl3) d 7.28 (dd, 1H), 7.11 (m, 1H), 7.00 (dd, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.26 (dd, 1H), 5.87 (dd, 1H), 5.50 (d, J = 6 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 2.35 (s, 1H), 2.20 (dd, 6H), 0.98 (m, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 166.04, 164.59, 162.83, 160.70, 148.34, 136.96, 127.39, 126.50, 125.65, 122.38, 120.70, 117.18, 117.12, 115.25, 77.14, 56.90, 17.48, 17.39, 12.34, 11.82; C21H33NO3SSiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 430.18, 검출된 값은 430.1이다.
화합물 42.
1H NMR ( CDCl3) d 7.99 (d, 2H), 7.57 (t, 1H), 7.47 (t, 2H), 7.30 (dd, 2H), 7.18 (d, 1H), 7.01 (t, 1H), 5.73 (d, J = 6 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 1.04 (m, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 166.13, 164.82, 136.86, 129.89, 128.11, 127.80, 126.58, 125.96, 76.89, 57.11, 17.50, 17.41, 11.83; C23H31NO3SSiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 452.17, 검출된 값은 452.0이다.
화합물 43.
1H NMR ( CDCl3) d 7.30 (dd, 1H), 7.08 (dd, 1H), 6.99 (dd, 1H), 5.34 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.15 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 1.42 (s, 9H) 0.95 (m, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 165.75, 147.74, 136.80, 127.58, 126.48, 125.97, 122.05, 83.53, 77.76, 58.26, 27.88, 17.67, 17.47, 17.37, 12.26, 11.70; C21H35NO4SSiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 448.20, 검출된 값은 448.1이다.
화합물 44.
1H NMR ( CDCl3) d 7.98 (d, 1H), 7.65 (dd, 1H), 7.29 (dd, 1H), 7.15 (dd, 1H), 6.99 (dd, 1H), 6.56 (m, 1H), 5.71 (d, J = 6 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 6 Hz, 1H), 0.99 (m, 21H); 13C NMR ( CDCl3) d 164.11, 147.61, 127.96, 126.57, 126.06, 120.95, 112.12, 76.52, 57.17, 17.67, 17.50, 17.39, 11.74; C21H29NO4SSiNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 442.15, 검출된 값은 442.0이다.
화합물 45.
1H NMR ( CDCl3) d 7.27 (d, 1H), 7.20 (d, 1H), 7.05 (dd, 1H), 6.87-6.95 (m, 4H), 6.76 (m, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.27 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.17 (t, 1H), 5.85 (d, 1H), 5.75 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.68 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.92 (d, 1H), 4.83 (s, 1H), 4.40-4.45 (m, 2H), 4.28 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.84 (d, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.79 (d, 1H), 3.46 (m, 1H), 3.19 (s, 1H), 2.34-2.49 (m, 3H), 2.30 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.85-1.97 (m, 9H), 1.72 (s, 3H), 1.55-1.67 (m, 5H), 1.23 (s, 6H), 1.00 (s, 21H), 0.92 (t, 9H), 0.58 (m, 6H); C59H87NO16SSi2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1176.52 , 검출된 값은 1176.4이다.
화합물 46.
1H NMR ( CDCl3) d 7.27 (d, 1H), 7.20 (d, 1H), 7.05 (dd, 1H), 6.87-6.95 (m, 4H), 6.45 (s, 1H), 6.15-6.19 (m, 2H), 5.78 (d, 1H), 5.68 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.60 (s, 1H), 4.90 (d, 1H), 4.82 (s, 1H), 4.40-4.46 (m, 2H), 4.29 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.84 (d, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.76 (d, 1H), 3.46 (m, 1H), 3.23 (s, 1H), 2.49 (m, 1H), 2.34 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.17 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.85-1.97 (m, 9H), 1.83 (s, 3H), 1.71 (s, 3H), 1.55-1.67 (m, 3H), 1.39 (m, 1H), 1.23 (s, 6H), 1.00 (s, 21H), 0.92 (t, 9H), 0.58 (m, 6H); C60H89NO16SSi2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1190.53, 검출된 값은 1190.5이다.
화합물 47.
1H NMR ( CDCl3) d 7.53-7.60 (m, 3H), 7.42-7.46 (t, 2H), 7.20 (d, 1H), 7.13-7.15 (m, 3H), 6.92-7.01 (m, 3H), 6.54 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.20 (d, 1H), 5.84 (m, 1H), 5.56 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.92 (m, 1H), 4.84 (s, 1H), 4.65 (d, 1H), 4.64 (d, 1H), 4.22 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.08 (m, 1H), 3.79 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.30 (m, 1H), 3.25 (s, 3H), 2.67 (m, 1H), 2.46 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.17 (m, 2H), 2.07 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.21 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.13 (m, 21H), 0.92 (t, 9H), 0.58 (m, 6H); C62H87NO16SSi2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1212.52, 검출된 값은 1212.5이다.
화합물 48.
1H NMR ( CDCl3) d 7.27 (d, 1H), 7.21 (d, 1H), 7.06 (dd, 1H), 6.90-6.97 (m, 3H), 6.46 (s, 1H), 6.17 (t, 1H), 5.68 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.43 (d, 1H), 5.42 (d, 1H), 4.90 (d, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.41-4.46 (m, 2H), 4.29 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (d, 1H), 3.24 (s, 1H), 2.52 (m, 1H), 2.41 (m, 2H), 2.30 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.88 (s, 1H), 1.73 (s, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.23 (s, 3H), 1.22 (s, 3H), 1.00 (s, 21H), 0.92 (t, 9H), 0.58 (m, 6H); C60H91NO17SSi2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1208.54, 검출된 값은 1208.5이다.
화합물 49.
1H NMR ( CDCl3) d 7.47 (s, 1H), 7.22-7.29 (m, 3H), 7.06 (d, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.94-6.98 (m, 3H), 6.50 (m, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.19 (t, 1H), 5.84 (d, 1H), 5.69 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.90 (d, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.41-4.46 (m, 2H), 4.29 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.77 (d, 1H), 3.16 (s, 1H), 2.52 (m, 1H), 2.36 (m, 1H), 2.31 (s, 3H), 2.24 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.88 (s, 1H), 1.72 (s, 3H), 1.17 (s, 6H), 1.00 (s, 21H), 0.92 (t, 9H), 0.58 (m, 6H); C60H85NO17SSi2Na (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 1202.50, 검출된 값은 1202.4이다.
화합물 50.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (d, 1H), 7.27 (dd, 1H), 7.06-7.10 (m, 2H), 6.95-7.01 (m, 2H), 6.80 (m, 1H), 6.28 (s, 1H), 6.23 (t, 1H), 6.10 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.77-5.84 (m, 2H), 5.66 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.92 (d, 1H), 4.67 (s, 1H), 4.40 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.29 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.73 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.54 (bs, 1H), 3.06 (bs, 1H), 2.55 (m, 1H), 2.38 (m, 3H), 2.24 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 1.84 (dd, 3H), 1.82 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.16 (s, 3H); 13C NMR ( CDCl3) d 203.82, 172.30, 171.23, 170.22, 166.79, 164.91, 153.44, 152.91, 141.88, 141.56, 140.94, 133.58, 127.06, 125.82, 125.59, 124.25, 120.32, 119.91, 115.68, 113.59, 99.99, 84.51, 81.15, 77.60, 76.50, 76.12, 75.72, 73.06, 72.76, 72.20, 58.88, 56.74, 55.90, 50.77, 45.58, 42.87, 36.56, 35.75, 26.96, 22.68, 21.67, 20.86, 17.82, 14.98, 9.53; C44H53NO16SNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 906.3, 검출된 값은 906.2이다.
화합물 51.
1H NMR ( CDCl3) d 7.32 (d, 1H), 7.27 (dd, 1H), 7.06-7.09 (m, 2H), 6.94-6.99 (m, 2H), 6.29 (s, 1H), 6.22 (t, 1H), 6.01 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.79 (d, 1H), 5.66 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.56 (s, 1H), 4.92 (d, 1H), 4.65 (s, 1H), 4.40 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.52 (bs, 1H), 3.07 (bs, 1H), 2.34-2.57 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.84 (s, 6H), 1.72 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.15 (s, 3H); 13C NMR ( CDCl3) d 203.82, 172.51, 171.23, 170.14, 166.79, 165.83, 153.43, 153.19, 152.87, 142.01, 141.21, 133.49, 127.05, 125.64, 125.45, 120.32, 119.90, 117.48, 115.62, 113.55, 84.51, 81.11, 77.56, 76.18, 75.73, 73.17, 72.90, 72.18, 58.85, 56.68, 55.89, 50.57, 45.57, 42.86, 35.73, 27.21, 26.85, 22.67, 21.68, 20.86, 19.84, 14.96, 9.52; C45H55NO16SNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 920.31, 검출된 값은 920.2이다.
화합물 52.
1H NMR ( CDCl3) d 7.66 (dd, 2H), 7.53 (tt, 1H), 7.43 (t, 2H), 7.33 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 6.97-7.06 (m, 3H), 6.76 (d, 1H), 6.27 (s, 1H), 6.16 (d, 1H), 5.91 (d, 1H), 5.62 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.96 (bs, 1H), 4.89 (dd, 1H), 4.74 ( s, 1H), 4.52 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.34 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 2.87 (bs, 1H), 2.40-2.61 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 1.99 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.66 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 1.12 (s, 3H); C47H53NO16SNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 942.30, 검출된 값은 942.2이다.
화합물 53.
1H NMR ( CDCl3) d 7.30 (d, 1H), 7.27 (dd, 1H), 7.06-7.09 (m, 2H), 6.94-7.00 (m, 2H), 6.30 (s, 1H), 6.21 (t, 1H), 5.66 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.42 (d, 1H), 5.28 (d, 1H), 4.91 (d, 1H), 4.59 (s, 1H), 4.41 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.48 (bs, 1H), 3.11 (bs, 1H), 2.34-2.57 (m, 4H), 2.22 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 1.89 (m, 1H), 1.85 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.39 (s, 9H), 1.29 (s, 3H), 1.15 (s, 3H); 13C NMR ( CDCl3) d 203.83, 172.63, 171.20, 170.00, 166.81, 154.88, 153.45, 152.74, 142.06, 141.29, 133.46, 127.05, 125.36, 120.23, 119.99, 115.61, 113.47, 84.51, 81.11, 80.36, 77.51, 76.43, 75.72, 73.21, 73.00, 72.15, 58.84, 56.54, 55.85, 45.58, 42.85, 36.47, 35.72, 28.12, 26.73, 22.63, 20.84, 14.95, 9.51; C45H57NO17SNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 938.32, 검출된 값은 938.2이다.
화합물 54.
1H NMR ( CDCl3) d 7.46 (s, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.28 (dd, 1H), 7.16 (d, 1H), 6.95-7.09 (m, 4H), 6.50 (m, 1H), 6.28 (s, 1H), 6.25 (t, 1H), 5.93 (d, 1H), 5.67 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.92 (d, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.41 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.74 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.63 (bs, 1H), 3.09 (bs, 1H), 2.33-2.58 (m, 4H), 2.22 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 1.89 (m, 1H), 1.82 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.28 (s, 3H), 1.15 (s, 3H); C45H51NO17SNa (M + Na) + 에 대하여 계산된 LRMS m/z는 932.28, 검출된 값은 932.2이다.
실시예 10
생체외에서 세포독성 분석
본 발명의 신규 택소이드 및 디설피드 포함 탁산 약제가 생체외에서 인간 암 세포주의 발현을 얼제하는 능력에 대해서 평가되었다. 인간 암 세포주 A-549(인간 폐암) 및 MCF-7(인간 유방암)이 이들 화합물의 세포독성을 진단하는데 사용되었다. 세포는 72h동안 이들 화합물에 노출되었고 세포의 생존율은 직접적인 분방법으로 측정되었다. A549 및 MCF-7은 플레이팅 효능으로 분석되었고(Goldmacher et al, J. Cell. Biol. 102: 1312-1319 (1986)) IC50값을 이 데이터로부터 계산하였다.
택소이드 14, 15, 31-35, 50-54 및 디설피드 함유 택소이드 18 및 37의 세포독성이 다음과 같이 측정되었다. A549 및 MCF-7 세포가 10% 태아 우 혈청으로 보완된 DMEM 배지에서 상이한 농도로 6-웰 조직 배양 플레이트에서 플레이팅 되었다.
다양한 농도의 탁산이 첨가되었고 세포는 거의 20 세포 이상이 콜로니가 형성될 때까지(6 내지 10일) 37oC 및 6% C02의 습기 있는 환경에서 보존되었다. 대조구 플레이트는 어떠한 탁산을 포함하지 않는다. 그 다음 세포는 포름알데히드로 고정되고 크리스탈 비올렛으로 염색되고 저배율 현미경으로 계수되었다. 플레이팅 효능은 콜로니 수로부터 결정되고 생존한 세포율이 처리 샘플의 플레이팅 효율 및 대조구의 플레이팅 효율의 비로서 계산되었다.
도 10은 본 발명의 12개의 신규 택소이드의 세포독성 측정 결과를 나타낸다. R4에서 페닐 치환기를 포함하는 탁산 52를 제외하고,10-10 내지 10-11M 범위의 IC 50값을 가지는 모든 다른 신규 택소이드는 A-549 및 MCF-7 세포주 모두에 대해 매우 강력하다. 탁산 52는 테스트된 세포주 모두에 대해 3×10-9M의 IC 50값으로 더 적은 세포독성을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 대표적인 디설피드 함유 택소이드의 세포독성 커브를 나타낸다. 디설피드 함유 택소이드 18 및 37은 모두 A-549 및 MCF-7 세포에 대해 매우 강력하고 급겨한 사멸 커브를 나타낸다.

Claims (7)

  1. 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물.
    상기식에서,
    R1 은 H, 전자공여기, 또는 전자수용기; R1' 및 R1'' 는 동일하거나 상이하고, H, 전자공여기, 또는 전자수용기이며;
    R2 는 H이고;
    R3 는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 아릴, 또는 헤테로사이클이며;
    R4 는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 아릴, 헤테로사이클, -OC(CH3)3, 또는 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 중 어느 하나로부터 형성된 카바메이트, 아릴, 또는 헤테로사이클이고;
    R5 는 링크 그룹이며; 및
    R6 는 H, 헤테로사이클릭 또는 아릴 에테르, 에스테르 또는 카바메이트, 또는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬 또는 알케닐 에스테르 또는 에테르, 또는 X가 질소 함유 헤테로사이클인 화학식 -COX 인 카바메이트, 또는 R10 및 R11이 동일하거나 상이하고 H, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬, 또는 간단하거나 치환된 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 아릴인 화학식 -CONR10R11인 카바메이트이다.
  2. 제1항에 있어서, R3 가 -CH=C(CH3)2인 화합물.
  3. 화학식 (I)로 표시되는 화합물.
    상기식에서,
    R2 는 링크 그룹이며;
    R1 은 H, 전자공여기, 또는 전자수용기;
    R1' 및 R1'' 는 동일하거나 상이하고, H, 전자공여기, 또는 전자수용기이며;
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하고 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 아릴 또는 헤테로사이클 및 R4는 추가적으로 -OC(CH3)3 또는 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 중 어느 하나로부터 형성된 카바메이트, 아릴, 또는 헤테로사이클이고;
    R5 및 R6는 동일하거나 상이하고 H, 헤테로사이클릭 또는 아릴 에테르, 에스테르 또는 카바메이트, 또는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬 또는 알케닐 에스테르 또는 에테르, 또는 X가 질소 함유 헤테로사이클인 화학식 -COX 인 카바메이트, 또는 R10 및 R11이 동일하거나 상이하고 H, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬, 또는 간단하거나 치환된 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 아릴인 화학식 -CONR10R11인 카바메이트이다.
  4. 화학식 (I)로 표시되는 화합물.
    상기식에서,
    R5 는 링크 그룹;
    R1 은 H, 전자공여기, 또는 전자수용기;
    R1' 및 R1'' 는 동일하거나 상이하고, H, 전자공여기, 또는 전자수용기이며;
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하고 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 아릴 또는 헤테로사이클 및 R4는 추가적으로 -OC(CH3)3 또는 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 중 어느 하나로부터 형성된 카바메이트, 아릴, 또는 헤테로사이클이고;
    R2 및 R6는 동일하거나 상이하고 H, 헤테로사이클릭 또는 아릴 에테르, 에스테르 또는 카바메이트, 또는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬 또는 알케닐 에스테르 또는 에테르, 또는 X가 질소 함유 헤테로사이클인 화학식 -COX 인 카바메이트, 또는 R10 및 R11이 동일하거나 상이하고 H, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬, 또는 간단하거나 치환된 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 아릴인 화학식 -CONR10R11인 카바메이트이다.
  5. 화학식 (I)로 표시되는 화합물.
    상기식에서,
    R6 는 링크 그룹;
    R1 은 H, 전자공여기, 또는 전자수용기;
    R1' 및 R1'' 는 동일하거나 상이하고, H, 전자공여기, 또는 전자수용기이며;
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하고 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 아릴 또는 헤테로사이클 및 R4는 추가적으로 -OC(CH3)3 또는 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 중 어느 하나로부터 형성된 카바메이트, 아릴, 또는 헤테로사이클이고;
    R2 및 R5는 동일하거나 상이하고 H, 헤테로사이클릭 또는 아릴 에테르, 에스테르 또는 카바메이트, 또는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬 또는 알케닐 에스테르 또는 에테르, 또는 X가 피페리디노(piperidino), 모포리노(morpholino), 피페라진(piperazine), N-메틸피페라지노(N-methylpiperazino)와 같은 질소 함유 헤테로사이클인 화학식 -COX 인 카바메이트, 또는 R10 및 R11이 동일하거나 상이하고 H, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬, 또는 간단하거나 치환된 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 아릴인 화학식 -CONR10R11인 카바메이트이다.
  6. 화학식 (I)로 표시되는 화합물.
    상기식에서,
    R3 는 링크 그룹;
    R1 은 H, 전자공여기, 또는 전자수용기;
    R1' 및 R1'' 는 동일하거나 상이하고, H, 전자공여기, 또는 전자수용기이며;
    R4는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 아릴 또는 헤테로사이클 및 R4는 추가적으로 -OC(CH3)3 또는 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 중 어느 하나로부터 형성된 카바메이트, 아릴, 또는 헤테로사이클이고;
    R2, R5 및 R6는 동일하거나 상이하고 H, 헤테로사이클릭 또는 아릴 에테르, 에스테르 또는 카바메이트, 또는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬 또는 알케닐 에스테르 또는 에테르, 또는 X가 피페리디노(piperidino), 모포리노(morpholino), 피페라진(piperazine), N-메틸피페라지노(N-methylpiperazino)와 같은 질소 함유 헤테로사이클인 화학식 -COX 인 카바메이트, 또는 R10 및 R11이 동일하거나 상이하고 H, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬, 또는 간단하거나 치환된 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 아릴인 화학식 -CONR10R11인 카바메이트이다.
  7. 화학식 (I)로 표시되는 화합물.
    상기식에서,
    R4 는 링크 그룹;
    R1 은 H, 전자공여기, 또는 전자수용기;
    R1' 및 R1'' 는 동일하거나 상이하고, H, 전자공여기, 또는 전자수용기이며;
    R3는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, 아릴 또는 헤테로사이클 및 R4는 추가적으로 -OC(CH3)3 또는 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 중 어느 하나로부터 형성된 카바메이트, 아릴, 또는 헤테로사이클이고;
    R2, R5 및 R6는 동일하거나 상이하고 H, 헤테로사이클릭 또는 아릴 에테르, 에스테르 또는 카바메이트, 또는 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬 또는 알케닐 에스테르 또는 에테르, 또는 X가 피페리디노(piperidino), 모포리노(morpholino), 피페라진(piperazine), N-메틸피페라지노(N-methylpiperazino)와 같은 질소 함유 헤테로사이클인 화학식 -COX 인 카바메이트, 또는 R10 및 R11이 동일하거나 상이하고 H, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 직쇄형, 분기형 또는 환형의 알킬, 또는 간단하거나 치환된 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 아릴인 화학식 -CONR10R11인 카바메이트이다.
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