CN108291225A - 单链反义寡核苷酸在预防或治疗涉及三核苷酸重复扩增的遗传疾病中的用途 - Google Patents

单链反义寡核苷酸在预防或治疗涉及三核苷酸重复扩增的遗传疾病中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含重复三核苷酸单元的反义寡核苷酸(AON)，其用于治疗或预防遗传性眼病、优选由RNA毒性引起的眼营养不良症比如Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)。本发明的寡核苷酸用于靶向内含子序列中存在的三核苷酸重复(TNR)序列扩增，以防止与这种TNR扩增相互作用的细胞蛋白质的疾病相关螯合。

Description

单链反义寡核苷酸在预防或治疗涉及三核苷酸重复扩增的遗 传疾病中的用途
技术领域
本发明涉及医学领域，特别地涉及预防和治疗遗传疾病的领域。更特别地，本发明涉及预防和/或治疗与三核苷酸重复扩增相关的遗传疾病，比如角膜内皮疾病。
背景技术
角膜内皮是角膜内表面上的非再生性细胞单层，将角膜基质与前房液分开(见图1)。角膜内皮通过如下持续的过程来负责保持角膜透明，该持续的过程防止角膜因阳离子和水分子流入胶原性角膜基质而过量水合，通常称为“去肿胀(deturgescence)”。
Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)是一种常见的与角膜滴状物的存在有关的遗传性角膜内皮变性疾病，角膜滴状物是角膜内皮层下方的微观胶原积聚。40岁以后，高达5％的美国成年人表现出角膜滴状物。滴状物的存在是FECD的指征，但通常表现为完全无症状的轻微疾病。晚期(严重)疾病发展于小部分患有滴状物的患者。晚期FECD的特征在于大量的滴状物、内皮细胞损失、角膜水肿、角膜混浊以及由于角膜水肿和混浊导致的视力丧失。角膜水肿、混浊和随后的视力丧失是内皮细胞变性和损失去肿胀的直接后果。由于FECD引起的视力丧失是需要全厚度角膜移植(穿透性角膜移植术)的最常见指征，仅在美国每年占超过14,000次手术。对于FECD没有其它治疗可用。尽管角膜移植是一种在很大程度上很成功的治疗，但它也有缺点，它具有侵入性，并且与大约30％的排斥率相关，这与其它实体器官同种异体移植没有什么不同。也可以进行一种仅替换角膜内皮的替代方法(内皮角膜移植术)，但只能由经验丰富的外科医生进行。两种干预均受限于供体材料(源自供体角膜的可移植角膜片或角膜衍生内皮细胞)的缺乏。FECD对于其他手术比如白内障手术也是一种风险，并且对于屈光手术比如激光辅助原位角膜磨镶术(LAISK)是禁忌，因为这些技术导致额外的角膜内皮细胞损失。
FECD分为早发型FECD和年龄相关型FECD，这可能是不同的疾病，因为在早发型FECD中通常不存在滴状物。早发型FECD很少见，并且与Col82A2等基因有关，该基因编码作为内皮基底膜组分的胶原蛋白VIII的α2-亚基。在年龄相关型FECD中，已经在不同的基因比如KCNJ13(钾通道)、SLC4A11(硼酸钠共转运子)和ZEB1(锌指E-盒同源结构域蛋白1)中发现了某些罕见的常染色体显性突变。然而，重要的是，根据全基因组关联研究(Baratz KH等人，E2-2 protein and Fuch’s corneal dystrophy.N Engl J Med 2010 363：1016-1024)，大多数常染色体显性年龄相关型FECD的遗传基础归因于转录因子-4(TCF4)基因。在这些研究中，在TCF4基因的内含子中识别出单核苷酸多态性(SNP)：染色体18q21.2上的rs613872，其特异性地在年龄相关型FECD患者中分离出。FECD发展风险的增加计算为纯合子受试者中增加30倍，并且rs613872标志物能够以76％的准确度区分病例和对照。在先前观察到FECD与位于18q21.2-18q21.32的染色体区域相关联(Sundin OH等人，A commonlocus for late onset Fuchs corneal dystrophy maps to 18q21.2-q21.32.InvestOphthalmol Vis Sci 2006 47：3919-3926)之后，TCF4基因座的至少两个区域与FECD的发展相关。其他几项研究表明，TCF4三核苷酸重复(TNR)的存在比rs613872标志物更能预测FECD(Wieben ED等人，A common trinucleotide repeat expansion within thetranscription 4(TCF4，E2-2)gene predicts Fuchs corneal dystrophy.PLoS One 20127：e49083；Wieben ED等人，Comprehensive assessment of genetic variants withinTCF4 in Fuchs’endothelial corneal dystrophy.Invest Ophtalmol Vis Sci 2014 55：6101-6107；Mootha VV等人，Association and familial segregation of CTG18.1trinucleotide expansion of TCF4 gene in Fuchs’endothelial cornealdystrophy.Invest Ophtalmol Vis Sci 2014 55：32-42；Stamler JF等人，Confirmationof the association between the TCF4 risk allele and Fuchs endothelial cornealdystrophy in patients from the Midwestern United States.Ophthalmic Genet.201334(1-2)：32-4；Kuot A等人，Association of TCF4 and CLU polymorphisms with Fuchs’endothelial dystrophy and implication of CLU and TGFBI proteins in thedisease process.Eur J Hum Genet.2012 20(6)：632-8；Thalamuthu A等人，Associationof TCF4 gene polymorphisms with Fuchs’corneal dystrophy in the Chinese.InvestOphthalmol Vis Sci.2011 52(8)：5573-8；Xing C等人，Transethnic replication ofassociation of CTG18.1 repeat expansion of TCF4 gene with Fuchs’cornealdystrophy in Chinese implies common causal variant.Invest Ophthalmol VisSci.2014 55(11)：7073-8；Nanda GG等人，Genetic association of TCF4 intronicpolymorphisms，CTG18.1 and rs17089887，with Fuchs’endothelial corneal dystrophyin an Indian population.Invest Ophthalmol Vis Sci.2014 55(11)7674-80)。
不稳定的重复发现于各种基因区域，比如导致亨廷顿舞蹈病(HD)的基因的编码区，由此通过改变蛋白质功能和/或蛋白质折叠产生疾病的表型。不稳定的重复单元也发现于非编码区，比如引起1型肌强直性营养不良(DM1)的DMPK基因的3’-UTR、引起脆性X综合征的FMR1基因的5’-UTR，以及发现于内含子序列，比如引起2型肌强直性营养不良(DM2)的ZNF9基因的第一内含子。DM1是成人中最常见的肌营养不良症，并且主要是骨骼肌、心脏和大脑的遗传性、进行性、退行性、多系统性疾病。DM1由不稳定三核苷酸(CTG)n重复的扩增(如上所述，在DMPK基因的3’-UTR中)引起。DM2由四核苷酸(或四个核苷酸(quatronucleotide))(CCTG)n重复(四个核苷酸重复在下文中称为“QNR”)扩增(如上所述，在ZNF9基因的内含子1中)引起。发现TNR的不稳定性还是几种其它疾病比如X-连锁脊髓延髓肌肉萎缩症(SBMA)、几种脊髓小脑性共济失调(SCA基因家族)、C90RF72-相关肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆(C90RF72 ALS/FTD)和FECD的主要原因。
过度的TNR扩增可能导致一种称为“RNA毒性”的现象，这是上述疾病的主要原因。发生的是这些重复元件转录成毒性‘功能获得性’RNA，其表现为显性失活药理学，其中单个疾病等位基因可能已经导致疾病，尽管存在正常等位基因。在DM1的情况下，当剪接调节子比如Muscleblind-like 1(MBNL1)蛋白和CUG-三联体重复结合蛋白1(CUGBP1)与它们的正常细胞功能隔离：蛋白质结合过量TNR时，RNA毒性变为表现在mRNA加工的水平上。这种蛋白质-RNA复合物可以在DM1细胞中作为核RNA团簇(foci)而被可视化(Mankodi等人，Ribonuclear inclusions in skeletal muscle in myotonic dystrophy types 1 and2.Ann Neurol 2003 54(6)：760-8)。MBNL1是剪接调节子，但也结合3’-UTR，这因此也导致DM1中另外可选的聚腺苷酸化的误调节(Batra等人，Loss of MBNL1 leads to disruptionof developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediateddisease.Mol Cell 2014 56(2)：311-22)。最近的报道表明重复RNA可以翻译成毒性蛋白质类型(Cleary和Ranum.Repeat associated non-ATG(RAN)translation：new starts inmicrosatellite expansion disorders.Curr Opin Genet Dev 2014 26：6-15)。
观察到FECD与TCF4基因的内含子区域的(CTG)n TNR扩增相关联，该内含子与rs613872标志物所位于的内含子不同(Mootha等人，2014；Wieben等人，2012)。结果显示，79％的FECD患者(在白细胞DNA中记录)具有50或更多的重复(≥150个核苷酸)，而95％的病例对照的重复长度小于40，这表明重复长度为50或更多高度预示FECD，而在40至50之间的较少重复也促成该疾病的出现。本领域普遍接受的是，在TCF4基因中等于或大于40重复的TNR扩增的出现预示疾病并且指示潜在的导致FECD的RNA毒性机制(Du等人，RNA toxicityand missplicing in the common eye disease Fuch’s endothelial cornealdystrophy.J Biol Chem 2015 290(10)：5979-90)。在TCF4基因中的TNR扩增为纯合和杂合两种的FECD患者的成纤维细胞中识别出RNA团簇。在未受影响的个体的成纤维细胞中未发现RNA团簇。未受影响的个体一般似乎携带具有约20个TNR的野生型TCF4基因。杂合子FECD患者(具有检测到RNA团簇的成纤维细胞)携带一个正常长度等位基因(20个TNR)和一个扩增≥40个TNR的等位基因。在纯合子FECD患者中，两个等位基因均含有≥40个TNR。因此，TCF4扩增的TNR区域中少于40个重复可认为是非致病基因型。在FECD患者样品的角膜内皮中也识别出RNA团簇，而在未受影响的个体中未发现RNA团簇。这种RNA团簇的存在似乎与许多其它基因的RNA剪接模式的变化相关联(Du等人，2015)。这些剪接模式的变化与DM1中记录的类似变化一致(Wheeler等人，Correction of CIC-1 splicing eliminates chloridechannelopathy and myotonia in mouse models of myotonic dystrophy.J ClinInvest 2007 117(12)：3952-7；Savkur RS等人，Aberrant regulation of insulinreceptor alternative splicing is associated with insulin resistance inmyotonic dystrophy.Nat Genet 2001 29(1)：40-7；Li YJ等人，Replication of TCF4through association and linkage studies in late-onset Fuchs endothelialcorneal dystrophy.PLoS One.2011 6：e18044)。大致的结论是，大部分FECD病例由角膜内皮细胞中的RNA毒性引起，这是由于来自TCF4基因的内含子RNA中存在TNR扩增。延长的重复为杂合或纯合的患者中均发现RNA毒性，并且很可能是与包含TNR扩增的RNA相互作用的蛋白质的螯合(sequestration)的结果。这种蛋白质-通过这种螯合作用-不能再在细胞中发挥其正常功能。
尽管用全角膜移植或内皮层移植来治疗FECD能够获得良好的结果，但显然这样的手术仍然遇到了上述的巨大缺点。因此，仍然存在未满足的优选通过移植的合适替代方式治疗患有或具有发展FECD风险的患者的医疗需求。
发明内容
本发明涉及一种用于预防和/或治疗遗传疾病的反义寡核苷酸(AON)，优选地在患有所述遗传疾病、或具有患所述遗传疾病的风险的人受试者中，其中所述寡核苷酸与靶RNA分子至少部分互补，并且其中所述寡核苷酸能够结合存在于所述靶RNA分子内的内含子序列中的三核苷酸重复(TNR)扩增。所述遗传疾病优选地由RNA毒性引起，其中从内含子序列转录并且包含TNR扩增的RNA螯合(sequesters)细胞蛋白质，使得它们不能再在细胞内执行它们的正常功能。通过使用本发明的AON治疗和/或预防的优选的遗传疾病是人的眼营养不良、更优选由TCF4基因中的TNR扩增引起的称为Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)的疾病。在优选的方面，所述TNR扩增包含序列5’-(CUG)n-3’，其中n是40或更大的整数，优选50或更大的整数。在又一个优选的实施方式中，根据本发明使用的AON包含序列5’-(CAG)m-3’，其中m是2至66范围的整数，优选其中m是整数2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17。本发明还涉及本文所定义的AON，并且涉及包含本文公开的任何一种AON的药物组合物。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种治疗或预防人受试者中的FECD的方法，所述方法包括将根据本发明的寡核苷酸或根据本发明的组合物通过基质内注射施用于所述人受试者的角膜基质、或通过前房内注射施用于所述人受试者的前房液、或通过玻璃体内注射施用于所述人受试者的后房。
附图说明
图1是眼前部的示意图，从左至右显示(在左侧放大)：眼外侧的角膜上皮层，上皮和基质之间的前弹力层，角膜基质，后弹力层，角膜内皮层和前房液。
图2提供具有24个CTG重复(粗体)的健康个体的人TCF4内含子3序列(SEQ ID NO：1)。侧翼外显子序列加下划线。
图3示出反义寡核苷酸序列(AON)的实例及其在人TCF4基因的内含子3中的互补部分。SEQ ID NO：2表示在人TCF4基因的内含子3的mRNA中发现的5’-(CUG)n-3’重复(的部分)，在这种情况下，CUG重复表示为7倍。SEQ ID NO：3-15表示根据本发明的AON。SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：103(如此命名是因为序列表不表示短于10个核苷酸的寡核苷酸，并且这3个AON长度为9个核苷酸)也表示本发明的AON。SEQ ID NO：16表示对照寡核苷酸，其表示包含CUG重复的有义链，与SEQ ID NO：2相似。
图4示出玻璃体内注射Cy5标记的寡核苷酸至兔眼内之后与角膜内皮相关的荧光的时间依赖性增加以及角膜基质荧光的总体增加。
图5示出治疗性寡核苷酸(CAG)7(上面的三组)在减少源自TCF4基因中杂合扩增大于40个CUG重复的FECD患者的人角膜内皮细胞中的RNA团簇(粉红色斑点)中的作用。对照在下面的三组中示出，团簇仍清晰可见。使用浓度为200nM的治疗性寡核苷酸并用Dharmafect转染。使用Cy3标记的(CAG)7寡核苷酸探针，使用荧光原位杂交(FISH)识别RNA团簇。通过自动图像分析确定所检查细胞核中的RNA团簇数目并显示为直方图(图底部)。从显微照片和直方图可以观察到，与转染对照(不相关的)寡核苷酸相比，治疗性寡核苷酸(CAG)7有效减少RNA团簇数量。
图6示出治疗性寡核苷酸(CAG)7在减少源自TCF4基因中杂合扩增大于40个CUG重复的五个不同FECD患者(P44，P50，P63，P88和P92)的人角膜内皮细胞中RNA团簇中的作用。实验与图5中的相同，但是现在是对于来自这五个另外的五个患者的细胞。每个直方图代表一个单独的患者。AG(CAG)2-LNA是额外的AON，仅在来自第五位患者的细胞中测试一次。似乎具有该序列并且处于锁核酸(LNA)构型的该AON不如(CAG)7AON。右图示出所有五位患者的结果一起采用时每个细胞核的平均团簇。‘ctrl AON’表示用对照无关寡核苷酸进行的处理。
具体实施方式
本发明涉及能够用于预防或治疗遗传疾病、优选由RNA毒性引起的疾病、更优选作为RNA毒性的结果的眼部疾病的方法和分子。更具体地，本发明涉及用于治疗与参与剪接调控的蛋白质比如MBNL1的螯合(特别是通过这些蛋白质与前体mRNA的内含子中存在的过量TNR扩增的结合)相关联的疾病的反义寡核苷酸(AON)。用本发明的AON治疗的优选疾病是Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)，其与TCF4转录物的内含子3中过量的TNR扩增的发生、导致剪接调节蛋白MBNL1过度结合于这种过量的TNR扩增相关联。换句话说，并且在优选的方面，本发明涉及用于预防或治疗FECD的AON，其通过施用结合TCF4基因转录物中过量TNR扩增的AON，从而防止蛋白质对过量TNR扩增的不想要的结合。MBNL1与过量TNR扩增结合的标志是在患者患病细胞的细胞核中形成所谓的RNA团簇。因此，本发明的AON通过去除或防止RNA团簇形成、特别是在角膜内皮细胞中的RNA团簇形成，用于治疗或预防遗传(眼)病比如FECD。
图2示出健康个体的人TCF4基因的内含子3(编码链的5’至3’)序列，外加5’和3’末端的一段外显子序列。如上所述，与FECD发展相关的TCF4基因的内含子3中CTG重复扩增的存在是本领域公知的。WO2011/101711公开了使用寡核苷酸引物和PCR扩增检测(在人样品中)这些CTG-重复扩增的方法。WO2011/101711中公开的寡核苷酸和方法用于诊断患有FECD或处于发展FECD风险的患者，并确定个体是否应该避免进行角膜移植或激光矫正。应该注意的是，WO2011/101711没有公开或暗示防止FECD发展或缓解其症状的方法。
如上所述，DM1也是由RNA毒性引起的疾病，并且EP2049664B1公开了使用靶向人DMPK基因转录物中的TNR扩增的AON来治疗DM1的方法。EP2049664B1公开了具有序列5’-(CAG)n-3’的AON以治疗多种人顺式元件重复不稳定性相关病症，比如亨廷顿舞蹈病(HD)、脊髓小脑性共济失调、郝乌河综合征(Haw River syndrome)、X-连锁脊髓延髓肌肉萎缩症和齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubral pallidoluysian atrophy)、DM1、8型脊髓小脑性共济失调和2型亨廷顿舞蹈病。DM1中的TNR重复扩增在DMPK基因的3’-UTR中发现。其他的描述了使用(CAG)7AON以靶向与DM1相关联的人DMPK基因的外显子15的转录物(Mulders等人，2009.Triplet-repeat oligonucleotide-mediated reversal of RNAtoxicity in myotonie dystrophy.Proc Natl Acad Sci USA 106(33)：13915-20)。作者假设mRNA的细胞质库以及初级和成熟的扩增的(CUG)n转录物的细胞核库都作为靶标。
DM1是RNA毒性介导的疾病，并且毒性DMPK mRNA前体包含与FECD患者中的TCF4转录物具有相同重复单元(CUG)的扩增TNR。似乎MBNL1以与FECD患者中相似的方式在DM1患者中螯合。因此，假定DM1和FECD可以用相同的AON以相同的方式进行治疗是有吸引力的。然而，重要的是注意到，在DM1和FECD中发生的RNA毒性过程之间存在差异。在DM1中，蛋白质通过与3’-UTR RNA序列结合而螯合，该3’-UTR RNA序列不仅存在于初级转录物中，而且存在于成熟RNA中(当内含子已经被剪接出时)，并且因此可以位于细胞核或细胞质中。相反，在FECD中，RNA毒性由与内含子RNA结合的蛋白质的螯合引起，该内含子RNA作为初级mRNA前体的一部分，或者更可能作为从成熟mRNA剪切出的内含子RNA，在这两种情况下都保留在细胞核中。因此，寡核苷酸在DM1治疗中起作用的细胞区室与在FECD情况下起作用的细胞区室不同。因此，AON方法将以与在DM1中相同的方式在FECD中起作用不会立即显而易见，因为用于治疗FECD或就此而论的任何其它内含子TNR扩增相关疾病的AON将必须专有地在细胞的不同区室中(即在细胞核中)、在转录物的加工和转运的不同阶段起作用。此外，在AON治疗时所螯合的蛋白质比如MBNL1是否会被释放或多有效地被释放并不显而易见。与DM1相比，FECD的显著差异是假定MBNL1结合于剪接出的非降解内含子套索，该内含子套索以与外显子序列，包括含有3’-UTR和5’-UTR的RNA中的外显子序列不同的动力学进行加工。
有趣的是，本发明的发明人认识到，如果MBNL1的螯合或这些RNA团簇共有的其它因素在机制上参与FECD的病理学，那么如果发现DMPK在角膜内皮中表达，则含有TNR扩增的DMPK应当传达发展FECD的相似风险。有趣的是，DMPK实际上在人眼中表达(Winchester CL等人，Characterization of the expression of DMPK and SIX5 in the human eye andimplications of pathogenesis in myotonic dystrophy.Hum Mol Genet.1999 8：481-492)并且FECD已经在肌强直性营养不良患者中发现：在一组四名DM患者中，每名患者具有双侧FECD(Gattey D等人，Fuchs endothelial corneal dystrophy in patients withmyotonic dystrophy：a case series.Cornea 2014 33：96-98)。另外，在来自强直性肌营养不良患者的尸体解剖眼部中已经注意到角膜内皮细胞的相当多的损失，这是晚期FECD的临床特征(Winchester等人，1999)。本发明的发明人还认识到，使用本文公开的AON方法可以对患有FECD的DM1患者治疗FECD。但是，更重要的是，本发明的发明人认识到，通过靶向在内含子3中具有过量TNR扩增的TCF4转录物(如在FECD患者中的情况)，可以有效地治疗这些患者的FECD。
如上所述，DM2也是内含子序列中NR扩增(QNR)的结果的疾病。DM2患者在ZNF9基因的内含子中携带QNR扩增。然而，似乎观察到的RNA毒性在DM2和FECD之间是不同的。在DM2中，似乎存在含有QNR的(未剪接的)内含子RNA的积聚，这是由于ZNF9RNA自身的剪接被阻断的事实而引起，导致转录物(和功能性蛋白质)水平降低。在FECD中不缺少功能性TCF4(见下文)。
现有技术没有教导靶向内含子中基于(CUG)的TNR扩增(如TCF4转录物中的情况)的可能性，并且所讨论的参考文献均没有公开或暗示AON可用于预防或治疗角膜营养不良，比如FECD。为在此基础上进一步详尽阐述，DM1中的重复扩增导致主要在细胞核的RNA团簇形成，但也可在细胞质中观察到，这取决于基因型和细胞类型(Pettersson等人，Molecularmechanisms in DM1-a focus on foci.Nucleic Acids Res 2015 43(4)：2433-41.)。已经发现，在AON治疗后，含有重复的DMPK RNA迅速降解(Mulders等人，2009)。发生这种情况的确切机制尚不清楚，并且可能部分取决于转录物的位置，这受到RNA加工和转运的程度的影响，这些因素随细胞类型而不同。具有未剪接内含子或不完全聚腺苷酸化的转录物通常保留在细胞核中，并最终由核外泌体降解，因此详细地说明了一种根本上不同的RNA降解机制。具体地，已知DM1中的CUG扩增导致DMPK转录物的RNA加工缺陷，因此这些RNA可能保留在细胞核中。然而，在DM1中也显示出无义介导的衰变机制(一种细胞质过程)参与降解包含重复的RNA，其中无义介导的衰变因子的敲低(knockdown)也导致细胞核DMPK团簇的量增加(Garcia等人，Identification of genes in toxicity pathways of trinucleotide-repeat RNA in C.elegans.Nat Struct Mol Biol 2014 21(8)：712-20)。这表明大部分转录物得到高效加工，与在一些细胞中观察到的DMPK mRNA在细胞质中的位置一致。因此，在从细胞核团簇中释放后，DMPK转录物很可能由细胞质过程以及细胞核过程降解，尽管这些过程的相对程度仍然未知。
关于FECD中TCF4扩增的情况是不同的，因为仅在细胞核中观察到团簇，可能是因为重复位于内含子中，其不出现在输出到细胞质的成熟转录物内。因此，靶向TCF4重复的AON专有地在细胞核内起作用。首先，可能在参与内含子加工的特定细胞核域(例如核散斑)中的位置影响AON的递送和活性。其次，重复本身(在内含子序列中)的位置可以影响MBNL1的结合动力学，这可能受到也结合于内含子RNA的其它蛋白质的影响。细胞核定位和TNR处于内含子序列中的事实这两个方面都会影响AON起作用的能力。应该考虑的另一个因素是内含子RNA序列的稳定性和这种内含子RNA在从细胞核团簇中释放后降解的机制。RNA测序显示来自内含子含有重复的RNA积聚在FECD患者细胞中，同时未观察到来自转录物其他部分的RNA积聚(Du等人，2015)。此外，似乎TCF4 mRNA和蛋白质的表达水平不因延长的重复而显著改变，因为TCF4的单倍剂量不足引起称为皮特-霍普金斯综合征(Pitt-Hopkinssyndrome)的另一种更严重的病症(Mootha等人，TCF4 triplet repeat expansion andnuclear RNA foci in Fuchs endothelial corneal dystrophy.Invest Ophthalmol VisSci 2015 56(3)：2003-11；Sepp等人，Pitt-Hopkins syndrome-associated mutations inTCF4 lead to variable impairment of the transcription factor function rangingfrom hypomorphic to dominant-negative effects.Hum Mol Genet 2012 21(13)：2873-88.)。这表明观察到的细胞核团簇主要由剪接出的螯合蛋白质比如MBNL1的内含子RNA组成。在剪接反应期间，内含子的分支点腺苷通过非常规的2’-5’磷酸二酯键与剪接供体位点处的核苷酸连接，形成分支的套索结构。这些结构在细胞核中相对稳定，并且对于它们的降解需要额外的步骤。在正常情况下，特定的蛋白质因子释放与套索保持结合的剪接因子。在此之后，特定的套索脱支酶DBR1募集至复合物以打开2’-5’磷酸二酯键。脱支后，释放的直链内含子RNA由核外泌体和/或核酸外切酶XRN1降解。本发明的发明人假设TCF4 RNA与MBNL1(和可能的其它结合重复的蛋白)在细胞核团簇中的复合阻止了套索脱支和降解所需的一个或几个步骤。因此，与DMPK的情况相反，在FECD治疗期间含有重复的TCF4 RNA和来自细胞核团簇的相关蛋白的释放具有不同的动力学。RNA本身随后的降解也是如此，并且RNA可能需要额外的加工和优化以有效地清除。
据发明人所知，这是第一次公开与过量内含子TNR扩增相关联的疾病可以使用AON来进行治疗，该AON与TNR互补，在患病患者细胞的细胞核中，有效地结合这种TNR扩增引起剪接调节蛋白如MBNL1的释放，从而消除RNA毒性。这对于治疗过量TNR扩增存在于TCF4基因的内含子3中的FECD是特别有用的，尤其是现在已经由本发明人令人信服地表明，AON可以有效地递送至角膜内皮细胞层，并由角膜内皮细胞层摄取。然而，使用患病细胞的细胞核中的核团簇的减少或消失作为有效性标志，本发明的发明人预期涉及内含子TNR扩增的其它毒性功能获得性RNA的治疗，可以使用靶向该内含子TNR扩增的AON进行治疗。
本发明涉及一种反义寡核苷酸(AON)，优选单链AON，包含这种AON的组合物，以及包含这种AON和药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。本发明还涉及使用这种AON或组合物用于体内或体外治疗或预防由RNA毒性引起的疾病，其包括将这种AON或组合物施用于受试者，优选人受试者。本发明还涉及治疗和/或预防由RNA毒性引起的疾病、优选眼营养不良、更优选FECD的方法，其包括将这种AON或组合物施用于受试者、优选人受试者。
本发明的AON优选包含一个或多个经修饰以增加核酸酶抗性的残基，和/或经修饰以增加AON对靶序列的亲和力的残基。因此，在一个优选的实施方式中，AON序列包含至少一个核苷酸类似物或等同物，其中核苷酸类似物或等同物定义为具有修饰的碱基、和/或修饰的主链、和/或非天然的核苷间键、或这些修饰的组合的残基。在一个优选的实施方式中，核苷酸类似物或等同物包含修饰的主链。这些主链的实例提供为吗啉代主链、氨基甲酸酯主链、硅氧烷主链、硫化物、亚砜和砜主链、甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基主链、亚甲基甲酰乙酰基(methyleneformacetyl)主链、核糖乙酰基主链、含烯烃主链、氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺主链、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链、和酰胺主链。磷酰二胺吗啉代寡聚物是先前已作为反义试剂研究的修饰的主链寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电荷的主链，其中DNA的脱氧核糖由六元环替代，并且磷酸二酯键由二氨基磷酸酯键(phosphorodiamidate)替代。吗啉代寡核苷酸对酶促降解具有抗性，并且通过阻止翻译或干扰mRNA前体剪接而不是通过激活RNase H而起到反义试剂的作用。已经通过物理破坏细胞膜的方法成功地将吗啉代寡核苷酸递送至组织培养细胞，并且一项研究比较了这些方法中的几种，发现划痕标记(scrape loading)是最高效的递送方法；然而，因为吗啉代主链不带电荷，阳离子脂质不是细胞中吗啉代寡核苷酸摄取的有效介质。
根据本发明的一个实施方式，主链中残基之间的键不包括磷原子，比如由短链烷基形成的键或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。
根据该实施方式，优选的核苷酸类似物或等同物包含具有改性聚酰胺主链的肽核酸(PNA)(Nielsen等人，1991 Science 254：1497-1500)。基于PNA的分子在碱基对识别方面是真正模仿DNA分子的。PNA的主链由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成，其中核碱基通过亚甲基羰基键与主链连接。另外可选的主链包含一碳延伸的吡咯烷PNA单体(Govindaraju和Kumar 2005 Chem Commun 495-497)。由于PNA分子的主链不含带电荷的磷酸盐基团，因此PNA-RNA杂合体通常分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂合体更稳定(Egholm等人，1993 Nature 365：566-568)。
根据本发明的另一个实施方式，主链包含吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖由6-元吗啉代环替代。最优选的核苷酸类似物或等同物包含磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖由6-元吗啉代环替代，并且相邻吗啉代环之间的阴离子磷酸二酯键由非离子二氨基磷酸酯键替代。
在又一个实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含磷酸二酯键中非桥连氧之一的取代。这种修饰稍微使碱基配对不稳定，但增加了对核酸酶降解的显著抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、H-膦酸酯、膦酸甲基酯和其它膦酸烷基酯(包括膦酸3’-亚烷基酯、膦酸5’-亚烷基酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)，硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)。
本发明的另一个优选的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个糖部分，其在2’、3’和/或5’位单取代或双取代，比如-OH；-F；取代的或非取代的、直链或支链低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷烃基(alkanyl)、烯丙基、或芳烷基，以上基团可以由一个或多个杂原子打断；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲氨基氧基乙氧基；以及-二甲氨基乙氧基乙氧基。该糖部分可以是五环糖或其衍生物、或脱氧五环糖或其衍生物、优选是核糖或其衍生物、或脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生化的糖部分包括锁核酸(LNA)，其中2’-碳原子与糖环的3’或4’碳原子连接，由此形成双环糖部分。优选的LNA包括2’-O，4’-C-乙烯-桥连核酸(Morita等人，2001 Nucleic Acid Res Supplement No.1：241-242)。这些取代使得核苷酸类似物或等同物耐受RNase H和核酸酶，并增加了对靶RNA的亲和力。
本领域技术人员应该理解，没有必要修饰反义寡核苷酸中的所有核苷间键。例如，一些核苷间键可以是未修饰的，而其它核苷间键是修饰的。包含由沿着AON的长度均匀或非均匀分布的一种形式的(修饰的)核苷间键、多种形式的(修饰的)核苷间键组成的主链的AON都包括在本发明中。另外，任何形式的主链修饰(均匀的、非均匀的，单一形式或多种形式以及它们的所有排列)可以与下文提到的任何形式的糖或核苷修饰或类似物进行组合。根据本发明的AON的特别优选的主链是均匀的(全部)硫代磷酸酯(PS)主链。
在另一个实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个碱基修饰或取代。经修饰的碱基包括合成碱基和天然碱基比如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤和本领域中已知的或将已知的嘧啶和嘌呤碱基的其它-氮杂、去氮杂、-羟基、-卤素、-硫基、硫醇、-烷基、-烯基、-炔基、硫代烷基衍生物。
本领域技术人员应该理解，没有必要均匀地修饰反义寡核苷酸中的所有位置。另外，可以将多于一种的上述类似物或等同物引入单个反义寡核苷酸中或甚至在反义寡核苷酸内的单个位置上。在某些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸具有至少两种不同类型的类似物或等同物。根据另一个实施方式，根据本发明的AON包含2’-O(优选低级)烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸，比如2’-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2’-O-甲氧基乙基修饰的核糖、2’-O-乙基修饰的核糖、2’-O-丙基修饰的核糖、和/或这些修饰的取代衍生物，比如卤化衍生物。根据本发明的有效且尤其优选的AON形式包含具有硫代磷酸酯主链的2’-O-甲基修饰的核糖部分，优选其中基本上所有核糖部分均为2’-O-甲基且基本上所有核苷间键均为硫代磷酸酯键。
根据本发明的寡核苷酸含有与内含子序列中发现的TNR扩增(的部分)互补的序列，并且包含与扩增中的三联体序列互补的多个序列。尽管TNR可以称为CUG三联体的重复序列(从5’至3’)，但DNA(和相应的RNA)的性质使得这也可以写为UGC重复或写为GCU重复，这取决于将什么认为是三联体的第一个核苷酸。这意味着根据本发明的反义寡核苷酸可以从与三联体CAG、GCA或AGC(从5’至3’)的核苷酸之一互补的任意核苷酸开始。根据本发明的教导可以使用的反义寡核苷酸的实例在图3中提供，表明互补序列的三个核苷酸中的任意一个可以是第一个核苷酸。对内含子中5’-(CUG)n-3’TNR的靶向优选通过使用具有通过标准沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对5’-(CAG)m-3’、或通过摆动碱基对如5’-(CAI)m-3’、5’-(CGG)m-3’、5’-(CGI)m-3’、5’-(CIG)m-3’、5’-(CII)m-3’、5’-(UAG)m-3’、5’-(UAI)m-3’、5’-(UGG)m-3’、5’-(UGI)m-3’、5’-(UIG)m-3’和5’-(UII)m-3’形成的互补序列的AON而进行。当第二个核苷酸向5’末端移动一个位置并成为重复的第一个核苷酸时，则考虑以下重复序列：5’-(AGC)m-3’、5’-(AIC)m-3’、5’-(GGC)m-3’、5’-(GIC)m-3’、5’-(IGC)m-3’、5’-(IIC)m-3’、5’-(AGU)m-3’、5’-(AIU)m-3’、5’-(GGU)m-3’、5’-(GIU)m-3’、5’-(IGU)m-3’和5’-(IIU)m-3’，当第三个核苷酸接替第一个核苷酸时，则考虑以下重复序列：5’-(GCA)m-3’、5’-(ICA)m-3’、5’-(GCG)m-3’、5’-(ICG)m-3’、5’-(GCI)m-3’、5’-(ICI)m-3’、5’-(GUA)m-3’、5’-(IUA)m-3’、5’-(GUG)m-3’、5’-(IUG)m-3’、5’-(GUI)m-3’和5’-(IUI)m-3’。显然，在重复40次或更多次的CUG序列中，还可以识别UGC重复和GCU重复。
本发明利用一种分子优选反义寡核苷酸(AON)，其能够结合包含序列5’-(CUG)n-3’的三核苷酸重复(TNR)扩增，其中n足够长以引起这种TNR扩增在其中转录的细胞中的RNA毒性。TCF4基因是这样一种基因，当包含40个或更多TNR时，其通过将角膜内皮细胞中的正常细胞蛋白质螯合至TNR扩增而引起FECD。然而，本发明涉及分子比如AON用于由内含子序列中TNR扩增的出现引起的任何病症的用途。现有技术并没有教导如何治疗或预防其中通过内含子中的TNR扩增导致RNA毒性的遗传疾病，尤其没有教导那些由CUG TNR扩增引起的遗传疾病。本发明的核酸分子由与TNR互补的序列组成。
尽管使用“裸”或“裸露(gymnotic)”AON作为能够结合TNR扩增的分子来举例说明本发明，但本领域普通技术人员将认识到能够与核酸序列、更特别是TNR、还更特别是5’-(CUG)n-3’扩增结合的其它分子包括在本发明内。这样的分子的实例是蛋白质，比如锌指蛋白、抗体或抗体片段、适体、二价配体(Haghighat Jahromi A等人，Developing bivalentligands to target CUG triplet repeats，the causative agent of MyotonicDystrophy Type 1.J Med Chem 2013.56：9471-9481)等。本发明人还包括从编码包含根据本发明的AON或由其组成的核酸分子的载体、比如DNA载体或病毒载体(例如腺病毒、AAV或慢病毒载体)表达的AON。
因此，本发明提供用于预防和/或治疗不稳定的顺式元件DNA重复相关遗传疾病、优选眼营养不良、更优选FECD的方法中的分子。本发明涉及一种方法，包括提供与TNR、优选在内含子区域中的TNR互补和/或能够与TNR、优选在内含子区域中的TNR杂交的核酸分子的步骤。与本发明的核酸分子杂交的RNA的降解不是必需的，只要其螯合与患病状态相关联的蛋白质在施用根据本发明的分子时不再螯合或至少相对较低水平地螯合。这可以通过观察细胞核内的RNA团簇来评估。在一个方面，本发明公开和教导由仅与人基因转录物中的重复序列互补的序列组成的AON在制备用于诊断、治疗或预防哺乳动物受试者、优选人的顺式元件重复不稳定性相关遗传疾病的药物中的用途。在优选的实施方式中，顺式元件重复不稳定性相关遗传疾病是由在一个或多个内含子序列中含有TNR的RNA转录物引起的RNA毒性的结果。在最优选的实施方式中，所述疾病是FECD。
本发明的寡核苷酸优选是单链的、化学修饰的和合成制备的。或者，它们可以在靶细胞比如角膜内皮细胞内由核酸序列比如由病毒(例如慢病毒、AAV或腺病毒)或非病毒载体递送的核酸序列进行表达。根据本发明的AON的长度可以是8至200个核苷酸，优选10至100个，更优选12至50个。根据本发明的AON可以包含2至66个由3个核苷酸组成的重复单元，优选5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个这样的重复单元。TNR包含三个核苷酸(＝三核苷酸)的相同重复单元的至少两个重复单元，这意味着当三核苷酸重复3次时，TNR的长度至少为9个核苷酸，并且当三核苷酸重复7次时，TNR的长度至少为21个核苷酸。导致疾病的TNR的长度取决于疾病，在FECD的情况下，TNR的长度等于或大于重复单元的40个重复，通常超过45个，甚至更通常超过50个，尽管这在病人之间可能不同。应该清楚的是，本发明的AON与靶RNA中的许多重复单元(最少两个)互补，但这并不意味着AON必须由3个核苷酸的倍数组成。例如，除了与两个或更多重复单元互补的中心部分之外，AON可以在AON的一端(5’或3’)或两端(5’和3’)包含1或2个互补核苷酸。换句话说，本发明的AON可以与靶RNA中TNR扩增内的序列完全互补，而AON的互补区域不由3的倍数组成。例如，本发明的寡核苷酸的长度可以是9个核苷酸，但仅包含2个重复CAG单元，参见例如SEQID NO：102和SEQ ID NO：103，这表明本发明的寡核苷酸不一定必须是3个核苷酸的倍数。
本发明的一个重要方面是在FECD的情况下将本发明的AON递送至角膜内皮。治疗量的AON可通过基质内注射给药至角膜基质。例如，在角膜炎的情况下向角膜施用抗生素时进行基质内注射。或者，治疗性寡核苷酸可以在内皮细胞层的另一侧通过前房内注射给药至房水中。由于眼睛的前房和后房连通，本发明的治疗性寡核苷酸也可以通过玻璃体内注射给药至眼后房中。在图4中提供了这样的图示和实例，其中证明与荧光染料(Cy5)偶联的寡核苷酸在玻璃体内注射后以时间依赖性方式与角膜内皮细胞层特异性结合。与角膜内皮层的结合在注射后48小时出现最大值。所有的给药途径都是可以接受的，只要它们导致角膜内皮细胞摄取。然而，角膜内皮吸收AON的能力是无法预料的，因为虽然已经开发出许多病毒和非病毒载体以将基因递送至角膜内皮，但在体内仅取得了有限的成功(George AJ等人，Am J Respir Crit Care Med.2000.162：S194-200)。未使用注射程序的成功的内皮细胞基因递送的体内研究尚未在文献中报道过。已经利用注入前房的连接蛋白-43反义siRNA寡核苷酸证实了一种利用注射入前房的成功方法(Nakano Y等人，Connexin43 knockdownaccelerates wound healing but inhibits mesenchymal transition after cornealendothelial injury in vivo.Invest Ophthalmol Vis Sci.2008.49：93-104)。然而，由于角膜内皮的功能是保持渗透性屏障以帮助角膜基质水合作用，并且这种功能主要依赖于间隙连接的存在，这在很大程度上是由连接蛋白43保持的，似乎这种靶向的敲低有助于寡核苷酸摄入角膜内皮的机制。因此，不将这视为一般适用于其它AON的教导。递送的治疗性寡核苷酸的功效将取决于从角膜基质或房水(即使首先注射到玻璃体中)吸收进入细胞的量和其最终递送到细胞核的量。通过使用转染试剂或所谓的寡核苷酸递送增强剂增加寡核苷酸摄入细胞的核定位和效率。体内转染试剂现在可用，例如jetPEI(polyplustransfectionTM)，其被提出用于增加治疗性寡核苷酸到角膜内皮内的摄取和核定位，并且代表了相对于简单地将治疗性寡核苷酸作为“裸”分子施用而言的改进。与靶RNA分子的碱基配对优先发生在细胞中。为了体内应用，可以将根据本发明的寡核苷酸包装在脂质体、多核糖体或纳米颗粒或其它合适的颗粒如病毒颗粒中用于递送(施用)。或者，或与递送载体组合，寡核苷酸可以与聚乙烯亚胺(PEI)和/或聚乙二醇(PEG)复合。本领域技术人员会理解，如果适用，根据本发明的两种或更多种寡核苷酸可以组合。本领域技术人员将会理解，当本文涉及根据本发明的寡核苷酸时，根据本发明的组合物或药物组合物优选可以互换地用于根据本发明的方法和用途中。
本发明涉及用于预防和/或治疗遗传疾病的(单链)AON，其中所述寡核苷酸与靶RNA分子至少部分互补，并且其中所述寡核苷酸能够结合所述靶RNA分子内的内含子序列中存在的三核苷酸重复(TNR)扩增。在优选的方面，所述TNR扩增包含序列5’-(CUG)n-3’，其中n是40或更大的整数，更优选其中n是50或更大的整数。在另一个优选的方面，本发明的AON的所有核苷酸都是2’-O甲基硫代磷酸酯核糖核苷酸。
在特别优选的实施方式中，本发明的AON包含序列5’-(CAG)m-3’、5’-(CAI)m-3’、5’-(CGG)m-3’、5’-(CGI)m-3’、5’-(CIG)m-3’、5’-(CII)m-3’、5’-(UAG)m-3’、5’-(UAI)m-3’、5’-(UGG)m-3’、5’-(UGI)m-3’、5’-(UIG)m-3’、5’-(UII)m-3’、5’-(AGC)m-3’、5’-(AIC)m-3’、5’-(GGC)m-3’、5’-(GIC)m-3’、5’-(IGC)m-3’、5’-(IIC)m-3’、5’-(AGU)m-3’、5’-(AIU)m-3’、5’-(GGU)m-3’、5’-(GIU)m-3’、5’-(IGU)m-3’、5’-(IIU)m-3’、5’-(GCA)m-3’、5’-(ICA)m-3’、5’-(GCG)m-3’、5’-(ICG)m-3’、5’-(GCI)m-3’、5’-(ICI)m-3’、5’-(GUA)m-3’、5’-(IUA)m-3’、5’-(GUG)m-3’、5’-(IUG)m-3’、5’-(GUI)m-3’或5’-(IUI)m-3’，其中m是2-66范围的整数，优选地，其中m是整数2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17。在本发明的另一个优选方面，本发明的寡核苷酸的长度为9个或更多个核苷酸。
本发明的AON优选用于治疗和/或预防遗传疾病，其中导致疾病的TNR扩增存在于TCF4基因的转录物中。由TCF4基因内含子序列中的TNR扩增引起的RNA毒性导致的疾病的一个实例是眼营养不良，优选Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)。因此，在优选的方面，本发明的AON用于预防和/或治疗FECD。优选地，根据本发明使用的AON选自具有SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、101、102和103的AON(见图3)。优选的受试者是人受试者。尽管根据本发明的AON用于治疗和/或预防本文所定义的遗传疾病，但本发明还涉及可存在于药物组合物中的寡核苷酸本身。根据本发明的药物组合物优选包含本文所定义的寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂或载体对于本领域技术人员来说是公知的。由于在优选的方面，将本文所述的AON递送至可能难以通过简单施用穿透的组织(比如眼内部)，本发明的组合物优选包含寡核苷酸递送增强剂。尽管在某些方面，AON可直接或借助AON递送增强剂递送，但本发明的AON也可通过比如详述于WO 2014/011053的病毒或非病毒基因递送载体或基因治疗载体进行递送。实例是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体和慢病毒载体。非病毒基因递送载体(或非病毒核酸递送载体)例如是脂质体、多核糖体和纳米颗粒。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种治疗或预防人受试者中的FECD的方法，所述方法包括将根据本发明的寡核苷酸或根据本发明的组合物通过基质内注射施用于所述人受试者的角膜基质、或通过前房内注射施用于所述人受试者的前房液、或通过玻璃体内注射施用于所述人受试者的后房。
在又一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的反义寡核苷酸用于制备用于治疗和/或预防遗传疾病、优选由RNA毒性引起的遗传疾病、更优选地由于在内含子序列(比如人TCF4基因中发现的)中的TNR扩增引起的RNA毒性导致的遗传疾病、最优选用于治疗和/或预防人FECD的药物的用途。
本文考虑使用的非载体化AON通常以0.0001～200mg/kg、优选0.001～100mg/kg、更优选0.01～50mg/kg范围的剂量使用，取决于疾病、靶器官或组织、以及给药途径。
对于眼部疾病，比如FECD，玻璃体内施用的合适剂量为每只眼0.05mg至5mg，优选0.1～1mg，比如每只眼约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg。
通过口服、眼内、肺内、鼻内、肌肉内、皮下、皮内、直肠，通过吞咽、注射、吸入、输注、喷雾给药，可将本发明的AON以(水性)溶液、混悬液、(水包油)乳液、软膏、锭剂、丸剂等形式对患者进行全身、局部(locally，topically)施用。更优选的给药途径是通过角膜内注射水溶液或专门适用于眼内给药的制剂。EP 2 425 814公开了一种特别适用于眼内(玻璃体内)施用肽或核酸药物的水包油乳液。这种乳液比玻璃体液密度小，使得乳液漂浮在玻璃体顶部，避免注射的药物损害视力。
根据施用途径和患者的需要，给药可以每天、每周、每月、每季度、每年一次。
在优选的实施方式中，如本文之前描述的作为本发明分子的递送载体的病毒载体、优选AAV载体以每次注射1×109至1×1017个病毒颗粒、更优选每次注射1×1010至1×1014、并且最优选1×1010至1×1012个病毒颗粒的范围的剂量施用。
本发明所属领域的普通技术人员将清楚，治疗细节将需要根据并取决于比如以下因素来建立：寡核苷酸的序列和化学性质、施用途径、剂型、剂量、给药方案、形式(载体或非载体化AON)、患者的年龄和体重、疾病阶段等，这可能需要进一步的非临床和临床研究。
实施例
实施例1.治疗由存在长度大于50个重复的TCF4 TNR导致的FECD的治疗方法
通过使用针对TCF4中扩增的CUG TNR的反义寡核苷酸(AON)，实现了特异性序列结合，使得这导致这些序列螯合RNA加工因子比如MBNL1的能力降低。RNA的结合可以由于从细胞核团簇的释放和对套索脱支酶和/或RNase的增加的暴露而另外导致其降解，从而进一步减少可以螯合RNA加工因子的含重复RNA的细胞库。在FECD中，MBNL1的螯合导致毒性RNA团簇和其它RNA的异常剪接模式。对TCF4衍生内含子中5’-(CUG)n-3’TNR的靶向通过使用具有通过标准沃森-克里克碱基对5’-(CAG)m-3’或通过摆动碱基对比如5’-(CAI)m-3’、5’-(CGG)m-3’、5’-(CGI)m-3’、5’-(CIG)m-3’、5’-(CII)m-3’、5’-(UAG)m-3’、5’-(UAI)m-3’、5’-(UGG)m-3’、5’-(UGI)m-3’、5’-(UIG)m-3’和5’-(UII)m-3’形成的互补序列的AON而进行。图3提供了可用于抑制含有50个或更多CUG TNR序列的TCF4 RNA存在的寡核苷酸的实例。
为了筛选不同AON的治疗效果，将它们与对照(有义)AON(图3的底部)一起转染到源自患者的成纤维细胞或角膜细胞中。细胞核RNA团簇的消失通过与Cy3-标记的寡核苷酸的荧光原位杂交以及通过用抗-MBNL1抗体的免疫荧光进行验证。
正如AON处理后对DMPK所观察到的，团簇消失产生自RNA螯合MBNL1的能力降低和/或由于RNA对于RNA降解酶变得更容易接近导致的RNA量降低。应该指出的是，FECD中的团簇可以由未剪接的mRNA前体和/或剪接出的内含子套索、或甚至其中仅保留重复序列的部分降解的内含子RNA构成。这会影响RNA的稳定性和降解动力学。为了验证含有重复的RNA的特性和稳定性，进行Northern印迹分析。为了确定观察到的条带是否是内含子套索，使用三个独立的步骤。首先，在AON处理之前，细胞通过RNAi耗尽套索脱支酶(DBR1)，这导致套索的稳定化(Armakola等人，2012.Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppressesTDP-43 toxicity in ALS disease models.Nat Genet 44(12)：1302-9.)。其次，在RNA分离之后，使来自AON处理细胞或对照处理细胞的RNA样品经受RNAseR，该RNAseR高效地水解直链RNA，但不水解内含子套索(Suzuki等人，2006.Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs frompre-mRNA splicing.Nucleic Acids Res 34(8)：e63)。第三，在互补步骤中，在与TCF4内含子中特定位置互补的DNA寡核苷酸的存在下，用RNaseH处理RNA样品，使得通过RNaseH的水解导致未剪接的内含子裂解成分离的片段，而使内含子套索线性化(Li-Pook-Than和Bonen.2006.Multiple physical forms of excised group II intron RNAs in wheatmitochondria.Nucleic Acids Res 34(9)：2782-90)。
分析来自AON处理的细胞和来自对照细胞的RNA对已知受MBNL1调节的RNA加工事件的影响。最初，AON的影响通过所选择的转录物的RT-PCR进行验证，上述所选择的转录物的剪接已知在FECD中受到MBNL1螯合成细胞核团簇的显著影响(Du等人，2015，同上)。在此之后，通过深度测序分析全转录组水平上剪接的恢复。
FISH和免疫荧光
为了检测细胞核团簇，基本上根据Du等人(2015)的方案进行FISH：将盖玻片上的成纤维细胞和角膜组织用PBS洗涤一次并在室温下在4％多聚甲醛的PBS溶液中固定30分钟。固定后，将细胞用PBS洗涤两次并在4℃下储存在70％乙醇中。在室温下将细胞在50％甲酰胺和2xSSC中再水合5分钟。然后在37℃将细胞在100μl含有10％硫酸葡聚糖、2mM氧钒基-核糖核苷复合物、0.2％BSA、100μg酵母tRNA、2xSSC、50％甲酰胺和1.2μg Cy3-(CAG)7探针的混合物中杂交过夜。杂交和洗涤后，在室温下将细胞用Hoechst 33342(1∶200稀释)染色30分钟，并使用ProLong Gold抗褪色试剂封固在载玻片上。Cy3信号在Zeiss LSM 710激光扫描共焦显微镜上以63的放大倍数获取。与Cy3-(CAG)7探针杂交后，角膜内皮层用含有0.5％Triton X-100的新鲜PBS透化10分钟。然后将角膜细胞在室温下与抗-MBNL1抗体(1∶100于PBS中；sc-47740，Santa Cruz Biotechnology)一起孵育1小时，并在室温下与缀合有Alexa Fluor 488的二抗(1∶500于PBS中；A11001，Invitrogen)孵育30分钟。孵育后，将角膜内皮细胞用PBS洗涤，用Hoechst 33342染色，并如上所述封固在显微镜载玻片上。
Northern印迹
来自患者成纤维细胞或角膜细胞的TCF4 RNA变体在AON处理(和/或脱支酶DRB1敲低)之前和之后的稳定性通过Mulders等人(2009，上文)使用的Northern印迹程序测定。使总RNA在1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶中电泳。根据来源和分离程序，每个泳道加载1至15μgRNA。将RNA转移至Hybond-XL尼龙膜并与[32P]标记的(CAG)7或对照寡核苷酸杂交。Northern印迹分析之前，将选择的样品用RNaseR或RNaseH处理。对于RNase R处理，在37℃将RNA在20mM M Tris-HCl(pH 8.0)、100mM KCl、0.1mM MgCl2和1U/μl RNaseR(Epibio)中在寡聚体中孵育30分钟。对于RNaseH，在37℃将RNA与内含子特异性寡聚体孵育30分钟，之后在37℃用0.03U/ml RNaseH(Invitrogen)、1U/ml RNasin(Promega)、0.27mg/ml BSA(Promega)和10mM DTT处理30分钟。对RNase处理的样品进行苯酚提取和乙醇沉淀，之后进行Northern印迹分析。
实施例2.使用治疗性寡核苷酸靶向角膜内皮细胞层
为了研究寡核苷酸是否能够进入角膜内皮，对十只雌荷兰黑带兔(Dutch BeltedRabbit)进行双眼单次玻璃体内给药，给予单剂量0.6mg在30μl PBS中浓度为20mg/ml的使用2’-O-甲基修饰的Cy-5-标记的寡核苷酸(具有与本发明无关的序列)。在每个时间点(玻璃体内注射后6、24、48、72和168小时)通过静脉内注射戊巴比妥钠并放血处死两只兔子。随后取下眼睛并将其置于改良的戴维森液(Davidson’s fluid)中进行固定。然后制备组织切片并用苏木精和伊红染色，然后在荧光显微镜上检查以特别注意与荧光增加相关的眼内结构，这将反映标记的寡核苷酸的积聚(图4)。Cy-5标记的寡核苷酸在6小时时染色，而单独Cy-5作为对照。Cy-5对照在6小时的时间点没有可见的染色。因此，结论是摄取是通过寡核苷酸，而不是通过Cy-5标记。在48小时的时间点已经观察到最大摄取。
先前已经注意到治疗性寡核苷酸在没有借助通常在体外情形使用的转染试剂的情况下进入眼部细胞结构中。本发明的发明人最近发现，当与潜在的治疗性寡核苷酸全身共同给药时，体内转染赋形剂可以增加潜在治疗性寡核苷酸进入各种组织(数据未显示)。
实施例3.TCF-4靶向的治疗性寡核苷酸减少FECD CEC中的RNA团簇
包含具有7个重复的重复CAG序列((CAG)7)的预测治疗性寡核苷酸还显示减少源自杂合扩增大于40个CUG重复的FECD患者的人角膜内皮细胞中的RNA团簇。在患者的TCF4基因中发现等位基因CUG TNR重复为12和52。使用本领域已知的方法(Peh等人，2013 BMC ResNotes 6：176；Peh等人，2015 Sci Rep 5：9167)从该患者获得角膜内皮细胞，并且在将(CAG)7转染到体外保持的细胞中研究在这些细胞中减少RNA团簇的效果。使用浓度为200nM的治疗性寡核苷酸并用Dharmafect(按照制造商的使用说明书每孔0.5ul)转染24小时。然后，将细胞固定并用Cy3-标记的(CAG)7寡核苷酸探针进行FISH(如实施例1中所述进行)并在共焦显微镜上观察。
图5示出治疗性寡核苷酸(CAG)7在减少角膜内皮细胞中的RNA团簇(粉红色斑点)中的效果。上面三组是处理的细胞，下面三组是用对照寡核苷酸处理的细胞。使用浓度为200nM的治疗性寡核苷酸并用Dharmafect转染。细胞核中的RNA团簇的数目通过自动图像分析测定，并将其作为直方图显示在图5中(图的底部)。具体地，FISH-标记的RNA团簇用基于分割的方法使用CellProfilerTM ver 2.1.1(Broad Institute)进行定量。简而言之，使用最大相关阈值将细胞核限定在405nm通道。使用鲁棒背景(Robust Background)算法，将RNA团簇限定在568nm通道，作为2和10个像素内的对象，每个个体掩蔽对象(细胞核)，线性尺度(smoothing scale)为2.0，阈值校正因子为1.45，并且下限和上限设定为0.05和1.0。数据使用Microsoft Excel进一步处理。
从显微照片和直方图可以观察到，与转染对照(不相关的)寡核苷酸(在直方图中称为‘未处理’)相比，治疗性寡核苷酸(CAG)7有效减少RNA团簇的数量。这表明本发明的方法适用于来自FECD患者的人角膜内皮细胞。
然后在五个独立的具有至少一个含有大于40个TNR重复的TCF4等位基因的FECD患者样品中重复该实验。这些实验的结果显示在图6中；每个直方图代表不同的患者。与图5中所见相似，与对照反义寡核苷酸(ctrl AON)相比，用(CAG)7治疗性寡核苷酸处理的团簇数目减少：没有团簇或具有有限数量团簇的细胞核的百分比增加。在来自第五位患者的细胞中，使用另外的寡核苷酸，其是锁核酸(LNA)构型的AG(CAG)2AON。这种特殊的化学特性和序列似乎不如(CAG)7重复。右图示出来自这五位患者的数据一起采用时每个细胞核的团簇的平均数目，显示出本发明的AON对减少视网膜中团簇的显著效果。

Claims (17)

1.一种用于预防和/或治疗遗传疾病的单链反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与靶RNA分子至少部分互补，并且其中所述寡核苷酸能够结合所述靶RNA分子内的内含子序列中存在的三核苷酸重复(TNR)扩增。
2.根据权利要求1所述用途的寡核苷酸，其中所述TNR扩增包含序列5’-(CUG)n-3’，其中n是40或更大的整数。
3.根据权利要求2所述用途的寡核苷酸，其中n是50或更大的整数。
4.根据权利要求1至3中任一项所述用途的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的全部核苷酸是2’-O甲基硫代磷酸酯核糖核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述用途的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含序列5’-(CAG)m-3’、5’-(CAI)m-3’、5’-(CGG)m-3’、5’-(CGI)m-3’、5’-(CIG)m-3’、5’-(CII)m-3’、5’-(UAG)m-3’、5’-(UAI)m-3’、5’-(UGG)m-3’、5’-(UGI)m-3’、5’-(UIG)m-3’和/或5’-(UII)m-3’，其中m是2至66范围内的整数。
6.根据权利要求5所述用途的寡核苷酸，其中m是整数2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17。
7.根据权利要求1至6中任一项所述用途的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为9或更多个核苷酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述用途的寡核苷酸，其中所述TNR扩增存在于TCF4基因的转录物中。
9.根据权利要求1至8中任一项所述用途的寡核苷酸，其中所述遗传疾病是由RNA毒性引起的眼营养不良。
10.根据权利要求9所述用途的寡核苷酸，其中所述眼营养不良是Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述用途的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自具有SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、101、102和103的反义寡核苷酸(AON)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述用途的寡核苷酸，其中所述用途是在患有所述遗传疾病或处于患有所述遗传疾病风险中的人受试者中。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的寡核苷酸。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求13所述的寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求14所述的组合物，还包含寡核苷酸递送增强剂。
16.一种药物组合物，其包含编码核酸序列的病毒或非病毒基因递送载体，所述核酸序列包含根据权利要求13所述的寡核苷酸或由其组成。
17.一种治疗或预防人受试者中的FECD的方法，所述方法包括将根据权利要求13所述的寡核苷酸或根据权利要求14至16中任一项所述的组合物通过基质内注射施用于所述人受试者的角膜基质、或通过前房内注射施用于所述人受试者的前房液、或通过玻璃体内注射施用于所述人受试者的后房。
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