JP2018533975A

JP2018533975A - トリヌクレオチドリピート伸長が関与する遺伝的疾患の予防または治療における一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用

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Publication number: JP2018533975A
Application number: JP2018536344A
Authority: JP
Inventors: アダムソン，ピーター; ユハトゥルネン，ジャンヌ; ヨハネスプラテンバーグ，ゲラルドゥス
Original assignee: プロキューアールセラピューティクスツーベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 2015-10-05
Filing date: 2016-10-05
Publication date: 2018-11-22
Anticipated expiration: 2036-10-05
Also published as: CN108291225A; AU2016335032B2; WO2017060317A1; EP3359667A1; US20200362348A1; US10760076B2; AU2016335032A1; JP2022070913A; US20180282724A1; CA3000061C; CN108291225B; CA3000061A1; JP7089763B2; KR20180053753A

Abstract

本発明は、遺伝的な眼疾患、好ましくはフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）などのＲＮＡ毒性によって引き起こされる眼のジストロフィー障害の治療または予防における使用のための、トリヌクレオチドリピート単位を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、イントロン配列内に存在するトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）配列伸長部をターゲティングすることにより、かかるＴＮＲ伸長部と相互作用する細胞内タンパク質の排除が関与する疾患が予防される。

Description

本発明は、医学の分野に、具体的には、遺伝的障害の予防および治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、トリヌクレオチドリピート伸長と関連する遺伝的疾患、例えば、角膜内皮障害の予防および／または治療に関する。

角膜内皮は、角膜内面上の非新生細胞の単層であり、角膜実質を前房水から分離する（図１を参照）。角膜内皮は、膠原性の角膜実質への陽イオンおよび水分子の流入による角膜への過剰な水分供給を妨げる、一般に脱膨潤（deturgescence）と呼ばれる継続的プロセスによって角膜透明性の維持に関与する。

フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）は、角膜グッテー（guttae）の存在を伴う一般的な遺伝性の角膜内皮細胞性変性障害であり、それは角膜内皮層下における微視的なコラーゲンの沈着である。４０歳以降の米国人の成人は、最高５％が角膜グッテーを示す。グッテーの存在はＦＥＣＤを示すが、一般には全くの無症状性の軽度の疾患を意味する。進行した（重度の）疾患は、ほんの一部のグッテー患者で発症する。進行したＦＥＣＤは、広範囲なグッテー、内皮細胞損失、角膜浮腫、角膜混濁、ならびに角膜浮腫および混濁による視力喪失を特徴とする。角膜浮腫、混濁およびそれに続く視力喪失は、内皮細胞変性および脱膨潤の喪失による直接的な結果である。ＦＥＣＤによる視力喪失は、全ての層の角膜移植（全層角膜移植術）を必要とし、米国のみでも毎年１４，０００例を超える処置をもたらす、最も頻繁に生じる徴候である。ＦＥＣＤに利用可能な治療は他にない。角膜移植は、大部分が治療に成功しているが、侵襲的であり、約３０％の拒絶反応率と関係し、それは他の固形臓器の同種移植と変わらないという不利点がある。角膜内皮のみを交換する代替的なアプローチ（角膜内皮移植術（endokeratoplasty））を実施することもできるが、それは非常に経験豊富な外科医だけが可能である。いずれの介入も、ドナー角膜に由来する、移植可能な角膜ボタン（corneal button）であれ、角膜由来内皮細胞であれ、ドナー材料の不足という問題がある。ＦＥＣＤはまた、白内障手術などの他の処置のリスクでもあり、屈折矯正手術、例えば、レーシック（ＬＡＩＳＫ：Laser-Assisted in situ Keratomileusis）の禁忌であり、というのも、これらの技術が更なる角膜内皮細胞の喪失をもたらすからである。

ＦＥＣＤは早発性ＦＥＣＤと老人性ＦＥＣＤに分けられ、早発性ＦＥＣＤでは典型的にはグッテーが存在しないため、これらは異なる疾患であると考えられる。早発性ＦＥＣＤは稀であり、内皮基底膜の構成要素である、コラーゲンＶＩＩＩのα２−サブユニットをコードするＣｏｌ８２Ａ２などの遺伝子と関連している。老人性ＦＥＣＤでは、特定の稀な常染色体優性変異が、様々な遺伝子、例えばＫＣＮＪ１３（カリウムチャネル）、ＳＬＣ４Ａ１１（ホウ酸ナトリウム共輸送体）およびＺＥＢ１（Ｚｉｎｃ−フィンガーＥ−ボックスホメオドメインタンパク質１）で見出さている。しかしながら重要なことに、大多数の常染色体優性の老人性ＦＥＣＤの遺伝的基礎は、ゲノムワイド関連研究によると、転写因子−４（ＴＣＦ４）遺伝子に起因している（Baratz KH et al. E2-2 protein and Fuch's corneal dystrophy. N Engl J Med 2010 363:1016-1024）。これらの研究において、ＴＣＦ４遺伝子のイントロン中で一塩基多型（ＳＮＰ）が同定されており（染色体１８ｑ２１．２上のｒｓ６１３８７２）、それは具体的には老人性ＦＥＣＤ患者に分類される。ＦＥＣＤの進行リスクの増加は、ホモ接合対象では３０倍に増加する計算であり、ｒｓ６１３８７２マーカーは、７６％の精度でケースと対照とを識別可能であった。１８ｑ２１．２〜１８ｑ２１．３２に位置する染色体領域に関連するＦＥＣＤについての先の知見によると、ＴＣＦ４遺伝子座の少なくとも２つの領域がＦＥＣＤの進行と関係することがわかった、（Sundin OH et al. A common locus for late onset Fuchs corneal dystrophy maps to 18q21.2-q21.32. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006 47:3919-3926）。他の幾つかの研究では、ＴＣＦ４トリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）の存在が、ｒｓ６１３８７２マーカーよりも良好なＦＥＣＤの予測手段であることが示されている（Wieben ED et al. A common trinucleotide repeat expansion within the transcription 4 (TCF4, E2-2) gene predicts Fuchs corneal dystrophy. PLoS One 2012 7:e49083；Wieben ED et al. Comprehensive assessment of genetic variants within TCF4 in Fuchs' endothelial corneal dystrophy. Invest Ophtalmol Vis Sci 2014 55:6101-6107；Mootha VV et al. Association and familial segregation of CTG18.1 trinucleotide expansion of TCF4 gene in Fuchs' endothelial corneal dystrophy. Invest Ophtalmol Vis Sci 2014 55:32-42；Stamler JF et al. Confirmation of the association between the TCF4 risk allele and Fuchs endothelial corneal dystrophy in patients from the Midwestern United States. Ophthalmic Genet. 2013 34(1-2):32-4；Kuot A et al. Association of TCF4 and CLU polymorphisms with Fuchs' endothelial dystrophy and implication of CLU and TGFBI proteins in the disease process. Eur J Hum Genet. 2012 20(6):632-8； Thalamuthu A et al. Association of TCF4 gene polymorphisms with Fuchs' corneal dystrophy in the Chinese. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 52(8):5573-8；Xing C et al. Transethnic replication of association of CTG18.1 repeat expansion of TCF4 gene with Fuchs' corneal dystrophy in Chinese implies common causal variant. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 55(11):7073-8；Nanda GG et al. Genetic association of TCF4 intronic polymorphisms, CTG18.1 and rs17089887, with Fuchs' endothelial corneal dystrophy in an Indian population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 55(11):7674-80）。

不安定なリピートは、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）を引き起こす遺伝子のコード領域内などの、種々の遺伝子領域で見出されておりそれにより、タンパク質機能および／またはタンパク質フォールディングの変化により疾患の表現型がもたらされる。不安定なリピート単位は、非コード領域、例えば、１型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）を引き起こすＤＭＰＫ遺伝子の３’−ＵＴＲ、脆弱Ｘ症候群を引き起こすＦＭＲ１遺伝子の５’−ＵＴＲ内など、およびイントロン配列、例えば、２型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ２）を引き起こすＺＮＦ９遺伝子の第１のイントロン内などでも見出されている。ＤＭ１は成人における最も一般的な筋ジストロフィーであり、主に骨格筋、心臓および脳における遺伝性、進行性、退行性、多臓器性の障害である。ＤＭ１は、不安定なトリヌクレオチド（ＣＴＧ）ｎリピート（上記のとおり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’−ＵＴＲ中）の伸長によって引き起こされる。ＤＭ２は、テトラヌクレオチド（または４ヌクレオチド）（ＣＣＴＧ）ｎリピート（以下、４ヌクレオチドリピートは「ＱＮＲ」と称する）伸長（上記のとおり、ＺＮＦ９遺伝子のイントロン１中）によって引き起こされる。ＴＮＲの不安定性はまた、例えばＸ−関連球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、幾つかの脊髄小脳失調（ＳＣＡ遺伝子ファミリー）、Ｃ９０ＲＦ７２関連筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症（Ｃ９０ＲＦ７２ＡＬＳ／ＦＴＤ）およびＦＥＣＤなど、他の幾つかの障害における主な原因であることが見出されている。

過剰なＴＮＲ伸長は「ＲＮＡ毒性」と称される現象をもたらす場合もあり、それは上記の疾患の主な原因となる。現状では、これらの反復要素が有毒な「機能獲得」ＲＮＡに転写される結果、ドミナントネガティブな薬理作用が表れ、ある一つの疾患アレルが、正常なアレルの存在にもかかわらず、疾患を引き起こしうる。ＤＭ１の場合、ＲＮＡ毒性はｍＲＮＡのプロセシングレベルで明確に表れ、ＭｕｓｃｌｅＢｌｉｎｄ様１（ＭＢＮＬ１）タンパク質およびＣＵＧ三塩基リピート結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ１）などのスプライシング調節因子が、それらの正常な細胞機能から排除される場合、タンパク質が過剰なＴＮＲと結合する。かかるタンパク質−ＲＮＡ複合体は、核内ＲＮＡ凝集体（foci）としてＤＭ１細胞で視認できる（Mankodi et al. Ribonuclear inclusions in skeletal muscle in myotonic dystrophy types 1 and 2. Ann Neurol 2003 54(6):760-8）。ＭＢＮＬ１はスプライシング調節因子であるが、また３’−ＵＴＲと結合し、したがって、ＤＭ１において代替的なポリアデニル化の制御破綻を生じさせる（Batra et al. Loss of MBNL1 leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease. Mol Cell 2014 56(2):311-22）。最近の報告では、リピートＲＮＡが毒性タンパク質種に翻訳されうることを示唆している（Cleary and Ranum. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Curr Opin Genet Dev 2014 26:6-15）。

ＦＥＣＤは、ｒｓ６１３８７２マーカーが位置するイントロンとは異なる、ＴＣＦ４遺伝子のイントロン領域における、（ＣＴＧ）ｎＴＮＲ伸長と関係することが認められている（Mootha et al. 2014；Wieben et al. 2012）。ＦＥＣＤ患者の７９％（白血球ＤＮＡにおいて示された）が５０以上のリピート（≧１５０ヌクレオチド）を有する一方で、症例対照の９５％が４０未満のリピート長を有することが示されており、それは、５０以上のリピート長がＦＥＣＤを高度に予測する一方で、より短い４０〜５０の間の場合には疾患の発症にも寄与することを示す。当分野では一般に、ＴＣＦ４遺伝子における４０リピート以上のサイズのＴＮＲ伸長の出現は、疾患を予測し、ＦＥＣＤに至る潜在的なＲＮＡ毒性メカニズムを示すことが知られている（Du et al. RNA toxicity and missplicing in the common eye disease Fuch's endothelial corneal dystrophy. J Biol Chem 2015 290(10):5979-90）。ＲＮＡ凝集体は、ＴＣＦ４遺伝子のＴＮＲ伸長に関するホモ接合およびヘテロ接合両方のＦＥＣＤ患者由来の線維芽細胞において同定された。ＲＮＡ凝集体は、非罹患個体に由来する線維芽細胞では見出されなかった。非罹患個体は一般に、約２０のＴＮＲを有する野生型ＴＣＦ４遺伝子を有するようである。ヘテロ接合ＦＥＣＤ患者（ＲＮＡ凝集体が検出された線維芽細胞を有する）は、１つの正常長のアレル（２０のＴＮＲ）と、４０以上のＴＮＲの伸長を有するもう１つのアレルとを有していた。ホモ接合ＦＥＣＤ患者では、両方のアレルが４０以上のＴＮＲを含んでいた。したがって、ＴＣＦ４の伸長ＴＮＲ領域における４０未満のリピートは、非病因性の遺伝子型と考えることができる。ＲＮＡ凝集体はＦＥＣＤ患者サンプルの角膜内皮でも同定されているが、非罹患個体では見出されなかった。かかるＲＮＡ凝集体の存在は、他の多くの遺伝子（Du et al. 2015）のＲＮＡスプライシングパターンの変化と関係しているようである。これらのスプライシングパターンの変化は、ＤＭ１にみられる同様の変化とも一致している（Wheeler et al. Correction of ClC-1 splicing eliminates chloride channelopathy and myotonia in mouse models of myotonic dystrophy. J Clin Invest 2007 117(12):3952-7；Savkur RS et al. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet 2001 29(1):40-7；Li YJ et al. Replication of TCF4 through association and linkage studies in late-onset Fuchs endothelial corneal dystrophy. PLoS One. 2011 6:e18044）。一般的な結論は、多くのＦＥＣＤのケースが、ＴＣＦ４遺伝子に由来するイントロンＲＮＡにおけるＴＮＲ伸長の存在に起因する、角膜内皮細胞におけるＲＮＡ毒性によって引き起こされる、ということである。ＲＮＡ毒性は、延長されたリピートに関してヘテロ接合またはホモ接合の患者で見出されており、それは、ＴＮＲ伸長を有するＲＮＡと相互作用するタンパク質を排除する結果である可能性が高い。かかるタンパク質は、この排除を通じて、細胞内でもはやその通常の機能を実行することができない。

ＦＥＣＤを治療するための、全角膜移植または内皮層移植により良好な結果が達成されうるにもかかわらず、そのような処置は、上記で概説したように未だ大きな欠点に直面することが明らかである。ゆえに、ＦＥＣＤに罹患するか、またはそれを発症するリスクを有する患者を、望ましくは移植の代替的で適切な手段により治療するための、未解決の医学的ニーズが存在する。

本発明は、好ましくは、遺伝的疾患に罹患するか、または前記遺伝的疾患に罹患するリスクを有するヒト対象における、前記遺伝的疾患の予防および／または治療における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、標的ＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的ＲＮＡ分子内のイントロン配列に存在するトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）伸長部と結合することができる、前記オリゴヌクレオチドに関する。前記遺伝的疾患は、好ましくはＲＮＡ毒性によって引き起こされ、イントロン配列から転写されＴＮＲ伸長部を含むＲＮＡは、細胞タンパク質を排除することにより、それらが細胞内でその通常の機能を実行することを不能にする。本発明のＡＯＮを用いて治療および／または予防される好ましい遺伝的疾患は、ヒトにおける眼ジストロフィー、より好ましくは、ＴＣＦ４遺伝子のＴＮＲ伸長によって引き起こされるフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）と称される疾患である。好ましい態様では、前記ＴＮＲ伸長部は、配列５’−（ＣＵＧ）ｎ−３’を含み、ｎは４０以上（好ましくは５０以上）の整数である。更に別の好ましい実施形態において、本発明による使用のためのＡＯＮは、配列５’−（ＣＡＧ）ｍ−３’を含み、ｍは２〜６６の整数であり、好ましくは、ｍは２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の整数である。本発明はまた、本明細書で定義されるＡＯＮ、および本明細書で開示されるＡＯＮのいずれか一つを含む医薬組成物に関する。

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＦＥＣＤの治療もしくは予防方法に関し、前記方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド、または本発明による組成物を、実質内注射により前記ヒト対象の角膜実質に、または前房内注射により前記ヒト対象の前房水に、または硝子体内注射により前記ヒト対象の後眼房に投与することを含む。

眼の正面部分の概略図（左の拡大図）であり、（左から右に向かって）眼の外側の角膜上皮層、上皮と実質との間のボ−マン層、角膜実質、デスメ膜、角膜内皮層および前房水を示す図である。健常な個体の、２４のＣＴＧリピート（太字）を有するヒトＴＣＦ４イントロン３の配列（配列番号１）を表す図である。下線は側方のエクソン配列を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（ＡＯＮ）およびヒトＴＣＦ４遺伝子のイントロン３内でのそれらの相補性部分の例を示す図である。配列番号２は、ヒトＴＣＦ４遺伝子のイントロン３のｍＲＮＡ中で見出された５’−（ＣＵＧ）ｎ−３’リピート（の一部）を表し、この場合、ＣＵＧリピートは７回反復で表される。配列番号３〜１５は、本発明によるＡＯＮを表す。配列番号１０１、１０２および１０３（配列表では１０ヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドを表示できず、またこれらの３つのＡＯＮは９ヌクレオチド長であるため、このように命名）もまた、本発明によるＡＯＮを表す。配列番号１６は、対照オリゴヌクレオチドを表し、配列番号２と同様、ＣＵＧリピートを含むセンス鎖を表す。ウサギの眼の中へのＣｙ５標識オリゴヌクレオチドの硝子体内注射後の、角膜内皮と関連する蛍光の時間依存的増加、および角膜実質における蛍光の全体的増加を表す写真である。ＴＣＦ４遺伝子内に４０超のＣＵＧリピート伸長部を有するヘテロ接合のＦＥＣＤ患者に由来するヒト角膜内皮細胞内のＲＮＡ凝集体（ピンク色のスポット）の低減における、治療的オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）７の効果を示す図である（上部の３パネル）。対照を下部の３パネルに示す（未だ凝集体が明確に視認できる）。治療的オリゴヌクレオチドを２００ｎＭの濃度で用い、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔをトランスフェクトした。ＲＮＡ凝集体は、Ｃｙ３標識（ＣＡＧ）７オリゴヌクレオチドプローブを用いた蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて同定した。試験した細胞の核内のＲＮＡ凝集体の数を自動画像分析により決定し、ヒストグラムとして表示した（図の下部）。顕微鏡写真およびヒストグラムの両方から観察できるように、対照（無関係）オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションと比較し、治療的オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）７はＲＮＡ凝集体数の低減に効果的であった。ＴＣＦ４遺伝子中に４０超のＣＵＧリピートのヘテロ接合伸長を有する、５例の異なるＦＥＣＤ患者（Ｐ４４、Ｐ５０、Ｐ６３、Ｐ８８およびＰ９２）に由来するヒトの角膜内皮細胞内のＲＮＡ凝集体を低減させる際の、治療的オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）７の効果を示す図である。実験は、これらの更に５例の患者から得た細胞を今回使用した以外、図５の場合と同様に行った。各ヒストグラムは、一人の患者のものを表す。５人目の患者からのみ得た細胞では、ＡＧ（ＣＡＧ）２−ＬＮＡは一度試験した追加のＡＯＮである。この配列を有し、架橋型核酸（ＬＮＡ）の構造を有するこのＡＯＮは、（ＣＡＧ）７のＡＯＮよりも劣るようであった。右側のグラフは、全５例の患者の結果を一緒にした、核あたりの凝集体の平均を表す。「ｃｔｒｌＡＯＮ」は、対照の無関係オリゴヌクレオチドによる処理を意味する。

本発明は、遺伝的疾患、好ましくはＲＮＡ毒性によって引き起こされる疾患、より好ましくはＲＮＡ毒性の結果である眼疾患の予防または治療に使用できる方法および分子に関する。より具体的には、本発明は、ＭＢＮＬ１などの、スプライシング制御に関与するタンパク質の排除、特に前駆体ｍＲＮＡのイントロンに存在する過剰なＴＮＲ伸長部へのかかるタンパク質の結合を通じた排除に関連する疾患の治療における使用のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。本発明のＡＯＮで治療される好ましい疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）であり、それは、ＴＣＦ４転写物のイントロン３内の過剰なＴＮＲ伸長部の発生と関係し、スプライシング制御タンパク質ＭＢＮＬ１のかかる過剰なＴＮＲ伸長部への過剰な結合を引き起こすものである。言い換えると、また好ましい態様では、本発明は、ＴＣＦ４遺伝子の転写物内の過剰なＴＮＲ伸長部と結合するＡＯＮを投与することにより、過剰なＴＮＲ伸長部へのタンパク質の望ましくない結合を防止する、ＦＥＣＤの予防または治療における使用のためのＡＯＮに関する。ＭＢＮＬ１の過剰なＴＮＲ伸長部への結合の証となるものは、患者の罹患した細胞核のいわゆるＲＮＡ凝集体の形成である。ゆえに、本発明のＡＯＮは、特に角膜内皮細胞におけるＲＮＡ凝集体の形成を除去または防止することにより、ＦＥＣＤなどの遺伝的（眼）疾患の治療または予防において使用される。

図２は健常な個体のヒトＴＣＦ４遺伝子のイントロン３（コーディング鎖の５’から３’）の配列、およびその５’および３’末端の一続きのエクソン配列を示す。上記で概説したように、ＦＥＣＤの進行に関連するＴＣＦ４遺伝子のイントロン３のＣＴＧリピート伸長の存在は当分野で周知である。国際公開第２０１１／１０１７１１号パンフレットは、オリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲ増幅を用いてこれらのＣＴＧリピート伸長を（ヒトのサンプルにおいて）検出する方法を開示する。国際公開第２０１１／１０１７１１号パンフレットで開示されるオリゴヌクレオチドおよび方法は、ＦＥＣＤを有するかまたはＦＥＣＤを発症するリスクを有する患者を診断し、個体が角膜移植またはレーザー矯正を受けることを回避すべきか否かを決定するのに用いられる。国際公開第２０１１／１０１７１１号パンフレットは、ＦＥＣＤの症状の進行を防止または軽減する方法を開示または示唆していないことに留意されたい。

上記で概説したように、ＤＭ１もまた、ＲＮＡ毒性から生じる疾患であり、欧州特許第２０４９６６４号明細書は、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の転写物内のＴＮＲ伸長部を標的とするＡＯＮを用いたＤＭ１の治療方法を開示している。欧州特許第２０４９６６４号明細書は、ヒトのｃｉｓ−エレメントリピートの不安定性に関連する、ＨＤ、脊髄小脳失調、ＨａｗＲｉｖｅｒ症候群、Ｘ連鎖脊髄性および延髄筋萎縮ならびに歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮、ＤＭ１、８型脊髄小脳失調、ならびに２型ハンチントン舞踏病などの、種々の障害を治療するための、配列５’−（ＣＡＧ）ｎ−３’を有するＡＯＮを開示している。ＤＭ１におけるＴＮＲリピート伸長は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’−ＵＴＲに見出される。その他では、ＤＭ１と相関するヒトＤＭＰＫ遺伝子のエクソン１５の転写物を標的とした、（ＣＡＧ）ＡＯＮの使用が記載されている（Mulders et al. 2009. Triplet-repeat oligonucleotide-mediated reversal of RNA toxicity in myotonic dystrophy. Proc Natl Acad Sci USA 106(33):13915-20)。その著者らは、ｍＲＮＡの細胞質内プール、ならびに一次および成熟した伸長（ＣＵＧ）ｎ転写物の核内プールの両方が標的となると仮定している。

ＤＭ１はＲＮＡ毒性により媒介される疾患であり、毒性を有するＤＭＰＫプレｍＲＮＡは、ＦＥＣＤ患者におけるＴＣＦ４転写物と同じ繰り返し単位（ＣＵＧ）を有するＴＮＲ伸長部を含有する。ＭＢＮＬ１は、ＦＥＣＤ患者の場合と同様にＤＭ１患者においても排除されていと考えてもよい。したがって、ＤＭ１およびＦＥＣＤが、同じＡＯＮで同様に治療できるという仮定は興味深い。しかしながら、生じているＲＮＡ毒性プロセスがＤＭ１とＦＥＣＤとの間で相違する点に留意することが重要である。ＤＭ１においては、タンパク質は、一次転写物内のみに存在するのではなく、成熟ＲＮＡ（イントロンが既にスプライシングアウトされた）内に存在する３’−ＵＴＲＲＮＡ配列と結合することにより排除され、ゆえにそれらは核または細胞質内に位置しうる。これに対して、ＦＥＣＤにおいては、ＲＮＡ毒性は、イントロンＲＮＡ（一次プレｍＲＮＡの一部として、または、大抵の場合は成熟ｍＲＮＡからスプライシングアウトされたイントロンＲＮＡとして）へのタンパク質の結合による排除によって引き起こされ、いずれの場合も核内に保持される。ゆえに、ＤＭ１の治療でオリゴヌクレオチドが作用する部位は、それらがＦＥＣＤの場合に作用する部位とは異なる細胞区画である。したがって、ＡＯＮのアプローチが、ＤＭ１の場合と同様に、ＦＥＣＤでも作用するとは限らない。何故なら、ＦＥＣＤまたは他のあらゆるイントロンＴＮＲ伸長に関連する疾患の治療に用いられるＡＯＮは、細胞内の異なる区画（すなわち核内）において、異なるプロセシングおよび転写物輸送の時期において、排他的に機能する筈だからである。この他、ＭＢＮＬ１などの排除されたタンパク質がＡＯＮ処理の際に放出されたか否か、またはどの程度の効率で放出されるかも自明ではない。ＤＭ１と比べたＦＥＣＤの顕著な相違は、ＭＢＮＬ１が、スプライシングアウトされ、分解されていないイントロンラリアットと結合すると仮定されることであり、それは、エクソン配列（３’−ＵＴＲおよび５’−ＵＴＲを含むＲＮＡ内のエクソン配列も含む）とは異なる動態により処理される。

興味深いことに、本発明の発明者らは、ＭＢＮＬ１またはこれらのＲＮＡ凝集体に共通する他の因子の排除がＦＥＣＤの病理に機構的に関与する場合には、ＤＭＰＫの、角膜内皮での発現が見られる場合には、ＴＮＲ伸長を含むＤＭＰＫがＦＥＣＤを進行させる同様のリスクをもたらす筈であると理解した。興味深いことに、ＤＭＰＫはヒトの眼で実際に発現し（Winchester CL et al. Characterization of the expression of DMPK and SIX5 in the human eye and implications of pathogenesis in myotonic dystrophy. Hum Mol Genet. 1999 8:481-492）、またＦＥＣＤは筋強直性ジストロフィー患者で見出されている。４例のＤＭ患者のコホートにおいて、各患者では両目にＦＥＣＤを有していた（Gattey D et al. Fuchs endothelial corneal dystrophy in patients with myotonic dystrophy: a case series. Cornea 2014 33:96-98）。また、検死解剖した筋強直性ジストロフィー患者の眼において、進行したＦＥＣＤの臨床的特徴である角膜内皮細胞のかなりの喪失があることに留意されたい（Winchester et al. 1999）。本発明の発明者らはまた、ＦＥＣＤを発症するＤＭ１患者のＦＥＣＤが、本明細書で開示されるＡＯＮアプローチを用いて治療されうることを理解した。しかしながら、より重要なこととして、本発明の発明者らは、過剰なＴＮＲ伸長をイントロン３に有するＴＣＦ４転写物をターゲティングすることにより、ＦＥＣＤ患者の場合と同様、かかる患者のＦＥＣＤを効果的に治療できることを理解した。

上記のように、ＤＭ２もまた、イントロン配列内のＮＲ伸長（ＱＮＲ）の結果生じる疾患である。ＤＭ２患者は、ＺＮＦ９遺伝子のイントロン内にＱＮＲ伸長を有する。しかしながら、観察されるＲＮＡ毒性は、ＤＭ２とＦＥＣＤとの間では異なると考えられる。ＤＭ２においては、ＺＮＦ９ＲＮＡ自体のスプライシングが遮断されるという事実に起因し、ＱＮＲｓを有する（スプライスされていない）イントロンＲＮＡが蓄積すると考えられるが、それにより転写物（および機能性タンパク質）のレベルの低減がもたらされる。ＦＥＣＤにおいては、機能性ＴＣＦ４の欠如が見られない（下記参照）。

現況技術では、ＴＣＦ４転写物のケースのように、イントロン内にある（ＣＵＧ）ベースのＴＮＲ伸長部をターゲティングする可能性を教示しておらず、また既に議論したいずれの参考文献も、角膜変性、例えばＦＥＣＤなどの予防または治療における使用のためのＡＯＮを開示も示唆もしない。この点を更に詳細に述べると、ＤＭ１におけるリピート伸長は主に核においてＲＮＡ凝集体の形成を生じさせるが、遺伝子型および細胞のタイプにより細胞形質でも観察されうる（Pettersson et al. Molecular mechanisms in DM1 - a focus on foci. Nucleic Acids Res 2015 43(4):2433-41.）。またＡＯＮ処理の後、リピート含有ＤＭＰＫＲＮＡが急速に分解することが見出されている（Mulders et al. 2009）。これを生じさせる正確なメカニズムは未知であるが、おそらく、一部には、転写物の局在化に依存し、それはＲＮＡプロセシングの程度と細胞のタイプ間で変化する輸送と、の両者の影響を受けると考えられる。スプライシングされていないイントロンまたは不完全なポリアデニル化を有する転写物は通常、核内に保持され、最終的に核内エキソソームにより分解し、ゆえに、ＲＮＡ分解のメカニズムにおける根本的な違いを説明するものである。具体的には、ＤＭ１におけるＣＵＧ伸長がＤＭＰＫ転写物のＲＮＡプロセシングの欠如をもたらすことが知られており、ゆえにそのようなＲＮＡはおそらく核内で保持される。しかしながら、リピート含有ＲＮＡの分解における、ナンセンス媒介崩壊メカニズムである、細胞質内プロセスの関与が、核内のＤＭＰＫ凝集体量の増加ももたらすナンセンス依存的分解因子のノックダウンにより、ＤＭ１においても示されている（Garcia et al. Identification of genes in toxicity pathways of trinucleotide-repeat RNA in C. elegans. Nat Struct Mol Biol 2014 21(8):712-20）。これは、転写物のかなりの部分が効率的にプロセシングされることを示しており、幾つかの細胞ではＤＭＰＫｍＲＮＡが観察される位置が細胞質であることと一致している。したがって、ＤＭＰＫ転写物は、核凝集体から遊離した後に、細胞質のおよび核のプロセシングにより分解すると考えられるが、これらのプロセスの相対的な程度は不明のままである。

ＦＥＣＤにおけるＴＣＦ４伸長に関しては、おそらく該リピートがイントロンに位置し、細胞質に輸送される成熟転写物内には存在せず、ゆえに凝集体が核内でのみ観察されるため、状況は異なる。ゆえに、ＴＣＦ４リピートを標的とするＡＯＮは核内で排他的に作用する。第１に、おそらくイントロンのプロセシングに関与する特定の核ドメイン内（例えば核スペックル）における局在化は、ＡＯＮの送達および活性に影響を及ぼす。第２に、（イントロン配列内の）リピートの位置はそれ自体でＭＢＮＬ１の結合動態に影響を及ぼし得、イントロンＲＮＡとも結合する他のタンパク質によっても影響され得る。核局在化およびＴＮＲがイントロン配列内に存在する事実のいずれの側面も、ＡＯＮが作用する能力に影響を及ぼす。考慮すべき更なる要因の一つは、イントロンＲＮＡ配列の安定性およびかかるイントロンＲＮＡの核内凝集体からの遊離後の分解のメカニズムである。ＲＮＡのシークエンシングは、イントロン含有リピート由来のＲＮＡがＦＥＣＤ患者細胞において蓄積することを示す一方で、転写物の他の部分由来のＲＮＡの蓄積が観察されないことを示している（Du et. al. 2015）。更に、ＴＣＦ４のハプロ不全が、ピット−ホプキンス症候群として知られる別のより重篤な障害の原因となるため、伸長したリピートによりＴＣＦ４ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルは顕著に変化しないと考えられる（Mootha et al. TCF4 triplet repeat expansion and nuclear RNA foci in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci 2015 56(3):2003-11；Sepp et al. Pitt-Hopkins syndrome-associated mutations in TCF4 lead to variable impairment of the transcription factor function ranging from hypomorphic to dominant-negative effects. Hum Mol Genet 2012 21(13):2873-88.）。これは、観察された核内凝集体が、ＭＢＮＬ１などのタンパク質を排除するスプライシングアウトされたイントロンＲＮＡから主に構成されることを示唆する。スプライシング反応の間、イントロンの分岐点となるアデノシンが、非典型的な２’−５’ホスホジエステル結合により、スプライシングドナー部位でヌクレオチドと結合し、分枝鎖状ラリアット構造を形成する。これらの構造は核内で比較的安定であり、それらの分解には更なるステップが必要となる。通常の状況では、特異的なタンパク質因子が、ラリアットに結合したままのスプライシング因子を遊離させる。この後、特異的なラリアット枝切り酵素（ＤＢＲ１）が複合体に動員され、２’−５’ホスホジエステル結合が開放される。枝切り後、遊離した直鎖状イントロンＲＮＡが、核内エキソソームおよび／またはエキソヌクレアーゼＸＲＮ１により分解される。本発明の発明者らの仮定では、核内凝集体におけるＴＣＦ４ＲＮＡとＭＢＮＬ１（また、おそらく他のリピート結合タンパク質）との複合体形成は、ラリアットの脱分枝および分解に必要とされるステップの１つまたは複数を妨害する。このように、ＤＭＰＫによる状況と対照的に、ＦＥＣＤの治療の際の、リピート含有ＴＣＦ４ＲＮＡおよび関連するタンパク質の核内凝集体からの遊離は、異なる動態を有する。同様のことが、その後のＲＮＡ自体の分解においても見られ、該ＲＮＡは、効果的に除去されるために更なるプロセシング、および最適化が必要でありうる。

本発明者の知る限りでは、ＴＮＲ伸長部と有効に結合し、患者の細胞の核内においてスプライシング制御タンパク質、例えばＭＢＮＬ１などを遊離させ、それによりＲＮＡ毒性を除去する、ＴＮＲと相補的なＡＯＮを使用して、過剰なイントロンＴＮＲ伸長に関連する疾患を治療できることが開示されるのはこれが初めてである。これは、過剰なＴＮＲ伸長がＴＣＦ４遺伝子のイントロン３にあるＦＥＣＤの治療に特に有用であり、特に今回、本発明者らは、ＡＯＮが効果的に角膜内皮細胞層に送達され、取り込まれ得ることを確信的に示している。しかしながら、効果の指標として、罹患する細胞の核内における核凝集体の低減または消失を用いることにより、イントロンＴＮＲ伸長を含む機能性ＲＮＡの他の毒性獲得の治療が、それを標的とするＡＯＮを用いることで治療が可能になることが、本発明の発明者によって初めて予測されている。

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、好ましくは一本鎖ＡＯＮ、かかるＡＯＮを含む組成物、ならびにそのようなＡＯＮおよび薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、かかるＡＯＮまたは組成物の対象、好ましくはヒト対象への投与を含む、ＲＮＡ毒性によって引き起こされる疾患のｉｎｖｉｖｏもしくはｉｎｖｉｔｒｏでの治療または予防のための、かかるＡＯＮまたは組成物の使用に関する。本発明はまた、かかるＡＯＮまたは組成物の対象、好ましくはヒト対象への投与を含む、ＲＮＡ毒性、好ましくは眼ジストロフィー、より好ましくはＦＥＣＤによって引き起こされる疾患の治療および／または予防方法に関する。

本発明のＡＯＮは、ヌクレアーゼ耐性が向上する、および／または、標的配列へのＡＯＮの親和性が向上するように修飾されている、１つまたは複数の残基を含むことが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、該ＡＯＮ配列は、ヌクレオチドの類似体または等価体であって、修飾塩基、および／もしくは修飾された骨格、および／もしくは非天然のヌクレオシド間連結、またはこれらの修飾の組合せを有する残基であると定義される、ヌクレオチドの類似体または等価体の少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、該ヌクレオチドの類似体または等価体は、修飾された骨格を含む。かかる骨格の例としては、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、ならびにアミド骨格が挙げられる。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーは、以前にアンチセンス剤として研究された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が６員環で置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換された、非荷電の骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解への耐性を有し、ＲＮａｓｅＨの活性化よりもむしろ、翻訳を停止させるか、またはプレｍＲＮＡスプライシングに干渉することにより、アンチセンス剤として機能すると考えられる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、物理的に細胞膜を破壊する方法により、培養細胞に送達することに成功しており、またこれらの方法を幾つか比較したある研究では、スクレープローディング（scrape loading）法が送達の最も効率的な方法であることが解明されているが、モルホリノ骨格が電荷を有さないため、カチオン性脂質は、細胞へのモルホリノオリゴヌクレオチド取り込みの有効な媒介物ではない。

本発明の一実施形態では、骨格内の残基間の結合は、リン原子を含まず、例えば、アルキルまたはシクロアルキル短鎖によるヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルとによる混合ヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数のヘテロ原子含有もしくは複素環短鎖によるヌクレオシド間結合、で形成される結合が挙げられる。この実施形態に従えば、好ましいヌクレオチドの類似体または等価体は、修飾されたポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Nielsen et al. 1991 Science 254:1497-1500）。ＰＮＡベースの分子は、塩基対認識に関してＤＮＡ分子の真の擬態物である。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成され、核酸塩基がメチレンカルボニル結合により骨格に連結される。代替的骨格は、１炭素伸長ピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Govindaraju and Kumar 2005 Chem Commun 495-497）。ＰＮＡ分子の骨格が荷電リン酸基を含まないため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは通常、それぞれＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定である（Egholm et al. 1993 Nature 365:566-568）。

本発明の別の実施形態では、骨格はモルホリノヌクレオチド類似体または等価体を含み、リボースまたはデオキシリボース糖が６員のモルホリノ環で置換されている。最も好ましいヌクレオチド類似体または等価体は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、リボースまたはデオキシリボース糖が６員のモルホリノ環で置換され、隣接するモルホリノ環の間のアニオン性のホスホジエステル結合が、非イオン性のホスホロジアミデート結合で置換されている。

なお更なる本発明の実施形態では、本発明のヌクレオチドの類似体または等価体は、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素のうちの一つの置換を含む。この修飾はわずかに塩基対形成を不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に顕著な耐性を付加する。好ましいヌクレオチド類似体または等価体としては、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキル、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートとアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートまたはボラノホスフェートを含む。本発明の更に好ましいヌクレオチドの類似体または等価体は、例えば２’、３’および／または５’の位置で、以下の基により一もしくは二置換された１つまたは複数の糖部分を含む：−ＯＨ；−Ｆ；置換もしくは非置換の、直鎖状もしくは分岐鎖状の、１つまたは複数のヘテロ原子によって中断されていてもよい低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカニル、アリルまたはアラルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アリル基；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；および−ジメチルアミノエトキシエトキシ。該糖部分は、フラノースまたはその誘導体、またはデオキシフラノースもしくはその誘導体、好ましくはリボースまたはその誘導体、またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってよい。好ましい糖誘導体部分は、架橋型核酸（ＬＮＡ）を含み、その２’−炭素原子が糖環の３’または４’炭素原子と結合し、それにより二環式糖部分を形成する。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を含む（Morita et al. 2001 Nucleic Acid Res Supplement No. 1:241-242）。これらの置換は、ヌクレオチドの類似体または等価体にＲＮａｓｅＨおよびヌクレアーゼ耐性を付与し、標的ＲＮＡに対する親和性を増加させる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合を修飾する必要がないことは、当業者に理解されるとおりである。例えば、幾つかのヌクレオシド間結合は修飾されなくてもよい一方、他のヌクレオシド間結合は修飾される。一形式の（修飾された）ヌクレオシド間結合、複数の形式の（修飾された）ヌクレオシド間結合が、ＡＯＮの長さに沿って均一もしくは不均一に分布してなる骨格を含むＡＯＮは、本発明に包含される。更に、いかなる様式の骨格の修飾（均一、不均一、一形式もしくは多形式、およびそれらのあらゆる順列）を、下記のいかなる形態の糖もしくはヌクレオシドの修飾体もしくは類似体と組み合わせてもよい。本発明によるＡＯＮの特に好ましい骨格は、均一な（全てが）ホスホロチオエート（ＰＳ）である骨格である。

他の実施形態では、本発明のヌクレオチドの類似体または等価体は、１つまたは複数の塩基の修飾または置換を含む。修飾塩基としては、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および−アザ、デアザ、−ヒドロキシ、−ハロ、−チオ、チオール、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、チオアルキル誘導体などの、当分野で公知のもしくは公知となる、合成および天然の塩基、ピリミジンおよびプリン塩基が挙げられる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの全ての位置で均一に修飾されることが必要でないことは、当業者が理解するとおりである。更に、前述の類似体または等価体のうちの２つ以上は、１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド内に、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド内の１つの位置に組み込まれてもよい。ある特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるタイプの類似体または等価体を有する。別の実施形態によると、本発明に記載のＡＯＮは、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボース、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボースなどの２’−Ｏ（好ましくは低級）アルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または、ハロゲン化誘導体など、これらの修飾体の置換誘導体を含む。

本発明による有効な、かつ特に好ましいＡＯＮフォーマットは、ホスホロチオエート骨格を有する２’−Ｏ−メチル修飾リボース部分を含み、その際、好ましくは、実質的に全てのリボース部分が２’−Ｏ−メチルであり、実質的に全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、イントロン配列内に見出せるＴＮＲ伸長部（の一部）と相補的な配列を含有し、該伸長部内の三塩基配列と相補的な複数の配列を含む。ＴＮＲは、ＣＵＧの三塩基（５’から３’）のリピート配列を指してもよいが、ＤＮＡ（および対応するＲＮＡ）の性質次第では、かかる配列は、何が該三塩基の最初のヌクレオチドであるかに応じて、ＵＧＣリピートとして、またはＧＣＵリピートとして記載されることもある。これは、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、三塩基内のヌクレオチドの１つと相補的な、ＣＡＧ、ＧＣＡまたはＡＧＣ（５’から３’）のいずれのヌクレオチドから開始してもよいことを意味する。本発明の教示による、使用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例を図３に示すが、これは相補的配列の３ヌクレオチドのいずれかが最初のヌクレオチドであってもよいことを指し示す。イントロン内の５’−（ＣＵＧ）ｎ−３’のＴＮＲのターゲティングは、好ましくは標準的なワトソン−クリック塩基対を介して形成する相補的配列、５’−（ＣＡＧ）ｍ−３’、またはその揺れ塩基対を介して形成する配列、例えば５’−（ＣＡＩ）ｍ−３’、５’−（ＣＧＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＧＩ）ｍ−３’、５’−（ＣＩＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＩＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＡＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＡＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＧＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＧＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＩＧ）ｍ−３’および５’−（ＵＩＩ）ｍ−３’を有するＡＯＮを用いることにより行われる。第２のヌクレオチドが５’末端の方へ位置が１つ移動し、リピートの最初のヌクレオチドとなる場合には、以下のリピート配列：５’−（ＡＧＣ）ｍ−３’、５’−（ＡＩＣ）ｍ−３’、５’−（ＧＧＣ）ｍ−３’、５’−（ＧＩＣ）ｍ−３’、５’−（ＩＧＣ）ｍ−３’、５’−（ＩＩＣ）ｍ−３’、５’−（ＡＧＵ）ｍ−３’、５’−（ＡＩＵ）ｍ−３’、５’−（ＧＧＵ）ｍ−３’、５’−（ＧＩＵ）ｍ−３’、５’−（ＩＧＵ）ｍ−３’および５’−（ＩＩＵ）ｍ−３’が企図される。第３のヌクレオチドが最初のヌクレオチドに代わる場合には、以下のリピート配列：５’−（ＧＣＡ）ｍ−３’、５’−（ＩＣＡ）ｍ−３’、５’−（ＧＣＧ）ｍ−３’、５’−（ＩＣＧ）ｍ−３’、５’−（ＧＣＩ）ｍ−３’、５’−（ＩＣＩ）ｍ−３’、５’−（ＧＵＡ）ｍ−３’、５’−（ＩＵＡ）ｍ−３’、５’−（ＧＵＧ）ｍ−３’、５’−（ＩＵＧ）ｍ−３’、５’−（ＧＵＩ）ｍ−３’および５’−（ＩＵＩ）ｍ−３’が企図される。明らかに、４０回以上繰り返されるＣＵＧ配列においては、ＵＧＣリピートおよびＧＣＵリピートを認識することもできる。

本発明では、配列５’−（ＣＵＧ）ｎ−３’を含むトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）伸長部と結合することができる、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）分子を使用し、ｎは、かかるＴＮＲ伸長部が転写される細胞内においてＲＮＡ毒性を生じさせるのに十分な長さである。ＴＣＦ４遺伝子は、４０以上のＴＮＲを含むときには、角膜内皮細胞において、ＴＮＲ伸長と作用する正常な細胞内タンパク質の排除によりＦＥＣＤを生じさせる遺伝子である。しかしながら、本発明は、例えばイントロン配列内のＴＮＲ伸長の発生によって引き起こされるあらゆる障害における使用のための、ＡＯＮなどの分子に関する。先行技術は、ＲＮＡ毒性が、特にＣＵＧＴＮＲ伸長によって引き起こされるものではない、イントロン内のＴＮＲ伸長によってもたらされる遺伝的障害の治療または予防方法を教示しない。本発明の核酸分子は、ＴＮＲと相補的な配列からなる。

本発明では、ＴＮＲ伸長部と結合できる分子として「裸の」またはジムノティックな（gymnotic）ＡＯＮの使用が例示されているが、当業者であれば、核酸配列と、具体的にはＴＮＲ、より具体的には５’−（ＣＵＧ）ｎ−３’伸長部と結合できる他の分子が本発明に包含されることを理解するであろう。そのような分子の例は、タンパク質、例えばＺｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒタンパク質、抗体または抗体断片、アプタマー、二価リガンド（Haghighat Jahromi A et al. Developing bivalent ligands to target CUG triplet repeats, the causative agent of Myotonic Dystrophy Type 1. J Med Chem 2013. 56:9471-9481）等である。また、ベクターから発現されるＡＯＮも本発明に包含され、例えば本発明によるＡＯＮを含む、またはそれからなる、核酸分子をコードするＤＮＡベクターまたはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）が包含される。

したがって、本発明は、不安定なｃｉｓ−エレメントＤＮＡリピートに関連する遺伝的障害、好ましくは眼のジストロフィー、より好ましくはＦＥＣＤの予防および／または治療方法における使用のための分子を提供する。本発明は、好ましくはイントロン領域のＴＮＲと相補的な、および／またはＴＮＲにハイブリダイズできる核酸分子を提供するステップを含む方法に関する。本発明に記載分子の投与により、排除されることで疾患状態と関連するタンパク質がもはや排除されないか、または少なくとも比較的低いレベルで排除される限り、本発明の核酸分子がハイブリダイズするＲＮＡが分解されることは必須ではない。これは、細胞の核内のＲＮＡ凝集体を観察することによって評価できる。一態様では、本発明は、哺乳動物の対象、好ましくはヒトにおける、ｃｉｓ−エレメントリピートの不安定性に関連する遺伝的障害の診断、治療または予防のための医薬の製造のための、ヒト遺伝子転写物内のリピート配列とのみ相補的な配列からなるＡＯＮの使用を開示し、教示する。好ましい実施形態では、ｃｉｓ−エレメントリピートの不安定性に関連する遺伝的障害は、１つまたは複数のイントロン配列内にＴＮＲを含むＲＮＡ転写物によって引き起こされるＲＮＡ毒性の結果である。最も好ましい実施形態では、前記疾患はＦＥＣＤである。

本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖の、化学的に修飾された合成物である。あるいは、それらはウイルスベクター（例えばレンチウイルス、ＡＡＶ、またはアデノウイルス）または非ウイルスベクターにより送達されるなど、核酸配列から、標的細胞、例えば角膜内皮細胞内で発現されてもよい。本発明によるＡＯＮは、８〜２００ヌクレオチド長、好ましくは１０〜１００、より好ましくは１２〜５０であり得る。本発明によるＡＯＮは、３ヌクレオチドからなる２〜６６の間のリピート単位、好ましくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７のそのような反復単位を含みうる。ＴＮＲは、３ヌクレオチド（＝トリヌクレオチド）の同一のリピート単位の少なくとも２つの反復単位を含み、それは、トリヌクレオチドが３回繰り返されるとき、ＴＮＲの長さは少なくとも９ヌクレオチドであり、トリヌクレオチドが７回繰り返されるとき、ＴＮＲの長さは少なくとも２１ヌクレオチドであることを意味する。疾患を引き起こすＴＮＲの長さは、疾患により異なり、ＦＥＣＤの場合では４０以上、通常４５超、更に通常では５０超のリピート単位の繰り返しであるが、これは患者毎に異なることもある。本発明のＡＯＮが標的ＲＮＡ内の多くの（最低２つの）反復単位と相補的であることは当然であるが、これは該ＡＯＮが複数の３ヌクレオチドからならなければならないことを意味するものではない。例えば、ＡＯＮは、２つ以上のリピート単位と相補的である中心部に加えて、該ＡＯＮの一端（５’または３’）または両端（５’と３’）に、１つまたは２つの相補的ヌクレオチドを含んでもよい。言い換えると、本発明のＡＯＮは、標的ＲＮＡ内のＴＮＲ伸長内の配列と完全に相補的である一方で、該ＡＯＮの相補的領域が３の倍数からならなくともよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、９ヌクレオチド長であるが、２つの反復ＣＡＧ単位のみを含む、例えば配列番号１０２および配列番号１０３のようなものであってもよく、すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは、必ずしも３ヌクレオチドの複数の繰り返しである必要がないことを示唆する。

本発明の重要な態様は、ＦＥＣＤの場合における、角膜内皮への本発明のＡＯＮの送達である。治療有効量のＡＯＮを、実質内注射によって角膜実質に投薬できる。例えば、角膜炎の場合に角膜に抗生物質を投与するとき、実質内注射が行われる。あるいは、治療用のオリゴヌクレオチドを、前房内注射により、内皮細胞層の反対側の眼房水に投薬することができる。前眼房と後眼房は繋がっているため、本発明の治療用オリゴヌクレオチドは、硝子体内注射によって後眼房に投与することもできる。図４にこの図解および例が示されており、蛍光色素（Ｃｙ５）にカップリングしたオリゴヌクレオチドが、硝子体内注射の後、時間依存的様式に角膜内皮細胞層に特異的と会合していることが実証される。角膜内皮層との会合は、注射後４８時間が最大であると考えられる。角膜内皮細胞による取り込みがなされる限り、いかなる投与経路も採用可能である。にもかかわらず、多くのウイルスおよび非ウイルスベクターでは、ｉｎｖｉｖｏでの角膜内皮への遺伝子送達を研究してきたが、その成功例が限られたものであったため、角膜内皮によって取り込まれるＡＯＮの能力は予想外である。（George AJ et al. Am J Respir Crit Care Med. 2000. 162:S194-200）。注射処置を用いることなく、ｉｎｖｉｖｏ研究での内皮への遺伝子送達に成功した事例は、文献では報告されていない。前眼房への注射を利用して成功に至った一つのアプローチとして、前眼房へのコネキシン−４３アンチセンスｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの注射が示されている（Nakano Y et al. Connexin43 knockdown accelerates wound healing but inhibits mesenchymal transition after corneal endothelial injury in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008. 49:93-104）。しかしながら、角膜内皮の機能として、角膜実質の水分供給を補助するために、漏出性のバリアが維持されており、またこの機能は、コネキシン−４３によって、大部分で維持されるギャップジャンクションの存在に大きく依存するため、この標的に対するノックダウンは、角膜内皮へのオリゴヌクレオチド取り込みのメカニズムに貢献すると考えられる。したがって、これは他のＡＯＮに一般的に適用できる教示とは考えられない。送達された治療用オリゴヌクレオチドの有効性は、角膜実質からまたは房水（たとえ最初に硝子体に注射したとしても）細胞に取り込まれる量、および細胞核に対するそれらの最終的な送達に依存する。細胞へのオリゴヌクレオチド取り込みの核局在性および効率は、トランスフェクション試薬またはいわゆるオリゴヌクレオチド送達増強剤を用いることで増加する。ｉｎｖｉｖｏトランスフェクション試薬は、例えば現在ではｊｅｔＰＥＩ（ｐｏｌｙｐｌｕｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（商標））が入手できるが、それは、治療用オリゴヌクレオチドの角膜内皮への取り込みおよび核局在化を増大させるために提案されたものであり、単に「裸の」分子として治療用オリゴヌクレオチドを投与するよりも改善されることを表すものである。標的ＲＮＡ分子との塩基対形成は、好ましくは細胞内で生じる。ｉｎｖｉｖｏでの適用に関して、本発明によるオリゴヌクレオチドを、リポソーム、ポリソームもしくはナノ粒子または他の適切な粒子、例えばウイルス粒子中に封入し、送達（投与）してもよい。あるいは、または送達ビヒクルとの組合せで、オリゴヌクレオチドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との複合体としてもよい。当業者であれば、適用可能である場合には、本発明による２つ以上のオリゴヌクレオチドを組み合わせてもよいことを理解するであろう。当業者であれば、本発明によるオリゴヌクレオチドを指すとき、本発明による組成物または医薬組成物が、好ましくは本発明による方法および用途に互換的に使用できることを理解するであろう。

本発明は、遺伝的疾患の予防および／または治療における使用のための（一本鎖）ＡＯＮであって、標的ＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的ＲＮＡ分子内のイントロン配列に存在するトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）伸長部と結合することができる、前記オリゴヌクレオチドに関する。好ましい態様では、前記ＴＮＲ伸長部は、配列５’−（ＣＵＧ）ｎ−３’を含み、ｎは４０以上の整数であり、より好ましくは、ｎは５０以上の整数である。別の好ましい態様では、本発明のＡＯＮの全てのヌクレオチドは、２’−Ｏメチルホスホロチオエートリボヌクレオチドである。

特定の好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは、５’−（ＣＡＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＡＩ）ｍ−３’、５’−（ＣＧＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＧＩ）ｍ−３’、５’−（ＣＩＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＩＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＡＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＡＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＧＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＧＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＩＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＩＩ）ｍ−３’、５’−（ＡＧＣ）ｍ−３’、５’−（ＡＩＣ）ｍ−３’、５’−（ＧＧＣ）ｍ−３’、５’−（ＧＩＣ）ｍ−３’、５’−（ＩＧＣ）ｍ−３’、５’−（ＩＩＣ）ｍ−３’、５’−（ＡＧＵ）ｍ−３’、５’−（ＡＩＵ）ｍ−３’、５’−（ＧＧＵ）ｍ−３’、５’−（ＧＩＵ）ｍ−３’、５’−（ＩＧＵ）ｍ−３’、５’−（ＩＩＵ）ｍ−３’、５’−（ＧＣＡ）ｍ−３’、５’−（ＩＣＡ）ｍ−３’、５’−（ＧＣＧ）ｍ−３’、５’−（ＩＣＧ）ｍ−３’、５’−（ＧＣＩ）ｍ−３’、５’−（ＩＣＩ）ｍ−３’、５’−（ＧＵＡ）ｍ−３’、５’−（ＩＵＡ）ｍ−３’、５’−（ＧＵＧ）ｍ−３’、５’−（ＩＵＧ）ｍ−３’、５’−（ＧＵＩ）ｍ−３’または５’−（ＩＵＩ）ｍ−３’の配列を含み、ｍは２〜６６の範囲の整数であり、好ましくは、ｍは２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の整数である。本発明の別の好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、９以上のヌクレオチド長を有する。

本発明のＡＯＮは、好ましくは遺伝的疾患の治療および／または予防における使用のためのものであり、該疾患を引き起こすＴＮＲ伸長は、ＴＣＦ４遺伝子の転写物内に存在する。ＴＣＦ４遺伝子内のイントロン配列内のＴＮＲ伸長に起因するＲＮＡ毒性によって引き起こされる疾患の１つの例は、眼のジストロフィー、好ましくはフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）である。ゆえに、好ましい態様では、本発明のＡＯＮは、ＦＥＣＤの予防および／または治療における使用のためのものである。好ましくは、本発明による使用のためのＡＯＮは、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１０１、１０２および１０３を有するＡＯＮからなる群から選択される（図３を参照）。好ましい対象はヒト対象である。本明細書で定義されるように、本発明によるＡＯＮは、遺伝的疾患の治療および／または予防における使用のためのものであるが、本発明はまた、医薬組成物中に存在する該オリゴヌクレオチド自体にも関する。本発明による医薬組成物は、好ましくは、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む。薬学的に許容される賦形剤または担体は、当業者に周知である。好ましい態様では、本明細書に記載のＡＯＮは（例えば眼内への）単純な投与では浸透させるのが困難と考えられる組織に送達されるため、本発明の組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチド送達増強剤を含む。特定の態様では、ＡＯＮは直接に、またはＡＯＮ送達増強剤の補助を受けて送達されうるが、本発明のＡＯＮはまた、例えば、国際公開第２０１４／０１１０５３号パンフレットに詳説される、ウイルス性または非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子治療ベクターにより送達されうる。その例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターである。非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクル（または非ウイルス性核酸送達ビヒクル）は、例えばリポソーム、ポリソームおよびナノ粒子である。

別の実施形態では、本発明は、ヒト対象においてＦＥＣＤを治療または予防するための方法であって、本発明によるオリゴヌクレオチドまたは本発明による組成物を、実質内注射により前記ヒト対象の角膜実質に、または前房内注射により前記ヒト対象の前房水に、または硝子体内注射により前記ヒト対象の後眼房に投与することを含む前記方法に関する。

更に別の実施形態では、本発明は、遺伝的疾患、好ましくは、ＲＮＡ毒性によって引き起こされる遺伝的疾患、より好ましくは、ヒトＴＣＦ４遺伝子などで見出されるなど、イントロン配列内でのＴＮＲ伸長に起因するＲＮＡ毒性によって引き起こされる、遺伝的疾患の治療および／または予防のための医薬、最も好ましくはヒトにおけるＦＥＣＤの治療および／または予防のための医薬の調製における使用のための、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。

本発明で企図される使用のための非ベクター化ＡＯＮは、疾患、標的器官または組織、および投与経路に応じて、典型的には０．０００１〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量で用いられる。

ＦＥＣＤのような眼疾患では、適切な投薬量は、硝子体内投与の場合、片目あたり０．０５〜５ｍｇの間、好ましくは０．１〜１ｍｇの間の範囲であり、例えば、片目あたり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇである。

本発明に従うＡＯＮは、患者に対して、全身的、部分的、局所的に、経口、眼内、肺内、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、直腸内投与を通じて、嚥下、注射、吸入、点滴、噴霧によって、（水）溶液剤、懸濁剤、（水中油）エマルジョン剤、軟膏剤、ロゼンジ剤、丸剤等の形態で、投与してもよい。より好ましい投与経路は、水溶液または眼内投与用に特別に適合された製剤の角膜内注射による投与である。欧州特許出願公開第２４２５８１４号明細書は、特にペプチドまたは核酸系薬物の眼内（硝子体内）投与に適する水中油エマルジョン剤を開示する。このエマルジョン剤は硝子体液体より濃厚ではないため、該エマルジョンは硝子体上に浮遊し、それにより注射剤による視力の減弱が回避される。

投薬は、投与経路および患者への必要性に応じて、毎日、毎週、毎月、３カ月毎および年に１回であってもよい。

好ましい実施形態では、本発明による分子の送達ビヒクルとしてのウイルスベクター、好ましくは本明細書に前述のＡＡＶベクターは、注射１回あたり１×１０^９〜１×１０^１７ウイルス粒子、より好ましくは、注射あたり１×１０^１０〜１×１０^１４、最も好ましくは１×１０^１０〜１×１０^１２ウイルス粒子の範囲の用量で投与される。

本発明が関係する分野の当業者であれば、治療の詳細は、オリゴヌクレオチドの配列および化学構造、投与経路、製剤、用量、投薬レジメン、フォーマット（ベクター化または非ベクター化ＡＯＮ）、患者の年齢および体重、疾患の段階等に応じて確立される必要があり、それは更に非臨床的および臨床的な検査が必要となる場合もあることは明らかであろう。

実施例１
５０超のリピート長を有するＴＣＦ４ＴＮＲの存在から生じるＦＥＣＤを治療するための治療的アプローチ
ＴＣＦ４中のＣＵＧＴＮＲ伸長部に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いて特異的配列への結合を行い、それにより、ＭＢＮＬ１などのＲＮＡプロセシング因子を排除する、該配列の能力を低減させる。ＲＮＡへの結合により更に、核凝集体からの放出、およびラリアット枝切り酵素および／またはＲＮａｓｅへの増大した曝露による分解がもたらされ、それにより、ＲＮＡプロセシング因子を排除しうるリピート含有ＲＮＡの細胞プールを更に減少させることができる。ＦＥＣＤにおいて、ＭＢＮＬ１の排除は、毒性をもたらすＲＮＡ凝集体および他の異常なＲＮＡスプライシングパターンをもたらす。ＴＣＦ４由来のイントロン内の５’−（ＣＵＧ）ｎ−３’ＴＮＲのターゲティングは、ＡＯＮを用いることで、標準的なワトソン−クリック塩基対：（５’−（ＣＡＧ）ｍ−３’）、または揺れ塩基対、例えば５’−（ＣＡＩ）ｍ−３’、５’−（ＣＧＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＧＩ）ｍ−３’、５’−（ＣＩＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＩＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＡＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＡＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＧＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＧＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＩＧ）ｍ−３’および５’−（ＵＩＩ）ｍ−３’を通じて形成される相補的配列によりなされる。図３は、５０以上のＣＵＧＴＮＲ配列を含むＴＣＦ４ＲＮＡの存在を抑制するのに使用できるオリゴヌクレオチドの例を表す。

様々なＡＯＮの治療効果に関するスクリーニングするために、対照（センス）ＡＯＮ（図３の一番下）と一緒に、それらを、患者由来の線維芽細胞または角膜細胞にトランスフェクトする。核ＲＮＡ凝集体の消失は、Ｃｙ３標識オリゴとの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ならびに抗ＭＢＮＬ１抗体による蛍光抗体法により検証する。

凝集体の消失は、ＡＯＮ処理後のＤＭＰＫで観察されるように、ＲＮＡのＭＢＮＬ１を排除する能力の低下により、および／または、ＲＮＡ分解酵素のアクセスが容易になることによるＲＮＡの量の低減によりなされる。ＦＥＣＤにおいては、該凝集体は、スプライシングされていないプレｍＲＮＡ、および／もしくは、スプライシングアウトされたイントロンラリアット、またはリピート配列のみが残る部分的に分解されたイントロンＲＮＡのいずれかからも構成されうる点に留意すべきである。これは、ＲＮＡの安定性および分解の動態に影響を及ぼす。リピート含有ＲＮＡの同一性および安定性の両方を検証するため、ノーザンブロット分析を行う。観察されるバンドがイントロンラリアットであるか否かを確認するため、３つの異なるアプローチを使用する。第１に、ＡＯＮ処理の前に、細胞において、ＲＮＡｉによりラリアット枝切り酵素（ＤＢＲ１）を枯渇させ、ラリアットを安定化させる（Armakola et al. 2012. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nat Genet 44(12):1302-9.）。第２に、ＲＮＡ単離の後に、ＡＯＮまたは対照で処理した細胞由来のＲＮＡサンプルをＲＮＡｓｅＲに供し、イントロンラリアットでなく直鎖状ＲＮＡを効率的に加水分解する（Suzuki et al. 2006. Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs from pre-mRNA splicing. Nucleic Acids Res 34(8):e63）。第３に、補完的アプローチにおいて、ＲＮＡサンプルを、ＴＣＦ４イントロン内の特定の位置と相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下で、ＲＮａｓｅＨで処理し、ＲＮａｓｅＨによる加水分解によりスプライシングされていないイントロンを別々の断片に切断しつつ、イントロンラリアットを直鎖化する（Li-Pook-Than and Bonen. 2006. Multiple physical forms of excised group II intron RNAs in wheat mitochondria. Nucleic Acids Res 34(9):2782-90）。

ＡＯＮ処理細胞および対照細胞由来のＲＮＡを、ＭＢＮＬ１により制御されることが知られているＲＮＡプロセシング事象に対する効果に関して分析する。最初に、ＡＯＮの効果を、スプライシングによりＦＥＣＤにおける核凝集体へのＭＢＮＬ１の排除が顕著に影響されることが知られている、選択された転写物のＲＴ−ＰＣＲによって検証する（上記のDu et al. 2015）。この後、トランスクリプトーム全体のレベルにおけるスプライシングの復元を、ディープシークエンシングにより分析する。

ＦＩＳＨおよび蛍光抗体法
核凝集体の検出のため、Ｄｕら（２０１５）のプロトコールに基本的に従い、ＦＩＳＨを実施する。カバースリップ上の線維芽細胞および角膜組織をＰＢＳで一回洗浄し、室温で３０分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定する。固定後、細胞をＰＢＳで二回洗浄し、４℃にて７０％エタノール中に保存する。細胞を、室温で５分間、５０％ホルムアミドおよび２×ＳＳＣで再度水和する。次に細胞を、３７℃で一晩、１０％硫酸デキストラン、２ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体、０．２％ＢＳＡ、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ、２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミドおよび１．２μｇのＣｙ３−（ＣＡＧ）７プローブを含有する混合液１００μｌでハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、細胞を室温で３０分間、ヘキスト３３３４２（１：２００の希釈剤）で染色し、ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄａｎｔｉｆａｄｅ試薬を使用してスライドグラス上に置く。ＺｅｉｓｓＬＳＭ７１０レーザースキャニング共焦点顕微鏡で、×６３の倍率でＣｙ３シグナルを得る。Ｃｙ３−（ＣＡＧ）７プローブによるハイブリダイゼーションの後、角膜内皮層に、１０分間、０．５％のトリトンＸ−１００を含む新鮮なＰＢＳを浸透させる。次に角膜細胞を抗ＭＢＮＬ１抗体（ＰＢＳ中、１：１００；ｓｃ−４７７４０、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と室温で１時間インキュベートし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８とコンジュゲートした二次抗体（ＰＢＳ中、１：５００、Ａ１１００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３０分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、角膜内皮細胞をＰＢＳで洗浄し、ヘキスト３３３４２で染色し、上記の同様に顕微鏡のスライド上に置く。

ノーザンブロット
患者の線維芽細胞または角膜細胞由来のＴＣＦ４ＲＮＡ変異体の、ＡＯＮ処理（および／または脱分枝酵素ＤＲＢ１によるノックダウン）の前後の安定性を、Ｍｕｌｄｅｒｓら（２００９、上記）で用いられるノーザンブロット操作により評価する。全ＲＮＡを、１．２％のアガロース−ホルムアルデヒド変性ゲル中で電気泳動する。給源および単離手順に応じて、１レーンあたり１〜１５μｇのＲＮＡをロードする。ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ−ＸＬナイロンメンブレンに移し、［^３２Ｐ］標識した（ＣＡＧ）７または対照オリゴヌクレオチドでハイブリダイズする。ノーザンブロット分析前に、選択されたサンプルをＲＮａｓｅＲまたはＲＮａｓｅＨで処理する。ＲＮａｓｅＲ処理の場合、ＲＮＡを、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＭｇＣｌ_２および１Ｕ／μｌＲＮａｓｅＲ（Ｅｐｉｂｉｏ）で、３７℃で３０分間、オリゴマーとインキュベートする。ＲＮａｓｅＨの場合、ＲＮＡを３７℃で３０分間、イントロン特異的オリゴマーとインキュベートし、次に０．０３Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．２７ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１０ｍＭのＤＴＴにて、３７℃で３０分間処理する。ＲＮａｓｅ処理サンプルをフェノール抽出およびエタノール沈殿した後、ノーザンブロット分析を行う。

実施例２
治療用オリゴヌクレオチドを用いた角膜内皮細胞層のターゲティング
オリゴヌクレオチドが角膜内皮に取り込まれるか否かを調査するため、１０匹の雌のダッチベルテッド系（Dutch Belted）ウサギの両眼に、Ｃｙ−５標識された、（本発明とは無関係な配列の）２’−Ｏ−メチル修飾オリゴヌクレオチドを利用して、３０μｌのＰＢＳ中、０．６ｍｇの単回投与で、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、硝子体内に１回投与した。２匹のウサギにおいて、各時点（硝子体内注射後６、２４、４８、７２および１６８時間）にペントバルビタールナトリウムの静脈内注射および全採血を行い、屠殺した。眼を摘出し、修飾デヴィッドソン液中で固定させた。次に組織標本スライドを調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次に蛍光顕微鏡で調べ、特に標識オリゴヌクレオチドの蓄積を反映する蛍光増加に関係する眼内の構造に注目して調べた（図４）。Ｃｙ−５標識したオリゴでは、対照として供されたＣｙ−５単独に対して、６時間目において染色が確認された。６時間目の時点では、Ｃｙ−５対照では染色が確認されなかった。ゆえに、取り込みが、Ｃｙ−５標識を介してではなくオリゴによりなされたと結論づけた。最大の取り込みは、４８時間目の時点で既に観察された。

治療用オリゴヌクレオチドの眼細胞構造への取り込みは、通常ｉｎｖｉｔｒｏ研究で用いられるトランスフェクション試薬を用いないことが先行研究において示されている。本発明の発明者らは今回、ｉｎｖｉｖｏでのトランスフェクション賦形剤が、潜在的治療用オリゴヌクレオチドと共に全身投与したとき種々の組織への潜在的治療用オリゴヌクレオチドの取り込みを増加させうることを見出した（データ示さず）。

実施例３
ＴＣＦ−４を標的とする治療用オリゴヌクレオチドによる、ＦＥＣＤのＣＥＣにおけるＲＮＡ凝集体の低減
ＣＡＧ配列の７回リピート（（ＣＡＧ）７）を有する予備設計された治療用オリゴヌクレオチドは、４０超のＣＵＧリピート伸長のヘテロ接合を有するＦＥＣＤ患者に由来するヒトの角膜内皮細胞においてＲＮＡ凝集体を低減させることも示されている。アレル上のＣＵＧＴＮＲリピートは、患者のＴＣＦ４遺伝子において１２および５２であることが見出されている。この患者に由来する角膜内皮細胞を用い、当分野で公知の方法を使用して（Peh et al. 2013 BMC Res Notes 6:176; Peh et al. 2015 Sci Rep 5:9167）、ｉｎｖｉｔｒｏで維持された細胞に（ＣＡＧ）７をトランスフェクトするする際に、これらの細胞におけるＲＮＡ凝集体を低減させる効果を調査した。治療用オリゴヌクレオチドを２００ｎＭの濃度で用い、２４時間、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（製造業者の指示に従い、ウェルあたり０．５μｌ）をトランスフェクトした。次に細胞を固定し、Ｃｙ３標識された（ＣＡＧ）７のオリゴヌクレオチドプローブでＦＩＳＨに供し（実施例１に記載と同様に実施）、共焦点顕微鏡で観察をした。

図５は、角膜内皮細胞におけるＲＮＡ凝集体（ピンクのスポット）の低減の際の、治療用オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）７の効果を示す。上部３枚のパネルは処理された細胞であり、下部の３枚のパネルは対照オリゴヌクレオチドを用いて処理された細胞である。治療用オリゴヌクレオチドを２００ｎＭの濃度で用い、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔをトランスフェクトした。核内ＲＮＡ凝集体数を自動画像解析により測定し、ヒストグラムとして図５に表示した（図の下部）。具体的には、ＦＩＳＨ標識したＲＮＡ凝集体を、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ｖｅｒ２．１．１（ＢｒｏａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、セグメントベースのアプローチで定量した。手短には、最大相関値の閾値を使用し、４０５ｎｍのチャネルにおいて核を定義した。ＲｏｂｕｓｔＢａｃｋｇｒｏｕｎｄアルゴリズムを使用し、個々のマスキング物体（核）あたり２．０のスムージングスケールで、１．４５の閾値補正計数、および０．０５および１．０の下限値および上限値に設定し、５６８ｎｍのチャネルにおける２〜１０ピクセルの内の物体としてＲＮＡ凝集体を定義した。ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌを使用して、データを更に処理した。

顕微鏡写真およびヒストグラムの両方から観察できるように、治療用オリゴヌクレオチド（ＣＡＧ）７は、対照（無関係）オリゴヌクレオチド（ヒストグラムでは「無処理」と称する）のトランスフェクションと比較し、ＲＮＡ凝集体数の低減において効果的であった。これは、本発明の方法がＦＥＣＤ患者由来のヒトの角膜内皮細胞で適用できることを示す。

次にこの実験を、４０超のＴＮＲリピートを含有する少なくとも１つのＴＣＦ４アレルを有する、５人の個々のＦＥＣＤ患者サンプルで繰り返した。これらの実験結果を図６（各ヒストグラムは各患者を表す）に示す。図５から読み取れることと同様に、対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ｃｔｒｌＡＯＮ）と比較し、（ＣＡＧ）７の治療用オリゴヌクレオチドによる処理の際には、凝集体数は減少し、凝集体のない核または限られた数の凝集体しか有さない核のパーセンテージが増加する。５人目の患者由来の細胞では、更なるオリゴヌクレオチド（架橋型核酸（ＬＮＡ）の構造におけるＡＧ（ＣＡＧ）２ＡＯＮ）を用いた。この特定の化学構造および配列は、（ＣＡＧ）７リピートよりも劣っていると考えられた。右上のグラフは、これらの５例の患者からのデータまとめた、核あたりの凝集体の平均数を表し、網膜内の凝集体の低減に対する本発明のＡＯＮの顕著な効果を示すものである。

Claims

遺伝的疾患の予防および／または治療における使用のための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、標的ＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的ＲＮＡ分子内のイントロン配列に存在するトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）伸長部と結合することができる、前記オリゴヌクレオチド。
前記ＴＮＲ伸長部が、配列５’−（ＣＵＧ）ｎ−３’を含み、ｎが４０以上の整数である、請求項１に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
ｎが５０以上の整数である、請求項２に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、２’−Ｏメチルホスホロチオエートリボヌクレオチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドが、５’−（ＣＡＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＡＩ）ｍ−３’、５’−（ＣＧＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＧＩ）ｍ−３’、５’−（ＣＩＧ）ｍ−３’、５’−（ＣＩＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＡＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＡＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＧＧ）ｍ−３’、５’−（ＵＧＩ）ｍ−３’、５’−（ＵＩＧ）ｍ−３’および／または５’−（ＵＩＩ）ｍ−３’の配列を含み、ｍが２から６６の範囲の整数である、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
ｍが２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の整数である、請求項５に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドが９以上のヌクレオチド長を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
前記ＴＮＲ伸長部が、ＴＣＦ４遺伝子の転写物内に存在する、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
前記遺伝的疾患が、ＲＮＡ毒性によって引き起こされる眼ジストロフィーである、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
前記眼ジストロフィーがフックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）である、請求項９に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１０１、１０２および１０３を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
前記使用が、前記遺伝的疾患に罹患しているか、または前記遺伝的疾患に罹患するリスクを有するヒト対象における使用である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
請求項１から１２のいずれか一項に定義されたオリゴヌクレオチド。
請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
オリゴヌクレオチド送達増強剤を更に含む、請求項１４に記載の組成物。
請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドを含むか、またはそれからなる核酸配列をコードするウイルス性または非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクルを含む医薬組成物。
ヒト対象においてＦＥＣＤを治療または予防するための方法であって、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物を、実質内注射により前記ヒト対象の角膜実質に、または前房内注射により前記ヒト対象の前房水に、または硝子体内注射により前記ヒト対象の後眼房に投与することを含む前記方法。