WO2023214512A1 - 人工ｒｎａ分子 - Google Patents

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WO2023214512A1
WO2023214512A1 PCT/JP2023/015828 JP2023015828W WO2023214512A1 WO 2023214512 A1 WO2023214512 A1 WO 2023214512A1 JP 2023015828 W JP2023015828 W JP 2023015828W WO 2023214512 A1 WO2023214512 A1 WO 2023214512A1
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WO
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sequence
mrna
polynucleotide
rna molecule
exon
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PCT/JP2023/015828
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玲 芳本
真一 中川
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学校法人常翔学園
国立大学法人北海道大学
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a novel artificial RNA molecule, and particularly to an artificial RNA molecule that regulates splicing of mRNA.
  • 4.5SH RNA is a rodent-specific non-coding RNA, and its base sequence has been identified (Non-Patent Document 1). However, the function of 4.5SH RNA has not been elucidated.
  • gene therapy has been attracting attention in recent years.
  • techniques applying, for example, nucleic acid drugs and genome editing using CRISPR/Cas9 are known.
  • nucleic acid medicines for example, antisense nucleic acid medicines that treat neurological diseases and muscle diseases by regulating mRNA splicing of genes that cause diseases are on the market (for example, Patent Document 1).
  • antisense nucleic acid drugs are generally about 14 to 25 bases in length, screening is required to search for sites that are effective in regulating mRNA splicing in the target gene, which takes time and development. It's expensive. Furthermore, due to its short half-life, the drug's efficacy cannot be maintained unless it is repeatedly administered every few weeks to several months, resulting in a heavy medical economic burden.
  • One method to solve this problem is a technology that applies genome editing using CRISPR/Cas9. Technologies that apply genome editing can have long-lasting effects because they act directly on the genome.
  • an adeno-associated virus vector As an expression vector for the CRISPR/Cas9 system, an adeno-associated virus vector (AAV) is often used from the viewpoint of safety, etc.
  • AAV adeno-associated virus vector
  • the problem is that the Cas9 gene has a large molecular weight and is difficult to load into AAV.
  • the present invention aims to provide a new technique for regulating mRNA splicing.
  • RNA splicing As a result of extensive studies, the present inventors discovered that non-coding RNA specific to rodents is involved in mRNA splicing. Further studies revealed that the characteristic secondary structure of the specific sequence of the rodent-specific non-coding RNA plays a role in attracting splicing control factors and stabilizing the RNA molecule. We have discovered that by using an artificial RNA molecule in which this secondary structure is combined with a sequence complementary to the target mRNA precursor, mRNA splicing can be regulated and the above problems can be solved, and the present invention has been completed.
  • RNA molecule containing the following (a) and the following (b), in which the following (a) and (b) are arranged in this order from the 5' side to the 3' side, (a) A polynucleotide potentially having a secondary structure represented by the following formula (I), or 7 nucleotides on the 3' side of a polynucleotide potentially having a secondary structure represented by the following formula (I) Polynucleotide in which 1 to 3 bases have been substituted, deleted, or added (b) Pre-mRNA targeting that contains a complementary sequence to the target sequence, which is a partial sequence of the pre-mRNA polynucleotide (In the formula, N 1 to N 25 each independently represent A, C, G or U, N 1 and N 25 are N 2 and N 24 , N 3 and N 23 are N 4 and N 22 , N 5 and N 21 , N 6 and N 20 , N 8 and N 19 , N 9 and N 18 , N 10 and
  • the artificial RNA molecule described in [4] The artificial RNA molecule according to any one of [1] to [3] above, wherein the length of (b) is 15 to 300 bases, more preferably 20 to 60 bases; [5] The artificial RNA molecule according to any one of [1] to [4] above, wherein the target sequence is an exon sequence; [6] The artificial RNA molecule according to any one of [1] to [5] above, in which the following (c) is arranged on the 3' side of (b), (c) A polynucleotide containing a sequence that contributes to terminal stability [7] The artificial RNA molecule according to [6] above, wherein (c) is a polynucleotide containing a transcription termination signal sequence recognized by an RNA pol III enzyme; [8] The artificial RNA molecule according to any one of [1] to [7] above, wherein (a) is a polynucleotide that binds to a protein that controls mRNA s
  • step (B) a step in which the artificial RNA molecule prepared in step (A) is brought into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor, thereby regulating mRNA splicing.
  • step (A) a step in which the artificial RNA molecule prepared in step (A) is brought into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor, thereby regulating mRNA splicing.
  • step (B) a step in which the artificial RNA molecule prepared in step (A) is brought into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor, thereby regulating mRNA splicing.
  • step (B) a step in which the artificial RNA molecule prepared in step (A) is brought into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor, thereby regulating
  • a method for producing mature mRNA comprising: (A) A step of preparing an artificial RNA molecule containing the following (a) and the following (b), in which the following (a) and (b) are arranged in this order from the 5' side to the 3' side, (a) A polynucleotide potentially having a secondary structure represented by formula (I), or 7 bases on the 3' side of a polynucleotide potentially having a secondary structure represented by formula (I) (b) A pre-mRNA targeting polynucleotide containing a complementary sequence to a target sequence which is a partial sequence of a pre-mRNA.
  • step (B') a step of bringing the artificial RNA molecule prepared in step (A) into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor, and (C) step (B') A method, the method comprising: regulating mRNA splicing to produce mature mRNA; [19] The method according to [18] above, wherein the regulation of splicing of the mRNA is by exon skipping; [20] The above-mentioned [18] or [19], wherein the base sequence of (a) is the sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a sequence having 80% or more sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • an artificial RNA molecule that combines a characteristic secondary structure and a sequence complementary to a target mRNA precursor, and a method using the artificial RNA molecule, enables mRNA splicing that is different from conventional techniques.
  • a new technique is provided for regulating the
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a part of the secondary structure of 4.5SH RNA predicted by the secondary structure prediction program RNAfold.
  • FIG. 2 is an electropherogram showing RT-PCR performed using primers that specifically amplify three genes with asSINEB1 in wild-type and 4.5SH knockout mice. These are the results for Smchd1, Slc25a40, and Smg6 in order from the left.
  • the upper row indicates mRNA containing a novel exon in gray
  • the lower row indicates mRNA containing no new exon.
  • the exon in question is shown in gray, with black and white on either side.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a reporter carrying the U6 promoter and mouse 4.5SH sequences.
  • a U6 promoter sequence and a 4.5SH sequence are arranged in this order from the 5' side of the reporter.
  • FIG. 4 is an electrophoretogram showing the results of confirmation by Northern blotting that 4.5SH RNA is expressed in human cells by introducing and expressing the promoter shown in FIG. 3.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram obtained when minigenes each containing two genes having asSINEB1 were introduced into human 4.5SH-expressing cells, and RT-PCR was performed using primers that specifically amplify each gene. From the left, the results are for Slc25a40 and Smg6.
  • FIG. 6 is a bar graph showing the skipping efficiency determined from the electropherogram of FIG. 5.
  • FIG. The results for Slc25a40 are shown on the left, and the results for Smg6 are shown on the right.
  • Part of the DNA base sequence of a plasmid expressing 4.5SH wild type (WT), Slc25a40 wild type (WT), 4.5SH mutant type (MUT), and Slc25a40 mutant type (MUT) from top to bottom. It is. Portions where the bases differ between WT and MUT are shown in gray.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram obtained when a mutant plasmid and a wild-type plasmid were introduced into human cells, and RT-PCR was performed using primers that specifically amplify each.
  • 9 is a bar graph showing the skipping efficiency determined from the electropherogram of FIG. 8. From left to right, only Slc25a40 wild type, both wild types, Slc25a40 mutant type and 4.5SH wild type, Slc25a40 wild type and 4.5SH mutant type, and both mutant types are shown.
  • FIG. 3 shows the exon skipping efficiency of B1 modified 4.5SH (SL-B1-4.5SH).
  • FIG. 2 is an electrophoretogram when co-expressing a minigene for detecting FAS gene exon skipping and wild-type 4.5SH or FAS-modified 4.5SH.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram when a minigene containing Slc25a40 exon 8.5 and wild-type 4.5SH or FAS-modified 4.5SH are coexpressed.
  • 13 is a bar graph showing the skipping efficiency determined from the electropherograms of FIGS. 11 and 12.
  • FIG. FIG. 2 is a schematic diagram of the target sequence of DMD gene-modified 4.5SH. It is an electrophoretogram when the minigene for DMD gene exon skipping detection and DMD gene modification 4.5SH were co-expressed. For the markers shown in the schematic diagram on the left, the upper row indicates mRNA containing gray DMD exon 53, and the lower row indicates mRNA not containing DMD exon 53.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram obtained by BioAnalyzer when the minigene for detecting DMD gene exon skipping and the DMD gene modified 4.5SH are coexpressed.
  • the schematic diagram above is a schematic diagram illustrating targeting of DMD genetically modified 4.5SH to DMD exon 53. Regarding the markers shown in the schematic diagram on the left, the upper row shows mRNA containing DMD exon 53, and the lower row shows mRNA not containing DMD exon 53.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the target sequence of DMD gene-modified 4.5SH.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of co-expressing a minigene for detecting DMD gene exon skipping and DMD gene modification 4.5SH.
  • FIG. 3 is a diagram showing the exon skipping efficiency of MAPT gene-modified 4.5SH.
  • a schematic diagram illustrating targeting of MAPT gene-modified 4.5SH to MAPT exon 10 an electrophoretogram by BioAnalyzer, an electropherogram showing the results of confirming RNA expression by Northern blotting, and a bar graph showing exon skipping efficiency. It is. Regarding the markers shown in the schematic diagram on the left of the electrophoretogram obtained by BioAnalyzer, the upper row indicates mRNA containing MAPT exon 10, and the lower row indicates mRNA not containing MAPT exon 10.
  • RNA molecule of the present invention (a) a polynucleotide potentially having a secondary structure represented by formula (I), or a polynucleotide potentially having a secondary structure represented by formula (I); A polynucleotide (polynucleotide (a)) in which 1 to 3 bases have been substituted, deleted, or added to the 7 bases on the 3' side of the polynucleotide (polynucleotide (a)) forms a strong stem-loop structure, and the stem-loop structure A splicing control factor binds to the pre-mRNA, and (b) a pre-mRNA targeting polynucleotide (polynucleotide (b)) containing a complementary sequence to the target sequence, which is a partial sequence of the pre-mRNA.
  • Binds to target sequences in the body Binds to target sequences in the body.
  • the splicing control factor bound to the polynucleotide (a) acts to suppress or promote the splicing reaction, a portion containing the target sequence, such as an exon, is skipped or included during mRNA splicing.
  • artificial RNA molecule is an expression intended to mean an RNA molecule that does not exist in nature, and is an artificial RNA molecule that corresponds to the artificial RNA molecule containing polynucleotide (a) and polynucleotide (b) of the present invention. Even if the RNA molecule is artificially produced, if the entire sequence of the molecule exists in nature as it is, it is not included in the artificial RNA molecule of the present invention.
  • pre-mRNA refers to RNA that has been transcribed by an RNA polymerase enzyme using DNA as a template in the cell nucleus and has not yet undergone mRNA splicing.
  • mRNA splicing refers to a process in which introns are removed from pre-mRNA and mature mRNA is produced from the pre-mRNA. The same applies to the term simply "splicing.”
  • exon refers to a sequence contained in mature mRNA.
  • NCBI National Center for Bio-technology Information
  • GenBank GenBank
  • other NCBI databases by means of a computer implemented with software.
  • one skilled in the art can view the genome in the Ensembl database (http://www.ensembl.org) and obtain information regarding exons.
  • intron refers to a sequence that is not included in mature mRNA.
  • exons one skilled in the art can obtain annotated sequences of introns from publicly accessible databases such as NCBI, GenBank or other NCBI databases by means of a computer implemented with software. It is possible.
  • alternative splicing refers to splicing performed by removing specific exons.
  • base pair bond refers to the so-called Watson-Crick type hydrogen bond between nucleotides adenine (A) and thymine (T) (or uracil (U)), guanine (G) and cytosine (C). It includes not only base pair bonds of , but also fluctuation base pair bonds of G and U, inosine (I) and U, I and A, etc.
  • exonization refers to a sequence that is originally an intron included in mature mRNA as a result of regulated mRNA splicing.
  • new exon refers to a sequence that was originally an intron, resulting from exonization.
  • stem-loop structure refers to a secondary structure formed within a single nucleic acid molecule, and is a structure formed by a nucleotide sequence held within the nucleic acid molecule itself.
  • the stem-loop structure consists of a stem region created by base pairing between a base sequence located at the 3' end and a base sequence located at the 5' end of the same molecule. It consists of a region with a loop structure formed by a base sequence located between a base sequence located at the 3' end and a base sequence located at the 5' end.
  • RNA Fold http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin
  • Experimental methods include RNA footprint assay, nuclear magnetic resonance (NMR) and crystal structure analysis of nucleic acid molecules.
  • MFE minimum free energy
  • exon skipping refers to one aspect of alternative splicing that produces mature mRNA that does not contain specific exons that originally exist.
  • the present invention provides an artificial RNA comprising the following (a) and the following (b), in which the following (a) and (b) are arranged in this order from the 5' side to the 3' side. molecules (also referred to as artificial RNA molecules of the invention).
  • Pre-mRNA targeting that contains a complementary sequence to the target sequence, which is a partial sequence of the pre-mRNA polynucleotide
  • a polynucleotide in which 1 to 3 bases have been substituted, deleted, or added to the 7 bases on the 3' side is simply a "polynucleotide (a)";
  • a pre-mRNA targeting polynucleotide that includes a complementary sequence to the sequence is simply referred to as a "polynucleotide (b),” and a polynucleotide that includes a sequence that contributes to (c) terminus stability as described below is simply referred to as a “polynucleotide (b).”
  • Polynucleotide (a) is a polynucleotide potentially having a secondary structure represented by the following formula (I), or a 3′ polynucleotide potentially having a secondary structure represented by the following formula (I). It is a polynucleotide in which 1 to 3 bases have been substituted, deleted, or added among the seven bases on the side.
  • N 1 to N 25 each independently represent A, C, G or U
  • N 1 and N 25 are N 2 and N 24
  • N 3 and N 23 are N 4 and N 22
  • N 8 and N 19 are base pairs, respectively.
  • Polynucleotide (a) forms a strong stem-loop structure of N 1 to N 25 as a secondary structure that exists stably under physiological conditions, as shown by formula (I).
  • N 1 to N 25 are base - paired within one RNA molecule to form a strong stem-loop structure.
  • the nine base pair bonds formed between 10 and N 17 are preferably G and C or G and U.
  • the number of base pair bonds between G and C or G and U is preferably 5 to 9, more preferably 6 to 9, and 7 to 9.
  • N 11 to N 16 are preferably RYRRYR in order to form a loop structure.
  • R represents a purine base (A or G) and Y represents a pyrimidine base (C or U).
  • the seven bases on the 3' side of N25 shown in formula (I) do not need to be bases that form a stem-loop structure, and 1 to 3 bases may be substituted, deleted, or added. .
  • the base substitution, deletion or addition may be made to any of the seven bases shown in formula (I), preferably 1 to 2 bases, and more preferably 1 base.
  • purine bases are preferably substituted with other purine bases
  • pyrimidine bases are preferably substituted with pyrimidine bases.
  • sequence (primary structure) of polynucleotide (a) is not particularly limited as long as it is a base sequence potentially having a secondary structure represented by formula (I), but may include the sequence shown in SEQ ID NO: 2. Alternatively, it is preferable to include a sequence having 80% or more sequence identity to the sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • the sequence shown by SEQ ID NO: 2 is rich in G and C, and can form a strong stem-loop structure shown in formula (I) as described below (FIG. 1).
  • Polynucleotide (a) preferably has a sequence identity of 85% or more, even more preferably 90% or more, particularly preferably 92% or more with the sequence shown in SEQ ID NO: 2. , most preferably 95% or more.
  • the MFE of the stem-loop structure of polynucleotide (a) is preferably -10.00 kcal/mol or less, more preferably -11.00 kcal/mol or less, even more preferably -12.00 kcal/mol or less, and -12.80 kcal/mol. It is particularly preferably at most mol, and most preferably at most -12.90 kcal/mol. It is thought that the strength of the stem-loop structure within the above range stabilizes the RNA molecule.
  • the MFE of a stem-loop structure can vary depending on the number of base pair bonds in the stem region (length of complementary strand), the number of mismatched or bulged bases, the number of bases forming a loop structure, etc.
  • Polynucleotide (a) is considered to contribute to the stabilization of the artificial RNA molecule by containing the stem-loop structure and the 3'-side base following it as described above. Furthermore, polynucleotide (a) is thought to play a role in attracting splicing control factors.
  • splicing control factor is an expression intended to refer to all factors that control mRNA splicing that exist in living organisms, and specifically includes proteins and nucleic acids that control mRNA splicing. Also includes RNA complexes.
  • polynucleotide (a) has the function of attracting splicing control factors and binding to splicing control factors.
  • the splicing control factor that binds to polynucleotide (a) determines what kind of regulation the artificial RNA molecule of the present invention performs in mRNA splicing, that is, what kind of alternative splicing is performed.
  • the splicing control factor that binds to polynucleotide (a) includes proteins constituting the nuclear small RNA U2 complex and its binding proteins. More specifically, SF3b1, U2AF2, Nono, Sfpq, Hnrnpf, etc. may be mentioned. Furthermore, from the results of mass spectrometry, it is presumed that Hnrnpm, Hnrnpa1, Hnrnpa2b1, Ddx5, Hnrnpa3, Fus, Hnrnpa0, Pabpc1, Snrpa, Dhx9, Myef2, Ddx17, Hnrnph1, Prpf8, Rps3a, Rbm14, etc. bind.
  • splicing regulators include the ability to suppress sequences such as splice donor or splice acceptor sequences that are necessary to enable the splicing reaction, or the ability to suppress exon inclusion signals, and the ability to accurately recognize intronic sequences.
  • sequences such as splice donor or splice acceptor sequences that are necessary to enable the splicing reaction, or the ability to suppress exon inclusion signals, and the ability to accurately recognize intronic sequences.
  • the functions related to this are known.
  • polynucleotide (a) is the sequence discovered from 4.5SH RNA (hereinafter also referred to as 4.5SH), which is a non-coding RNA specific to rodents (SEQ ID NO: 2). ).
  • 4.5SH the sequence shown by SEQ ID NO: 2 forms a stem-loop structure as a secondary structure that exists stably under physiological conditions, attracts splicing control factors, and activates the pre-mRNA targeted by 4.5SH. It was found that this sequence is an essential sequence in the regulation of mRNA splicing of the body sequence. The sequence targeted by 4.5SH and its regulation of mRNA splicing will be described later.
  • 4.5SH is transcribed from DNA by RNA polymerase III enzyme (RNA pol III enzyme).
  • polynucleotide (a) in 4.5SH does not form a complementary strand with the target sequence, it is thought to attract mRNA splicing inhibitors and inhibit accurate recognition of introns. .
  • sequence shown in SEQ ID NO: 2 is thought to contribute to the overall stability of 4.5SH because it forms a strong stem-loop structure, as shown in Formula (I) and Figure 1. It will be done.
  • polynucleotide (a) of the present invention will be explained with reference to the drawings, using the sequence shown by SEQ ID NO: 2 as a specific example thereof.
  • Figure 1 shows the part of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 in 4.5SH predicted in RNA Fold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi). It is a figure showing a secondary structure.
  • G which is the terminal end of the stem-loop structure, corresponds to the 5' terminal base in the above formula (I).
  • the "X-th base” means the X-th base counting from the 5' side.
  • the 1st G and 25th U are base-paired
  • the 2nd C and 24th G are base-paired
  • the 3rd The C and the 23rd G make a base pair
  • the 4th G and the 22nd C make a base pair
  • the 5th G and the 21st C make a base pair
  • the 6th U and the 20th The G at the 8th position and the 19th C form a base pair
  • the 9th U and the 18th A form a base pair
  • the 10th G and the 17th C form a base pair.
  • They form a stem region.
  • the 11th to 16th bases are bases that do not have a partner to form a base pair bond, and form a loop structure.
  • a at position 26 to U at position 32 are not bases that form a stem-loop structure.
  • the bases from the 26th A to the 32nd U in the sequence shown in SEQ ID NO: 2 are not bases forming a stem-loop structure, but are complementary to the target sequence of 4.5SH, which will be described later. Nor are they bases that form chains.
  • Polynucleotide (b) is a pre-mRNA targeting polynucleotide that includes a complementary sequence to a target sequence that is a partial sequence of a pre-mRNA. Any sequence can be designed for the polynucleotide (b) depending on the target sequence.
  • the polynucleotide (b) contains a sequence complementary to the target sequence, which is a partial sequence of the mRNA precursor. That is, polynucleotide (b) forms a complementary strand to the target sequence. Formation of a complementary strand does not require that two nucleic acid molecules be completely (100%) complementary.
  • a complementary sequence refers to a sequence in which two nucleic acid molecules complement each other through base pairing. For example, sequences with 80 to 100% complementarity (e.g., sequences in which 4 or 5 out of 5 bases are complementary), or sequences with 90 to 100% identity (e.g., 9 or 10 out of 10 bases) are complementary sequences).
  • the base sequence complementarity between the polynucleotide (b) and the target sequence is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more.
  • the base length of the polynucleotide (b) is preferably 15 bases or more, more preferably 20 bases or more, and 40 bases or more, from the viewpoint of the stability of the complementary strand with the target sequence and the specificity of the complementary strand with the target sequence.
  • the above is more preferable, and 50 or more bases is particularly preferable.
  • the base length of the polynucleotide (b) is preferably 300 bases or less, more preferably 200 bases or less, even more preferably 100 bases or less, particularly 80 bases or less, from the viewpoint of ease of synthesizing the artificial RNA molecule.
  • 60 bases or less is most preferable.
  • the stability of the complementary strand between the polynucleotide (b) and the target sequence is determined not only by the complementarity of the base sequences mentioned above, but also by the number of hydrogen bonds between the bases (for example, the pair of G and C is better than the pair of A and U). It can also change depending on the number of hydrogen bonds (the number of hydrogen bonds is greater than the number of hydrogen bonds) and the position of the non-complementary sequences (such as whether it is in the center or at the end of the complementary strand).
  • the target sequence of polynucleotide (b) is not particularly limited as long as it is a partial base sequence of a pre-mRNA that is a target for regulating mRNA splicing, but the presence or absence of the target sequence in mature mRNA may
  • the exon sequence is preferably an exon sequence that changes the function of the protein encoded by the exon.
  • the exon sequence may be the entire base sequence of the exon or a partial base sequence of the exon, depending on the length of the target exon.
  • the target sequence of polynucleotide (b) may also include a part of the intron sequence located within 300 bases upstream (5' side) or downstream (3' side) of the exon. , it may be only a part of the above intron sequence that does not include exon sequences.
  • the polynucleotide (b) may include multiple sequences each complementary to multiple target sequences. Such multiple target sequences are preferably selected from a region including the same exon and 300 bases upstream or downstream thereof, but are not limited thereto.
  • the polynucleotide (b) contains multiple sequences each complementary to the multiple target sequences. is preferred.
  • the base length of the polynucleotide (b) is preferably 60 bases or more, more preferably 90 bases or more, and even more preferably 100 bases or more.
  • 400 bases or less is preferable, and 300 bases or less is more preferable.
  • the artificial RNA molecule of the present invention preferably includes, in addition to the above-mentioned polynucleotide (a) and polynucleotide (b), a polynucleotide (polynucleotide (c)) containing a sequence that contributes to terminal stability, This polynucleotide (c) is preferably placed on the 3' side of polynucleotide (b).
  • the polynucleotide (c) is preferably a polynucleotide containing a transcription termination signal sequence recognized by an RNA pol III enzyme.
  • the transcription termination signal sequence recognized by RNA pol III enzyme is a sequence in which seven or more uracils (U) are linked.
  • the transcription termination signal sequence recognized by the RNA pol III enzyme not only functions as a signal to terminate transcription when non-coding RNA is transcribed from DNA, but may also contribute to stabilizing the entire non-coding RNA.
  • the structure of the 3' end of non-coding RNA may also contribute to stabilizing the entire non-coding RNA (Trends in Genetics, 2007 Dec; vol23: 614- 622, Biochim Biophys Acta. 2013 Mar; 1829(3-4): 318-330).
  • RNA pol III enzymes Terends in Genetics, 2007 Dec; vol 23 : 614-622, Biochim Biophys Acta. 2013 Mar; 1829(3-4): 318-330, etc.
  • the artificial RNA molecules of the invention modulate mRNA splicing of pre-mRNA targeted by polynucleotide (b). Regulation of mRNA splicing includes intron retention and modification of alternative splicing, with modification of alternative splicing being preferred. Modifications of alternative splicing include induction of exon inclusion or exon skipping. Among these, the function of 4.5SH is to suppress new exon formation by exon skipping, so it is preferable to induce exon skipping.
  • At least one polynucleotide (a) and at least one polynucleotide (b) are arranged in this order from the 5' side to the 3' side. Moreover, when polynucleotide (c) is included, polynucleotide (c) is arranged on the 3' side of polynucleotide (a) and polynucleotide (b).
  • polynucleotide (a), polynucleotide (b), and polynucleotide (c) may be arranged, or one each may be arranged. Since polynucleotide (a) is an essential sequence for regulating mRNA splicing, the effect of the present invention may be further exhibited by arranging two or more polynucleotides (a). When two or more polynucleotides (a) are arranged, at least two structures represented by formula (I) may be arranged via a multibranched loop.
  • the second polynucleotide (a) is preferably arranged on the 3' side of the polynucleotide (b).
  • a spacer may be present between each of polynucleotide (a), polynucleotide (b), and polynucleotide (c), or no spacer may be present.
  • the base length of the spacer can be, for example, 200 bases or less, 150 bases or less, 100 bases or less, 50 bases or less, 40 bases or less, or 30 bases or less.
  • the nucleic acid in the artificial RNA molecule of the present invention may be a natural type or a modified nucleic acid.
  • Modified nucleic acids include, for example, nucleic acids in which the OH group at the 2' position of ribose is replaced with an F group or OMe group, phosphorothioate nucleic acids, morpholino nucleic acids, and crosslinked nucleic acids in order to increase resistance to nucleases and hydrolysis. (LNA) etc. may be included.
  • LNA LNA
  • pseudouridine ( ⁇ ), N1-methylpseudouridine (N1m ⁇ ), etc. may be included in place of uridine (U).
  • the position of the modified nucleic acid can be all or a part, and if it is a part, it can be a random position at any ratio.
  • a structure commonly used in genetic engineering can be added to the 5' end of the artificial RNA molecule of the present invention in order to stabilize the molecule.
  • triphosphoric acid may be added or a cap structure may be added.
  • a structure commonly used in genetic engineering can be added to the 3' end of the artificial RNA molecule of the present invention in order to stabilize the molecule.
  • a phosphate group may be added.
  • the RNA molecule of the present invention may contain polynucleotides other than the above polynucleotides (a), polynucleotides (b) and polynucleotides (c).
  • Other sequences include, for example, polynucleotides for gene expression and drug delivery. More specifically, for example, a polynucleotide containing a promoter sequence of an expression vector, a polynucleotide containing a transcription termination sequence of an expression vector, a polynucleotide containing a sequence for avoiding degradation by an RNA nuclease enzyme, a polynucleotide having an affinity for a splicing control factor, etc. For example, polynucleotides containing a sequence with a specific sex.
  • the artificial RNA molecule of the present invention targets a pre-mRNA with a polynucleotide (b), thereby regulating the splicing of the pre-mRNA, thereby making it possible to control the gene (target gene) that is translated and expressed.
  • target genes include, for example, the FAS gene, dystrophin gene (DMD), tau (MAPT) gene, fukutin gene (FKTN), survival motor neuron (SMN) 2 gene, myotonin protein kinase (DMPK) gene, and IKBKAP.
  • Examples include the GFAP gene, the titin gene (TTN), the C1-INH gene (SERPING1 gene), the eye shut homolog (EYS) gene, and the huntingtin gene (HTT).
  • the target gene may be a gene that is known to form multiple isoforms from a single gene by alternative splicing, or it may be a gene whose isoforms are generally not confirmed in vivo. Good too.
  • examples of genes that are known to form multiple isoforms from a single gene by alternative splicing include the FAS gene and the tau (MAPT) gene.
  • Genes whose isoforms have not generally been confirmed in vivo include, for example, the dystrophin gene (DMD) and the fukutin gene (FKTN).
  • the present invention also provides an expression vector containing a DNA sequence encoding the above-described artificial RNA molecule of the present invention.
  • the artificial RNA of the present invention can be expressed in vivo and used to regulate mRNA splicing of a target gene.
  • Expression vectors include plasmids, bacteriophages, viral vectors, cosmids, and the like.
  • plasmids examples include PCDNA3 and PCDNA5FRT/TO.
  • a viral vector is a vector based on one or more nucleic acid sequences containing the viral genome.
  • examples of viral vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors (AAV), retrovirus vectors, lentivirus vectors, and the like.
  • a parvovirus vector such as an AAV vector is preferred.
  • Parvoviruses are small viruses with single-stranded DNA genomes.
  • AAV belongs to the parvovirus family.
  • the expression promoter possessed by the expression vector may be any promoter of RNA pol III enzyme, and specific examples thereof include U6 promoter, H1 promoter, etc.
  • the U6 promoter is preferred.
  • the expression vector containing the DNA sequence encoding the artificial RNA molecule of the present invention can be obtained by chemically synthesizing the artificial RNA molecule of the present invention and expression vectors such as expression promoters and plasmids, or It can also be obtained by chemically or biochemically synthesizing an artificial RNA molecule and an expression promoter and recombining it into an expression vector such as a virus or plasmid.
  • a method for recombining an expression vector so as to contain a DNA sequence encoding the artificial RNA of the present invention a method commonly used in molecular biology can be used. For example, there are methods using restriction enzymes and ligase, or methods using Gibson assembly.
  • the invention provides a method of modulating mRNA splicing, comprising: (A) A step of preparing an artificial RNA molecule containing the following (a) and the following (b), in which the following (a) and (b) are arranged in this order from the 5' side to the 3' side, (a) A polynucleotide potentially having a secondary structure represented by formula (I), or 7 bases on the 3' side of a polynucleotide potentially having a secondary structure represented by formula (I) (b) A pre-mRNA targeting polynucleotide containing a complementary sequence to a target sequence which is a partial sequence of a pre-mRNA.
  • step (B) a step in which the artificial RNA molecule prepared in step (A) is brought into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor, thereby regulating mRNA splicing.
  • a method also referred to as a regulation method of the present invention comprising:
  • Step (A) is a step of preparing an artificial RNA molecule.
  • the step of preparing the artificial RNA molecule of the present invention is not particularly limited, and may include a method of chemically synthesizing an RNA molecule, a method of synthesizing it using a biochemical method, and the like.
  • Chemical synthesis methods include the phosphoroamitide method and its improved methods, the H-phosphonate method and its improved methods, and the like.
  • Examples of the biochemical synthesis method include a method of synthesizing RNA molecules using an in vitro transcription system (enzyme synthesis method).
  • contract-manufactured artificial RNA can also be applied to the present invention.
  • Step (B) is a step in which the artificial RNA molecule prepared in step (A) is brought into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor, thereby regulating mRNA splicing. It is.
  • a method for bringing the artificial RNA molecule into contact with the target mRNA precursor there are conventional methods in this technical field, such as introducing the artificial RNA molecule into cells outside the living body and administering the artificial RNA molecule to the living body. Can be used.
  • RNA molecules can be introduced into cells outside the body, such as lipofection, liposome, electroporation, calcium phosphate co-precipitation, microinjection, gene gun method, A reverse transfection method or the like can be used.
  • mRNA splicing usually proceeds by a two-step mechanism.
  • the 5' splice site is cleaved, generating a free 5' exon and a lasso-shaped intermediate.
  • this 5' exon joins to the 5' exon with release of the intron as a lariat-shaped product.
  • These reactions are catalyzed by the spliceosome (see e.g. Moore, M.J., P.A.Sharp (1993) Nature, 365:364-368).
  • mRNA splicing is regulated depends on the type of splicing control factor called in by polynucleotide (a) and the target sequence targeted by polynucleotide (b).
  • Specific methods for regulating mRNA splicing include methods for inducing intron retention and methods for correcting alternative splicing, but methods for correcting alternative splicing are preferred.
  • Methods for correcting alternative splicing include methods of inducing exon inclusion, methods of inducing exon skipping, etc., and methods of inducing exon skipping are preferred.
  • RNA splicing has been regulated can be performed by RT-PCR or the like. Specifically, total RNA is extracted from cells or tissues into which the artificial RNA molecule of the present invention has been introduced, cDNA is obtained by reverse transcription reaction using reverse transcriptase, mRNA is purified, and the target sequence is specifically isolated. By performing PCR using PCR primers that amplify the target sequence, it can be confirmed that mature mRNA with regulated splicing of the target sequence has been obtained.
  • the invention provides a method for producing mature mRNA, comprising: (A) A step of preparing an artificial RNA molecule containing the following (a) and the following (b), in which the following (a) and (b) are arranged in this order from the 5' side to the 3' side, (a) A polynucleotide potentially having a secondary structure represented by formula (I), or 7 bases on the 3' side of a polynucleotide potentially having a secondary structure represented by formula (I) (b) A pre-mRNA targeting polynucleotide containing a complementary sequence to a target sequence which is a partial sequence of a pre-mRNA.
  • step (B') a step of bringing the artificial RNA molecule prepared in step (A) into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor, and (C) step (B')
  • a method also referred to as a production method of the present invention, comprising a step in which mRNA splicing is regulated to produce mature mRNA.
  • Mature mRNA obtained by the production method of the present invention can be used for gene therapy by in vivo and ex vivo approaches.
  • the artificial mRNA molecule of the present invention is administered into a living body, and the artificial mRNA molecule is incorporated into the nucleus of the cell, and the mature mRNA produced in the living body remains, so that normal Embodiments can be envisaged in which proteins are produced.
  • the artificial mRNA molecule of the present invention is administered, and the artificial mRNA molecule is incorporated into the nucleus of the cell, and the mature mRNA produced within the cell is By retaining the protein, it is possible to envisage a form of use in which cells and tissues that produce normal proteins are returned to the patient.
  • Step (B') is a step of bringing the artificial RNA molecule prepared in step (A) into contact with the mRNA precursor to form a complementary strand between the artificial RNA molecule and the mRNA precursor. Similar to step (B) in the regulation method of the present invention, step (B') includes methods of introducing the artificial RNA molecule into cells outside the living body, methods of administering the artificial RNA molecule to the living body, etc. Conventional methods can be used.
  • Step (C) is a step in which mRNA splicing is regulated by step (B') and mature mRNA is produced. Confirmation that mRNA splicing is regulated and mature mRNA is produced in step (B') can be performed by RT-PCR or the like, as in the regulation method of the present invention.
  • the above description of the artificial RNA molecule of the present invention applies similarly to the description of the artificial RNA molecule in the regulation method of the present invention and the production method of the present invention.
  • the applicable contents of the explanations regarding the regulation method of the present invention and the production method of the present invention are similarly applied to each embodiment.
  • the present invention can also provide a pharmaceutical composition comprising the artificial RNA molecule of the present invention or the mature mRNA obtained by the production method of the present invention.
  • This pharmaceutical composition can be used to treat or prevent diseases treatable by modulating mRNA splicing.
  • any method commonly used in this technical field can be used without particular limitation.
  • methods using expression vectors, lipid nanoparticles (LNP), etc. include a method using a chemical modification, a method using a chemical modification, and the like.
  • RNA vectors include viral vectors and non-viral vectors such as plasmids and bacteria.
  • viral vectors are widely used in gene therapy because they can introduce and deliver drugs with relatively high efficiency.
  • AAV vectors are preferably used from the viewpoint of safety.
  • the artificial RNA molecule of the present invention is loaded onto an AAV, multiple copies can be loaded onto the AAV. Therefore, the expression level of RNA can be increased, and it is expected that the effects of the present invention will be enhanced.
  • LNPs lipid nanoparticles
  • Methods using chemical modification involve chemically modifying nucleotides constituting artificial RNA molecules or mature mRNA, and specifically include methods of adding peptides to nucleotides, 2'O-ME modification, and phosphorothioate modification. Examples include a method of adding, a method of adding pseudouridine, and the like. Such chemical modifications make it possible to protect RNA molecules from RNA degrading enzymes, to deliver them specifically to target tissues or cells, and to bind more firmly to target sequences.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • ALPS autoimmune lymphoproliferative syndrome
  • DMD Ducenne muscular dystrophy
  • FTDP-17 frontotemporal lobar dementia
  • Fukuyama muscular dystrophy Fukuyama muscular dystrophy, myotonic dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), spinal muscular atrophy (SMA), spinobulbar muscular atrophy (SBMA), familial dysautonomia (FD), Alexander disease, Angelman syndrome (AS), idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM), Parkinson's disease, hereditary angioedema (HAE), retinitis pigmentosa, Huntington's disease, chronic kidney disease, non-alcoholic steatohepatitis ( NASH), thalassemia, various cancers, etc.
  • Chimeric mice were produced from the established ES cells and crossed with wild-type mice to obtain recombinant heterozygous mice. Heteromous mice were mated with each other to obtain blastocysts of 4.5SH knockout mice.
  • 4.5SH knockout ES cells were obtained from the blastocyst.
  • RNA was extracted from 4.5SH knockout mouse ES cells, and RT-PCR was performed using cDNA synthesized from the RNA as a template and primers that specifically amplify 4.5SH. As a result, 4.5SH was significantly reduced in 4.5SH knockout mice.
  • RNA-Seq Analysis Total RNA was prepared from the established 4.5SH knockout mouse ES cells and wild type mouse ES cells using Trizol. RNA-Seq analysis was performed on the prepared total RNA. For sequencing, Illumina HiSeq4000 was used. Using rMATS 4.1.1 as the analysis software, changes in alternative splicing were compared between the three groups of 4.5SH knockout mouse ES cells and wild type mouse cells.
  • Table 1 shows the results of comparing five types of statistically significant alternative splicing changes between 4.5SH knockout mouse ES cells and wild type mouse cells at an FDR (False Discovery Rate) of less than 0.05. show.
  • the five types of alternative splicing are cassette exon type (SE), alternative 5' splice site type (A5SS), alternative 3' splice site type (A3SS), and mutually exclusive exon type (MXE). and intron-retaining type (IR).
  • Primers SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, and SEQ ID NO: 7 and 8) that specifically amplify three genes (Smchd1 exons 21-22, Slc25a40 exons 8-9, and Smg6 exons 8-9) were used.
  • RT-PCR was performed using This resulted in introns between exon 24 and exon 25 of Smchd1 (NM_028887.3), between exon 8 and exon 9 of Slc25a40 (NM_178766.5), and between exon 8 and exon 9 of Smg6 (NM_001002764.1). Since asSINEB1 exists within the 4.5SH, if these asSINEB1 become exons and become new exons by knocking out 4.5SH, this will be one way to prove the above hypothesis.
  • a plasmid carrying the U6 promoter and mouse 4.5SH sequence (Figure 3) was prepared, and the plasmid (pUC57) was introduced into human cells (HEK293 cells) by liposome transfection. Expression of 4.5SH RNA was confirmed by Northern blotting, and human 4.5SH expressing cells were obtained ( Figure 4).
  • the minigene inserted into the SacII sequence in the intron of the plasmid derived from Ad2) was inserted into the plasmid (pcDNA3 BamHI/XbaI), and the resulting vector (Ad2/pcDNA3 BamHI/XbaI, the common sequence of the vector is SEQ ID NO: 28).
  • FIGS. 5 and 6 each show the results of a control in which the minigene was introduced into human cells (HEK293 cells) before 4.5SH introduction instead of into human 4.5SH-expressing cells.
  • Experimental Example 3 and Experimental Example 4 show that 4.5SH suppresses asSINEB1 present in an intron from becoming an exon, and that the suppression of exonization is due to exon skipping of a new exon. I understand.
  • Mutations were introduced into the plasmid expressing the natural type (wild type) 4.5SH obtained in the same manner as in Experimental Example 4 to obtain a plasmid expressing the mutant type. That is, a part of G in the asSINEB1 recognition region of the wild-type 4.5SH sequence was changed to C, and the mouse 4.5SH sequence was modified to avoid base pairing with the new exon (exon 8.5) between Slc25a40 exons 8-9. A modified plasmid was created ( Figure 7). The obtained plasmid was transformed into E. coli. The transformed Escherichia coli was spread on LB (ampicillin-containing) plates, colonies were formed at 37°C, and screening was performed. The DNA sequence of the plasmid carried by ampicillin-resistant E. coli was determined, and a mutant 4.5SH expression plasmid was obtained ( Figure 7).
  • a mutation was introduced into a plasmid expressing a minigene containing natural type (wild type) Slc25a40 exon 8.5 obtained in the same manner as in Experimental Example 4 to obtain a plasmid expressing the mutant type.
  • a part of G in the wild-type Slca40 exon 8.5 sequence was changed to C, a DNA sequence fragment (SEQ ID NO: 11) designed not to base pair with wild-type 4.5SH was synthesized, and Gibson assembly was performed.
  • a mutation was inserted into the plasmid by The obtained plasmid was transformed into E. coli.
  • the transformed Escherichia coli was spread on LB (ampicillin-containing) plates, colonies were formed at 37°C, and screening was performed.
  • the DNA sequence of the plasmid carried by ampicillin-resistant E. coli was determined, and a plasmid expressing a minigene containing mutant Slc25a40 exon 8.5 was obtained ( Figure 7).
  • each of the above mutant plasmids and each wild type plasmid were co-introduced into human cells (HEK293 cells) by lipofection. After culturing at 37°C for 24 hours, the cells were collected and RNA was extracted. RT-PCR was performed using cDNA synthesized from RNA as a template and the primers (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27) that specifically amplify both minigenes, which were also used in Experimental Example 4. 10 ⁇ L of the PCR reaction product was subjected to electrophoresis in a polyacrylamide gel, and exon skipping efficiency was determined using the above-mentioned formula. The results are shown in FIGS. 8 and 9. In addition, in FIGS.
  • the leftmost lane and bar graph are samples in which the plasmid before introducing 4.5SH (so-called empty vector) and the minigene expression plasmid containing wild-type Slc25a40 exon 8.5 were co-introduced. .
  • Exon skipping was detected in cells in which wild-type 4.5SH and a minigene containing wild-type Slc25a40 exon 8.5 were coexpressed (second lane from the left in FIG. 8). In cells in which mutant 4.5SH and a minigene containing wild type Slc25a40 exon 8.5 were coexpressed, and in cells in which wild type 4.5SH and a minigene containing mutant Slc25a40 exon 8.5 were coexpressed, Exon skipping was not detected or the skipping efficiency was lower than when the wild types were coexpressed (third lane from the left and fourth lane from the left in Figure 8).
  • the transformed Escherichia coli was spread on LB (ampicillin-containing) plates, colonies were formed at 37°C, and screening was performed.
  • the DNA sequence of the plasmid carried by ampicillin-resistant E. coli was determined, and the B1 modified 4.5SH expression plasmid shown in SEQ ID NO: 30 was obtained.
  • the B1 modified 4.5SH expression plasmid obtained above was introduced into human cells (HEK293 cells) by liposome transfection to obtain B1 modified 4.5SH expressing cells. Expression of B1-modified 4.5SH RNA was confirmed by Northern blotting (middle right lane in FIG. 10: SL1-B1-4.5SH).
  • RT-PCR was performed using cDNA synthesized from RNA as a template and primers (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27) that specifically amplify the minigene containing wild-type Slc25a40Ex8.5, which were also used in Experimental Example 4.
  • Slc25a40 exon 8.5 exon skipping efficiency was significantly reduced in B1-modified 4.5SH-expressing cells (rightmost lane in Figure 10) compared to wild-type 4.5SH-expressing cells (center lane in Figure 10). ( Figure 10 bottom row).
  • the leftmost column in Figure 10 shows that instead of using human 4.5SH-expressing cells or B1-modified 4.5SH-expressing cells, the plasmid (so-called empty vector) before introducing mouse 4.5SH in Experimental Example 4 was used in human cells. (HEK293 cells) The results for the introduced control are shown.
  • Example 1 FAS gene modification 4.5SH
  • human FAS gene-modified 4.5SH was produced and exon skipping was investigated.
  • a mutation was introduced into a plasmid expressing wild type 4.5SH to obtain a plasmid expressing the mutant type. Specifically, a DNA fragment was synthesized by modifying the asSINEB1 recognition region sequence of the wild-type 4.5SH sequence into a DNA sequence complementary to FAS gene exon 6 shown in SEQ ID NO: 12, and a plasmid (pUC57 ) was inserted. The obtained plasmid was transformed into E. coli. The transformed Escherichia coli was spread on LB (ampicillin-containing) plates, colonies were formed at 37°C, and screening was performed. The DNA sequence of the plasmid carried by ampicillin-resistant E. coli was determined, and a human FAS gene-modified 4.5SH expression plasmid shown in SEQ ID NO: 13 was obtained.
  • a DNA fragment containing FAS gene exon 5, intron 5, exon 6, intron 6, and exon 7 shown in SEQ ID NO: 14 was amplified by PCR, the PCR product was purified, and a plasmid (pcDNA3 bamHI/xhoI) was obtained by Gibson assembly. A mutation was inserted into. The obtained plasmid was transformed into E. coli. The transformed Escherichia coli was spread on LB (ampicillin-containing) plates, colonies were formed at 37°C, and screening was performed. The DNA sequence of a plasmid carried by ampicillin-resistant E. coli was determined, and a minigene for detecting exon skipping of the FAS gene was obtained.
  • the FAS gene-modified 4.5SH expression plasmid and the minigene for detecting FAS gene exon skipping were co-introduced into human cells (HEK293 cells) by lipofection. After culturing at 37°C for 24 hours, the cells were collected and RNA was extracted. RT-PCR was performed using cDNA synthesized from RNA as a template and a reverse primer and a forward primer that bind to pcDNA3 shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. By using such a primer set, the FAS gene endogenous to cells will not be amplified. Table 2 shows the conditions for RT-PCR.
  • the left lane of the electrophoretogram in FIG. 11 is an electrophoretogram obtained by co-expressing the wild-type 4.5SH expression plasmid and the minigene for detecting FAS gene exon skipping in human cells (HEK293 cells), and performing RT-PCR on the extracted RNA.
  • the exon skipping efficiency was significantly lower than that of the FAS gene-modified 4.5SH expression plasmid.
  • the left lane of the electropherogram in Figure 12 shows the wild-type 4.5SH expression plasmid and the plasmid expressing the minigene containing wild-type Slc25a40 exon 8.5 co-expressed in human cells (HEK293 cells), and the extracted RNA was subjected to RT-PCR.
  • This is an electrophoresis diagram.
  • the results of co-expressing the wild-type 4.5SH expression plasmid and the wild-type Slc25a40 exon 8.5 left lane in Figure 12 and leftmost bar in Figure 13) and the minigene for detecting FAS gene-modified 4.5SH and FAS gene exon skipping.
  • FAS gene-modified 4.5SH has a FAS gene exon 6 skipping activity equivalent to that of wild type 4.5SH towards asSINEB1.
  • Fig. 11, Fig. 12, Fig. 13 since it is known that the FAS gene has two isoforms containing exon 6 and an isoform that does not contain exon 6 in vivo, a wild-type 4.5SH expression plasmid and a minigene for detecting FAS gene exon skipping were used.
  • the results of co-expression (right lane in FIG. 11 and third bar from the right in FIG. 13) are considered to indicate the isoform amount ratio in vivo.
  • Example 2 Human DMD gene modification 4.5SH
  • DMD human dystrophin gene-modified 4.5SH
  • DMD exon 53 is 212 bases long, which is longer than FAS gene exon 6 (63 bases), so first, divide the target sequence into four locations (#1, #2, #3, #4) (see Figure 14).
  • four DMD genetically modified 4.5SH (DMD genetically modified 4.5SH #1 to #4) having different base sequences of polynucleotide (b) were produced.
  • DNA fragments modified to the DMD sequence complementary to exon 53 of the above DMD gene were synthesized, and mutations were inserted into the plasmid (pcDNA3 bamHI/xh AlbanyI) by Gibson assembly.
  • the obtained plasmid was transformed into E. coli.
  • the transformed Escherichia coli was spread on LB (ampicillin-containing) plates, colonies were formed at 37°C, and screening was performed.
  • the DNA sequences of plasmids carried by ampicillin-resistant E. coli were determined, and four types of DMD gene-modified 4.5SH expression plasmids shown in SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 24 were obtained.
  • Ad2 adenovirus late gene
  • DMD gene-modified 4.5SH expression plasmid and the vector (Ad2/pcDNA3 BamHI/XbaI, common sequence of the vector is SEQ ID NO: 28) in which the minigene for detecting DMD gene exon skipping was inserted into human cells ( HEK293 cells).
  • DMD gene-modified 4.5SH expression plasmids include one type each (plasmids expressing each of DMD gene-modified 4.5SH #1 to #4) and a mixture of all four types as mini gene insertion plasmids for detecting DMD gene exon skipping. Co-introduced with After culturing at 37°C for 24 hours, the cells were collected and RNA was extracted.
  • RT-PCR was performed using cDNA synthesized from RNA as a template and the primers (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27) that specifically amplify each minigene that were also used in Experimental Example 4.
  • Table 3 shows the conditions for RT-PCR.
  • Example 2-2 Optimization of human DMD genetically modified 4.5SH ⁇ Design of polynucleotide (b) sequence> Furthermore, in order to create DMD gene-modified 4.5SH with high skipping efficiency, the target sequence of DMD exon 53 was optimized. Sequence #4 (SEQ ID NO: 20), which is part of DMD exon 53, contains two transcription termination signal sequences (specifically, TTTT) that are recognized by RNA pol III enzymes, indicating that transcription is terminated. Since this was found, the corresponding location was converted to TATT and designated as #5 (SEQ ID NO: 31, FIG. 17). Using this DNA sequence, DMD gene-modified 4.5SH#5 was produced in the same manner as in Example 2. FIG. 17 schematically shows locations complementary to the exon of DMD exon 53 in each sequence.
  • TTTT transcription termination signal sequences
  • DMD gene-modified 4.5SH Modify the asSINEB1 recognition region sequence of the wild-type 4.5SH sequence to the DNA sequences shown in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 31 (each DNA sequence complementary to a part of DMD gene exon 53).
  • the resulting DNA fragments were synthesized to obtain four types of DMD gene-modified 4.5SH #1, #2, #3, or #5 expression plasmids shown in SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 32.
  • the DMD gene-modified 4.5SH expression plasmid and the minigene for detecting DMD gene exon skipping prepared in the same manner as in Example 2 were co-introduced into human cells (HEK293 cells) by lipofection.
  • all possible combinations of the DMD gene-modified 4.5SH expression plasmid and the minigene for detecting DMD gene exon skipping were co-introduced.
  • RT-PCR was performed using cDNA synthesized from RNA as a template and the primers (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27) that specifically amplify the minigene that were also used in Experimental Example 4. Table 4 shows the conditions for RT-PCR.
  • the second lane from the left shows a vector expressing wild-type 4.5SH RNA (same as the plasmid (pUC57) prepared when obtaining human 4.5SH expressing cells in Experimental Example 4) and DMD gene exon skipping. Shows the results of a sample co-introduced with a detection minigene.
  • a DNA fragment expressing the sequence of DMD genetically modified 4.5SH #6 was synthesized, and a DMD genetically modified 4.5SH expression plasmid expressing DMD genetically modified 4.5SH #6 shown in SEQ ID NO: 34 was obtained. Furthermore, a DMD genetically modified 4.5SH containing a sequence (SEQ ID NO: 35) in which the sequences of the polynucleotide (b) of DMD genetically modified 4.5SH#6 and the polynucleotide (b) of DMD genetically modified 4.5SH#5 are linked. #7 was designed, a DNA fragment expressing DMD genetically modified 4.5SH #7 was synthesized, and a DMD genetically modified 4.5SH expression plasmid expressing #7 shown in SEQ ID NO: 36 was obtained.
  • B1 type human DMD gene modification 4.5SH (comparative example)>
  • the B1 modified sequence was obtained by replacing the 4.5SH polynucleotide (a) of DMD gene-modified 4.5SH #7 with the sequence corresponding to the SINEB1 polynucleotide (a), which is a homologous sequence of 4.5SH.
  • a certain comparative example was designed, a DNA fragment expressing the sequence of the comparative example was synthesized, and a DMD gene-modified B1 modified 4.5SH expression plasmid expressing the comparative example shown in SEQ ID NO: 37 was obtained.
  • the DMD gene modified B1 modified 4.5SH expression plasmid obtained above and the minigene for detecting DMD gene exon skipping obtained in Example 2 were co-introduced into human cells (HEK293 cells) by lipofection. After culturing at 37°C for 24 hours, the cells were collected and RNA was extracted. RT-PCR was performed using cDNA synthesized from RNA as a template and primers (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27) that specifically amplify the minigene for detecting DMD gene exon skipping. Table 5 shows the conditions for RT-PCR.
  • the skipping efficiency of DMD exon 53 in the comparative example sequence was 5.06%, which was a significant decrease in skipping efficiency (6th lane from the left in FIG. 18).
  • the leftmost lane shows the results of a sample co-introduced with the plasmid (so-called empty vector) before 4.5SH introduction and the minigene for detecting DMD gene exon skipping
  • the second lane from the left shows the results of the sample co-introduced with the plasmid (so-called empty vector) before introduction of 4.5SH
  • the second lane from the left shows the results of the sample co-introduced with the plasmid (so-called empty vector) before introduction of 4.5SH.
  • .5SH RNA-expressing vector (same as the plasmid (pUC57) prepared when obtaining human 4.5SH-expressing cells in Experimental Example 4) and the minigene for DMD gene exon skipping detection are shown. There is. Since exon skipping does not occur in the DMD gene in vivo, the skipping efficiency is 0% in the control into which an empty vector has been introduced.
  • Example 3 MAPT gene modification 4.5SH
  • tau (MAPT) gene-modified 4.5SH was produced and exon skipping was investigated.
  • MAPT gene-modified 4.5SH expression plasmid shown in SEQ ID NO: 39 was obtained.
  • a reporter carrying the U6 promoter and the MAPT gene-modified 4.5SH sequence was produced, and the expression vector (pUC57) carrying the reporter was introduced into human cells (HEK293 cells) by liposome transfection.
  • Expression of MAPT gene-modified 4.5SH RNA was confirmed by Northern blotting (middle row, rightmost lane in FIG. 20), and MAPT gene-modified 4.5SH-expressing cells were obtained.
  • PCR a DNA fragment containing MAPT gene exon 9, exon 10, exon 11, etc. shown in SEQ ID NO: 40 (see Qingming Yu et al, (2004) J Neurochem, Jul;90(1):164-72 for details).
  • the PCR product was amplified, the PCR product was purified, and the mutation was inserted into the plasmid (pcDNA3 bamHI/xhoI) by Gibson assembly.
  • the obtained plasmid was transformed into E. coli.
  • the transformed Escherichia coli was spread on LB (ampicillin-containing) plates, colonies were formed at 37°C, and screening was performed.
  • the DNA sequence of a plasmid carried by ampicillin-resistant Escherichia coli was determined, and a minigene for detecting exon skipping of the MAPT gene was obtained.
  • the MAPT gene-modified 4.5SH expression plasmid and the minigene for MAPT gene exon skipping detection were co-introduced into human cells (HEK293 cells) by lipofection. After culturing at 37°C for 24 hours, the cells were collected and RNA was extracted. RT-PCR was performed using cDNA synthesized from RNA as a template and a reverse primer that binds to pcDNA3 shown in SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 and a forward primer that binds to MAPT gene exon 11. By using such a primer set, the MAPT gene endogenous to cells will not be amplified. Table 6 shows the conditions for RT-PCR.
  • the lane in the center of the electrophoretogram (second from the left) in Figure 19 shows the FAS-modified 4.5SH expression plasmid obtained in Example 1 coexpressed with the minigene for MAPT gene exon skipping detection in human cells, and the extracted RNA This is an electropherogram obtained by RT-PCR.
  • the exon skipping efficiency was 64.99%, which was significantly lower than the skipping efficiency when the MAPT gene-modified 4.5SH expression plasmid was expressed (Figure 194.5SH-asFAS).
  • the control on the left shows the results of a sample in which a plasmid before mutation introduction (so-called empty vector) and a minigene for MAPT gene exon skipping detection were co-introduced. It is known that the MAPT gene has an isoform containing exon 10 and an isoform not containing exon 10 in vivo, so the skipping efficiency of the control in which an empty vector was introduced is It is thought that it indicates a quantitative ratio.
  • an artificial RNA molecule comprising a rodent-specific non-coding RNA molecule sequence provides a technique for controlling gene expression through the regulation of mRNA splicing, thereby regulating mRNA splicing. It can be used to treat diseases that can be treated by

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Abstract

ｍＲＮＡスプライシングを調節する新たな技術を提供すること。 下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子。 （ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド （ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド

Description

人工ＲＮＡ分子
　本発明は、新規な人工ＲＮＡ分子に関し、とりわけｍＲＮＡのスプライシングを調節する人工ＲＮＡ分子、に関する。
　４．５ＳＨ　ＲＮＡは、齧歯目ネズミ亜目動物（Ｍｙｏｄｏｎｔａ　Ｃｌａｄｅ）特異的な非コードＲＮＡであり、塩基配列が同定されている（非特許文献１）。しかしながら、４．５ＳＨ　ＲＮＡの機能については解明されていない。
　他方、近年では遺伝子治療が関心を集めている。遺伝子治療としては、例えば、核酸医薬品や、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集を応用した技術が知られている。
　核酸医薬品としては、例えば、疾患の原因となる遺伝子のｍＲＮＡスプライシングを調節することで、神経疾患や筋疾患を治療するアンチセンス核酸医薬品が上市されている（例えば、特許文献１）。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集を応用した技術としては、例えば、疾患の原因となる遺伝子、具体的には疾患原因突然変異を有するβグロビン遺伝子などの発現を低下させ、対応する正常な状態の遺伝子の発現を増加させた患者由来の幹細胞を患者に移殖する技術等の開発が進んでいる（例えば、特許文献２）。
特開２０１４－５４２５０号公報 特開２０２１－１６６５１４号公報
Harada ,F and Kato, N.(1980) NAR.,8:1273-J285
　しかしながら、アンチセンス核酸医薬品は、一般的にその長さが１４～２５塩基程度であるため、標的遺伝子の中からｍＲＮＡスプライシング調節に効果的な箇所を探索するスクリーニングが必要であり、開発に時間と費用がかかる。また、半減期が短いために数週間から数か月おきに繰り返し投与しなければ薬効が保たれず、医療経済的に大きな負担となる。
　この課題を解決する方法の一つとして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集を応用した技術が挙げられる。ゲノム編集を応用した技術であれば、ゲノムに直接作用するので、効果を長く持続させることができる。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム発現ベクターとしては、安全性等の観点から、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が用いられることが多いが、Ｃａｓ９遺伝子は分子量が大きく、ＡＡＶに搭載しづらいという問題がある。
　上記のような状況から、アンチセンス核酸やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集とは異なる遺伝子発現を制御可能な新たな技術が必要とされている。
　そこで、本発明は、ｍＲＮＡスプライシングを調節する新たな技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、齧歯目ネズミ亜目動物特異的な非コードＲＮＡがｍＲＮＡスプライシングに関与することを見出した。そしてさらに検討を重ねて、上記齧歯目ネズミ亜目動物特異的な非コードＲＮＡの特定の配列の特徴的な二次構造が、スプライシング制御因子を呼び込む役割およびＲＮＡ分子を安定化する役割を果たし、この二次構造を、標的とするｍＲＮＡ前駆体に相補的な配列と組み合わせた人工ＲＮＡ分子を用いることにより、ｍＲＮＡスプライシングを調節でき、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
［１］下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子、
（ａ）下記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または下記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
（ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｎ1～Ｎ25は、それぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｎ1とＮ25とは、Ｎ2とＮ24とは、Ｎ3とＮ23とは、Ｎ4とＮ22とは、Ｎ5とＮ21とは、Ｎ6とＮ20とは、Ｎ8とＮ19とは、Ｎ9とＮ18とは、Ｎ10とＮ17とは、それぞれ塩基対を形成する。）、
［２］前記（ｂ）により標的化されたｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節する、上記［１］記載の人工ＲＮＡ分子、
［３］前記（ａ）の塩基配列が配列番号２で示された配列、または配列番号２で示された配列と配列同一性が８０％以上である配列である、上記［１］または［２］記載の人工ＲＮＡ分子、
［４］前記（ｂ）の長さが１５～３００塩基、より好ましくは２０～６０塩基である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の人工ＲＮＡ分子、
［５］前記標的配列がエクソン配列である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の人工ＲＮＡ分子、
［６］前記（ｂ）の３´側に下記（ｃ）が配置されてなる、上記［１］～［５］のいずれかに記載の人工ＲＮＡ分子、
（ｃ）末端の安定性に寄与する配列を含むポリヌクレオチド
［７］前記（ｃ）が、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列を含むポリヌクレオチドである、上記［６］記載の人工ＲＮＡ分子、
［８］前記（ａ）が、ｍＲＮＡスプライシングを制御するタンパク質に結合するポリヌクレオチドである、上記［１］～［７］のいずれかに記載の人工ＲＮＡ分子、
［９］前記標的配列が、ＦＡＳ遺伝子、ジストロフィン遺伝子、およびフクチン遺伝子から選択される遺伝子の一部の配列である、上記［１］～［８］のいずれかに記載の人工ＲＮＡ分子、
［１０］前記標的配列が、ＭＡＰＴ遺伝子の一部の配列である、上記［１］～［９］のいずれかに記載の人工ＲＮＡ分子、
［１１］上記［１］～［１０］のいずれかに記載の人工ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター、
［１２］ｍＲＮＡスプライシングを調節する方法であって、
（Ａ）下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子を準備する工程、
（ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
（ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド、および
（Ｂ）工程（Ａ）で準備した人工ＲＮＡ分子をｍＲＮＡ前駆体に接触させ、人工ＲＮＡ分子とｍＲＮＡ前駆体との間に相補鎖を形成させ、それによりｍＲＮＡスプライシングが調節される工程
を含む、方法、
［１３］前記ｍＲＮＡのスプライシングの調節が、エクソンスキッピングによるものである、上記［１２］記載の方法、
［１４］前記（ａ）の塩基配列が配列番号２で示された配列、または配列番号２で示された配列と配列同一性が８０％以上である配列である、上記［１２］または［１３］記載の方法、
［１５］前記（ｂ）の長さが１５～３００塩基、より好ましくは２０～６０塩基である、上記［１２］～［１４］のいずれかに記載の方法、
［１６］標的配列がエクソン配列である、上記［１２］～［１５］のいずれかに記載の方法、
［１７］前記人工ＲＮＡ分子が、前記（ｂ）の３´側にＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列を含むポリヌクレオチドが配置されてなる、上記［１２］～［１６］のいずれかに記載の方法、
［１８］成熟ｍＲＮＡの産生方法であって、
（Ａ）下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子を準備する工程、
（ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
（ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド
（Ｂ’）工程（Ａ）で準備した人工ＲＮＡ分子をｍＲＮＡ前駆体に接触させ、人工ＲＮＡ分子とｍＲＮＡ前駆体との間に相補鎖を形成させる工程、および
（Ｃ）工程（Ｂ’）によりｍＲＮＡスプライシングが調節されて、成熟ｍＲＮＡが産生される工程
を含む、方法、
［１９］前記ｍＲＮＡのスプライシングの調節が、エクソンスキッピングによるものである、上記［１８］記載の方法、
［２０］前記（ａ）の塩基配列が配列番号２で示された配列、または配列番号２で示された配列と配列同一性が８０％以上である配列である、上記［１８］または［１９］記載の方法、
［２１］前記（ｂ）の長さが１５～３００塩基、より好ましくは２０～６０塩基である、上記［１８］～［２０］のいずれかに記載の方法、
［２２］標的配列がエクソン配列である、上記［１８］～［２１］のいずれかに記載の方法、ならびに
［２３］前記人工ＲＮＡ分子が、前記（ｂ）の３´側にＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列を含むポリヌクレオチドが配置されてなる、上記［１８］～［２２］のいずれかに記載の方法、
に関する。
　本発明によれば、特徴的な二次構造と標的とするｍＲＮＡ前駆体に相補的な配列とを組み合わせた人工ＲＮＡ分子、およびその人工ＲＮＡ分子を用いた方法により、従来技術とは異なるｍＲＮＡスプライシングを調節する新たな技術が提供される。
二次構造予測プログラムＲＮＡｆоｌｄにより予測された４．５ＳＨ　ＲＮＡの二次構造の一部を示す模式図である。 野生型および４．５ＳＨノックアウトマウスにおいてａｓＳＩＮＥＢ１をもつ３つの遺伝子をそれぞれ特異的に増幅するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した際の泳動図である。左から順にＳｍｃｈｄ１、Ｓｌｃ２５ａ４０、Ｓｍｇ６の結果である。左の模式図で示すマーカーは、上段が灰色の新規エクソンを含むｍＲＮＡを示し、下段が新規エクソンを含まないｍＲＮＡを示す。問題とするエクソンを灰色に、その両側を黒色および白色で表したものである。 Ｕ６プロモーターおよびマウス４．５ＳＨの配列を搭載したレポーターの模式図である。レポーターの５´側から順にＵ６プロモーター配列、４．５ＳＨ配列が配置されている。 図３に図示したプロモーターを導入・発現したことにより、ヒト細胞において４．５ＳＨ　ＲＮＡが発現していることをノザンブロッティング法により確認した結果を示す泳動図である。 ヒト４．５ＳＨ発現細胞に、ａｓＳＩＮＥＢ１をもつ２つの遺伝子をそれぞれ組み込んだミニジーンを導入し、それぞれを特異的に増幅するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した際の泳動図である。左から順にＳｌｃ２５ａ４０、Ｓｍｇ６の結果である。左の模式図で示すマーカーは、上段が灰色の新規エクソンを含むｍＲＮＡを示し、下段が新規エクソンを含まないｍＲＮＡを示す。 図５の泳動図から求めたスキッピング効率を示す棒グラフである。左にＳｌｃ２５ａ４０、右にＳｍｇ６の結果を表す。 上から順に、４．５ＳＨの野生型（ＷＴ）、Ｓｌｃ２５ａ４０の野生型（ＷＴ）、４．５ＳＨの変異型（ＭＵＴ）、Ｓｌｃ２５ａ４０の変異型（ＭＵＴ）を発現するプラスミドのＤＮＡ塩基配列の一部である。ＷＴとＭＵＴで塩基が異なる部分を灰色で示す。 変異型プラスミドおよび野生型プラスミドをヒト細胞に導入し、それぞれを特異的に増幅するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した際の泳動図である。 図８の泳動図から求めたスキッピング効率を示す棒グラフである。左から順にＳｌｃ２５ａ４０野生型のみ、野生型同士、Ｓｌｃ２５ａ４０変異型と４．５ＳＨ野生型、Ｓｌｃ２５ａ４０野生型と４．５ＳＨ変異型、変異型同士、を示す。 Ｂ１改変４．５ＳＨ（ＳＬ－Ｂ１－４．５ＳＨ）のエクソンスキッピング効率を示す図である。上から順に、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図、ノザンブロッティング法によりＲＮＡの発現を確認した結果を示す泳動図、エクソンスキッピング効率を示す棒グラフである。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図の左の模式図で示すマーカーは、上段がＳｌｃ２５ａ４０新規エクソン（エクソン８．５）を含むｍＲＮＡを示し、下段がＳｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含まないｍＲＮＡを示す。 ＦＡＳ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンと野生型４．５ＳＨまたはＦＡＳ改変４．５ＳＨを共発現させた際の泳動図である。 Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンと野生型４．５ＳＨまたはＦＡＳ改変４．５ＳＨを共発現させた際の泳動図である。 図１１および図１２の泳動図から求めたスキッピング効率を示す棒グラフである。 ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨの標的配列の模式図である。 ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンとＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨを共発現させた際の泳動図である。左の模式図で示すマーカーは、上段が灰色のＤＭＤエクソン５３を含むｍＲＮＡを示し、下段がＤＭＤエクソン５３を含まないｍＲＮＡを示す。 ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンとＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨを共発現させた際のＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図である。上の模式図は、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨのＤＭＤエクソン５３への標的化を説明する模式図である。左の模式図で示すマーカーは、上段がＤＭＤエクソン５３を含むｍＲＮＡを示し、下段がＤＭＤエクソン５３を含まないｍＲＮＡを示す。 ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨの標的配列の模式図である。 ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンとＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨを共発現させた際の結果を示す図である。上から、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図、ノザンブロッティング法によりＲＮＡの発現を確認した結果を示す泳動図、エクソンスキッピング効率を示す棒グラフである。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図の左の模式図で示すマーカーは、上段がＤＭＤエクソン５３を含むｍＲＮＡを示し、下段がＤＭＤエクソン５３を含まないｍＲＮＡを示す。 ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨのエクソンスキッピング効率を示す図である。上から順にＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨのＭＡＰＴエクソン１０への標的化を説明する模式図、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図、ノザンブロッティング法によりＲＮＡの発現を確認した結果を示す泳動図、エクソンスキッピング効率を示す棒グラフである。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによる泳動図の左の模式図で示すマーカーは、上段がＭＡＰＴエクソン１０を含むｍＲＮＡを示し、下段がＭＡＰＴエクソン１０を含まないｍＲＮＡを示す。
　理論に拘束されることは意図しないが、本発明の効果が発揮されるメカニズムとしては、例えば以下のように考えられる。
　本発明の人工ＲＮＡ分子においては、（ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ａ））が、強固なステムループ構造を形成し、そのステムループ構造にスプライシング制御因子が結合し、（ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ｂ））によって、ｍＲＮＡ前駆体内の標的配列に結合する。そしてポリヌクレオチド（ａ）に結合したスプライシング制御因子がスプライシング反応に対して抑制的または促進的に作動することによって、標的配列を含む部分、例えばエクソンがｍＲＮＡスプライシングに際してスキップまたはインクルージョンされる。
＜定義＞
　本明細書において、「人工ＲＮＡ分子」とは、自然界には存在しないＲＮＡ分子を意図する表現であり、本発明のポリヌクレオチド（ａ）およびポリヌクレオチド（ｂ）を含む人工ＲＮＡ分子に該当する人工的に作製されたＲＮＡ分子であっても、その分子全体の配列がそのまま天然に存在する場合は本発明の人工ＲＮＡ分子には含まれないものとする。
　本明細書において、「ｍＲＮＡ前駆体」とは、細胞核内でＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼ酵素により転写された、ｍＲＮＡスプライシングを受ける前のＲＮＡをいう。
　本明細書において、「ｍＲＮＡスプライシング」とは、ｍＲＮＡ前駆体からイントロンが取り除かれ、ｍＲＮＡ前駆体から成熟ｍＲＮＡが作られる工程をいう。また、単に「スプライシング」という場合も同様である。
　本明細書において、「エクソン」とは、成熟ｍＲＮＡに含まれる配列をいう。当業者であれば、ソフトウェアを実装したコンピューターによって、例えば、Ensembl, National Center for Bio-technology Information（ＮＣＢＩ）、ＧｅｎＢａｎｋまたは他のＮＣＢＩデータベースなどの公的にアクセス可能なデータベースからエクソンの注釈付きの配列を入手し得る。具体的には、例えば、ヒト遺伝子に関していえば、当業者は以下のＮＣＢＩ検索クエリー：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=Homo+sapiens[Orgn]から遺伝子を選択し得る。あるいは、当業者はＥｎｓｅｍｂｌデータベース（http://www.ensembl.org）でゲノムを閲覧し、エクソンに関する情報を入手することができる。
　本明細書において、「イントロン」とは、成熟ｍＲＮＡに含まれない配列をいう。上記「エクソン」の場合と同様に、当業者であれば、ソフトウェアを実装したコンピューターによって、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋまたは他のＮＣＢＩデータベースなどの公的にアクセス可能なデータベースからのイントロンの注釈付きの配列を入手し得る。
　本明細書において、「選択的スプライシング」とは、特定のエクソンを取り除いて行われるスプライシングをいう。
　本明細書において、「塩基対結合」とは、ヌクレオチドのアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（もしくはウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）が水素結合する、いわゆるワトソンクリック型の塩基対結合だけではなく、ＧとＵ、イノシン（Ｉ）とＵ、ＩとＡなどのゆらぎ塩基対結合も含む。
　本明細書において、「エクソン化」とは、本来イントロンである配列が、ｍＲＮＡスプライシングが調節された結果、成熟ｍＲＮＡに含まれることをいう。
　本明細書において、「新規エクソン」とは、エクソン化により生じた本来イントロンであった配列をいう。
　本明細書において、「ステムループ構造」とは、１本の核酸分子内に形成される二次構造であって、核酸分子自身でホールディングしたヌクレオチド配列により形成される構造をいう。ステムループ構造は、同一分子に含まれる３´末端側に位置する塩基配列と５´末端側に位置する塩基配列とが、塩基対結合を形成することによって生み出されるステム領域と、ステム領域を構成する３´末端側に位置する塩基配列と５´末端側に位置する塩基配列との間に位置する塩基配列によるループ構造の領域からなる。当業者であれば、ステムループ構造を形成することおよびステムループ構造の強さは、熱力学的なシミュレーションとしては、ＲＮＡ Ｆｏｌｄ（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）等の二次構造予測プログラムによって、実験的手法としては、ＲＮＡフットプリントアッセイ、核酸分子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）および結晶構造解析によって確認することができる。
　ステムループ構造の強さは、二次構造の安定性を示す指標である最小自由エネルギー（ＭＦＥ：minimum free energy）によって評価することができる。ＭＦＥの値が小さいほど、二次構造が安定であり、ステムループ構造が強固であることを示す。ＭＦＥは、ＲＮＡ　Ｆｏｌｄ（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）等の二次構造予測プログラムによって計算することができる。
　本明細書において、「エクソンスキッピング」とは、本来存在する特定のエクソンを含有しない成熟ｍＲＮＡが生じる選択的スプライシングの一態様のことをいう。
　本明細書において、「エクソンスキッピング効率」は、エクソンがスキップしたバンドのポリヌクレオチド量（Ｘ）およびそのヌクレオチドの長さ（ＬX）と、エクソンがスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量（Ｙ）およびそのヌクレオチドの長さ（ＬY）から、以下の式により計算することができる。
スキッピング効率（％）＝｛Ｘ／ＬX÷（Ｘ／ＬX＋Ｙ／ＬY）｝×１００
　第一の実施態様において、本発明は、下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子（本発明の人工ＲＮＡ分子ともいう）を提供する。
（ａ）上記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または上記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
（ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド
　以下、本明細書では、（ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または下記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドを単に「ポリヌクレオチド（ａ）」、（ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチドを単に「ポリヌクレオチド（ｂ）」、後述の（ｃ）末端の安定性に寄与する配列を含むポリヌクレオチドを単に「ポリヌクレオチド（ｃ）」という場合がある。
＜ポリヌクレオチド（ａ）＞
　ポリヌクレオチド（ａ）は、下記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または下記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｎ1～Ｎ25は、それぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｎ1とＮ25とは、Ｎ2とＮ24とは、Ｎ3とＮ23とは、Ｎ4とＮ22とは、Ｎ5とＮ21とは、Ｎ6とＮ20とは、Ｎ8とＮ19とは、Ｎ9とＮ18とは、Ｎ10とＮ17とは、それぞれ塩基対を形成する。）
　ポリヌクレオチド（ａ）は、生理条件下で安定に存在する二次構造として、式（Ｉ）で示されるように、Ｎ1～Ｎ25に係る強固なステムループ構造を形成する。
　Ｎ1～Ｎ25は、１本のＲＮＡ分子内において塩基対結合し、強固なステムループ構造を形成するために、Ｎ1～Ｎ10およびＮ17～Ｎ25が、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）またはＧとウラシル（Ｕ）に富むことが好ましい。Ｎ1とＮ25、Ｎ2とＮ24、Ｎ3とＮ23、Ｎ4とＮ22、Ｎ5とＮ21、Ｎ6とＮ20、Ｎ8とＮ19、Ｎ9とＮ18、およびＮ10とＮ17に形成される９個の塩基対結合はＧとＣまたはＧとＵによるものであることが好ましい。この９個の塩基対結合のうち、ＧとＣまたはＧとＵによる塩基対結合が５～９個であることが好ましく、６～９個であることがより好ましく、７～９個であることがさらに好ましく、８～９個であることがさらに好ましく、５～８個であることがさらに好ましく、６～８個であることがさらに好ましく、７～８個であることが特に好ましく、８個であることが最も好ましい。Ｎ11～Ｎ16は、ループ構造を形成するために、ＲＹＲＲＹＲであることが好ましい。ここで、Ｒはプリン塩基（ＡまたはＧ）、Ｙはピリミジン塩基（ＣまたはＵ）を表す。
　式（Ｉ）に示されるＮ25より３´側の７個の塩基は、ステムループ構造を形成する塩基である必要はなく、１～３個の塩基が置換、欠失または付加されてもよい。塩基の置換、欠失または付加は、式（Ｉ）に示される７個の塩基のうちどの塩基になされていてもよく、１～２個が好ましく、１個がより好ましい。置換の場合には、プリン塩基はプリン塩基同士、ピリミジン塩基はピリミジン塩基同士で置換されていることが好ましい。付加の場合には、特に、３´末端のＵに塩基が付加されていることが好ましい。
　ポリヌクレオチド（ａ）の配列（一次構造）は、式（Ｉ）で示される二次構造を潜在的に有する塩基配列であれば特に制限されるものではないが、配列番号２で示された配列または配列番号２で示された配列に８０％以上の配列同一性を有する配列を含むことが好ましい。配列番号２で示された配列は、ＧおよびＣに富み、後述するように式（Ｉ）に示す強固なステムループ構造を形成し得る（図１）。
　ポリヌクレオチド（ａ）は、配列番号２で示された配列との配列同一性が８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９２％以上であることが特に好ましく、９５％以上であることが最も好ましい。
　ポリヌクレオチド（ａ）のステムループ構造のＭＦＥは、－１０．００ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下が好ましく、－１１．００ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下がより好ましく、－１２．００ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下がさらに好ましく、－１２．８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下が特に好ましく、－１２．９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下が最も好ましい。ステムループ構造の強さが上記の範囲であることにより、ＲＮＡ分子が安定化すると考えられる。
　ステムループ構造のＭＦＥは、ステム領域の塩基対結合の数（相補鎖の長さ）、ミスマッチまたはバルジの塩基の数、ループ構造を形成する塩基の数等によって変化し得る。
　ポリヌクレオチド（ａ）は、上述のようにステムループ構造とそれに続く３´側塩基を含むことにより、人工ＲＮＡ分子の安定化に寄与すると考えられる。また、ポリヌクレオチド（ａ）は、スプライシング制御因子を呼び込む役割を果たすと考えられる。
　本明細書において、「スプライシング制御因子」とは、生体内に存在するｍＲＮＡスプライシングを制御する因子全てを意図する表現であり、具体的にはｍＲＮＡスプライシングを制御するタンパク質や核酸が挙げられ、タンパク質とＲＮＡの複合体なども含む。
　ポリヌクレオチド（ａ）には、スプライシング制御因子を呼び込み、スプライシング制御因子と結合する機能があると考えられる。ポリヌクレオチド（ａ）に結合するスプライシング制御因子により、本発明の人工ＲＮＡ分子がｍＲＮＡスプライシングにおいてどのような調節を行うのか、つまりどのような選択的スプライシングが行われるのかが決定される。
　ポリヌクレオチド（ａ）に結合するスプライシング制御因子としては、より詳しくは、核内低分子ＲＮＡ　Ｕ２複合体を構成するタンパク質、およびその結合タンパク質などが挙げられる。さらに具体的には、ＳＦ３ｂ１、Ｕ２ＡＦ２、Ｎｏｎｏ、Ｓｆｐｑ、Ｈｎｒｎｐｆなどが挙げられる。また、質量分析の結果から、Ｈｎｒｎｐｍ、Ｈｎｒｎｐａ１、Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１、Ｄｄｘ５、Ｈｎｒｎｐａ３、Ｆｕｓ、Ｈｎｒｎｐａ０、Ｐａｂｐｃ１、Ｓｎｒｐａ、Ｄｈｘ９、Ｍｙｅｆ２、Ｄｄｘ１７、Ｈｎｒｎｐｈ１、Ｐｒｐｆ８、Ｒｐｓ３ａ、Ｒｂｍ１４などが結合すると推認される。
　これらスプライシング制御因子の機能としては、スプライシング反応を可能にするのに必要なスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列などの配列を抑制する機能、またはエクソン包含シグナルを抑制する機能、イントロン配列の正確な認識に関わる機能などが知られている。
　ポリヌクレオチド（ａ）の具体例としては、齧歯目ネズミ亜目動物に特異的な非コードＲＮＡである、４．５ＳＨ　ＲＮＡ（以下、４．５ＳＨともいう）から発見された配列（配列番号２）が挙げられる。４．５ＳＨおいて、配列番号２で示された配列は、生理条件下で安定に存在する二次構造としてステムループ構造を形成し、スプライシング制御因子を呼び込み、４．５ＳＨが標的とするｍＲＮＡ前駆体の配列のｍＲＮＡスプライシングの調節において必須の配列であることが見出された。４．５ＳＨが標的とする配列やそのｍＲＮＡスプライシングの調節については後述する。なお、４．５ＳＨは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ酵素（ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素）によってＤＮＡから転写される。
　４．５ＳＨにおけるポリヌクレオチド（ａ）に相当する配列は、標的とする配列と相補鎖を形成することはないため、ｍＲＮＡスプライシング抑制因子を呼び込み、イントロンの正確な認識を阻害していると考えられる。また、配列番号２に示された配列は、式（Ｉ）および図１に示すように、強固なステムループ構造を形成する点から、４．５ＳＨ全体の安定性にも寄与していると考えられる。
　以下、本発明におけるポリヌクレオチド（ａ）について、その具体例である配列番号２で示された配列を例に、図面を参照して説明する。
　図１は、ＲＮＡ　Ｆｏｌｄ（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）において予測された４．５ＳＨにおける配列番号２で示された配列の部分の二次構造を示す図である。図１において、ステムループ構造の末端であるＧが上記式（Ｉ）における５´末端の塩基に相当する。
　本明細書において、「Ｘ番目の塩基」とは、５´側から数えてＸ番目の塩基であることを意味する。図１において、４．５ＳＨにおける配列番号２で示された配列は、１番目のＧと２５番目のＵが塩基対結合し、２番目のＣと２４番目のＧが塩基対結合し、３番目のＣと２３番目のＧが塩基対結合し、４番目のＧと２２番目のＣが塩基対結合し、５番目のＧと２１番目のＣが塩基対結合し、６番目のＵと２０番目のＧが塩基対結合し、８番目のＧと１９番目のＣが塩基対結合し、９番目のＵと１８番目のＡが塩基対結合し、１０番目のＧと１７番目のＣが塩基対結合することによって、ステム領域を形成している。１１番目から１６番目の塩基は、塩基対結合を形成する相手の存在しない塩基であり、ループ構造を形成する。
　図１において、２６番目のＡから３２番目のＵは、ステムループ構造を形成する塩基ではない。また、４．５ＳＨにおいて、配列番号２で示す配列のうち２６番目のＡから３２番目のＵの塩基は、ステムループ構造を形成する塩基ではなく、後述する４．５ＳＨの標的とする配列と相補鎖を形成する塩基でもない。
＜ポリヌクレオチド（ｂ）＞
　ポリヌクレオチド（ｂ）は、ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド（ｂ）には、標的配列に応じて、任意の配列を設計することができる。
　ポリヌクレオチド（ｂ）は、ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含む。すなわち、ポリヌクレオチド（ｂ）は標的配列と相補鎖を形成する。相補鎖の形成には、２本の核酸分子が完全に（１００％の）相補的である必要はない。
　相補的な配列とは、２本の核酸分子同士が塩基対結合により相補するための配列をいう。例えば８０～１００％の相補性を有する配列（例えば５塩基中４塩基または５塩基が相補的である配列）、あるいは９０～１００％の同一性を有する配列（例えば１０塩基中９塩基または１０塩基が相補的である配列）であればよい。
　ポリヌクレオチド（ｂ）と標的配列との塩基配列の相補性は８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
　ポリヌクレオチド（ｂ）の塩基長は、標的配列との相補鎖の安定性の観点および標的配列との相補鎖の特異性の観点から、１５塩基以上が好ましく、２０塩基以上がより好ましく、４０塩基以上がさらに好ましく、５０塩基以上が特に好ましい。また、ポリヌクレオチド（ｂ）の塩基長は、人工ＲＮＡ分子の合成のしやすさの観点から、３００塩基以下が好ましく、２００塩基以下がより好ましく、１００塩基以下がさらに好ましく、８０塩基以下が特に好ましく、６０塩基以下が最も好ましい。
　ポリヌクレオチド（ｂ）と標的配列との相補鎖の安定性は、上記の塩基配列の相補性だけではなく、塩基同士の水素結合の数（例えばＧとＣの対の方がＡとＵの対よりも水素結合の数が多い）や、相補的でない配列の位置（相補鎖の中央であるか末端であるか等）にもよっても変化し得る。
　ポリヌクレオチド（ｂ）の標的配列としては、ｍＲＮＡスプライシングを調節する標的となるｍＲＮＡ前駆体の一部の塩基配列であれば特に制限されるものではないが、成熟ｍＲＮＡにおけるその存在または不存在によってｍＲＮＡがコードするタンパク質の機能が変化するエクソンに係るエクソン配列であることが好ましい。この際、エクソン配列とは、標的とするエクソンの長さによって、エクソンの全塩基配列であってもエクソンの一部の塩基配列であってもよい。また、ポリヌクレオチド（ｂ）の標的配列としては、エクソン配列に加えてエクソンの上流（５´側）または下流（３´側）の３００塩基内にある、イントロンの配列の一部を含んでもよく、エクソン配列を含まない上記イントロンの配列の一部のみであってもよい。
　ポリヌクレオチド（ｂ）は、複数の標的配列にそれぞれ相補する複数の配列を含んでもよい。そのような複数の標的配列は、同一のエクソンおよびその上流または下流の３００塩基を含む範囲の領域から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
　標的配列がエクソン配列であって、そのエクソン配列がエクソンの平均長（約１５０塩基）以上である場合には、ポリヌクレオチド（ｂ）は、複数の標的配列にそれぞれ相補する複数の配列を含むことが好ましい。そのような場合には、ポリヌクレオチド（ｂ）の塩基長は６０塩基以上が好ましく、９０塩基以上がより好ましく、１００塩基以上がさらに好ましい。また、４００塩基以下が好ましく、３００塩基以下がより好ましい。
＜ポリヌクレオチド（ｃ）＞
　本発明の人工ＲＮＡ分子は、上述したポリヌクレオチド（ａ）およびポリヌクレオチド（ｂ）に加えて、末端の安定性に寄与する配列を含むポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ｃ））を含むことが好ましく、このポリヌクレオチド（ｃ）はポリヌクレオチド（ｂ）の３´側に配置されることが好ましい。
　ポリヌクレオチド（ｃ）は、本発明の人工ＲＮＡ分子が非コードＲＮＡとして機能するために、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましい。ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列は、ウラシル（Ｕ）が７以上連結した配列である。
　ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列は、ＤＮＡから非コードＲＮＡが転写されるときに転写を終結するシグナルとして機能するだけではなく、非コードＲＮＡ全体の安定化にも寄与する場合がある。ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列以外にも、非コードＲＮＡの３´末端の構造は、非コードＲＮＡ全体の安定化にも寄与する場合がある（Trends in Genetics, 2007 Dec; vol23: 614-622、Biochim Biophys Acta. 2013 Mar; 1829(3-4): 318-330など参照）。非コードＲＮＡの３´末端の構造としては、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列の上流にｍｉＲＮＡの配列や自己切断型リボザイムがコードされている場合などもある（Trends in Genetics, 2007 Dec; vol23: 614-622、Biochim Biophys Acta. 2013 Mar; 1829(3-4): 318-330など参照）。
＜人工ＲＮＡ分子＞
　本発明の人工ＲＮＡ分子は、ポリヌクレオチド（ｂ）により標的化されたｍＲＮＡ前駆体のｍＲＮＡスプライシングを調節する。ｍＲＮＡスプライシングの調節には、イントロン保持および選択的スプライシングの修正が挙げられ、このうち選択的スプライシングの修正が好ましい。選択的スプライシングの修正には、エクソンのインクリュージョン誘導またはエクソンのスキッピング（エクソンスキッピング）誘導が挙げられる。このうち、４．５ＳＨの機能が、エクソンスキッピングによる新規エクソン化の抑制であることから、エクソンスキッピングの誘導であることが好ましい。
　本発明において、少なくとも１つのポリヌクレオチド（ａ）と少なくとも１つのポリヌクレオチド（ｂ）は、５´側から３´側にこの順に配置されてなる。また、ポリヌクレオチド（ｃ）を含む場合には、ポリヌクレオチド（ｃ）はポリヌクレオチド（ａ）およびポリヌクレオチド（ｂ）の３´側に配置される。
　ポリヌクレオチド（ａ）、ポリヌクレオチド（ｂ）およびポリヌクレオチド（ｃ）は、それぞれ２つ以上を配置してもよく、１つずつ配置してもよい。ポリヌクレオチド（ａ）は、ｍＲＮＡスプライシングの調節に必須の配列であるため、ポリヌクレオチド（ａ）を２つ以上配置すると本発明の効果がさらに発揮される可能性がある。ポリヌクレオチド（ａ）を２つ以上配置する場合、式（Ｉ）で示される少なくとも２つの構造は、多分岐ループを介して配置されてもよい。また、ポリヌクレオチド（ａ）は、３つ以上配置してもさらなる効果の増大は期待し難く、人工ＲＮＡ分子の安定性の観点からも、３つ以下とすることが好ましい。ポリヌクレオチド（ａ）を２つ以上配置する場合、２つ目のポリヌクレオチド（ａ）は、ポリヌクレオチド（ｂ）の３´側に配置されることが好ましい。
　ポリヌクレオチド（ａ）、ポリヌクレオチド（ｂ）およびポリヌクレオチド（ｃ）の間にはそれぞれスペーサーが存在していても良く、スペーサーが存在していなくても良い。スペーサーが存在する場合のスペーサーの塩基長は、例えば２００塩基以下、１５０塩基以下、１００塩基以下、５０塩基以下、４０塩基以下、３０塩基以下とすることができる。
　本発明の人工ＲＮＡ分子中の核酸は、天然型であっても修飾核酸であってもよい。修飾核酸としては、例えば、ヌクレアーゼおよび加水分解への耐性を高める等の観点から、リボースの２´位のＯＨ基をＦ基やＯＭｅ基に置換した核酸や、ホスホロチオエート核酸、モルフォリノ核酸、架橋型核酸（ＬＮＡ）等を含んでいても良い。また、細胞毒性を低減させる等の観点から、ウリジン（Ｕ）に替えて、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（Ｎ１ｍΨ）等を含んでいても良い。修飾核酸の位置は、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
＜５´末端＞
　本発明の人工ＲＮＡ分子の５´末端には、分子を安定化させるために、遺伝子工学的に汎用される構造を付加することができる。例えば、三リン酸が付加していてもよく、キャップ構造が付加していてもよい。
＜３´末端＞
　本発明の人工ＲＮＡ分子の３´末端には、分子を安定化させるために、遺伝子工学的に汎用される構造を付加することができる。例えば、リン酸基が付加していてもよい。
＜その他の配列＞
　本発明のＲＮＡ分子は、上記ポリヌクレオチド（ａ）、ポリヌクレオチド（ｂ）およびポリヌクレオチド（ｃ）以外のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。その他の配列としては、例えば、遺伝子発現や薬物送達のためのポリヌクレオチドなどが挙げられる。より具体的には、例えば、発現ベクターのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド、発現ベクターの転写終結配列を含むポリヌクレオチド、ＲＮＡヌクレアーゼ酵素による分解を回避するための配列を含むポリヌクレオチド、スプライシング制御因子に親和性をもつ配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
＜標的遺伝子＞
　本発明の人工ＲＮＡ分子は、ポリヌクレオチド（ｂ）によりｍＲＮＡ前駆体を標的化し、それによりｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節することにより、結果として翻訳、発現される遺伝子（標的遺伝子）の制御を可能とする。このような標的遺伝子としては、例えば、ＦＡＳ遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子、フクチン遺伝子（ＦＫＴＮ）、サバイバル運動ニューロン（ＳＭＮ）２遺伝子、ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、タイチン遺伝子（ＴＴＮ）、Ｃ１－ＩＮＨ遺伝子（ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子）、アイシャットホモログ（ＥＹＳ）遺伝子、ハンチントン遺伝子（ＨＴＴ）等が挙げられる。標的遺伝子としては、選択的スプライシングにより単一の遺伝子から複数のアイソフォームが形成されることが知られている遺伝子であってもよく、一般に生体内ではアイソフォームが確認されていない遺伝子であってもよい。ここで、選択的スプライシングにより単一の遺伝子から複数のアイソフォームが形成されることが知られている遺伝子としては、例えば、ＦＡＳ遺伝子やタウ（ＭＡＰＴ）遺伝子が挙げられる。一般に生体内ではアイソフォームが確認されていない遺伝子としては、例えば、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）やフクチン遺伝子（ＦＫＴＮ）が挙げられる。
＜発現ベクター＞
　本発明においては、上述の本発明の人工ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターも提供される。このような発現ベクターを用いることにより、本発明の人工ＲＮＡをｉｎ　ｖｉｖоで発現させ、標的遺伝子のｍＲＮＡスプライシングの調節に利用することができる。
　発現ベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター、コスミドなどが挙げられる。
　プラスミドとしては、ＰＣＤＮＡ３、ＰＣＤＮＡ５ＦＲＴ／ＴＯ等が挙げられる。
　ウイルスベクターとは、ウイルスゲノムを含む１つまたは複数の核酸配列に基づくベクターである。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。
　本発明において、発現ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合には、ＡＡＶベクターなどのパルボウイルスベクターが好ましい。パルボウイルスは、一本鎖ＤＮＡゲノムを有する小型ウイルスである。ＡＡＶは、パルボウイルスファミリーに属する。
　発現ベクターが有する発現プロモーターとしては、本発明の人工ＲＮＡ分子がＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素によって転写されるため、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素のプロモーターであればよく、具体的には、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等が挙げられ、なかでもＵ６プロモーターが好ましい。
　本発明の人工ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターは、本発明の人工ＲＮＡ分子、および発現プロモーターやプラスミド等の発現ベクター全てを化学的に合成して得ることもできるし、本発明の人工ＲＮＡ分子と発現プロモーターを化学的または生化学的に合成し、ウイルスやプラスミド等の発現ベクターに組み換えて得ることもできる。
　本発明の人工ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むように発現ベクターを組み換える方法としては、分子生物学的に一般的な方法が用いられる。例えば、制限酵素とリガーゼを用いた方法、もしくはギブソン・アセンブリを用いた方法がある。
　第二の実施態様において、本発明は、ｍＲＮＡスプライシングを調節する方法であって、
（Ａ）下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子を準備する工程、
（ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
（ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド、および
（Ｂ）工程（Ａ）で準備した人工ＲＮＡ分子をｍＲＮＡ前駆体に接触させ、人工ＲＮＡ分子とｍＲＮＡ前駆体との間に相補鎖を形成させ、それによりｍＲＮＡスプライシングが調節される工程を含む、方法（本発明の調節方法ともいう。）が提供される。
＜工程（Ａ）＞
　工程（Ａ）は、人工ＲＮＡ分子を準備する工程である。本発明の人工ＲＮＡ分子を準備する工程としては、ＲＮＡ分子を化学的に合成する方法や、生化学的な手法によって合成する方法など、特に制限されない。化学的に合成する方法としては、ホスホロアミタイド法やその改良法、Ｈ－ホスホネート法やその改良法等が挙げられる。生化学的な手法によって合成する方法としては、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写システムによりＲＮＡ分子を合成する方法（酵素合成法）などが挙げられる。また、委託製造された人工ＲＮＡを本発明に適応することもできる。
＜工程（Ｂ）＞
　工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で準備した人工ＲＮＡ分子をｍＲＮＡ前駆体に接触させ、人工ＲＮＡ分子とｍＲＮＡ前駆体との間に相補鎖を形成させ、それによりｍＲＮＡスプライシングが調節される工程である。人工ＲＮＡ分子を標的となるｍＲＮＡ前駆体に接触させる方法としては、人工ＲＮＡ分子を生体外で細胞に導入する方法や、人工ＲＮＡ分子を生体に投与する方法など、本技術分野における通常の方法を用いることができる。
　人工ＲＮＡ分子を生体外で細胞に導入する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、リバーストランスフェクション法等を用いることができる。
　ここで、ｍＲＮＡスプライシングは、通常、２段階メカニズムにより進行する。第一段階において、５´スプライシング部位が分裂され、遊離５´エクソンおよび投げ縄型中間体が生成される。第二段階において、この５´エクソンは、投げ縄（ラリアット）型生成物としてのイントロンの放出を伴い５´エクソンに結合する。これらの反応は、スプライソソームにより触媒される（Moore,M.J., P.A.Sharp (1993) Nature,365:364～368など参照）。
　ｍＲＮＡスプライシングがどのように調節されるのかは、ポリヌクレオチド（ａ）が呼び込むスプライシング制御因子の種類や、ポリヌクレオチド（ｂ）が標的化する標的配列などに依存する。
　ｍＲＮＡスプライシングを調節する方法としては、具体的には、イントロン保持を誘導する方法および選択的スプライシングを修正する方法などが挙げられるが、選択的スプライシングを修正する方法であることが好ましい。選択的スプライシングを修正する方法には、エクソンのインクリュージョンを誘導する方法またはエクソンのスキッピング（エクソンスキッピング）を誘導する方法などが含まれ、エクソンスキッピングを誘導する方法であることが好ましい。
　ｍＲＮＡスプライシングが調節されたことの確認は、ＲＴ－ＰＣＲ等によってすることができる。具体的には、本発明の人工ＲＮＡ分子を導入した細胞や組織から全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを取得することによりｍＲＮＡを精製し、標的配列を特異的に増幅するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、標的配列のスプライシングが調節された成熟ｍＲＮＡが取得されたことが確認できる。
　第三の実施態様において、本発明は、成熟ｍＲＮＡの産生方法であって、
（Ａ）下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子を準備する工程、
（ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
（ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド
（Ｂ’）工程（Ａ）で準備した人工ＲＮＡ分子をｍＲＮＡ前駆体に接触させ、人工ＲＮＡ分子とｍＲＮＡ前駆体との間に相補鎖を形成させる工程、および
（Ｃ）工程（Ｂ’）によりｍＲＮＡスプライシングが調節されて、成熟ｍＲＮＡが産生される工程を含む、方法（本発明の産生方法ともいう）を提供する。
　本発明の産生方法より得られた成熟ｍＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｅｘ　ｖｉｖｏのアプローチによる遺伝子治療に使用され得る。ｉｎ　ｖｉｖｏによるアプローチとしては、例えば、本発明の人工ｍＲＮＡ分子を生体内へ投与し、その人工ｍＲＮＡ分子が細胞の核内に取り込まれ、生体内で産生された成熟ｍＲＮＡが留まることで、正常なタンパク質が産生されるような実施形態を想定することができる。ｅｘ　ｖｉｖｏによるアプローチとしては、例えば、生体内にある細胞や組織を取り出して本発明の人工ｍＲＮＡ分子を投与し、その人工ｍＲＮＡ分子が細胞の核内に取り込まれ、細胞内で産生された成熟ｍＲＮＡが留まることで、正常なタンパク質が産生される細胞や組織を、再度患者に戻すような利用形態を想定することができる。
＜工程（Ｂ’）＞
　工程（Ｂ’）は、工程（Ａ）で準備した人工ＲＮＡ分子をｍＲＮＡ前駆体に接触させ、人工ＲＮＡ分子とｍＲＮＡ前駆体との間に相補鎖を形成させる工程である。工程（Ｂ’）には、本発明の調節方法における工程（Ｂ）と同様に、人工ＲＮＡ分子を生体外で細胞に導入する方法や、人工ＲＮＡ分子を生体に投与する方法など、本技術分野における通常の方法を用いることができる。
＜工程（Ｃ）＞
　工程（Ｃ）は、工程（Ｂ’）によりｍＲＮＡスプライシングが調節されて、成熟ｍＲＮＡが産生される工程である。工程（Ｂ’）によりｍＲＮＡスプライシングが調節されて、成熟ｍＲＮＡが産生されたことの確認は、本発明の調節方法と同様に、ＲＴ－ＰＣＲ等により行うことができる。
　本発明の調節方法および本発明の産生方法における人工ＲＮＡ分子の説明には、上述の本発明の人工ＲＮＡ分子の説明が同様に適用される。また、本発明の調節方法および本発明の産生方法における説明は、適用可能な内容（特に上述の工程（Ａ）に関する説明）はそれぞれいずれの実施態様にも同様に適用される。
［医薬組成物］
　本発明はまた、本発明の人工ＲＮＡ分子または本発明の産生方法により得られる成熟ｍＲＮＡを含む医薬組成物も提供することができる。この医薬組成物は、ｍＲＮＡスプライシングを調節することにより治療可能な疾患の治療または予防に使用することができる。
　このような医薬組成物の薬物送達システム（ＤＤＳ）としては、本技術分野において通常用いられる方法を特に制限なく使用することができるが、例えば、発現ベクターを用いる方法、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を用いる方法、化学修飾を用いる方法などが挙げられる。
　発現ベクターを用いる方法は、具体的には、ウイルスベクター、およびプラスミドやバクテリアなどの非ウイルスベクターが挙げられる。なかでも、ウイルスベクターは、比較的高効率に薬物を導入・送達できるため、遺伝子治療で広く用いられている。さらに、ウイルスベクターのなかでも、安全性の観点から、ＡＡＶベクターが好適に用いられている。本発明の人工ＲＮＡ分子をＡＡＶに搭載する場合、複数コピー搭載することができる。そのため、ＲＮＡの発現量を上昇させることができ、本発明の効果を上げることが期待される。
　脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を用いる方法とは、ＲＮＡ分子をＬＮＰに封入する薬物送達方法である。ＲＮＡ分子はＲＮＡ分解酵素から保護するＬＮＰにパッケージ化され、細胞に侵入し、細胞質に放出される。ＬＮＰを使用すると、化学的に修飾または非修飾のＲＮＡ分子を効率よく送達することが可能になる。ＬＮＰの作製には、ＰＥＧ化脂質、コレステロール、中性リン脂質等が必要である。
　化学修飾を用いる方法は、人工ＲＮＡ分子または成熟ｍＲＮＡを構成するヌクレオチドを化学的に修飾するものであり、具体的には、ヌクレオチドにペプチドを付加する方法、２´Ｏ－ＭＥ修飾、ホスホロチオエート修飾を付加する方法、シュードウリジンを付加する方法等が挙げられる。このような化学修飾を行うことにより、ＲＮＡ分子をＲＮＡ分解酵素から保護したり、標的とする組織や細胞に特異的に送達したり、標的配列とより強固な結合をすることが可能となる。
　ｍＲＮＡスプライシングを調節することにより治療可能な疾患としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、デユセンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、福山型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、家族性自律神経失調症（ＦＤ）、アレキサンダー病、アンジェルマン症候群（ＡＳ）、特発性拡張型心筋症（ＤＣＭ）、パーキンソン病、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、網膜色素変性症、ハンチントン病、慢性腎臓病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、サラセミア、各種がん等が挙げられる。
　以下、本発明を具体的な実験例および実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実験例や実施例にのみ限定されるものではない。
実験例１：ノックアウトマウスの作出
　まず、４．５ＳＨノックアウトマウスを作出した。ノックアウトマウスの作出は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた大規模なゲノム欠失／挿入法の一般的な方法に従った（Luqing Zhang et al, (2015) PLoS One, Mar 24;10(3)など参照）。具体的には、マウス４．５ＳＨ遺伝子クラスターの両端と相補する配列を両端に有する薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子カセットを設計して単離し、単離した遺伝子をエレクトロポレーション法によりマウスＥＳ細胞に導入した。相同組み換えの効率を高めるために、相補的な配列の末端部分を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を同時に導入した。
　樹立したＥＳ細胞からキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させて組換え個体のヘテロマウスを得た。ヘテロマウス同士を交配し、４．５ＳＨノックアウトマウスの胚盤胞を得た。胚盤胞より、４．５ＳＨノックアウトＥＳ細胞を得た。４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、４．５ＳＨを特異的に増幅するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。その結果、４．５ＳＨノックアウトマウスでは、４．５ＳＨが大幅に減少していた。
実験例２：ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析
　樹立した４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞および野生型マウスのＥＳ細胞からＴｒｉｚｏｌを用いてトータルＲＮＡを調製した。調製したトータルＲＮＡについて、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行った。シーケンスには、イルミナ社製ＨｉＳｅｑ４０００を用いた。解析ソフトウェアにはｒＭＡＴＳ４．１．１を用い、４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞と野生型マウスの細胞についてそれぞれ３群間での選択的スプライシングの変化の比較を行った。
　４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞と野生型マウスの細胞での統計的に有意な選択的スプライシングの５つの類型の変化について、ＦＤＲ（Ｆａｌｓｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｒａｔｅ）０．０５未満で比較した結果を表１に示す。ここで、選択的スプライシングの５つの類型とは、カセットエクソン型（ＳＥ）、選択的５´スプライス部位型（Ａ５ＳＳ）、選択的３´スプライス部位型（Ａ３ＳＳ）、相互排他的エクソン型（ＭＸＥ）およびイントロン保持型（ＩＲ）を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析の結果、４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞で特異的に出現しているエクソンが２９３個あることがわかった。
　次に、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析の結果から４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞で特異的に出現しているエクソンの特徴を解析したところ、４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞で特異的に出現しているエクソンの多くはａｓＳＩＮＥＢ１の配列と一致することがわかった。ここで、ａｓＳＩＮＥＢ１とは、ＳＩＮＥＢ１の相補鎖（ａｓ）である。そこで、ネズミ亜目において、４．５ＳＨは、イントロン内に存在するａｓＳＩＮＥＢ１がエクソン化することを抑制しているという仮説を立て、以下の実験例によって実証した。
実験例３：マウス細胞内におけるエクソンスキッピングの確認
　雌雄それぞれの４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞および野生型マウスのＥＳ細胞からＲＮＡを抽出して、ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、ａｓＳＩＮＥＢ１をもつ３つの遺伝子（Ｓｍｃｈｄ１エクソン２１－２２、Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８－９、Ｓｍｇ６エクソン８－９）をそれぞれ特異的に増幅するプライマー（配列番号３および４、配列番号５および６、ならびに配列番号７および８）を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。これにより、Ｓｍｃｈｄ１（ＮＭ＿０２８８８７．３）のエクソン２４とエクソン２５の間、Ｓｌｃ２５ａ４０（ＮＭ＿１７８７６６．５）のエクソン８とエクソン９の間、およびＳｍｇ６（ＮＭ＿００１００２７６４．１）エクソン８とエクソン９の間、のイントロン内には、ａｓＳＩＮＥＢ１が存在するので、これらのａｓＳＩＮＥＢ１が、４．５ＳＨのノックアウトによってエクソン化し新規エクソンとなれば、上記仮説の実証の一つとなる。
　その結果、Ｓｍｃｄｈ１、Ｓｌｃ２５ａ４０、およびＳｍｇ６について、野生型マウスの細胞では新規エクソンのエクソンスキッピングが検出された一方で、４．５ＳＨノックアウトマウスのＥＳ細胞では新規エクソンのエクソンスキッピングが検出されなかった（図２）。したがって、４．５ＳＨ存在下では新規エクソンがスキッピングしており、４．５ＳＨノックアウト下ではスキッピングしておらず、新規エクソンの出現が確認された。以下、本明細書および図面において、これらの新規エクソンをそれぞれＳｍｃｄｈ１ Ｅｘ２４．５、Ｓｌｃ２５ａ４０ Ｅｘ８．５、およびＳｍｇ６ Ｅｘ８．５や、それぞれＳｍｃｄｈ１エクソン２４．５、Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５、およびＳｍｇ６エクソン８．５とも称する。
実験例４：ヒト細胞過剰発現系におけるエクソンスキッピングの確認
　本来４．５ＳＨをもたないヒト細胞を用いて４．５ＳＨの活性を確認することにより上記仮説をさらに実証する目的で、ヒト細胞過剰発現系におけるエクソンスキッピングを確認した。
　Ｕ６プロモーターおよびマウス４．５ＳＨの配列（図３）を搭載したプラスミドを作製し、そのプラスミド（ｐＵＣ５７）をリポソームトランスフェクション法により、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に導入した。ノザンブロッティング法により、４．５ＳＨ　ＲＮＡが発現していることを確認し、ヒト４．５ＳＨ発現細胞を取得した（図４）。
　野生型Ｓｌｃ２５ａ４０Ｅｘ８．５とその上流下流１００塩基を含むＤＮＡ配列（配列番号９）、および野生型Ｓｍｇ６Ｅｘ８．５とその上流下流１００塩基を含むＤＮＡ配列（配列番号１０）を、それぞれアデノウイルス後期遺伝子（Ａｄ２）由来のプラスミドのイントロン内のＳａｃＩＩ配列に挿入したミニジーンをそれぞれプラスミド（ｐｃＤＮＡ３　ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ）に挿入し、得られたベクター（Ａｄ２／ｐｃＤＮＡ３　ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ、ベクターの共通配列は配列番号２８）を、ヒト４．５ＳＨ発現細胞に導入し、２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、２つのミニジーンをいずれも特異的に増幅するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。その結果、Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５およびＳｍｇ６エクソン８．５のミニジーンについて、エクソンスキッピングが検出された（図５）。なお、図５および図６のそれぞれ左側の列は、ミニジーンをヒト４．５ＳＨ発現細胞に導入する代わりに４．５ＳＨ導入前のヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に導入したコントロールでの結果を示す。
　上記ＰＣＲの反応産物１０μＬをポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、得られた泳動図の各バンドからエクソンスキッピング効率を算出した。エクソンがスキップしたバンドのポリヌクレオチド量（Ｘ）およびヌクレオチドの長さ（ＬX）と、エクソンがスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量（Ｙ）およびヌクレオチドの長さ（ＬY）から、以下の式によりスキッピング効率を求めた（図６）。
スキッピング効率（％）＝｛Ｘ／ＬX÷（Ｘ／ＬX＋Ｙ／ＬY）｝×１００
　上記により、本来４．５ＳＨをもたないヒト細胞においても、４．５ＳＨが無いとイントロン内の新規エクソンが出現し、４．５ＳＨが有ると新規エクソンがスキッピングされることがわかった。
　実験例３および実験例４から、４．５ＳＨは、イントロン内に存在するａｓＳＩＮＥＢ１がエクソン化することを抑制していること、および、エクソン化の抑制は、新規エクソンのエクソンスキッピングによるものであることがわかった。
実験例５：変異型を用いた共発現による塩基対結合の検討
　４．５ＳＨとａｓＳＩＮＥＢ１の塩基対結合を調べる目的で、４．５ＳＨおよびａｓＳＩＮＥＢ１の変異型をそれぞれ取得し、細胞内で共発現させ、エクソンスキッピングの有無を検出した。
　実験例４と同様にして得られた天然型（野生型）４．５ＳＨを発現するプラスミドに変異を導入し、変異型を発現するプラスミドを取得した。すなわち、野生型４．５ＳＨ配列のａｓＳＩＮＥＢ１認識領域の一部のＧをＣに改変し、Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８－９間の新規エクソン（エクソン８．５）と塩基対結合しないようマウス４．５ＳＨの配列を改変したプラスミドを作製した（図７）。得られたプラスミドを大腸菌にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌をＬＢ（アンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。アンピシリン耐性をもつ大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定し、変異型４．５ＳＨ発現プラスミドを得た（図７）。
　実験例４と同様にして得られた天然型（野生型）Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンを発現するプラスミドに変異を導入し、変異型を発現するプラスミドを取得した。つまり、野生型Ｓｌｃａ４０エクソン８．５配列の一部のＧをＣに改変し、野生型４．５ＳＨと塩基対結合しないよう設計したＤＮＡ配列の断片（配列番号１１）を合成し、ギブソン・アセンブリによって、プラスミドに変異を挿入した。得られたプラスミドを大腸菌にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌をＬＢ（アンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。アンピシリン耐性をもつ大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定し、変異型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンを発現するプラスミドを得た（図７）。
　上記各変異型プラスミドおよび各野生型プラスミドを、リポフェクション法によりヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共導入した。２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、実験例４においても使用した両ミニジーンを特異的に増幅するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＰＣＲの反応産物１０μＬをポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、上述の式により、エクソンスキッピング効率を求めた。結果を図８および図９に示す。なお、図８および図９において、左端のレーンおよび棒グラフは、４．５ＳＨを導入する前のプラスミド（いわゆる空ベクター）と野生型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーン発現プラスミドを共導入したサンプルである。
　野生型４．５ＳＨと野生型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンとを共発現させた細胞ではエクソンスキッピングが検出された（図８左から２番目のレーン）。変異型４．５ＳＨと野生型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンとを共発現させた細胞、および野生型４．５ＳＨと変異型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンとを共発現させた細胞では、エクソンスキッピングが検出されないか、スキッピング効率が野生型同士を共発現させた場合に比べて低かった（図８左から３番目のレーンおよび左から４番目のレーン）。変異型４．５ＳＨと変異型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンとを共発現させた細胞では、エクソンスキッピングが検出され、スキッピング効率も野生型同士を共発現させた場合と同等であった（図８左から５番目のレーン、スキッピング効率は図９左から５番目）。このことから、４．５ＳＨによるエクソンスキッピングには、４．５ＳＨとａｓＳＩＮＥＢ１の塩基対結合が必要であることがわかる。
実験例６：ポリヌクレオチド（ａ）の解析
　４．５ＳＨにおいてポリヌクレオチド（ａ）が重要であることを確認する目的で、４．５ＳＨのポリヌクレオチド（ａ）部分の配列（配列番号２）を、４．５ＳＨの相同配列であるＳＩＮＥＢ１の対応する部分の配列（配列番号２８に対応するＲＮＡ配列）に置き換えたＢ１改変４．５ＳＨを作製し、細胞内での発現量およびエクソンスキッピングの効率を調べた。
＜Ｂ１改変４．５ＳＨの取得＞
　実験例４と同様にして得られた野生型４．５ＳＨを発現するプラスミドに変異を導入し、Ｂ１改変４．５ＳＨを発現するプラスミドを取得した。具体的には、野生型４．５ＳＨのポリヌクレオチド（ａ）部分の配列（配列番号２に対応するＤＮＡ配列）を、ＳＩＮＥＢ１の対応する部分のＤＮＡ配列（配列番号２９）に改変し、そのＤＮＡ配列の５´側にＵ６プロモーターを搭載したプラスミド（ｐＵＣ５７）を作製した。得られたプラスミドを大腸菌にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌をＬＢ（アンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。アンピシリン耐性をもつ大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定し、配列番号３０に示すＢ１改変４．５ＳＨ発現プラスミドを得た。
　上記で得られたＢ１改変４．５ＳＨ発現プラスミドを、リポソームトランスフェクション法により、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に導入し、Ｂ１改変４．５ＳＨ発現細胞を得た。ノザンブロッティング法により、Ｂ１改変４．５ＳＨ　ＲＮＡの発現を確認した（図１０中段、右端のレーン：ＳＬ１－Ｂ１－４．５ＳＨ）。
＜Ｂ１改変４．５ＳＨと野生型４．５ＳＨのスキッピング効率の比較＞
　実験例４と同様にして得られた野生型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５とその上流下流１００塩基を含むミニジーンを、野生型４．５ＳＨ発現細胞（実験例４のヒト４．５ＳＨ発現細胞と同様にして得られる）、および、上記で得られたＢ１改変４．５ＳＨ発現細胞に導入し、２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、実験例４においても使用した野生型Ｓｌｃ２５ａ４０Ｅｘ８．５を含むミニジーンを特異的に増幅するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。その結果、Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５について、野生型４．５ＳＨ発現細胞（図１０中央のレーン）に比べてＢ１改変４．５ＳＨ発現細胞（図１０右端のレーン）ではエクソンスキッピングの効率が著しく低下した（図１０下段）。なお、図１０左端の列は、ヒト４．５ＳＨ発現細胞またはＢ１改変４．５ＳＨ発現細胞を用いる代わりに、実験例４においてマウス４．５ＳＨを導入する前のプラスミド（いわゆる空ベクター）をヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）導入したコントロールでの結果を示す。
実施例１：ＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨ
　４．５ＳＨによるａｓＳＩＮＥＢ１のエクソンスキッピングを、任意のエクソンスキッピングに応用できることを確認する目的で、ヒトＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨを作製し、エクソンスキッピングを調べた。
＜ＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨの取得＞
　野生型４．５ＳＨを発現するプラスミドに変異を導入し、変異型を発現するプラスミドを取得した。具体的には、野生型４．５ＳＨ配列のａｓＳＩＮＥＢ１認識領域の配列を、配列番号１２に示すＦＡＳ遺伝子エクソン６に相補するＤＮＡ配列に改変したＤＮＡ断片を合成し、ギブソン・アセンブリによって、プラスミド（ｐＵＣ５７）に挿入した。得られたプラスミドを大腸菌にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌をＬＢ（アンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。アンピシリン耐性をもつ大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定し、配列番号１３に示すヒトＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドを得た。
＜エクソンスキッピング検出用ミニジーンの作製＞
　配列番号１４に示すＦＡＳ遺伝子エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、およびエクソン７を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を精製し、ギブソン・アセンブリによって、プラスミド（ｐｃＤＮＡ３　ｂａｍＨＩ／ｘｈоＩ）に変異を挿入した。得られたプラスミドを大腸菌にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌をＬＢ（アンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。アンピシリン耐性をもつ大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定し、ＦＡＳ遺伝子のエクソンスキッピングを検出するためのミニジーンを得た。
＜ＦＡＳ遺伝子エクソンスキッピングの検出＞
　上記ＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドおよびＦＡＳ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンをリポフェクション法によりヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共導入した。２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、配列番号１５および配列番号１６に示すｐｃＤＮＡ３に結合するリバースプライマーおよびフォワードプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。このようなプライマーセットを用いることにより、細胞に内在するＦＡＳ遺伝子は増幅されない。ＲＴ－ＰＣＲの条件を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＰＣＲの反応産物１０μＬをポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、スキッピングを解析した。泳動図を図１１右レーンに示す。エクソンスキッピング効率は図１３に示す。
　ＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドおよびＦＡＳ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共発現させた細胞では、ＦＡＳ遺伝子エクソン６のエクソンスキッピングが確認された（図１１右レーン）。また、ＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨによるＦＡＳ遺伝子エクソン６のエクソンスキッピング効率は７０％であった（図１３右端のバー）。
　図１１の泳動図左レーンは、野生型４．５ＳＨ発現プラスミドおよびＦＡＳ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンをヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共発現させ、抽出したＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲした泳動図である。エクソンスキッピング効率はＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドよりも有意に低かった。
＜ＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨによるエクソンスキッピングの確認＞
　上記で得られたＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドおよび実験例４と同様にして得られた野生型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンを発現するプラスミドを、リポフェクション法によりヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共導入した。２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、実験例４においても使用したミニジーンを特異的に増幅するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＰＣＲの反応産物１０μＬをポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、スキッピングを解析した。泳動図のイメージを図１２右レーンに示す。
　図１２の泳動図左レーンは、野生型４．５ＳＨ発現プラスミドおよび野生型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を含むミニジーンを発現するプラスミドをヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共発現させ、抽出したＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲした泳動図である。野生型４．５ＳＨ発現プラスミドおよび野生型Ｓｌｃ２５ａ４０エクソン８．５を共発現させた結果（図１２左レーンと図１３左端のバー）と、ＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨおよびＦＡＳ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共発現させた結果（図１１右レーンと図１３右端のバー）を比較することで、ＦＡＳ遺伝子改変４．５ＳＨは、野生型４．５ＳＨのａｓＳＩＮＥＢ１に対するスキッピング活性と同等のＦＡＳ遺伝子エクソン６スキッピング活性をもつことがわかる（図１１、図１２、図１３）。なお、ＦＡＳ遺伝子は、生体内でエクソン６を含有するアイソフォームとエクソン６を含有しないアイソフォームがあることが知られていることから、野生型４．５ＳＨ発現プラスミドおよびＦＡＳ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共発現させた結果（図１１右レーンと図１３右から三番目のバー）は、生体内でのアイソフォーム量比を示していると考えられる。
実施例２：ヒトＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ
　４．５ＳＨによるａｓＳＩＮＥＢ１のエクソンスキッピングを、任意のエクソンスキッピングに応用できることを確認する目的で、ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子改変４．５ＳＨを作製し、エクソンスキッピングを調べた。ＤＭＤのエクソン５３は塩基長が２１２塩基とＦＡＳ遺伝子エクソン６（６３塩基）より長いため、まずは、標的配列を４ヵ所（＃１、＃２、＃３、＃４）に分け（図１４参照）、ポリヌクレオチド（ｂ）の塩基配列が異なる４つのＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ（ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃１～＃４）を作製した。
＜４つのＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨの取得＞
　野生型４．５ＳＨを発現するプラスミドに変異を導入し、変異型を発現する４種類のプラスミドを取得した。具体的には、野生型４．５ＳＨ配列のａｓＳＩＮＥＢ１認識領域の配列を、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に示すＤＭＤ遺伝子エクソン５３に相補するＤＮＡ配列に改変したＤＮＡ配列を設計した。
　上記ＤＭＤ遺伝子エクソン５３に相補するＤＭＤ配列に改変したＤＮＡ断片をそれぞれ合成し、ギブソン・アセンブリによって、プラスミド（ｐｃＤＮＡ３　ｂａｍＨＩ／ｘｈоＩ）に変異を挿入した。得られたプラスミドを大腸菌にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌をＬＢ（アンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。アンピシリン耐性をもつ大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定し、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４に示す４種類のＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドを得た。
＜エクソンスキッピング検出用ミニジーンの作製＞
　配列番号２５に示すＤＭＤ遺伝子エクソン５３およびその上流下流１００塩基を含むＤＮＡ配列を、アデノウイルス後期遺伝子（Ａｄ２）由来のプラスミドのイントロン内ＳａｃＩＩ配列に挿入し、ＤＭＤ遺伝子のエクソンスキッピングを検出するためのミニジーンを得た。
＜ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピングの検出＞
　上記ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミド、および上記ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンをプラスミドに挿入したベクター（Ａｄ２／ｐｃＤＮＡ３　ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ、ベクターの共通配列は配列番号２８）を、リポフェクション法によりヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共導入した。ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドは、各１種類ずつ（ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃１～＃４をそれぞれ発現するプラスミド）、および４種類全て混合したものをＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーン挿入プラスミドと共導入した。２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、実験例４においても使用した各ミニジーンを特異的に増幅するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＲＴ－ＰＣＲの条件を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＰＣＲの反応産物１０μＬをポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、スキッピングを解析した。泳動図のイメージを図１５に示す。
　ＤＭＤ遺伝子エクソン５３では、スキッピング効率は高くはないものの、スキッピングが検出された。特に、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃２（図１５においては単に「２」と表されている）と、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃１～＃４の４つ全てを混合した（図１５における「Ｍｉｘ」）サンプルでは、エクソンスキッピング後のバンドが確認できた（図１５左から３レーン目および左から６レーン目）。
実施例２－２：ヒトＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨの最適化
＜ポリヌクレオチド（ｂ）配列の設計＞
　さらにスキッピング効率の高いＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨを作製するため、ＤＭＤエクソン５３の標的配列の最適化を行った。ＤＭＤエクソン５３の一部である＃４の配列（配列番号２０）には、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列（具体的にはＴＴＴＴ）が２か所含まれ、転写が終結していることが分かったので、該当箇所をＴＡＴＴに変換し＃５とした（配列番号３１、図１７）。このＤＮＡ配列を用いて実施例２と同様にしてＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃５を作製した。図１７には、各配列のＤＭＤエクソン５３のエクソンに相補する箇所を模式図として示す。
＜ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨの取得＞
　野生型４．５ＳＨ配列のａｓＳＩＮＥＢ１認識領域の配列を、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３１に示すＤＮＡ配列（それぞれＤＭＤ遺伝子エクソン５３の一部に相補するＤＮＡ配列）に改変したＤＮＡ断片を合成し、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３２に示す４種類のＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃１、＃２、＃３または＃５発現プラスミドを得た。
　上記ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドおよび実施例２と同様に作製したＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンをリポフェクション法によりヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共導入した。ここで、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドは、とりうる全ての２種類の組み合わせを、ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンと共導入した。２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、実験例４においても使用したミニジーンを特異的に増幅するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＲＴ－ＰＣＲの条件を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＰＣＲの反応産物１μＬをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー（株）製）を用いて解析し、エクソンスキッピング効率を算出した結果、全ての組み合わせにおいて、スキッピング効率が高くはないものもあったが、スキッピングが検出された。最もエクソンスキッピング効率が高かったのは、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃２とＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃５の組み合わせであった（図１６右端のレーン）。なお、図１６において、左端のレーンは、実験例４においてマウス４．５ＳＨを導入する前のプラスミド（いわゆる空ベクター）とＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共導入したサンプルの結果を示している。また、左から２番目のレーンは、野生型４．５ＳＨ　ＲＮＡを発現するベクター（実験例４においてヒト４．５ＳＨ発現細胞を取得する際に作製したプラスミド（ｐＵＣ５７）と同じ）とＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共導入したサンプルの結果を示している。
＜ポリヌクレオチド（ｂ）配列の設計の最適化＞
　ここで、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃２のうち本発明のポリヌクレオチド（ｂ）に相当するＤＮＡ配列（配列番号１８）は、既存のアンチセンス核酸医薬品ｖｉｌｔоｌａｒｓｅｎの配列の近傍であった（図１７参照）。そこで、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃２のポリヌクレオチド（ｂ）の配列を、ｖｉｌｔоｌａｒｓｅｎの配列を全て含むように設計しなおし、配列番号３３で示す、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃６を設計して、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃６の配列を発現するＤＮＡ断片を合成し、配列番号３４に示すＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃６を発現するＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドを得た。さらに、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃６のポリヌクレオチド（ｂ）とＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃５のポリヌクレオチド（ｂ）の配列を連結した配列（配列番号３５）を含むＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃７を設計して、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃７を発現するＤＮＡ断片を合成し、配列番号３６に示す＃７を発現するＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドを得た。
＜Ｂ１型ヒトＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ（比較例）＞
　また、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃７の４．５ＳＨのポリヌクレオチド（ａ）を、４．５ＳＨの相同配列であるＳＩＮＥＢ１のポリヌクレオチド（ａ）に対応する部分の配列に置き換えたＢ１改変配列である比較例を設計して、比較例の配列を発現するＤＮＡ断片を合成し、配列番号３７に示す比較例を発現するＤＭＤ遺伝子改変Ｂ１改変４．５ＳＨ発現プラスミドを得た。
　上記で得られたＤＭＤ遺伝子改変Ｂ１改変４．５ＳＨ発現プラスミドおよび実施例２で得られたＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンをリポフェクション法によりヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共導入した。２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、ＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを特異的に増幅するプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＲＴ－ＰＣＲの条件を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　その結果、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃６とＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃５の組み合わせにおいて、ＤＭＤエクソン５３のスキッピング効率は１６.４９％であった（図１８左から４レーン目）。そして、ＤＭＤ遺伝子改変４．５ＳＨ＃７のＤＭＤエクソン５３のスキッピング効率は、４６．９２％であった（図１８左から５レーン目）。
　また、比較例の配列のＤＭＤエクソン５３のスキッピング効率は５．０６％であり、スキッピング効率は著しく低下していた（図１８左から６レーン目）。なお、図１８において、左端のレーンは、４．５ＳＨ導入前のプラスミド（いわゆる空ベクター）とＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共導入したサンプルの結果を、左から２番目のレーンは野生型４．５ＳＨ　ＲＮＡを発現するベクター（実験例４においてヒト４．５ＳＨ発現細胞を取得する際に作製したプラスミド（ｐＵＣ５７）と同じ）とＤＭＤ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共導入したサンプルの結果を示している。ＤＭＤ遺伝子は、生体内ではエクソンスキッピングが生じていないため、空ベクターを導入したコントロールではスキッピング効率が０％となる。
実施例３：ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨ
　４．５ＳＨによるａｓＳＩＮＥＢ１のエクソンスキッピングを、任意のエクソンスキッピングに応用できることを確認する目的で、タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子改変４．５ＳＨを作製し、エクソンスキッピングを調べた。
＜ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨの取得＞
　野生型４．５ＳＨ配列のａｓＳＩＮＥＢ１認識領域の配列を、配列番号３８に示すＭＡＰＴ遺伝子エクソン１０に相補するＤＮＡ配列に改変したＤＮＡ断片を合成し、ギブソン・アセンブリによって、プラスミド（ｐｃＤＮＡ３　ｂａｍＨＩ／ｘｈоＩ）に変異を挿入した。得られたプラスミドを大腸菌にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌をＬＢ（アンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。アンピシリン耐性をもつ大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定し、配列番号３９に示すヒトＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドを得た。Ｕ６プロモーターおよびＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨの配列を搭載したレポーターを作製し、そのレポーターを搭載した発現ベクター（ｐＵＣ５７）をリポソームトランスフェクション法により、ヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に導入した。ノザンブロッティング法により、ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨ　ＲＮＡが発現していることを確認し（図２０中段、右端のレーン）、ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨ発現細胞を取得した。
＜エクソンスキッピング検出用ミニジーンの作製＞
　配列番号４０に示すＭＡＰＴ遺伝子エクソン９、エクソン１０、およびエクソン１１等（詳細はQingming Yu et al, (2004) J Neurochem, Jul;90(1):164-72を参照）を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を精製し、ギブソン・アセンブリによって、プラスミド（ｐｃＤＮＡ３　ｂａｍＨＩ／ｘｈоＩ）に変異を挿入した。得られたプラスミドを大腸菌にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌をＬＢ（アンピシリン入り）プレートに撒いて、３７℃で、コロニーを形成させて、スクリーニングを行った。アンピシリン耐性をもつ大腸菌が保持していたプラスミドのＤＮＡ配列を決定し、ＭＡＰＴ遺伝子のエクソンスキッピングを検出するためのミニジーンを得た。
＜ＭＡＰＴ遺伝子エクソンスキッピングの検出＞
　上記ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドおよびＭＡＰＴ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンをリポフェクション法によりヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に共導入した。２４時間、３７℃の条件で培養後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、配列番号４１および配列番号４２に示すｐｃＤＮＡ３に結合するリバースプライマーおよびＭＡＰＴ遺伝子エクソン１１に結合するフォワードプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。このようなプライマーセットを用いることにより、細胞に内在するＭＡＰＴ遺伝子は増幅されない。ＲＴ－ＰＣＲの条件を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ＰＣＲの反応産物１μＬをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー（株）製）を用いて解析し、エクソンスキッピング効率を算出した結果を図１９に示す。
　ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドおよびＭＡＰＴ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共発現させた細胞では、ＭＡＰＴ遺伝子エクソン１０のエクソンスキッピングが確認された（図１９上段泳動図右端のレーン）。また、ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨによるＭＡＰＴ遺伝子エクソン１０のエクソンスキッピング効率は８８．７８％であった（図１９下段右端４．５ＳＨ－ａｓＭＡＰＴ）。
　図１９の泳動図中央（左から二番目）のレーンは、実施例１で得られたＦＡＳ改変４．５ＳＨ発現プラスミドをＭＡＰＴ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンとヒト細胞に共発現させ、抽出したＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲした泳動図である。エクソンスキッピング効率は、６４．９９％であり、上記ＭＡＰＴ遺伝子改変４．５ＳＨ発現プラスミドを発現させたときのスキッピング効率よりも有意に低かった（図１９４．５ＳＨ－ａｓＦＡＳ）。なお、図１９において、左端のコントロールは、変異導入前のプラスミド（いわゆる空ベクター）とＭＡＰＴ遺伝子エクソンスキッピング検出用ミニジーンを共導入したサンプルの結果を示している。ＭＡＰＴ遺伝子は、生体内でエクソン１０を含有するアイソフォームとエクソン１０を含有しないアイソフォームがあることが知られていることから、空ベクターを導入したコントロールのスキッピング効率は、生体内でのアイソフォーム量比を示していると考えられる。
　本発明によれば、齧歯目ネズミ亜目動物特異的な非コードＲＮＡ分子の配列を含む人工ＲＮＡ分子がｍＲＮＡスプライシングの調節を通じて遺伝子発現を制御する技術を提供するので、ｍＲＮＡスプライシングを調節することにより治療可能な疾患の治療に利用することができる。

Claims (21)

  1. 下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子。
    （ａ）下記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または下記式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
    （ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｎ1～Ｎ25は、それぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｎ1とＮ25とは、Ｎ2とＮ24とは、Ｎ3とＮ23とは、Ｎ4とＮ22とは、Ｎ5とＮ21とは、Ｎ6とＮ20とは、Ｎ8とＮ19とは、Ｎ9とＮ18とは、Ｎ10とＮ17とは、それぞれ塩基対を形成する。）
  2. 前記（ｂ）により標的化されたｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを調節する、請求項１記載の人工ＲＮＡ分子。
  3. 前記（ａ）の塩基配列が配列番号２で示された配列、または配列番号２で示された配列と配列同一性が８０％以上である配列である、請求項１または２記載の人工ＲＮＡ分子。
  4. 前記（ｂ）の長さが１５～３００塩基である、請求項１または２記載の人工ＲＮＡ分子。
  5. 前記標的配列がエクソン配列である、請求項１または２記載の人工ＲＮＡ分子。
  6. 前記（ｂ）の３´側に下記（ｃ）が配置されてなる、請求項１記載の人工ＲＮＡ分子。
    （ｃ）末端の安定性に寄与する配列を含むポリヌクレオチド
  7. 前記（ｃ）が、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列を含むポリヌクレオチドである、請求項６記載の人工ＲＮＡ分子。
  8. 前記（ａ）が、ｍＲＮＡスプライシングを制御するタンパク質に結合するポリヌクレオチドである、請求項１または２記載の人工ＲＮＡ分子。
  9. 前記標的配列が、ＦＡＳ遺伝子、ジストロフィン遺伝子、およびフクチン遺伝子から選択される遺伝子の一部の配列である、請求項１または２記載の人工ＲＮＡ分子。
  10. 前記標的配列が、ＭＡＰＴ遺伝子の一部の配列である、請求項１または２記載の人工ＲＮＡ分子。
  11. 請求項１または６記載の人工ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
  12. ｍＲＮＡスプライシングを調節する方法であって、
    （Ａ）下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子を準備する工程、
    （ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
    （ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド、および
    （Ｂ）工程（Ａ）で準備した人工ＲＮＡ分子をｍＲＮＡ前駆体に接触させ、人工ＲＮＡ分子とｍＲＮＡ前駆体との間に相補鎖を形成させ、それによりｍＲＮＡスプライシングが調節される工程
    を含む、方法。
  13. 前記ｍＲＮＡのスプライシングの調節が、エクソンスキッピングによるものである、請求項１２記載の方法。
  14. 前記（ａ）の塩基配列が配列番号２で示された配列、または配列番号２で示された配列と配列同一性が８０％以上である配列である、請求項１２または１３記載の方法。
  15. 標的配列がエクソン配列である、請求項１２または１３記載の方法。
  16. 前記人工ＲＮＡ分子が、前記（ｂ）の３´側にＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列を含むポリヌクレオチドが配置されてなる、請求項１２または１３記載の方法。
  17. 成熟ｍＲＮＡの産生方法であって、
    （Ａ）下記（ａ）と、下記（ｂ）とを含み、下記（ａ）および（ｂ）が５´側から３´側にこの順に配置されてなる人工ＲＮＡ分子を準備する工程、
    （ａ）式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチド、または式（Ｉ）で表される二次構造を潜在的に有するポリヌクレオチドの３´側の７個の塩基において１～３個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチド
    （ｂ）ｍＲＮＡ前駆体の一部の配列である標的配列に対して、相補的な配列を含むｍＲＮＡ前駆体標的化ポリヌクレオチド
    （Ｂ’）工程（Ａ）で準備した人工ＲＮＡ分子をｍＲＮＡ前駆体に接触させ、人工ＲＮＡ分子とｍＲＮＡ前駆体との間に相補鎖を形成させる工程、および
    （Ｃ）工程（Ｂ’）によりｍＲＮＡスプライシングが調節されて、成熟ｍＲＮＡが産生される工程
    を含む、方法。
  18. 前記ｍＲＮＡのスプライシングの調節が、エクソンスキッピングによるものである、請求項１７記載の方法。
  19. 前記（ａ）の塩基配列が配列番号２で示された配列、または配列番号２で示された配列と配列同一性が８０％以上である配列である、請求項１７または１８記載の方法。
  20. 標的配列がエクソン配列である、請求項１７または１８記載の方法。
  21. 前記人工ＲＮＡ分子が、前記（ｂ）の３´側にＲＮＡｐｏｌＩＩＩ酵素が認識する転写終結シグナル配列を含むポリヌクレオチドが配置されてなる、請求項１７または１８記載の方法。
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