JP2013521791A - 神経筋疾患の治療のための修飾型Ｕ７ｓｎＲＮＡ - Google Patents

Abstract

神経筋疾患の治療のための修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡ
本発明は、特にエクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、及びｍＲＮＡ根絶戦略による、ＲＮＡを基盤とした治療に関して使用される、操作されたＵ７ ｓｎＲＮＡの活性を改善する方法に関する。結果として生じる修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、神経筋疾患、特にデュシェンヌ型神経筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＤＭ１及び脊髄性筋萎縮症を治療するために有用である。

Description

本発明は、特にエクソンスキッピング（skipping）、エクソンインクルージョン（inclusion）、及びｍＲＮＡ根絶戦略による、ＲＮＡを基盤とした治療に関して使用される、操作されたＵ７ ｓｎＲＮＡの活性を改善する方法に関する。

従来の遺伝子治療は、主として標的細胞における遺伝子置換に着目してきた。ＲＮＡを基盤とした戦略は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写産物のプロセシングの変更、ｍＲＮＡの修復を介した遺伝的欠損のリプログラミング、及び対立遺伝子又はアイソフォーム特異的な遺伝子転写産物の標的サイレンシングを含む、一連の新規の治療応用を提供する。同様に、異常なスプライシング等のＲＮＡプロセシングの疾患において、内在性のスプライシングのパターンを修復することが好ましいことがあり、これは多数の選択的アイソフォームも修正する可能性がある。

多くの遺伝子は、選択的スプライシングを用いて複数の遺伝子産物を産生する。特定の遺伝子のスプライシング経路を調節できること（オンデマンド選択的スプライシング）は、遺伝子治療の分野において多くの潜在的な応用性を有する。例としては、正しいエクソンの強制的なスキッピングは、残りのエクソンがインフレーム又はアウトオブフレームのいずれで融合されるかに応じて、遺伝子機能を阻害するためか、又は内部で欠失若しくは短縮されたタンパク質の合成を促進するために使用され得る。同様に、最終的なｍＲＮＡから異常なスプライシングをされたエクソンの強制的なインクルージョンも、多くの遺伝性病態において臨床的に関連するだろう。

神経筋疾患とは、ヒトの体を動かす筋肉を弱める一群の遺伝性筋肉疾患をいう。それらとして、例えば神経筋ジストロフィー及び脊髄性筋萎縮症等の疾患が挙げられる。デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋緊張性、眼咽頭型、遠位型、及びエメリ・ドレフュス型を含む９疾患は常に神経筋ジストロフィーとして分類されるが、神経筋ジストロフィーとの類似性を有する全部で１００を超える疾患が存在する。これらの状態は遺伝的な根拠を有し、様々な遺伝的筋肉疾患が種々の遺伝様式に従う。最もよく知られているタイプ（デュシェンヌ型神経筋ジストロフィー（ＤＭＤ））は、ジストロフィンと名付けられた４２７ ｋＤａのタンパク質の欠如により特徴付けられる、重症劣性遺伝性Ｘ連鎖型である。機能的なジストロフィンタンパク質の欠如は、ジストロフィン遺伝子（Ｘｐ２１．２に位置する大きな遺伝子）における、ナンセンス変異又は欠失変異によって引き起こされる翻訳の破壊に起因する（Muntoni et al., Lancet Neurol., 2：731−740, 2003）。ＤＭＤを是正するための戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用して、いくつかのエクソンを読み飛ばし、それにより短縮されているが機能的な形態の該タンパク質を発現させることからなる。エクソンスキッピングと命名されたこの技術は、読み飛ばすエクソンのスプライシングに関与する配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用する（Wood et al., PLoS Genet., 3（6）：e109, 2007；Du & Gatti, Curr Opin Mol Ther., 11（2）：116−23, 2009）。特に、本発明者らは、内在性ｓｍ結合ドメインをＵ１ ｓｎＲＮＡの１つ（ｓｍＯＰＴ）で置換することによりスプライソソームへ向け直された修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡを使用することにより、マウスにおいてエクソンスキッピングによってＤＭＤを是正することが可能であることを示している（WO 2006／021724；Goyenvalle et al., Science, 306：1796−1799, 2004）。しかしながら、この技術は、ヒト患者における使用にはまだ適応されていない。

別の重要なジストロフィーは筋緊張性ジストロフィー（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ ｍｙｏｔｏｎｉｃａ、ＤＭ）であり、そのうち１型（ＤＭ１、スタイナート病としても知られる）が最も多く見られる。ＤＭ１は、ＤＭプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子（遺伝子地図位置：１９ｑ１３．２−ｑ１３．３）の３’非翻訳ドメインにおけるＣＴＧリピートの伸長によって引き起こされる、優性遺伝性疾患である。変異ＤＭＰＫ ｍＲＮＡは核において捕捉され、ＣＵＧ伸長は、該分子へのＲＮＡ結合タンパク質の結合を変化させる（Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94：7388−7393, 1997）。そのような蓄積は、選択的スプライシングの調節を変化させ、それはその後、いくつかのｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写産物の誤ったスプライシング及び神経筋機能不全につながる。ＤＭ１における表現型レスキューのための戦略は、マウスＤＭ１モデルにおいてＣＵＧ伸長を標的とするＡＯＮを使用することで評価されてきた（Wheeler et al., Science, 325：336−339, 2009；Mulders et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 106：13915−13920, 2009；Du & Gatti, Curr Opin Mol Ther., 11（2）：116−23, 2009）。しかしながら、合成オリゴヌクレオチドの使用は、反復治療を必要とする。実際に、現在筋緊張性ジストロフィーのための治療法又はこれに特異的な治療は存在しない。

筋ジストロフィーの他に、別の重要な筋疾患は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である：ＳＭＡは、遺伝的に決定された新生児死亡の最も一般的な原因である。ＳＭＡは、運動ニューロンの変性により特徴付けられる遺伝性神経筋疾患であり、進行性の筋萎縮（衰弱する）及び筋力低下をもたらす。該疾患は、運動ニューロンに必須なタンパク質である生存運動タンパク質（Survival Motor Protein）（ＳＭＮ）を産生する責任遺伝子である、生存運動ニューロン遺伝子として知られる遺伝子の異常又は欠損によって引き起こされる。ヒトにおいては、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２と命名された２コピーのＳＭＮ遺伝子が存在し、両方とも５ｑ１２．２−ｑ１３．３遺伝子座にマッピングされる。ＳＭＮ２遺伝子はＳＭＮ１遺伝子の欠損を補償できないので、ＳＭＮ１遺伝子の不活性化は疾患につながる。この理由は、コドンは変えないがスプライシング機構によるその認識を妨げる、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７におけるＣからＵへの重大な置換である。この置換の結果として、ＳＭＮ２遺伝子はエクソン７が読み飛ばされた転写産物を主に（転写産物の９０％）産生し、短縮されたタンパク質の産生につながり、そしてＳＭＮ１不活性化を補償できないことにつながる。

ＳＭＡ治療を開発するための現在の戦略としては、ＳＭＮ２のレベルを増加させるか、残存のＳＭＮ２の機能を増強するか、又はＳＭＮ１活性の喪失を別の方法で補償する、薬剤を同定することが挙げられる。ブチレート、バルプロ酸、ヒドロキシウレア、及びリルゾール（リルテック（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）等の薬剤は、ＳＭＡに対する臨床試験が行われているか又は行われていた。遺伝子置換戦略は動物において試験されているが（Foust et al., Nat Biotechnol., 28（3）：271−4, 2010）、ＳＭＡに対する現在の治療は、慢性的な運動単位の喪失の二次的影響の予防及び管理からなる。現在、ＳＭＡの経過を変化させることが知られている薬剤は存在しない。

それ故、今も尚神経筋疾患の新たな治療が必要とされている。特に、本発明者らは、ｓｍＯＰＴドメイン及び標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部にアンチセンスである配列を含む、新たな修飾型ヒトＵ７ ｓｎＲＮＡを開発した。本発明者らは、アンチセンス部分とＵ７ループとの間の相互作用が、神経筋疾患を治療するために使用され得る活性なＵ７由来ｓｎＲＮＰを得るために必要とされることを示した。

発明の詳細な説明
本発明者らは、ｓｍＯＰＴ配列（Ｕ７ｓｍＯＰＴ）及びアンチセンス配列を含む修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡが、特にエクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、又は有害なｍＲＮＡの根絶によって、神経筋疾患を治療するために有用であることを示した。しかしながら、適切なアンチセンス配列をＵ７ｓｍＯＰＴへ導入することは十分といえる程ではなく、多くの場合、その後の操作されたＵ７は、スプライシング機構を効率的に妨害しない。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは、たとえそれらが標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列と完璧に相互作用するよう設計されていても、スプライシングを是正することにはつながらない（例えば実験例におけるアンチセンスＳＤ２３又はＭ２３Ｄを参照されたい）。

本発明者らは、アンチセンス−Ｕ７ｓｍＯＰＴの正しい折り畳みが効率性のために必要であることを今や見出した。理論により制約されること無く、この現象を説明する１つの仮説は、アンチセンス配列がその後のｓｎＲＮＰの折り畳みに影響し、最終的にはその細胞輸送及びスプライソソームへのアドレッシング（addressing）を妨害し得るというものである。それ故、該分子のアンチセンス部分とＵ７ループとの間のハイブリダイゼーションによる相互作用は、修飾型分子の適切な折り畳みを可能にするために必須である。また、本発明者らは、そのような相互作用が天然に存在しないとき、アンチセンス−Ｕ７−ＳｍＯＰＴ分子にステムループとハイブリダイズすることが可能なドメイン（キス（ｋｉｓｓ）ドメイン）を付加することにより、前記分子を操作することが可能であることを見出した。

第一の態様によれば、本発明は、Ｓｍ結合ドメインがｓｍＯＰＴ配列で置き換えられ、アンチセンス配列が１つ以上の他のポリヌクレオチドで置き換えられている、修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡを対象とする。一実施形態において、少なくとも１つの他のポリヌクレオチドが、標的ｐｒｅ−メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）の少なくとも一部のアンチセンスである。別の実施形態において、少なくとも１つの他のポリヌクレオチド（キスドメイン）が、Ｕ７ループとハイブリダイズすることが可能である。更に別の実施形態において、少なくとも１つの他のポリヌクレオチドが、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部のアンチセンスであり、少なくとも１つの他のポリヌクレオチド（キスドメイン）が、Ｕ７ループとハイブリダイズすることが可能である。

故に、本発明は、３’末端から５’末端へと共有結合した以下の要素を含む、修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡを提供する：
・配列番号１の配列を有するポリヌクレオチド、
・配列番号２の配列を有するポリヌクレオチド、並びに
・以下である、１つ以上のポリヌクレオチド
−前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部のアンチセンスであり、且つ
−前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つ（キスドメイン）が、配列番号１のヌクレオチド１２とヌクレオチド２０の間に含まれるヌクレオチド内に含まれる、少なくとも２つのヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能であるもの。

核内低分子リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）は、真核細胞の核内に見出される低分子ＲＮＡ分子の一分類である。それらは、ＲＮＡスプライシング（ｐｒｅ−ｍＲＮＡからのイントロンの除去）、転写因子（７ＳＫ ＲＮＡ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｂ２ ＲＮＡ）の調節、及びテロメアの維持等の種々の重要な過程に関与している。それらは、常に特定のタンパク質と会合しており、結果として生じるＲＮＡ−タンパク質複合体は、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）又は時々ｓｎｕｒｐｓと呼ばれる。多くのｓｎＲＮＡが存在し、それらはＵ１、Ｕ２．．．Ｕ１０と称される。

Ｕ７型のｓｎＲＮＡは通常、ヒストンｍＲＮＡの成熟に関与している。このｓｎＲＮＡは、多数の真核生物種（これまでのところ５６種）において同定されており、これらの種のそれぞれのＵ７ ｓｎＲＮＡは、本発明のために同様に適しているとみなされるべきである。それでも尚、ヒト由来のＵ７ ｓｎＲＮＡの使用が好ましい。本明細書中、「ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ」とは、ヒト由来のｓｎＲＮＡを意味する；ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡはＳＵ７又は二次（ｓｅｃｏｎｄ）Ｕ７ ｓｎＲＮＡとしても知られる；本願の目的のためには、これらの名称は互換的である。好ましい実施形態において、Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、ＧｅｎｂａｎｋエントリーナンバーＮＲ＿０２３３１７．１に対応する配列を有する、１本鎖ポリヌクレオチドである。

野生型Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、ステムループ構造、Ｕ７特異的Ｓｍ配列、及びヒストンｐｒｅ−ｍＲＮＡの３’末端にアンチセンスである配列を含む。

本明細書中、「修飾型ｓｎＲＮＡ」とは、ｓｎＲＮＡの初期の機能に関与する配列が不活性化されたＲＮＡを意味する。例えば、ｓｎＲＮＡ分子は、特定のＳｍ結合ドメイン配列を介して一連の特定のＳｍタンパク質と相互作用して、ｓｎＲＮＰを形成することが知られている。一実施形態において、修飾型ｓｎＲＮＡは、Ｓｍ結合ドメインが別のｓｎＲＮＡ由来のＳｍ結合ドメインと置き換えられたｓｎＲＮＡである。この実施形態において、修飾型ｓｎＲＮＡの機能は、Ｓｍ結合ドメインの交換によって変更される。特に、Ｕ７（通常はヒストンｐｒｅ−ｍＲＮＡ ３’末端のプロセシングに関与する非スプライソソーム系ｓｎＲＮＡ）は、Ｕ７のＳｍ結合ドメインをＵ１及びＵ２（それぞれ、ドナー及びアクセプタースプライス部位のレベルで作用する２つのｓｎＲＮＡ）のＳｍ結合コンセンサス配列へと変換することにより、スプライソソームに向け直された（Gorman et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 95（9）：4929−34, 1998）。好ましい実施形態においては、天然のＳｍ結合部位を配列番号２の配列のＳｍＯＰＴドメインで置換することにより、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの核内濃度を増加させながら、ヒストンｐｒｅ−ｍＲＮＡの成熟を不活性化するために、Ｓｍ結合部位の配列が修飾されている。

ＳｍＯＰＴドメインに加え、Ｕ７は、ヒストンｐｒｅ−ｍＲＮＡの３’末端にアンチセンスである配列を含む。この配列が別の標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡにアンチセンスである配列に置換されている場合、Ｕ７は新たな標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡへと向け直される。従って、ｓｍＯＰＴドメイン及びアンチセンス配列を含む修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡの安定発現は、様々な標的ｍＲＮＡ構造の配列特異的修飾をもたらした（Suter et al., Hum Mol Genet., 8（13）：2415−23, 1999；Vacek et al., Blood, 101（1）：104−11, 2003）。最近になって、本発明者らは、適切に修飾されたマウスＵ７遺伝子をその天然のプロモーター及び３’要素と共に含むＡＡＶ−２／１ベースのベクターの送達後の、骨格筋への高効率な遺伝子導入及び完全なジストロフィンレスキューを示した（Goyenvalle et al., Science, 306：1796−1799, 2004）。

一態様において、本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部へのアンチセンスであるポリヌクレオチドを含む。本明細書中、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部のアンチセンスとは、その配列が標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの前記一部の配列に相補的であるポリヌクレオチドを意味する。それ故、この配列は、少なくとも１つのエクソンのスプライシング部位に向けられたアンチセンスでありうる（即ち、それは前記エクソンのスプライシングを妨害することができる）。アンチセンス配列は、好ましくは（preferentially）、以下からなる群から選択される少なくとも１つの配列に相補的な配列である：５’スプライス部位（ドナー部位）；３’スプライス部位（アクセプター部位）；イントロン性ＢＰ（分岐点（Branching Point））配列；及び随意に内部プリンリッチ配列、より具体的にはエクソン内部スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、及びイントロン性スプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）配列。別の実施形態において、エクソンインクルージョンが望まれる場合、アンチセンス配列は、好ましくは、イントロン性サイレンサー配列（ＩＳＳ）又は末端ステムループ（ＴＳＬ）に相補的な配列である。更に好ましい実施形態において、標的ｍＲＮＡは、その機能が神経筋疾患において改変されるタンパク質をコードしている。更により好ましい実施形態において、前記タンパク質はジストロフィン、ＤＭＰＫ、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２である。

本明細書中で使用される場合、「スプライシング」とは、イントロンが除かれ、エクソンが連結される、転写後のｐｒｅ−ｍＲＮＡの修飾をいう。スプライシングは、スプライソソームと呼ばれる、５つのｓｎＲＮＰで構成される大きなＲＮＡ−タンパク質複合体によって触媒される一連の反応において起き、イントロン内では、３’スプライス部位、５’スプライス部位、及び分岐部位がスプライシングに必要である。ｓｎＲＮＰのＲＮＡ成分は、イントロンと相互作用し、触媒反応に関与し得る。本明細書中で使用される場合、用語「イントロン性スプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）」、「イントロン性サイレンサー配列（ＩＳＳ）」、「末端ステムループ」及び「エクソン内部スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）」は、それぞれイントロン及びエクソン内の配列要素をいい、それらは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内でのトランス作用性タンパク因子の結合により選択的スプライシングを制御し、それによりスプライス部位の差次的な使用をもたらす（Buratti et al., Nucleic Acids Res., 34（12）：3494−510, 2006；Wang and Burge, RNA, 14：802−813, 2008）。本明細書中、「エクソンスキッピング」という用語は、構成的スプライシングの修飾によって成熟ｍＲＮＡからエクソンを排除する過程を意味する。それは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内のエクソン定義配列に相補的であるアンチセンス配列（本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡ内に含まれるものなど）を使用することによる、標的化されたエクソンのスプライシングに関与する鍵となる配列のマスキングを含む。上で論じたように、エクソンスプライシングは、ほぼ全長の半機能的なジストロフィンタンパク質を回復させるために有用であり得る（Wood et al., PLoS Genet., 3（6）：e109, 2007；Du & Gatti, Curr Opin Mol Ther., 11（2）：116−23, 2009）；しかしながら、それは読み枠を維持することなくエクソンを排除することにより、タンパク質を発現抑制すること（silencing）のためにも使用され得る。用語「エクソンインクルージョン」とは、本明細書中で使用される場合、スプライシング欠損に起因して、さもなくば成熟ｍＲＮＡから除外されたであろうエクソンの、完全にプロセシングされたｍＲＮＡへの包含をもたらす過程に関連する。それは通常、ＩＳＳ及び／又はＴＳＬに相補的であるアンチセンス配列（本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡ内に含まれるものなど）を使用して、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内の前記ＩＳＳ及び／又はＴＳＬをマスキングすることを含む。

別の実施形態において、本明細書中に詳述される標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部は、トリヌクレオチドリピート伸長である。更に好ましい実施形態において、トリヌクレオチドリピートはＣＵＧである。なお更に好ましい実施形態において、アンチセンスは、少なくとも１５リピートのトリヌクレオチドＣＡＧを含む。別の好ましい実施形態において、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、その機能が神経筋ジストロフィーにおいて変化するタンパク質をコードしている。更により好ましい実施形態において、前記タンパク質はジストロフィン又はＤＭＰＫである。

本発明者らは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの内因性アンチセンス配列を、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部にアンチセンスである配列で置換することは十分でないことを見出した。アンチセンス配列とＵ７ループとの間でのハイブリダイゼーションによる相互作用が必要である。本明細書中、「Ｕ７ループ」とは、塩基が対合していないＵ７ ｓｎＲＮＡのドメインを意味する。好ましくは、Ｕ７ループは、配列番号１のヌクレオチド１２とヌクレオチド２０との間に含まれるＵ７分子の一部からなる。

本発明に従う効率的なアンチセンス配列は、Ｕ７ループとハイブリダイズすることができる。本明細書中、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な塩基間の水素結合の形成を意味する。アンチセンスとＵ７ループの間の相互作用は、修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡの正しい折り畳みを可能にする。当業者は、適切で安定な折り畳みを保証するために、アンチセンスとＵ７ループの間のハイブリダイゼーションが最小限の強度を必要とする（即ち、最小限の数の連続した塩基が相互作用に関与するべきである）ことを容易に理解するであろう。アンチセンス−Ｕ７ループ相互作用に関与する塩基の数が多くなるほど、この相互作用が強くなることは明白である。好ましくは、塩基の数は少なくとも３つである；より好ましくは、少なくとも４つである。なお更に好ましい実施形態において、相互作用に関与するＵ７ループの塩基は、ＡＣＵＵである。別の更に好ましい実施形態において、相互作用に関わるＵ７ループの塩基は、ＧＣＵＵＵである。

本発明者らは、Ｕ７ループとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド（キスドメイン）を前記アンチセンス配列に付加することによって、非効率的なアンチセンス配列を正すことが可能であることも見出した。前記キスドメインは、Ｕ７ループとハイブリダイズすることができる、いくつかのヌクレオチドを含む。好ましくは、キスドメインは、少なくとも３個のヌクレオチドを含む、より好ましくは、少なくとも４個のヌクレオチドを含む。なお更に好ましい実施形態において、キスドメインは、ＡＡＧＵ、ＧＡＧＵ、ＧＧＧＵ及びＡＧＧＵから選択される配列を有する。別の更に好ましい実施形態において、キスドメインは、ＧＣＡＧＵ、ＧＡＡＧＵ、ＧＣＧＧＵ、ＧＧＡＧＵ、ＧＡＧＧＵ及びＧＧＧＧＵから選択される配列を有する。

本発明は、上記のような修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドも対象にする。本発明に従う遺伝子は、生物学的な産物（即ち、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド）をコードする任意の核酸分子である。それ故、本発明の文脈の中で、遺伝子としては、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成若しくは半合成のＤＮＡが挙げられる。特に、本発明に従う遺伝子は、１つ以上の天然に存在するか又は人工的に産生された非翻訳領域（複数可）を含む、生物学的な産物をコードする任意の核酸でありうる。遺伝子が、本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡを直接コードする配列に限定されず、その発現に必要な調節要素の制御下にある場合が、最も有用である。従って、本発明は、上記修飾型Ｕ７を含む遺伝子であって、調節配列と融合されている前記遺伝子を包含する。多くの強力な構成的プロモーターが当業者に公知である。例えば、当業者は、Eisenbergら（Trends in Genetics 19：362−365, 2003）に記載されたヒトハウスキーピング遺伝子のプロモーターのいずれかを使用し得る。しかしながら、本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡの適切な発現を保証するために、内因性のＵ７プロモーターを使用することがより有利である。なおより有利には、プロモーターは、ヒトＵ７プロモーターである。非常に好ましい実施形態において、プロモーターは、配列番号３の配列を有するヒトＵ７プロモーターである。

ｉｎ ｖｉｖｏで有効な治療用（therapeutic）ＲＮＡ分子を得るために、いくつかの重要なパラメーターが考慮された。これらのＲＮＡの遺伝子が高レベルの発現を生み出す効率的なプロモーター下にクローニングされなければならないだけでなく、加えて、治療用ＲＮＡが組み込まれているＲＮＡの状況は、安定性及び特定の細胞内局在を提供するべきである。更に、下流配列は、本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡの正しい転写終結部位を決定するのを助けるべきである。それ故、本発明の遺伝子は、内在性Ｕ７遺伝子の３’調節配列も含む。使用されるＵ７遺伝子がヒト遺伝子である場合、該ヒト遺伝子の下流配列を使用することが有利である。特に、配列番号４の配列によって表される、前記ヒト遺伝子の下流配列の２３０ヌクレオチドを使用することが最も有利である。

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは、修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。この遺伝子は、上で詳述したように、適切なプロモーター配列の制御下で有利にクローニングされうる。また、本発明のベクターに修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子の下流の適切な３’配列を挿入することは有益である。エクソン（en exon）が読み飛ばされることを保証するために、同一のベクターにおいて、別個の標的（好ましくは５’ドナー部位及びＢＰ配列）に対するアンチセンス配列を有する２つの修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡを使用することは有用であり得る。少なくとも２つの別個のエクソンのスプライス部位に対するアンチセンス配列も、同一のベクターにおいて結合され得る。或いは、いくつかのコンストラクトを用いることが可能である（それぞれ別個のアンチセンス配列を保持し、前記配列は１つ又はいくつかのエクソンに向けられている）。実際には、いくつかのアンチセンス配列（同一のエクソン若しくはいくつかの別個のエクソンに向けられるか又はエクソン及びイントロンに対して向けられる）が結合される場合、以下の場合があり得る：
−アンチセンス配列が同一の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡ内に挿入されており、前記ｓｎＲＮＡがただ１つのベクターによって保持されている、又は
−アンチセンス配列が異なるＵ７ ｓｎＲＮＡに挿入されており、各ｓｎＲＮＡが１つのベクターによって保持されている。

本発明のベクターの起源は、ウイルス由来又は非ウイルス由来のいずれかであり得る。

非ウイルスベクターとしては、プラスミドが挙げられる。そのようなプラスミドは、安全面の理由から、患者の中では複製することができない条件付複製プラスミドであり得る。これらのプラスミドは、特許ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／１０３４３及びＷＯ ２００９／０２７３５１に記載されたプラスミドに基づき得る。裸のプラスミドＤＮＡは、筋肉細胞へと直接注入され得るか（Wolff et al, Science, 247：1465−1468, 1990）、又は組織へと照射される金粒子へ付着され得る（Cheng et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90：4455−4459, 1993）。非常に効率的というわけではないが、これはｉｎ ｖｉｖｏでの長期の低レベル発現をもたらすことができる。プラスミドＤＮＡは、陽イオン性分子（負に荷電した核酸と共に自発性の複合体を形成する）に基づく、「自己集合」系と呼ばれる非ウイルス性遺伝子送達ベクターを用いることでも、細胞へとトランスフェクションされ得る（Eliyahu et al., Molecules, 10：34−64, 2005）。

本発明の好ましい態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルス生活環の複製期に必要な遺伝子（非必須遺伝子）を目的の異種遺伝子で置換することによって、組換えウイルスベクターは、それが通常感染するであろう細胞型に形質導入することができる。そのような組換えウイルスベクターを製造するために、非必須遺伝子は、パッケージング細胞株のゲノムへと組み込まれるか又はプラスミド上でかのいずれかで、トランスに提供される。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）等のウイルスに基づくいくつかのベクターが、遺伝子治療に使用可能である。それらの全てが本発明に包含される。

アデノウイルスベクターは現在、ヒトにおける遺伝子治療において、最も頻繁に使用されているウイルスベクターである。いわゆる第三世代（又は「ガットレス（gutless）」）アデノウイルスベクター（Lindermann and Schnittler, Thromb. Haemost., 102：1135−1143, 2009）の使用が、本発明における使用に好ましい。当業者は前記アデノウイルスベクターの特徴及び使用を完全に承知しているため、前記ベクターが本明細書に詳述される必要はない。

或いは、当業者は、レンチウイルスベクターを使用して、本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡを送達し得る。好ましくは、前記レンチウイルスは、自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスである。それでも尚、任意のレンチウイルスベクターが本発明の文脈の中で使用されうる。レンチウイルスベクターの構築及び操作は、当業者に周知である。

本発明に従う好ましいウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス又はＡＡＶに基づく。８つの血清型の中で、本発明に従って神経筋疾患を治療するために使用されるＡＡＶは、好ましくはＡＡＶ１（即ち、そのカプシドが血清型１である）である。ＡＡＶ１は、筋肉細胞の形質導入に最も効率的であることが示されている。一方、導入遺伝子に結合されるウイルス起源の配列（特にＩＴＲ）は、好ましくは、ＡＡＶ２起源のものである。結果として得られる本発明のＡＡＶに基づくベクターは、好ましくは、２／１偽型を有する。しかしながら、当業者は、本発明がこの特定のベクターに限定されないことを容易に理解するであろう；実際、全てのＡＡＶ血清型は、本発明における使用に同様に適している。例えば、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９も横紋筋細胞を効率的に形質導入し、一方ＡＡＶ５は脳における神経細胞の形質導入において高効率である（Markakis et al., Molecular Therapy, 18：588−593, 2010）；それ故、それらの全ては、本発明の文脈の中で成功裏に使用され得る。アデノウイルスベクター及びレンチウイルスベクターのように、上記ＡＡＶに基づくベクターは、すでに、遺伝子治療の目的で、当業者によって広く使用されている（例えば、Michelfelder and Trepel, Adv Genet., 67：29-60, 2009を参照されたい）；それ故、前記ＡＡＶベクターの構築方法及び使用方法を詳述する必要はない。

本発明に従うベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用及び／又はｅｘ ｖｉｖｏ適用においても使用され得る。本発明のベクターは、好ましくは、標的筋肉における直接注入によって、或いは全身性の静脈内、動脈内送達、又は脳若しくは脳脊髄液への送達によって使用されるが、それらは、例えば患者から採取された分化した筋肉細胞において直接的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで潜在的なアンチセンス配列の効率を試験するためにも使用され得る。更に、これらのベクターが、筋肉分化が可能な細胞（例えば、筋芽細胞又は別の筋原幹細胞（ＣＤ１３３^＋細胞（Torrente et al., Cell Transplant., 16（6）：563−77, 2007）、ＳＭＡＬＤ^＋細胞（Vauchez et al., Mol Ther. 17（11）：1948−58, 2009）、メソアンジオブラスト（mesangioblast）細胞、若しくは周皮細胞など）（これらの全ては筋肉細胞の前駆細胞である））へのトランスフェクションに導入される場合、次いで、前記トランスフェクションされた細胞は、患者に移植され得る。当該分野の方法により多能性幹細胞又はｉＰＳへと形質転換したヒト細胞を使用することも可能である（例えば、Takahashi et al., Cell, 131：861−872, 2007；Yamanaka, Cell Stem Cell., 1（1）：39−49, 2007；Park et al., Nature, 451（7175）：141−6, 2008；Park et al., Nat Protoc., 3（7）：1180−6, 2008；EP 2 096 169；WO 2008/118820；US2008/0280362を参照されたい）。従って、前記ｉＰＳは、本発明のベクターによってトランスフェクションされ、患者に移植され得る。

従って、本発明は、本発明のベクターによってトランスフェクションされた単離された真核細胞も包含する。前記細胞は、好ましくは、血液由来若しくは骨格筋由来の筋原細胞、筋芽細胞、又は筋肉分化が可能な細胞である。本発明の特定の実施形態において、筋肉分化が可能な細胞は、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）である。

本発明はまた、治療有効量の本発明のベクター及び医薬上許容される担体を含む、神経筋疾患の治療のための治療組成物に関する。別の態様において、ベクターの代わりに、本発明の医薬組成物は、医薬上許容される担体のみならず、上記のように本発明のベクターによってトランスフェクションされた有効量の細胞を含む。一実施形態において、前記医薬組成物は、以下の疾患を含む（しかしこれらに限定されない）神経筋疾患の治療用である：デュシェンヌ型（ＤＭＤ）、ベッカー型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋緊張性（特にＤＭ１）、眼咽頭型、遠位型、エメリ・ドレフュス型、及びＳＭＡ。より好ましくは、本発明の治療組成物は、ＤＭＤ、ＤＭ１又はＳＭＡを治療するのに使用される。

本発明は、以下を含む医薬組成物を提供する：
ａ）有効量の本発明のベクター又はトレンスフェクションされた細胞、及び；
ｂ）不活性又は生理学的に活性でありうる、医薬上許容される担体。

本明細書中で使用される場合、「医薬上許容される担体」としては、生理学的に適合性のあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤などが挙げられる。適切な担体、希釈剤及び／又は賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組み合わせの１つ以上が挙げられる。多くの場合、組成物中に、糖、多価アルコール、又は塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが好ましいであろう。特に、適切な担体の関連例としては、以下が挙げられる：（１）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ〜７．４、約１ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含むか又は含まない）、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、及び（３）５％（ｗ／ｖ）ブドウ糖；トリプタミン等の抗酸化剤及びＴｗｅｅｎ ２０等の安定化剤も含み得る。本発明のベクターがＳＭＡを治療するよう意図されている場合、マンニトールは周知の血液脳関門妨害剤（interruptive）であることから、マンニトールを担体として使用することが可能である（Fu et al., Molecular Therapy, 8：911−917, 2003）。

本明細書中の組成物は、特定の疾患が治療されるために必要に応じて、更なる治療薬剤も含み得る。例えば、前記組成物は、修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡの遺伝子を保持するベクターに加え、別の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子を含む第二のベクターを含み得る。前期修飾型Ｕ７遺伝子は、上記のように、同一のエクソンに若しくは異なるエクソンに向けられたか、又はエクソン及びイントロンに向けられたアンチセンスを含み得る。

本発明の組成物は多様な形態でありうる。これらとしては、例えば、液体、半固体、及び固体の剤形が挙げられるが、好ましい形態は目的とする投与及び治療への応用の様式に依存する。治療目的を達成するための、本発明に従う組成物の投与は、標的心筋組織への、局所投与、筋肉内投与、局所領域投与、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、心筋内投与、心膜投与、心外膜投与若しくは経冠動脈内（via intracoronary）投与によるか、又は脳内投与によるか若しくは脳脊髄液への投与によるものであり得る。好ましくは、心筋内投与、心外膜投与、心膜投与又は冠動脈内投与は、針又はカテーテルを使用して行われる。典型的な好ましい組成物は、注入可能又は不溶解性（infusible）の溶液の形態である。

本発明の一実施形態に従い、本発明のベクターは、標的ジストロフィー筋肉組織に局所的な様式で投与される。別の実施形態において、本発明のベクターは、脳内投与されるか又は脳脊髄液へと投与される。投与の部位は、本発明のベクターが治療することを意図している病態に依存するであろう：筋肉への投与は、神経筋ジストロフィーに最も効果的であろうことは明らかであり、一方、脳又は脳脊髄液への投与は、ＳＭＡに特に有用であろう。標的組織にベクターを投与する任意の適切な手段が、本発明の文脈の中で使用され得るが、好ましくは、そのような標的筋肉組織、脳、又は脳脊髄液への局所的な注入は、針を使用してベクターを筋肉、脳、又は脳脊髄液へ直接注入することによって達成される。用語「注入すること（injecting）」は、ベクターが標的組織に強制的に導入されることを意味する。任意の適切な注入装置が本発明に従って使用され得る。

本発明のベクターがジストロフィー筋肉へ又は脳へ若しくは脳脊髄液へ直接注入される場合、医薬組成物は、好ましくは液体の形態である。注入のための無菌の組成物は、適切な溶媒中に必要量の本発明のベクターを取り込み、続いて精密濾過によって無菌化することにより調製され得る。溶媒又は媒体として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組み合わせが使用され得る。多くの場合、組成物中に、糖、多価アルコール、又は塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが好ましいであろう。これらの組成物は、アジュバント、特に湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤及び安定化剤も含有し得る。注入のための無菌の組成物は、使用時に無菌の水又は任意の他の注入可能な無菌の媒体中に溶解され得る無菌の固体組成物の形態でも調製され得る。

１日当り、体重１キログラム当り、約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ程度の投与量レベルが、上記状態の治療に有用である（１日当り、患者１人当り、約０．５ｍｇから７ｇ）。有効な用量は、神経筋疾患を患っている所定の対象の体重及び状態に依存して変わるが、所定の対象及び状態のための適切な用量を決定することは、当業者の技術範囲内であるとみなされる。

本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、細胞タンパク質の正常な機能を回復するために有用である。より具体的には、本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、又は有害なｍＲＮＡの根絶を促進することができ、それ故結果として生じる細胞タンパク質は、完全に又は少なくとも部分的に機能的である。故に本発明は、細胞を本発明のベクターと接触させる工程を含む、エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、又は有害なｍＲＮＡの根絶によって細胞タンパク質の機能を回復する方法にも関する。本発明の修飾型Ｕ７ ｓｎＲＮＡの使用は、それ故、特定の種類の病態に限定されず、スプライシング欠損に起因する任意の疾患の治療に応用され得る。それでも本願の文脈の中で、前記細胞タンパク質は、好ましくは、その機能が神経筋疾患において改変されるタンパク質である。なおより好ましくは、前記細胞タンパク質は、ジストロフィン、ＤＭＰＫ又はＳＭＮである。

従って本発明は、有効量の本発明のベクターのいずれかを、好ましくは上記のような医薬組成物で、投与することによって筋肉疾患を治療する方法も提供する。従って本発明は、本発明のベクターの医薬としての使用にも関する。より具体的には、本発明のベクターは、以下の疾患を含む（しかしこれらに限定されない）神経筋疾患を治療するための医薬として使用される：デュシェンヌ型（ＤＭＤ）、ベッカー型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋緊張性（特にＤＭ１）、眼咽頭型、遠位型、エメリ・ドレフュス型、及びＳＭＡ。より好ましくは、本発明のベクターは、ＤＭＤ、ＤＭ１又はＳＭＡを治療するため使用される。

本発明は、例えば、神経筋疾患の治療のための、１つ以上の記載したベクター及び前記ベクターの使用のための説明書を含む、キットも含む。説明書は、ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで使用するための指示を含み得る。典型的には、キットは、ベクターを含む区画を有するであろう。ベクターは、凍結乾燥形態、液体の形態、又はキット中に含められるのに適している他の形態であり得る。キットは、キット中の説明書に記載されている方法を実施するために必要な追加要素、凍結乾燥粉末を再構成するための無菌の溶液、患者に投与する前にベクターと合わせるための追加の薬剤、及び患者にベクターを投与するのを助ける道具なども含み得る。

図面の説明
ｈＵ７−ＣＡＧ_１５によるＣＵＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡのサイレンシング。（ａ）ループ、Ｓｍ−Ｏｐｔ及びＣＡＧアンチセンス配列を表示する、ｈＵ７−ｓｎＲＮＡ−ＣＡＧ_１５（ｈＵ７−ＣＡＧ_１５）の構造。（ｂ）典型的なノザンブロット及びｈＵ７−ＣＡＧ_１５レンチウイルスベクター（4-8x106 vg/mL）で形質導入したＤＭ１筋肉細胞（１３／８００ ＣＴＧ）におけるＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現の解析（ｎ＝５）。（ｃ）ｈＵ７−ＣＡＧ_１５を形質導入したＤＭ１細胞（８００ ＣＴＧ）の核（青）内におけるＣＵＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡフォーカス（赤いスポット）の数のＦＩＳＨ解析（ｎ＝４）。（ｄ）ＤＭ１に転換した筋肉細胞（１３００ ＣＴＧ）の核及び細胞質画分における、正常及びＣＵＧ^ｅｘｐ ＤＭＰＫ、ＧＡＰＤＨ、Ｕ６ｓｎＲＮＡ ｍＲＮＡ並びにＤＭＰＫ ｐｒｅ−ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析。伸長したＤＭＰＫ対立遺伝子のエクソン１０内に位置するＢｐｍＩ制限酵素部位多型は、正常及びＣＵＧ^ｅｘｐ対立遺伝子産物を区別することを可能にする。 ＤＭ１筋肉細胞におけるｈＵ７−ＣＡＧ_ｎの発現の結果（ａ）７、１１又は１５ ＣＡＧのアンチセンス配列を含むｈＵ７−ＣＡＧ_ｎベクター（4 x 106 vg/mL）で形質導入したＤＭ１細胞（１３／８００ ＣＴＧ）における正常及びＣＵＧ^ｅｘｐ ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの発現（ｎ＝３）。 （ｂ）ＤＭ１細胞におけるスプライシング制御因子ＭＢＮＬ１の局在。 （ｃ）分化したＤＭ１筋肉細胞（２０００ ＣＴＧ）におけるＢＩＮ１（ブリッジングインテグレーター１（bridging integrator1））、ＤＭＤ（ジストロフィン）及びＬＤＢ３（サイファー（cypher））の転写産物の選択的スプライシング誤調節の是正（ｎ＝３）。 （ｄ）融合指数として定量したＤＭ１筋肉細胞（２０００ ＣＴＧ）の筋原性分化（ｎ＝６）。 ヒトＵ７遺伝子の天然のプロモーター、ＣＡＧ_１５アンチセンス配列（赤）、Ｓｍ結合ドメイン（Ｓｍ−Ｏｐｔ、青）、ループ（緑）及びヒトＵ７遺伝子の３’下流要素を含む修飾型ヒトＵ７遺伝子の配列。 （ａ）ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの発現を、ｈＵ７−ＣＡＧ_１５レンチウイルスベクターの濃度を増加させて形質導入したＤＭ１筋肉細胞（８００ ＣＴＧ）において解析した。（ｂ）ＣＵＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡフォーカスの再分配を、ｈＵ７−ＣＡＧ_１５レンチウイルスベクターの濃度を増加させて形質導入したＤＭ１細胞（８００ ＣＴＧ）の核において決定した。 ｈＵ７−ＣＡＧ_１５を発現する野生型筋芽細胞（１３／１８ ＣＴＧ）におけるＤＭＰＫ ｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって解析した（エクソン９〜エクソン１０）。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを、ローディングコントロールとして使用した（ｎ＝４）。 （ａ）ＤＭ１細胞（８００ ＣＴＧ）におけるスプライシングされたＤＭＰＫ ｍＲＮＡアイソフォームＥ１４／１６（エクソン１５及びＣＵＧトラクトを欠く）の発現を、ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡをローディングコントロールとしてＲＴ−ＰＣＲによって解析した（ｎ＝３）。（ｂ）ＤＭ１細胞におけるＤＭＰＫタンパク質レベルを、ＤＭＰＫだけでなくＣＲＰタンパク質も検出するＭＡＮＤＭ１抗体を使用して、ウェスタンブロットによって調べた（ｎ＝７）。ＣＲＰのレベルは、ＤＭ１細胞において変化しなかったため、等しく添加されたことを示す内部コントロールとして使用した。 ＣＵＧリピートを有するオフターゲットの転写産物の変化（倍）を、７、１１又は１５ ＣＡＧのアンチセンス配列を発現するｈＵ７−ＣＡＧ_ｎレンチウイルスベクターで形質導入したＤＭ１筋芽細胞（８００ ＣＴＧ）においてＲＴ−ＰＣＲによって解析した。 Ｕ７及びＵ７ｓｍＯＰＴの模式図。 （ａ）野生型マウスＵ７；（ｂ）野生型ヒトＵ７；（ｃ）Ｕ７ｓｍＯＰＴの仮説上の折り畳み：「キスドメイン」の必要性。 エクソン２３の決定に関与する重要なモチーフ（motives）を標的とする種々のコンストラクトを注入したＴＡ筋肉の横断切片におけるジストロフィンレスキュー（ＳＤ：スプライスドナー−ＢＰ２２：分岐点イントロン２２）。

実験例
修飾型ｈＵ７−ｓｎＲＮＡを使用することによるＤＭ１における変異型ｍＲＮＡの選択的破壊

材料及び方法

細胞培養
ヒト筋肉細胞を、倫理規定に関するフランスの法律に従って、Edom et al., Dev Biol, 164：219−229, 1994に記載されたように、骨格筋の生検又は剖検から単離した。野生型（ＷＴ）及びＤＭ１筋芽細胞を、２０％ＦＣＳ及び５μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したハムＦ１０培地中で、５％ＣＯ２及び３７℃で培養した。分化を引き起こすために、サブコンフルエント培養物から増殖培地を除き、１０μｇ／ｍＬインスリン及び１００μｇ／ｍＬトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭ培地によって置換した。伸長されたＤＭＰＫ対立遺伝子上にＢｐｍＩ制限酵素部位多型を含むＤＭ１線維芽細胞（Hamshere et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 94：7394−7399, 1997）を、以前に記載されたような誘導性Ｍｏｏｄシステム（Chaouch et al., Hum Gene Ther, 20：784−790, 2009）を使用して、不死化し、筋肉細胞へと転換した。

レンチウイルス作製及び形質導入
自己不活性化ＨＩＶ−１ベースレンチウイルスベクター、ｐＲＲＬ−ｈＵ７−ＣＡＧ_ｎは、以前に記載されたｐＲＲＬ−ｃＰＰＴ−ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥベクター（Follenzi et al., Nat Genet, 25：217−222, 2000）から作り出した。ＶＳＶ−Ｇ−偽型ベクターは、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって作製した（Charrier et al., Gene Ther, 12：597−606, 2005）。ウイルス粒子を含有する馴化培養液を回収し、超遠心によって濃縮した。ベクター力価（ベクターゲノムvg/mL）は、Charrier et al., Gene Ther, 12：597−606, 2005に記載されたように、感染した細胞のゲノムＤＮＡについての定量ＰＣＲによって決定した。１ｘ１０^６から１ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬを使用して、１．５ｘ１０^５のヒト筋肉細胞を形質導入した。ベクターの形質導入は、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で一晩行ない、形質導入された細胞を解析の前に少なくとも１週間培養し、増殖させた。

ＲＮＡ単離及びノザンブロット
細胞を、プロテイナーゼＫ緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ ＳＤＳ及び０．５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ）中で、４５分間、５５℃で溶解した。その後、ＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離した。ＲＮＡはＮＰ−４０存在下での低張溶解によって、以前に記載されたように（Hamshere et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 94:7394−7399, 1997）調製した核及び細胞質画分からも単離した。ノザンブロット解析のために、８〜１０μｇのＲＮＡを、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含有する１．３％アガロースＭＯＰＳ−ゲル上で分離し、１０ｘＳＳＣを用いたキャピラリートランスファーによって、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上にトランスファーした。ブロットを、ハイブリダイゼーション緩衝液（２％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１ｘＳＳＰＥ、１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、２％デンハート）中で、６８℃で一晩、ランダムプライム法で^３２Ｐ標識した（ＤＭＰＫ ｃＤＮＡのＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片）プローブを用いてハイブリダイズさせた。シグナルをホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で解析し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量した。全ての値を、５’末端^３２Ｐ標識１８Ｓ ｒＲＮＡ−オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション後の１８Ｓ ｒＲＮＡシグナルに対して標準化した。

ＲＴ−ＰＣＲ解析
製造者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、全量２０μＬ中で、１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。続いて、１μＬのｃＤＮＡ調製物を、標準的手順に従い（ＲｅｄｄｙＭｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、半定量ＰＣＲ解析に使用した。ＰＣＲ増幅は、それぞれの遺伝子についての増幅の直線範囲内で、２０〜３５サイクル行った。ＧＡＰＤＨのシグナルを標準化のために使用した。ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドで染色された１〜３％アガロースゲル上で解析した。定量は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して行った。選択的スプライシング解析について、選択した遺伝子及びエクソンは、ＤＭ１患者の筋肉において改変されると以前に記載されている：ＤＭＤ（ジストロフィン）のエクソン７８（Nakamori et al., Muscle Nerve, 36：251−257, 2007）、ＬＤＢ３（サイファー）のエクソン７（Lin et al., Hum Mol Genet, 15：2087−2097, 2006）及びＢＩＮ１（ブリッジングインテグレーター１）のエクソン１１（Hammer et al., 投稿中）。エクソンインクルージョンの割合を定量し、アイソフォームのシグナルの全強度と比較したインクルージョンのパーセンテージとして表した。ＤＭＰＫ解析については、ＤＭＰＫの２つの対立遺伝子を区別するために、Hamshere et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 94：7394−7399, 1997に記載されたように、６μＬのＰＣＲ混合液を、２．５ユニットのＢｐｍＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する２５μｌの切断混合液に入れ、３７℃で一晩インキュベートした。

以下のプライマーを使用した：
ＧＡＰＤＨ−Ｆ、ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ−Ｒ、ＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ（配列番号６）
Ｕ６ｓｎＲＮＡ−Ｆ、ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ（配列番号７）
Ｕ６ｓｎＲＮＡ−Ｒ、ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ（配列番号８）
ＤＭＰＫ ｅｘｏｎ ９−ｅｘｏｎ １０−Ｆ、ＣＡＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＧＴＧＣ（配列番号９）
ＤＭＰＫ ｅｘｏｎ ９−ｅｘｏｎ １０−Ｒ、ＧＣＴＴＧＣＡＣＧＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧ （配列番号１０）
ＤＭＰＫ ｉｎｔｒｏｎ ９−ｉｎｔｒｏｎ １０−Ｆ、ＣＴＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴ（配列番号１１）
ＤＭＰＫ ｉｎｔｒｏｎ ９−ｉｎｔｒｏｎ １０−Ｒ、ＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＴＣ（配列番号１２）
ＤＭＰＫ ｓｐｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｅｘｏｎ １４／１６−ｅｘｏｎ １６−Ｆ、ＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡ（配列番号１３）
ＤＭＰＫ ｓｐｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｅｘｏｎ １４／１６−ｅｘｏｎ １６−Ｒ、ＴＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＣＡＴＣＣＡ（配列番号１４）
ＣＰＡ６−Ｆ、ＡＣＴＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＣＣＣＣＣＡ（配列番号１５）
ＣＰＡ６−Ｒ、ＴＴＴＧＡＧＴＣＧＴＧＡＴＣＧＴＣＴＧＣ（配列番号１６）
ＬＴＢＰ３−Ｆ、ＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＧＴＴＴＣＣＧ（配列番号１７）
ＬＴＢＰ３−Ｒ、ＧＡＡＡＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＧＣＣＣＴＧ（配列番号１８）
ＬＲＰ８−Ｆ、ＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＣ（配列番号１９）
ＬＲＰ８−Ｒ、ＧＴＧＣＴＣＧＧＴＡＧＣＡＣＣＴＣＴＴＣ（配列番号２０）
ＴＭＣＣ１−Ｆ、ＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＣ（配列番号２１）
ＴＭＣＣ１−Ｒ、ＣＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＴＣＴＧ（配列番号２２）
ＣＡＳＫ−Ｆ、ＣＡＧＡＧＴＴＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴ（配列番号２３）
ＣＡＳＫ−Ｒ、ＡＣＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号２４）
ＭＡＰ３Ｋ４−Ｆ、ＡＡＧＧＧＣＡＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＴＧＧ（配列番号２５）
ＭＡＰ３Ｋ４−Ｒ、ＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＣＴ（配列番号２６）
ＢＩＮ１−ｅｘｏｎ １１−Ｆ、ＡＧＡＡＣＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧ（配列番号２７）
ＢＩＮ１−ｅｘｏｎ １１−Ｒ、ＴＣＧＴＧＧＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＧ（配列番号２８）
ＤＭＤ−ｅｘｏｎ ７８−Ｆ、ＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡ（配列番号２９）
ＤＭＤ−ｅｘｏｎ ７８−Ｒ、ＧＡＴＡＣＴＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＣＧＣ（配列番号３０）
ＬＤＢ３−ｅｘｏｎ ７−Ｆ、ＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣ（配列番号３１）
ＬＤＢ３−ｅｘｏｎ ７−Ｒ、ＧＡＣＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＡＴＧＣＴＧ（配列番号３２）

ＦＩＳＨ及び免疫蛍光法
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、Ｃｙ３標識ペプチド核酸（ＣＡＧ）_７プローブを使用して、Taneja, Biotechniques, 24：472-476, 1998に記載されたように行った。核１つ当りのフォーカスの数を決定するために、５００を超えるＤＭ１細胞を、少なくとも３回の独立した実験において数えた。ＦＩＳＨ免疫蛍光法（ＩＦ）複合実験は、ＭＢＮＬ１モノクローナル抗体（Ｇ． Ｍｏｒｒｉｓによって開発されたＭＢ１ａ[Holt et al., Am J Pathol, 174：216−227, 2009]）、続いてＡｌｅｘａ ４８８結合ヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体を使用して、Klein et al., Exp Cell Res, 314：1652−1666, 2008に記載されたように行った。画像は、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡及びソフトウェア（Ｌｅｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して取得し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）を用いて加工した。融合指数解析については、デスミン（Ｄ３３、ＤＡＫＯ）抗体を使用して、Jacquemin et al., J Cell Sci, 120：670−681, 2007に記載されたように、分化した筋肉細胞についてＩＦを実施し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｓｉｇｍａ）を用いて核を対比染色した。１５００を超える核を数え、融合指数を、デスミン陽性細胞における核の総数のパーセンテージとして、分化した筋管（＞２筋核）における核の数により、決定した。

ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは、以前に記載されたように（Furling et al., Am J Pathol, 162：1001−1009, 2003）、ＤＭＰＫ抗体（ＭＡＮＤＭ１）を使用して標準的な方法で実施した。

統計解析
集団のデータは、平均＋／−ＳＥＭとして表した。集団間比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェアを使用して、独立スチューデントｔ検定（図１ｂ、１ｃ、５及び６）及びニューマン−クールズ検定（図２ａ、２ｂ、２ｃ）により実施した。Ｐ＜０．０５（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）である場合、集団間の差を有意であるとみなした。

結果
本発明者らは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシング現象の阻害とは異なる修飾型ｈＵ７−ｓｎＲＮＡの新規機能を説明する。ＤＭＰＫ転写産物の３’ドメインの伸長された（ＣＵＧ）_ｎトラクトを標的とするポリＣＡＧ配列を含むｈＵ７−ｓｎＲＮＡは、野生型対立遺伝子の産物に影響することなく、変異ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの特異的な核内（nuclear）分解を引き起こした。筋緊張性ジストロフィーの原因であるＲＮＡ機能獲得型毒性の消失は、非コードリピート伸長疾患における遺伝子サイレンシングのためのｈＵ７−ｓｎＲＮＡの使用を支持する。

１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）は、成人において最も一般的な神経筋ジストロフィーである（Harper. Myotonic dystrophy Third Edn., W.B. Saunder, London., 2001）。ＤＭ１は、優性遺伝性疾患であり、ＲＮＡ機能獲得型疾患のグループに属し（Shin et al., M.S. Neurosci Lett, 466：99−102, 2009）、ＤＭプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’非翻訳ドメインにおける伸長されたＣＴＧリピートに起因する（Brook et al., Cell, 68, 799, 1992）。数千までの伸長されたＣＵＧリピート（ＣＵＧ^ｅｘｐ）を含む変異ＤＭＰＫ転写産物は、核内に捕捉される（Davis et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 94：7388−7393, 1997）。そのような蓄積は、選択的スプライシングの調節を変化させ、続いていくつかのｍＲＮＡ転写産物の誤ったスプライシング及び神経筋機能障害をもたらす（Ranum et al., Annu Rev Neurosci：29, 259−277, 2006）。実際に、ＣＵＧ^ｅｘｐ−ＤＭＰＫ ｍＲＮＡは、それらがＲＮＡ結合タンパク質と結合し、安定なリボ核タンパク質複合体又はフォーカスを形成するように、折りたたまれる（Miller et al., EMBO J, 19：4439−4448, 2000）。これらの複合体は、主にｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ−ｌｉｋｅ １（ＭＢＮＬ１）タンパク質を隔離し、この必須のｍＲＮＡスプライシング制御因子の機能喪失を確実にする（Lin et al., Hum Mol Genet, 15：2087−2097：2006）。

ＤＭ１における表現型レスキューの戦略は、マウスＤＭ１モデルにおいてＣＵＧ伸長を標的とする合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して評価されてきた（Wheeler et al., Science, 325：336−339, 2009；Mulders et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 106：13915−13920, 2009）。これらの研究は、ＣＵＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡを妨害及びアンフォールドしてＭＢＮＬ１をフォーカスから遊離させ、次いでそれをその全体的なスプライシング機能に利用可能にすることを目的として、モルフォリノ又は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのいずれかの局所送達を使用した。しかしながら、合成オリゴの使用は、繰り返しの処置を必要とする。この問題を克服するために、本発明者らは、効率的で持続性の効果を保証するために、ＣＡＧアンチセンス配列を含む最適化されたヒトｈＵ７−ｓｎＲＮＡを設計した。ヒトＵ７遺伝子を含む約０．５ｋｂの断片を、ヒトゲノムＤＮＡから増幅した。ｈＵ７−ｓｎＲＮＡ転写産物を、以前に記載されたように最適化した（Goyenvalle et al., Science, 306：1796−1799, 2004）。まず、そのＳｍ結合ドメインを、効率的なｓｎＲＮＰの集合を可能にし、その核内蓄積を増加させる適切なＳｍタンパク質と結合するように、Ｕ２−ｓｎＲＮＡ（Ｓｍ−Ｏｐｔ）由来の標準的なＳｍ配列（Stefanovic et al., Nucleic Acids Res, 23：3141−3151, 1995）によって置き換えた。続いて、ｈＵ７−ｓｎＲＮＡの天然ヒストンｐｒｅ−ｍＲＮＡ相補配列を、ポリＣＡＧによって置き換えた（図１ａ）。操作されたｈＵ７−ｓｎＲＮＡ−ＣＡＧ_ｎ（ｈＵ７−ＣＡＧ_ｎ）は、その天然のプロモーター及び３’下流要素の制御下に維持した（図３）。次いで、このコンストラクトを、ヒト骨格筋細胞への高効率な遺伝子導入のためにレンチウイルス骨格へとクローニングした。

選ばれたＣＴＧ伸長を有するＤＭ１患者から単離された筋肉細胞を、最適化されたｈＵ７−ＣＡＧ_１５（１５ ＣＡＧ リピート）を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。これらの細胞において、正常な対立遺伝子は、３７リピート未満を示し、一方変異対立遺伝子は、２００から２０００リピートの範囲にわたるＣＴＧ伸長を示した。形質導入された細胞を、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ安定性を評価する前に、少なくとも１週間培養し続けた。ノザンブロット解析によって、伸長されたＤＭＰＫ転写産物の定常状態レベルが、ｈＵ７−ＣＡＧ_１５を発現するＤＭ１細胞において７１から８２％有意に（Ｐ＜０．００１）減少したことが示された（図１ｂ）。伸長されたＤＭＰＫ ｍＲＮＡの消失は、ベクター用量依存的な様式で起こった（図４ａ）。重要なことに、正常なＤＭＰＫ ｍＲＮＡは維持された。この現象は、１３／１８ ＣＴＧリピートを有する野生型筋芽細胞においても確認された（図５）。更に、エクソン１５及びＣＵＧトラクトの両方を欠く、正常ＤＭＰＫアイソフォームＥ１４／１６（Tiscornia et al., Mol Cell, 5：959−967, 2000）の選択的スプライシングは、ｈＵ７−ＣＡＧ_１５によって影響を受けず（図６ａ）、処理したＤＭ１細胞においてＤＭＰＫタンパク質レベルの変化はみられなかった（図６ｂ）。ｈＵ７−ＣＡＧ_ｎ系の使用が、細胞継代を通して有害な転写産物の継続的且つ恒久的な標的破壊を維持することを可能にしたことも特筆すべきである。

変異型ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの消失を更に評価するために、本発明者らは、通常ＤＭ１の核内に多数のフォーカスとして蓄積するＣＵＧ^ｅｘｐリボ核タンパク質複合体を調べた。予期されたように、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析によって、処理したＤＭ１筋芽細胞におけるこれらの核内構造の用量依存的な劇的な消失が示された（図１ｃ及び図２４ｂ）。ｈＵ７−ＣＡＧ_１５で処理したＤＭ１筋芽細胞の６０％までがフォーカスを示さなかった（Ｐ＜０．００１）。この細胞集団の更なる２５％は、単一のかすかなフォーカスのみを示した。また、細胞質コンパートメントにおいては残存フォーカスが観察されなかった。伸長された対立遺伝子上に制限酵素部位多型を含むＤＭ１細胞（Hamshere et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 94：7394−7399, 1997）の核及び細胞質のＲＮＡ分画によって、変異型転写産物が核内に保持され、細胞質に運び出されないことが確認された（図１ｄ）。ｈＵ７−ＣＡＧ_１５の存在下において、ＣＴＧ^ｅｘｐ対立遺伝子からの転写産物は、細胞質画分においては検出されず、このことは核内でのＣＴＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡの選択的分解のメカニズムの存在を実証する。著しいことに、このメカニズムはＤＭＰＫ ｍＲＮＡに関係せず、このことはｈＵ７−ＣＡＧ_１５がｍＲＮＡ生成のレベルではなくフォーカスのレベルで作用したことを示唆する。

ＣＡＧアンチセンス配列の長さの効果を評価するために、本発明者らは、短縮したＣＡＧ配列（７及び１１リピート）を含む更なるｈＵ７−ｓｎＲＮＡコンストラクトを設計した。それらの全てが、ＤＭ１細胞においてＣＵＧ^ｅｘｐ−ＤＭＰＫ ｍＲＮＡを標的とし、効率的にサイレンシングした（Ｐ＜０．０１）。しかしながら、これらの短縮されたコンストラクトは、１３ ＣＵＧリピートを含む正常ＤＭＰＫ対立遺伝子産物にも影響を与えた（Ｐ＜０．０１）（図２ａ）。特異性のそのような喪失は、本発明者らに、７から１６リピートの範囲にわたるＣＵＧトラクトを有する６つのヒト転写産物も解析することを促した（図６）。これらの遺伝子産物のうち４つは、ｈＵ７−ＣＡＧ７_{１１又は１５のいずれか}を発現するＤＭ１細胞において影響を受けなかった。それにもかかわらず、ＣＰＡ６（７ ＣＵＧ）及びＬＲＰ８（１１ ＣＵＧ）転写産物の発現の変化は、ＣＡＧアンチセンス配列の長さの短縮と相関した。重要なことに、より長いＣＡＧ_１５は、ＣＰＡ６にもＬＲＰ８にも有意に影響しなかった。

次いで、本発明者らは、ｈＵ７−ＣＡＧ_１５が、毒性のあるＣＵＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡの病態生理学的な結果を逆転させることができるかを評価した。我々は、ＭＢＮＬ１の隔離及び選択的スプライシングの異常な調節等の、ＤＭ１の特徴に着目した。ＦＩＳＨ−免疫蛍光法複合解析によって、ＣＵＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡをサイレンシングすることが、処理したＤＭ１細胞における、核内ＣＵＧ^ｅｘｐ凝集体からの隔離されたＭＢＮＬ１の遊離、及びＭＢＮＬ１の正常な再配置をもたらすことが示された（図２ｂ）。

分化したＤＭ１筋肉細胞において異常なスプライシングを受ける、ＢＩＮ１、ＤＭＤ及びＬＤＢ３等のいくつかの遺伝子について、ＤＭ１のスプライシング誤調節の結果を調べた。これらの遺伝子のスプライシング特性は、ｈＵ７−ＣＡＧ_１５存在下で有意に（Ｐ＜０．０１）正常化され、一方、ｈＵ７−ＣＡＧ_１５は、野生型細胞においてはこれらの遺伝子のスプライシングに影響しなかった（図２ｃ）。長いＣＴＧ伸長を有するＤＭ１筋肉細胞が、分化欠損を示すことも知られている（Furling et al., Hum Mol Genet, 10：2079−2087, 2001）（Ｐ＜０．００１）。ここで、ｈＵ７−ＣＡＧ_１５存在下において、処理したＤＭ１筋芽細胞の融合指数は、かなり回復し（Ｐ＜０．０１）、野生型筋芽細胞のそれと同様のレベルにまでなった（図２ｅ）。

結論として、本発明者らのデータは、Ｕ７−ＣＡＧ系が、有害なＣＵＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡの持続性の選択的破壊を可能にしたことを示す。ＭＢＮＬ１及びおそらく他のｍＲＮＡ結合因子は、その後フォーカスから遊離し、処理したＤＭ１細胞におけるスプライシング及び分化の改善をもたらした。ＣＡＧアンチセンス配列の長さは重要であるように思われる。１５ＣＡＧリピート未満であると、オフターゲットの発生が、変異型ｍＲＮＡの破壊によってもたらされる利益を相殺し得る。Ｕ７−ＣＡＧ_１５がＣＵＧ^ｅｘｐ−ｍＲＮＡの選択的破壊を起こしたメカニズムそのものは、完全には決定されていない。操作されたＵ７−ｓｎＲＮＡ並びにモルフォリノ及び２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート（それらは、ＤＭ１において成功裏に適用されてきた（Wheeler et al., Science, 325 ：336−339, 2009；Mulders et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 106：13915−13920, 2009））は、ＲＮａｓｅ活性を作動させないはずである。それどころか、これらの化合物は、エクソンスキッピング及びエクソンインクルージョンの両方の戦略において、選択的スプライシングを強制するために一般に使用される（Du & Gatti, Curr Opin Mol Ther, 11（2）：116−23, 2009）。ＣＡＧアンチセンス分子存在下でのＣＵＧ^ｅｘｐ−ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの選択的破壊は、標準的なＲＮＡ干渉メカニズムには基づかないであろう。むしろ、ＣＵＧ^ｅｘｐ−ＤＭＰＫ／ＣＡＧ_ｎへテロ二本鎖の消失又は加速された核内崩壊は、変異ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの本来の不安定性に起因しているであろう（残念ながら未処理のＤＭ１細胞ではＭＢＮＬ１によって相殺される現象）。

キスドメインの概要（delineation）

材料及び方法
マウス及びＡＡＶ注入
全ての動物の処置は、機関に承認されたプロトコールに従い、且つ適切な生物学的封じ込めの下で実施した。８週齢ｍｄｘマウスに、ＡＡＶベクターを含有する５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水をＴＡへと注入した（表１を参照されたい）。１ヵ月後、該マウスを殺し、筋肉を回収し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結し、−８０℃で保存した。

コンストラクト及び組換えＡＡＶベクター
基準のコンストラクトＡＡＶ＿Ｕ７＿ＳＤ２３／ＢＰ２２は、ＷＯ ２００６／０２１７２４中に以前に記載された。修飾型コンストラクトについては、Ｕ７ループにおいて、又は仮説上のループ結合に対応するアンチセンス配列において、１から４塩基対を変異導入ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって変化させる（詳細な配列については表２を参照されたい）。ＡＡＶ２／１偽型ベクターは、記載したように２９３細胞におけるトランスフェクションにより調製し、ベクター粒子を、トランスフェクション後４８時間で採取した細胞ライセートから塩化セシウム勾配法で精製し、定量ドットブロットハイブリダイゼーションによって力価測定した。力価を表１に示す。

組織学
筋肉の全長にわたり２００μｍ間隔で切った一連の８μｍ横断切片を、免疫組織化学によってジストロフィンについて調べた（Ｃ末端ドメインに対するＮＣＬ−ＤＹＳ２モノクローナル抗体、ＮｏｖｏＣａｓｔｒａ）。マウントした切片を、共焦点レーザー顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）によって解析した。中間の組織は、ｍＲＮＡ解析のために回収した。

ＲＮＡ解析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、プールした中間切片から全ＲＮＡを単離した。ジストロフィンｍＲＮＡを検出するために、ランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下でＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を用いて、全ＲＮＡについて、まず逆転写を行った。次いで、ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより、ｃＤＮＡについて、ネステッドＰＣＲを行った。最初の反応は、Ｅｘ２０ｅｘｔ（配列番号３３：５’−ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＧ−３’）及びＥｘ２６ｅｘｔ（配列番号３４：５’−ＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＴＧＴＣＡＴＣＣ−３’）プライマーを用いて、３０サイクル（９４℃／３０秒；５５℃／１分；７２℃／２分）で行った。次いで、最初の反応の２μＬを使用し、Ｅｘ２０ｉｎｔ（配列番号３５：５’−ＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＡＧＣ−３’）及びＥｘ２６ｉｎｔ（配列番号３６：５’−ＣＣＴＧＣＣＴＴＴＡＡＧＧＣＴＴＣＣＴＴ−３’）を用いて、２５サイクルで増幅させた。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で解析した。

結果
以下のセクションは、ｍｄｘマウスモデルにおいてＵ７ｓｍＯＰＴ−エクソンスキッピングを使用することによるジストロフィンレスキューを達成するためのキスドメインの必要性を示す実験を説明する。ｍｄｘマウス（Bulfield et al., 1984；Ryder-Cook et al., 1988）は、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３内に１塩基置換を有し、これはポリペプチド鎖の中途での終結を起こし（Sicinski et al., 1989）、そのためジストロフィンの全長４２７ＫＤａの筋肉でのアイソフォームが産生されない。ジストロフィン遺伝子のエクソンフェージング（phasing）によれば、ｍＲＮＡスプライシングの過程においてエクソン２３を読み飛ばすことによって、短縮されたジストロフィン（準ジストロフィン）の翻訳が可能であり得る。

ｍｄｘジストロフィンｍＲＮＡ上のエクソン２３を含むナンセンス変異を読み飛ばすために、多数のアンチセンス配列を設計した。これらの配列をＵ７ｓｍＯＰＴと結合させ、骨格筋への高効率な遺伝子導入のためにＡＡＶ１カプシド内にパッケージされたＡＡＶ２ベースベクターへ導入した。約１０Ｅ１２ウイルスゲノムの単一ベクター投与で、成体のｍｄｘマウスの前脛骨筋（ＴＡ）の筋肉内に注入し、１ヵ月後にジストロフィンレスキューを解析した（図１０）。キスドメインとループとの間の相互作用を許すコンストラクトのみが、効率的にジストロフィンをレスキューする。

Claims (25)

1. ３’末端から５’末端へと共有結合した以下の要素を含む、修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ：
   ・配列番号１の配列を有するポリヌクレオチド
   ・配列番号２の配列を有するポリヌクレオチド、及び
   ・以下である１つ以上のポリヌクレオチド
   −前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部のアンチセンスであり、且つ
   −前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つ（キスドメイン）が、配列番号１のヌクレオチド１２とヌクレオチド２０の間に含まれるヌクレオチド内に含まれる少なくとも２つのヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である。
2. 前記標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部が、少なくとも１つのエクソンの１つのスプライス部位である、請求項１に記載の修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ。
3. スプライス部位が５’ドナー部位、３’アクセプター部位、分岐点（ＢＰ）配列、エクソン性スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列、イントロン性スプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）配列、並びにイントロン性サイレンサー配列（ＩＳＳ）及び末端ステムループ（ＴＳＬ）からなる群から選択される、請求項２に記載の修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ。
4. 標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの少なくとも一部が、トリヌクレオチドリピート伸長である、請求項１に記載の修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ。
5. トリヌクレオチドがＣＵＧである、請求項４に記載の修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ。
6. アンチセンスが少なくとも１５リピートのトリヌクレオチドＣＡＧを含む、請求項５に記載の修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ。
7. 前記キスドメインがＡＡＧＵ、ＧＡＧＵ、ＧＧＧＵ及びＡＧＧＵから選択される配列を有しているか、又は前記キスドメインがＧＣＡＧＵ、ＧＡＡＧＵ、ＧＣＧＧＵ、ＧＧＡＧＵ、ＧＡＧＧＵ及びＧＧＧＧＵから選択される配列を有している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾型ｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド。
9. 前記遺伝子が制御配列に融合している、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
10. 前記制御配列がヒトＵ７プロモーターを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
11. 前記プロモーターが配列番号３の配列を有する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
12. 前記制御配列がｈｕＵ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子下流配列を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
13. 前記下流配列が配列番号４の配列を有する、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
14. 請求項８〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
15. 前記ベクターがプラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１４に記載のベクター。
16. 請求項１４又は１５のいずれか一項に記載のベクターによってトランスフェクトされた、単離された真核細胞。
17. 前記細胞が、骨格筋細胞、筋芽細胞、又は筋肉へ分化可能な細胞である、請求項１６に記載の細胞。
18. 前記細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１８に記載の細胞。
19. 請求項１４若しくは１５のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
20. 医薬としての、請求項１４若しくは１５のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
21. 神経筋疾患を治療又は予防するための、請求項１４若しくは１５のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
22. 神経筋疾患が神経筋ジストロフィーである、請求項２１に記載のベクター又は細胞。
23. 神経筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー又は１型筋緊張性ジストロフィーである、請求項２２に記載のベクター又は細胞。
24. 神経筋疾患が脊髄性筋萎縮症である、請求項２１に記載のベクター又は細胞。
25. 細胞を請求項１４又は１５のいずれか一項に記載のベクターと接触させる工程を含む、エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、又は有害なｍＲＮＡの根絶により細胞タンパク質の機能を回復する方法。