DE60319354T2

DE60319354T2 - Mannose-6-Phosphat Rezeptor vermittelter Gentransfer zu Muskelzellen

Info

Publication number: DE60319354T2
Application number: DE60319354T
Authority: DE
Inventors: Gerard Johannes Platenburg
Original assignee: LBR MEDBIOTECH BV
Current assignee: LBR MEDBIOTECH BV
Priority date: 2003-07-11
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2023-07-12
Also published as: ES2302898T3; EP1495769A1; DK1495769T3; EP1495769B1; ATE387217T1; DE60319354D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Glykosid-Konjugate. Sie betrifft die Verbesserung der Muskelaufnahme von Verbindungen im Allgemeinen. Insbesondere betrifft sie Glykosid-Oligonukleotid-Konjugate zur Verwendung in Antisinn-Konzepten, insbesondere bei in vivo Antinsinn-Konzepten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wurde eine mögliche Gentherapie mit dem Ziel entwickelt, das Leseraster in Muskelzellen bei Duchenne-Muskel-Dystrophie(DMD)-Patienten über eine gezielte Steuerung von Dystrophin-Prä-mRNA-Splicing wiederherzustellen. Unter Einbeziehung der Tatsache, dass das Exon 45 das einzige am häufigsten deletierte Exon in DMD ist, wohingegen Exon(45 + 46)-Deletionen lediglich eine milde Form der Becker-Muskeldystrophie (BMD) verursachen, wurde ein auf Antisinn basiertes System aufgebaut, um ein Exon 46-Springen aus dem Transkript in kultivierte Myotuben der Maus und humanen Ursprungs zu induzieren. In Myotuben-Kulturen aus zwei nicht verwandten DMD-Patienten, die eine Exon 45-Deletion tragen, führte das induzierte Springen von Exon 46 in lediglich 15% der mRNA zu normalen Mengen von richtig lokalisiertem Dystrophin (dem natürlich die Domainen, welche den Exons 45 und 46 entsprechen, fehlen) in wenigstens 75% der Myotuben (van Deutekom et al. 2001). Unter Verwendung derselben auf Antisinn basierten Strategie, bei der eine andere Antisinn-Sequenz verwendet wurde, wurde in einer anderen Untersuchung das Springen von 11 weiteren Exons in dem Dystrophin-Gen in kultivierten humanen Myotuben gezeigt (Aartsma-Rus et al. 2002). Die Technologie, das Springen dieser 12 unterschiedlichen Exons zu induzieren, würde (in der Population von DMD, welche genetische Defekte verursacht) insgesamt eine Korrektur von mehr als 50% der Deletionen und 22% der Duplikationen in der in der Leiden DMD-Mutationsdatenbank vorhandenen Population ermöglichen.
Jedoch besteht das größte Hindernis darin, die schwache Muskelaufnahme dieser Antisinn-Oligonukleotide in vivo durch die relevanten Zellen zu überwinden, und dies trifft auch für andere Moleküle mit therapeutischem Potential zu. Eine wirksame Therapie für DMD erfordert, dass im Wesentlichen alle Skelettmuskeln einschließlich der Arme und Beine sowie die an der Atmung beteiligten Muskeln und der Herzmuskel behandelt werden. Keiner der bis heute untersuchten Mechanismen besitzt die Fähigkeit, spezifisch (Antisinn-)Oligonukleotide oder gar ganze Gene an nahezu alle Muskelgewebe/-zellen gleichzeitig über den gesamten Körper abzugeben. Die bis heute veröffentlichten Verfahren zur in vivo-Abgabe von Genen oder anderen Verbindungen in den Muskelumfassen die Injektion nackter DNA mit oder ohne Elektrotransfer, die intravaskuläre Abgabe (beides behandelt in Herweijer und Wolff, 2003) sowie die Verwendung von Mikroblasen (Lu et al. 2003). Eine direkte Injektion von DNA in den Skelettmuskel ist eine sichere und einfache Methode, bringt jedoch die Schwierigkeit niedriger Transfektionswirksamkeiten mit sich. Die Wirksamkeiten können durch Vorbehandlung des Muskels mit Hyaluronidase mit einem anschließenden Elektrotransfer signifikant verbessert werden, und durch Verwendung dieses Verfahrens konnte eine Dystrophin-Plasmid in 22% der Muskelfasern einer mdx-Maus für bis zu 8 Wochen exprimiert werden (Gollins et al. 2003). Ein großer Nachteil für die klinische Anwendung dieses Verfahrens besteht jedoch darin, dass die Muskelfaser durch die starken elektrischen Felder, die für eine wirksame Genabgabe erforderlich sind, zerstört wird. Eine Möglichkeit, die Zerstörung der Muskeln zu vermindern, ist die Injektion eines Gemisches nackter DNA und Mikroblasen in den Skelettmuskel. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von kommerziell erhältlichen Albumin-beschichteten Okta-Fluorpropangas-Mikroblasen, Optison, die Transfektionswirksamkeit verbessert und dass dies mit einer signifikanten Abnahme der Muskelzerstörung assoziiert war (Lu et al. 2003). Dennoch bleibt der Hauptnachteil einer direkten Injektion in Muskeln bestehen, nämlich dass jeder Muskel separat behandelt werden muss und daher eine Behandlung der ganzen Muskelmasse eines Individuums durch diese Verfahren nicht brauchbar ist.
Die intravaskuläre Abgabe von DNA stellt ein attraktiveres Verfahren dar, da eine gesamte Muskelgruppe mit einer einzelnen Injektion abgedeckt werden kann. Die intravaskuläre Abgabe über einen Katheter zur Überbrückung von Skelettmuskelgruppen in Kombination mit der Blockade des Blutstroms mit einer Blutdruckmanschette wurde erfolgreich in Kaninchen, Hunden und Rhesusaffen durchgeführt (Herweijer und Wolff, 2003). In Rhesusaffen wurden Transfektionswirksamkeiten in einem Bereich von weniger als 1% bis mehr als 30% in unterschiedlichen Muskeln im Bein und Arm festgestellt (Zhang et al. 2001). Auch wird angenommen, dass die Abgabe nicht auf den Skelettmuskel beschränkt ist, sondern dass die Abgabe auch in den Herzmuskel erfolgt (Herweijer et al., 2000). Jedoch würde die Behandlung des gesamten Körpers mehrere Injektionen erfordern und ferner erscheint die Behandlung von Respirationsmuskeln mit diesem Verfahren unmöglich.
Idealerweise würde eine Ganzkörper-Muskeltherapie von einzelnen intravenösen Injektionen einer Verbindung, die mit einer zellspezifischen Targeting-Fähigkeit ausgestattet ist, Gebrauch machen. Bis heute wurden zwei Moleküle beschrieben, die das Potential zum Targeting von Muskelzellen besitzen. Das erste ist eine Peptidsequenz mit einer verstärkten Skelett- und Herzmuskelbindung in vivo, welches durch Screening einer Zufallsphagen-Displaybibliothek gefunden wurde (Samoylova und Smith, 1999). Es wurde geschätzt, dass die Muskelselektvität des Phagenklons, der dieses Peptid trägt, in dem Bereich von 9- bis 20-fach beim Skelettmuskel und 5- bis 9-fach beim Herzmuskel liegt (in Abhängigkeit von dem Kontrollgewebe) im Vergleich zu den Phagen ohne Insert. Jedoch wurde bis jetzt nicht gezeigt, ob dieses Peptid für das in vivo-Targeting von konjugierten Verbindungen in Muskelzellen verwendet werden kann. Das andere beschriebene Molekül ist ein Fv-Teil eines monoklonalen Antikörpers (mAb), der selektiv in dem Skelettmuskel in vivo transportiert wird (Weisbart et al. 2003). Einzelketten-Fv-Fragmente des murinen mAb wurden in die Schwanzvenen von Mäusen injiziert, und 4 Stunden später wurden die Fragmente in 20% der Skelettmuskelzellen vorgefunden, wo sie hauptsächlich in dem Zellkern lokalisiert waren. Es wurde gezeigt, dass der mAb an das Protein Myosin IIb in Lysaten von Skelettmuskelzellen, aber an kein Protein in Lysaten von Herzmuskelzellen bindet. Daher kann dieser Antikörper für das Targeting von Skelettmuskeln, nicht jedoch des Herzmuskels verwendbar sein.
Mannose-6-Phosphat(M6P)-Reste sind einheitlich durch die zwei Mitglieder der P-Typ-Lektin-Familie charakterisiert, den ~46-kDa-Kation-abhängigen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (CD-MPR) und den ~300 kDa insulinähnlichen Wachstumsfaktor II/Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (IGF-II/MPR) (Dahms und Hancock, 2002). Die P-Typ-Lektine spielen eine wichtige Rolle bei der Herstellung funktionaler Lysosomen innerhalb der Zellen höherer Eukaryonten, indem neu synthetisierte lysosomale Enzyme, die das M6P-Signal tragen, in Lysosomen geführt werden. Lysosomale Enzyme werden durch Membran-gebundene Ribosomen synthetisiert und in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert, wo die naszierenden Proteine mit höheren Mannose-Oligosaccharid-Ketten glykosiliert werden. Die Mannosereste werden dann während einer weiteren Beförderung der Proteine durch den biosynthetischen ER-Golgi-Pfad phosphoriliert, was zu dem M6P-Liganden führt, der bei dem Targeting der lysosomalen Enzyme zu dem Lysosom über die M6P-Rezeptoren verwendet wird (Dahms und Hancock, 2002). An der Zelloberfläche bindet der IGF-II/MPR, nicht jedoch der CD-MPR, und internalisiert eine unterschiedliche Population von M6P-enthaltenden Proteinen und ist verantwortlich für die Endozytose der Mehrzahl der extrazellulären lysosomalen Enzyme (Ghosh et al. 2003; Hassan, 2003). Der IGF-II/MPR liegt in verschiedenen humanen Geweben, wie Niere, Leber, Milz und Lunge sowie in Herz- und Skelettmuskel vor (Funk et al. 1992; Wenk et al. 1991) und kann daher zum Targeting und zur Aufnahme von M6P-enthaltenden Verbindungen in das lysosomale Kompartiment von Muskelzellen verwendet werden. Die Durchführbarkeit eines solchen Versuchsansatzes wurde mit dem lysosomalen Enzym α-Glukosidase (GAA) gezeigt. Als erstes wurde gezeigt, dass die GAA, welche aus Rinderhoden isoliert wurde, in einer M6P-Rezeptor-abhängigen Weise von kultivierten humanen Skelettmuskelzellen, die von Muskelbiopsien stammen, endocytiert wurde (Reuser et al. 1984).
Die Aufnahme konnte vollständig durch M6P und durch β-Galaktosidase von Rinderhoden, einem lysosomalen Enzym, welches phosphorylierte hochgradige Mannose-artige Zuckerketten trägt, vollständig inhibiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass M6P-Rezeptoren auf der Plasmamembran von Skelettmuskelzellen vorkommen und bei der Aufnahme von M6P-enthaltenden lysosomalen Enzymen beteiligt sind. Eine Internalisierung des Enzyms in eine M6P-Rezeptor-abhängige Weise fand auch statt, wenn rekombinante humane GAA (rhGAA), welche in CHO-Zellen oder Mausmilch hergestellt wird, zu humanen GAA-/-Fibroblasten in der Zellkultur zugegeben wurde (Bijvoet et al. 1998; Martiniuk et al. 2000). Schließlich wurde nach der Injektion von rhGAA in GAA Knockout-Mäusen die Aufnahme in Herz-, Skelettmuskeln, Bein- und Respirationsmuskeln, u. a. das Zwerchfell, demonstriert (Bijvoet et al. 1998; Martiniuk et al. 2000).
US 6,172,208 beschreibt ein Konjugat, das ein Glykosid umfasst, insbesondere Mannose-6-Phosphat, das an ein Oligonukleotid gekoppelt ist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Abgabe von Verbindungen in extralysosomale Kompartimente von Zellen, insbesondere Muskelzellen, wie dem Zytoplasma, ER und dem Zellkern. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass Konjugate, die ein Glykosid umfassen, wie z. B. das Monosaccharid M6P, in der Lage sind, gekoppelte Verbindungen in den Zellkern von Muskelzellen abzugeben, obwohl der Stand der Technik lehrte, dass M6P spezifisch in das lysosomale Kompartiment von Zellen geführt wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Glykosid-Verbindungskonjugate bereitgestellt. Ein "Konjugat", wie hier verwendet, betrifft einen Liganden, wie z. B. ein Glykosid, der chemisch an eine Verbindung von Interesse konjugiert ist. Der Ligand ist in der Lage, an einen spezifischen Rezeptor zu binden und lenkt (oder führt) das Konjugat dadurch an diesen Rezeptor. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Ligand in der Lage, an einen M6P-Rezeptor, vorzugsweise an IGF-II/MPR zu binden. Vorzugsweise stammt der M6P-Rezeptor von einer Muskelzelle. Das Glykosid ist vorzugsweise ein Mono-, Di- oder höhergradiges Saccharid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Saccharid ein M6P-Rest, obwohl andere Saccharide mit Bindungsspezifität für Muskelzellrezeptoren verwendet werden können. Das Konjugat kann ein, zwei, drei oder mehrere Glykoside umfassen. Beispielsweise kann das Konjugat (M6P)2 oder (M6P)4 oder zusätzliche M6P-Reste umfassen. Für den Fall, dass das Konjugat mehr als ein Glykosid umfasst, ist es bevorzugt, dass das terminale Glykosid ein M6P ist.
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung eines Konjugats eines Glykosids, das an ein Oligonukleotid, ausgewählt aus RNA, DNA, Morpholin, 2'-O-Methyl-RNA, 2'-O-Allyl-RNA, Peptid-Nuklein-Säure (PNA) und verschlossene Nukleinsäure (LNA) gebunden ist, wobei das Glykosid ein Ligand ist, der in der Lage ist, an einen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor einer Muskelzelle zu binden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, und wobei die Abgabe des Oligonukleotids an ein extralysosomales Kompartiment der Muskelzelle erfolgt. Auch betrifft die Erfindung ein Konjugat, das ein Glykosid umfasst, das an ein Oligonukleotid gebunden ist, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus RNA, DNA, Morpholin, 2'-O-Methyl-RNA oder 2'-O-Allyl-RNA, Peptid-Nuklein-Säure (PNA) und verschlossene Nukleinsäure (LNA), wobei das Glykosid ein Ligand ist, der in der Lage ist, an einen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor einer Muskelzelle zu binden und wobei das Oligonukleotid wenigstens 20 Nukleotide umfasst, die mit dem humanen dystrophinen Gen identisch oder komplementär sind. IN einer Ausführungsform ist das Oligonukleotid oder Derivat oder Nachahmungsprodukt davon ausgewählt aus: Morpholin, 2'-O-Methyl-RNA oder 2'-O-Allyl-RNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mannose-6-Phosphat-Rezeptor ein insulinähnlicher Wachstumsfaktor II/Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (IGF-II/MPR).
In einer Ausführungsform ist das Glykosid des erfindungsgemäßen Konjugats ein Mono-, Di- oder Tri-Saccharid, oder ein beliebiges höhergradiges Saccharid, wobei das Saccharid wenigstens einen Mannose-6-Phosphat-Rest umfasst. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Saccharid wenigstens zwei Mannose-6-Phosphat-Reste. In einer weiteren Ausführungsform sind die Di-, Tri- oder höhergradige Saccharide über (α1,2), (α1,3) oder (α1,6)-Verknüpfungen verbunden. In einer weiteren Ausführungsform ist das Glykosid ein Zwei-Antennen- oder Drei-Antennen-Oligosaccharid, das Mono-, Di- oder Tri-Saccharide oder beliebige höhergradige Saccharide umfasst, wobei die Saccharide wenigstens einen Mannose-6-Phosphatrest umfassen, vorzugsweise umfassen die Saccharide wenigstens zwei Mannose-6-Phosphatreste.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Verbindung des erfindungsgemäßen Konjugats ein Wachstumsfaktor, ein Vakzin, ein Vitamin, ein Antikörper oder ein Kationenrest zu komplexen Nukleinsäuren.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Glykosid an die Verbindung über einen labilen Spacer gebunden, der intrazellulär gespalten werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Glykosid-Verbindungskonjugats, gekennzeichnet durch Verknüpfung von wenigstens einem Glykosid, das wenigstens einen Mannose-6-Phosphatrest umfasst, mit einem Oligonukleotid ausgewählt aus einem beliebigen der folgenden: DNA, RNA, PNA, LNA, Morpholin, 2'-O-Methyl-RNA oder 2'-O-Allyl-RNA.
Das M6P-Targetingsystem ist für den Import in das lysosomale Kompartiment von Zellen bestimmt und GAA kann dessen Wirkung nur in den Lysosomen ausüben, wo es Glykogen, das die Krankheit verursacht, hydrolisiert und in einer therapeutischen Anordnung auch macht.
Der Exon-Splicing-Prozess findet im Zellkern statt und keinesfalls in den Lysosomen, wo es keine zu spleißende RNA gibt. Die überraschende Entdeckung, die wir gemacht haben, besteht darin, dass M6P, gekoppelt an ein Antisinn-Molekül, das komplementär zu einer Spleißstelle ist, dessen Ladung auch an die Spleiß-Maschinerie richten kann, welche an einem anderen Ort lokalisiert ist als der "bekannte Ort", der von M6P und dessen Ladung (GAA) normalerweise verwendet wird. Diese unerwartete Entdeckung machte es uns möglich, M6P zu verwenden, um Muskelzellen mit bioaktiven Verbindungen an verschiedene zelluläre Kompartimente, wie z. B. den Zellkern, zielgerecht zu führen (als ein unerwartetes Ergebnis, da angenommen wurde, dass das M6P-Targetingsystem die Ladung an das lysosomale Kompartiment führt).
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von beliebigen Glykosid-Verbindungskonjugaten der Erfindung, um die Sequenz einer RNA oder dessen Vorläufer zu verändern, deren Zusammensetzung und Anordnung von deren Exons zu modifizieren oder zu modulieren, so dass ein Protein hergestellt werden kann, das in der Lage ist, die Funktionalität einer Zelle, an die es abgegeben wird, insbesondere von Muskelzellen, wiederherzustellen. In einem Aspekt können die erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugate verwendet werden, um eine beliebige RNA zu blockieren oder zu stimulieren, welche zu einer erhöhten Leistungsfähigkeit der Herz-, Respirations- oder Skelettmuskeln führen kann mit dem Ziel, den Verlauf bestimmter Krankheiten oder Nachteile, wie sie z. B. im Zusammenhang mit dem Altern auftreten, zu verbessern.
In einem weiteren Aspekt beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Abgabe einer Verbindung in den Zellkern von Zellen, umfassend einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor II/Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (IGF-II/MPR), bei dem ein erfindungsgemäßes Glykosid-Verbindungskonjugat mit den Zellen in Kontakt gebracht wird. In einem Aspekt umfasst das In-Kontakt-Bringen die Injektion in ein Tier oder humanes Gewebe. In einem anderen Aspekt sind die Zellen Muskelzellen eines Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), und die Verbindung ist ein Antisinn-Oligonukleotid, das ein Exon-Springen bewirkt, insbesondere ein Exon-46-Springen, und die Synthese von Dystrophin oder Varianten davon induziert oder wieder herstellt.
In einem weiteren Aspekt beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Muskelkrankheiten, wie Beckers Muskeldystrophie, spinale Muskelatrophie (SMA), Bethlem Myopathie, myotubuläre Myopathy, Muskeldystrophie vom Gliedergürteltyp 2A und 2B, Miyoshi Myopathie and merosindefiziente Muskeldystrophie, bei der Muskelzellen von Patienten in Kontakt mit einem erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugat gebracht werden.
Ferner beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Induktion der Synthese oder Funktion von beliebigen RNA-Spezies in Muskelzellen, bei dem die Zellen mit einem erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugat in Kontakt gebracht werden, wodurch die Verbindung die Aktivität von RNAs oder Proteinen, welche die Synthese oder Funktion der RNA-Spezies unterdrückt, vermindert.
Ferner beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Inhibition der Synthese oder Funktion beliebiger RNA-Spezies in Muskelzellen, welche eine Krankheit oder eine Anfälligkeit für eine Krankheit bewirken, die viralen oder bakteriellen Ursprungs sein kann, bei dem die Muskelzellen mit einem erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugat in Kontakt gebracht werden, wodurch die Verbindung die Synthese oder Funktion der RNA-Spezies inhibiert.
Ferner können die erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugate Verwendung finden bei der Erhöhung der Körpermuskelmasse von Farmtieren. Beispielsweise können die Muskelzellen mit einem Konjugat gezielt behandelt werden, das eine Verbindung umfasst, die so ausgestaltet ist, dass sie die Muskelmasse erhöht, wie z. B. ein Oligonukleotid, das die Myostatinproduktion inhibiert. Daher betrifft die Erfindung auch ein solches Verfahren.
Ferner beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Abgabe eines Vakzins in Muskelzellen, bei dem die Muskelzellen mit einem erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugat in Kontakt gebracht werden, wobei die Verbindung ein Vakzin ist.
Ferner beschreibt die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugats bei der therapeutischen Behandlung von Muskelkrankheiten.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugats zur Herstellung eines Arzneimittels. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Glykosid-Verbindungskonjugats zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische Behandlung von Muskelkrankheiten.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Glykosid-Verbindungskonjugat weiter einen Marker. In einer Ausführungsform ist der Marker direkt oder indirekt anhand visueller, chemischer oder molekularer Verfahren detektierbar. In einer Ausführungsform ist der Marker ein fluoreszierender Marker, ein chemiluminiszierender Marker, ein radioaktiver Marker, ein enzymatischer Marker oder ein molekularer Marker.
Ferner beschreibt die Erfindung ein Verfahren für in vivo- oder in vitro-Diagnosetests, bei denen ein erfindungsgemäßes Konjugat ferner einen Marker umfasst, der mit Muskelzellen in Kontakt gebracht wird, sowie der direkte oder indirekte Nachweis des Vorliegens oder Fehlens des Markers. Ferner betrifft die Erfindung ein Diagnose-Detektions-Kit, umfassend ein erfindungsgemäßes Konjugat, der ferner einen Marker und gegebenenfalls weiter Detektionsreagenzien umfasst.
BEISPIELE
Beispiel 1: Übersicht von Baueinheiten zur Synthese der Glykosidverbindungen
Um die Glykosidverbindung herzustellen, wurde eine mehrstufige Synthese entworfen. Alle Synthesen wurden unter Verwendung von Standardsyntheseverfahren der organischen Chemie durchgeführt. Diese getrennten Baueinheiten 1A und 1B (1A bzw. 1AB) wurden synthetisiert, wohingegen die verbleibenden Einheiten (1C und 1D) kommerziell bezogen wurden (1).
Beispiel 2: Zusammenbau der Baueinheit 1
Die Baueinheit 1 (2) besteht aus dem Glykosid, das über einen SPACER an einen Rest X gebunden ist. Der SPACER besteht aus einem C4-, C5- oder C11-Alkyl oder Tetraethylen-Glykol. Der Rest X besteht aus einer Phosphat-, Amid- oder Disulfid-Bindung.
Beispiel 3: Zusammenbau der Baueinheit 2
Die Baueinheit 2 (3) ist so entworfen, dass sie die Baueinheit 1 an die Verbindung, in Beispiel 4 an ein Oligonukleotid, koppelt.
Beispiel 4: Zusammenbau der (man-6P)₂-en (man-6P)₄-Oligonukleotide mit C₄-, C₅- und C₁₁-Alkyl und Tetraethylen-Glykol-Spacer
Unter Verwendung einer Amidit-Festphase-Synthese wurden die (man-6)_x-Oligonukleotide synthetisiert (4).
REFERENZEN

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Claims

Verwendung eines Konjugats eines Glykosids, das an ein Oligonukleotid, ausgewählt aus RNA, DNA, Morpholin, 2'-O-Methyl-RNA, 2'-O-Allyl-RNA, Peptid-Nuklein-Säure (PNA) und verschlossene Nukleinsäure (LNA) gebunden ist, wobei das Glykosid ein Ligand ist, der in der Lage ist, an einen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor einer Muskelzelle zu binden, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe des Oligonukleotids an ein extralysosomales Kompartiment der Muskelzelle.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel zur Behandlung einer Muskelkrankheit vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Muskelkrankheit ausgewählt ist aus Becker-Muskeldystrophie, spinale Muskelatrophie (SMA), Bethlem-Myopathie, myotubulare Myopathie, Gliedergürtel-Muskeldystrophie 2A und 2B, Miyoshi-Myopathie und Merosinmangel-Muskeldystrophie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Glykosid ein Mono-, Di- oder Tri-Saccharid oder ein beliebiges höhergradiges Saccharid ist, und wobei das Saccharid wenigstens einen Mannose-6-Phosphat-Rest umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Glykosid ein Zwei-Antennen oder Drei-Antennen-Oligosaccharid ist, das Mono-, Di- oder Tri-Saccharide oder beliebige höhergradige Saccharide umfasst, wobei die Saccharide wenigstens einen Mannose-6-Phosphat-Rest umfassen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Glykosid an das Oligonukleotid über einen labilen Spacer gebunden ist, der intrazellulär gespalten werden kann.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Oligonukleotid an das Glykosid über einen Kationenrest an komplexe Nukleinsäuren gebunden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Mannose-6-Phosphat-Rezeptor ein Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor II/Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (IGF-II/MPR) ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Abgabe in den Nukleus einer Muskelzelle erfolgt, wobei die Muskelzelle einen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor II/Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (IGF-II/MPR) umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9, wobei die Muskelzellen von einem Duchenne-Muskeldystrophie(DND)-Patienten stammen und wobei das Oligonukleotid ein Antisinn-Oligonukleotid ist, das ein Exon-Springen bewirkt und die Synthese von Dystrophin oder Varianten davon induziert oder wieder herstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Oligonukleotid oder das Derivat oder das Imitat davon wenigstens 20 Nukleotide umfasst, die identisch oder komplementär zu einem humanen Dystrohpien-Gen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zusammensetzung zur Induktion der Synthese oder Funktion einer beliebigen RNA-Spezies in Muskelzellen vorgesehen ist, wobei das Oligonukleotid des Konjugats die Aktivität von RNAs oder Proteinen inhibiert oder vermindert, wodurch die Synthese oder die Funktion der RNA-Spezies unterdrückt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zusammensetzung zur Inhibition der Synthese oder Funktion einer beliebigen RNA-Spezies in Muskelzellen vorgesehen ist, welche eine Krankheit oder Veranlagung für eine Krankheit bewirkt, wobei das Oligonukleotid des Konjugats die Synthese oder Funktion der RNA-Spezies inhibiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Konjugat ferner einen Marker umfasst.
Verwendung nach Anspruch 14, für in-vivo- oder in-vitro-Diagnosetests, umfassend die direkte oder indirekte Detektion des Vorliegens oder des Fehlens des Markers.
Konjugat, umfassend ein Glykosid, das an ein Oligonukleotid gebunden ist, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus RNA, DNA, Morpholin, 2'-O-Methyl-RNA oder 2'-O-Allyl-RNA, Peptid-Nukleinsäure (PNA) und verschlossene Nukleinsäure (LNA), wobei das Glykosid ein Ligand ist, das in der Lage ist, sich an einen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor einer Muskelzelle zu binden und wobei das Oligonukleotid wenigstens 20 Nukleotide umfasst, die identisch oder komplementär zu einem humanen Dystrophin-Gen sind.
Konjugat nach Anspruch 16, wobei das Glykosid ein Mono-, Di- oder Tri-Saccharid oder ein beliebiges höhergradiges Saccharid ist, und wobei das Saccharid wenigstens einen Mannose-6-Phosphat-Rest umfasst.
Konjugat nach Anspruch 16, wobei das Glykosid ein Zwei-Antennen- oder Drei-Antennen-Oligosaccharid ist, das Mono-, Di- oder Tri-Saccharide oder beliebige höhergradige Saccharide umfasst, wobei die Saccharide wenigstens einen Mannose-6-Phosphat-Rest umfassen.
Konjugat nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei das Glykosid an das Oligonukleotid über einen labilen Spacer gebunden ist, der intrazellulär gespalten werden kann.
Konjugat nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei das Konjugat ferner einen Marker umfasst.