JP2010500023A

JP2010500023A - Ｄｎａリピートの不安定性に関連した遺伝的障害を治療するための方法及び手段

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Publication number: JP2010500023A
Application number: JP2009523740A
Authority: JP
Inventors: キンペヨセフスヨハネスデ; ヘラルドヨハンヌプラテンバーグ; デリックヘルトワンシンク
Original assignee: Prosensa Technologies BV
Current assignee: Prosensa Technologies BV
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-10
Publication date: 2010-01-07
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Abstract

本発明は、ヒトにおけるシスエレメントリピートの不安定性に関連した遺伝的障害を診断、治療、又は予防する医薬品を製造するための、ヒト遺伝子転写物中の反復配列にのみ相補的であるオリゴヌクレオチド分子を適用する方法及び医薬品を提供する。したがって、本発明は、シスエレメントリピートの不安定性に関連した遺伝的障害を治療する方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法において適用して、細胞中のリピートが伸長した転写物の蓄積及び／又は翻訳を妨げることができる改変オリゴヌクレオチドにも関する。

Description

本発明は、医学分野、特に、コード配列又は非コード配列中の不安定なリピート、最も具体的には、ヒトハンチントン病を引き起こすＨＤ遺伝子又は筋緊張性ジストロフィー１型を引き起こすＤＭＰＫ遺伝子中の不安定なリピートを有する遺伝子に関連した遺伝的障害の治療に関する。

遺伝子特異的なマイクロサテライト反復配列及びミニサテライト反復配列の不安定性は、サテライト中の反復配列長の増大をもたらし、約３５種のヒトの遺伝的障害に関連している。トリヌクレオチドリピートの不安定性は、例えば、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ，spinal and bulbar muscular atrophy）、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１，myotonic dystrophy type 1）、脆弱Ｘ染色体症候群（ＦＲＡＸ，fragile X syndrome）（ＦＲＡＸ遺伝子Ａ、Ｅ、Ｆ）、ハンチントン病（ＨＤ，Huntington's disease）、及びいくつかの脊髄小脳失調症（ＳＣＡ，spinocerebellar ataxias）（ＳＣＡ遺伝子ファミリー）を引き起こす遺伝子において見出される。不安定なリピートは、ハンチントン病遺伝子などの遺伝子のコード領域中に存在し、タンパク質機能及び／又はタンパク質フォールディングの変化によって、障害の表現型がもたらされる。また、不安定なリピート単位は、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の場合の３’ＵＴＲ中や筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２，myotonic dystrophy type 2）の場合などのイントロン配列中など非翻訳領域中にも存在する。正常なリピート数は、ＤＭＰＫの場合、約５〜３７個であるが、前突然変異及び完全な疾患状態では、２〜１０倍以上、５０倍、１００倍、時には１０００倍以上のリピート単位まで増加する。ＤＭ２／ＺＮＦ９の場合、１０，０００個以上のリピートにまで増加することが報告されている(Cleary and Pearson, Cytogenet. Genome Res. 100: 25-55, 2003)。

ハンチントン病（ＨＤ）の原因である遺伝子は、４番染色体上に位置している。ハンチントン病は、常染色体優性形式で遺伝する。遺伝子が、ポリグルタミンストレッチをコードする３５個を上回るＣＡＧトリヌクレオチドリピートを有する場合、リピート数は世代を経るごとに増加し得る。リピートが漸進的に長くなるため、この疾患の重症度は高まる傾向がある。世代を経るごとに、より若年で発現し、このプロセスは表現促進現象と呼ばれる。ＨＤ遺伝子の産物は、３４８ｋＤａの細胞質タンパク質ハンチンチンである。ハンチンチンは、正常な形態では４０個未満のグルタミンアミノ酸残基からなる特徴的な配列を有するが、疾患を引き起こす変異ハンチンチンは、４０個より多い残基を有する。神経細胞中で変異ハンチンチン分子が連続的に発現されると、特に前頭葉及び大脳基底核において（主に尾状核において）、大きなタンパク質沈着物が形成され、これは最終的には細胞死を起こす。疾患の重症度は、一般に、余分な残基の数に比例している。

ＤＭ１は成人において最も一般的な筋ジストロフィーであり、主に骨格筋、心臓、及び脳の遺伝性、進行性、変性、全身多発性の障害である。ＤＭ１は、ヒト１９番染色体長腕上の筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ，myotonic dystrophy protein kinase）遺伝子の３’非翻訳領域中の不安定なトリヌクレオチド（ＣＴＧ）ｎリピートの伸長が原因で生じる(Brook et al, Cell, 1992)。筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）は、ＺＮＦ９遺伝子中のイントロン１におけるＣＣＴＧ伸長が原因で生じる(Liquori et al, Science 2001)。筋緊張性ジストロフィー１型の場合、ＤＭＰＫ転写物の核から細胞質への搬出が、核内フォーカス中で蓄積するヘアピン様の二次構造体を形成する、長くなったリピートによって妨害される。長い（ＣＵＧ）ｎ区域を有するＤＭＰＫ転写物は、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄファミリーのタンパク質に結合し、続いて、核においてリボ核内フォーカス中で凝集するヘアピン様構造体を形成することができる。これらの核封入体は、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質、及び潜在的に他の因子を隔離し、次いで細胞に対して制限的になると考えられている。ＤＭ２の場合、伸長した（ＣＣＵＧ）ｎリピートを有するＺＮＦ９ＲＮＡの蓄積により、同様のフォーカスが形成される。ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質はスプライシング因子であるため、これらが欠乏することにより、他の転写物のスプライシングが大幅に再編成される。その結果として、例えば、胎児エキソンの包含又はエキソンの排除により、多くの遺伝子の転写物が異常にスプライシングされて、非機能的なタンパク質となったり、細胞機能の障害がもたらされたりする。

上記の観察結果及び新しい見識から、筋緊張性ジストロフィー１型、ハンチントン病、及び他の疾患など不安定なリピートによる疾患は、疾患を引き起こす異常転写物を完全に又は少なくとも部分的に除去することによって治療できることが理解された。ＤＭ１の場合、核中に蓄積する異常転写物は、下方調節されるか、又は完全に除去され得る。異常転写物を比較的少量減少させるだけでも、かなりの量及び場合によっては十分な量の隔離されていた細胞因子が放出され、それによってＤＭの正常なＲＮＡプロセシング及び細胞代謝を回復するのに寄与し得る（Kanadia et al., PNAS 2006）。ＨＤの場合、ＨＤ患者の細胞におけるハンチンチンタンパク質沈着物の蓄積を減少させることにより、疾患の症状を改善することができる。

アンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉、又はリボザイムを用いて、不安定なリピートによる疾患である筋緊張性ジストロフィー１型に対する治療方法及び医薬品を設計する試みがいくつかなされている。（ｉ）Langlois et al. (Molecular Therapy, Vol. 7 No. 5, 2003)は、ＤＭＰＫｍＲＮＡを切断することができるリボザイムを設計した。このハンマーヘッド型リボザイムに、ＣＵＧリピートの直前のＤＭＰＫの３’ＵＴＲに相補的な一続きのＲＮＡを提供する。インビボで、ベクターから転写されたリボザイムは、トランスフェクトされた細胞において、伸長したＣＵＧリピートを含むｍＲＮＡ並びに正常なｍＲＮＡ種の両方を切断し、それぞれ６３％及び５０％減少させることができた。したがって、正常な転写物もこのアプローチによって重大な影響を受け、伸長したリピートを有する影響を受けたｍＲＮＡ種は特異的標的ではない。

（ii）別のアプローチは、Langlois et al., (Journal Biological Chemistry, vol 280, no.17, 2005)により、ＲＮＡ干渉を用いて実施された。レンチウイルスに送達されるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ，short-hairpin RNA）がＤＭ１筋芽細胞に導入され、核内に保有される変異ＤＭＰＫｍＲＮＡを下方調節することが実証された。４つのｓｈＲＮＡ分子が試験された。２つはＤＭＰＫのコード領域に対して相補的であり、１つは３’ＵＴＲ中の固有の配列に対して相補的であり、１つは無関係な配列を有する陰性対照であった。最初の２つのｓｈＲＮＡは、リピートが増幅されている変異ＤＭＰＫ転写物を約５０％まで下方調節することができたが、細胞質内の野生型転写物を下方調節するのにさらにより有効で、約３０％以下まで下方調節した。カチオン性脂質によって送達した当量の合成ｓｉＲＮＡは効果が無かった。３’ＵＴＲ配列を対象とするｓｈＲＮＡは、両方の転写物に対して無効であることが判明した。したがって、このアプローチでもまた、伸長したリピートｍＲＮＡ種は選択的標的ではない。

（iii）Furling et al. (Gene Therapy, Vol.10, p795-802, 2003)による第３のアプローチでは、１４９ｂｐ長のアンチセンスＲＮＡを発現する組換えレトロウイルスを用いて、ヒトＤＭ１筋芽細胞中のＤＭＰＫｍＲＮＡレベルを抑制した。レトロウイルスは、３９ｂｐ長の（ＣＵＧ）１３リピート及び特異性を高めるための、前記リピートの後の１１０ｂｐの領域に相補的な１４９ｂｐ長のアンチセンスＲＮＡをＤＭ１細胞に提供するように設計された。この方法により、野生型ＤＭＰＫ転写物での５０％の減少と比べて、８０％の変異した（リピートが伸長した）ＤＭＰＫ転写物が減少し、且つ、感染させたＤＭ１筋芽細胞において分化及び機能の特徴が回復した。したがって、このアプローチでもまた、伸長したリピートｍＲＮＡ種は選択的標的ではなく、非常に長いアンチセンスＲＮＡに依存し、且つ組換えウイルス送達技術と組み合わせてしか使用できない。

Cleary and Pearson, Cytogenet. Genome Res. 100: 25-55, 2003 Brook et al, Cell, 1992 Liquori et al, Science 2001 Kanadia et al., PNAS 2006 Langlois et al. Molecular Therapy, Vol. 7 No. 5, 2003 Langlois et al., Journal Biological Chemistry, vol 280, no.17, 2005 Furling et al. Gene Therapy, Vol.10, p795-802, 2003

前述した方法及び技術は、リピートの不安定性及び／又は伸長に関連している遺伝的疾患に関する、影響を受ける、リピートが伸長した対立遺伝子及び影響を受けない（正常な）対立遺伝子の両方の非選択的な分解を引き起こす、核酸に基づく方法を提供する。さらに、この技術は、疾患に関連する遺伝子に特異的な配列を使用しており、リピート伸長に関連するいくつかの遺伝子障害に適用可能である方法を提供するものではない。結局、この技術は、各オリゴヌクレオチド及び標的細胞に対して適応させる必要があり、且つさらに最適化される必要が依然としてある、組換えＤＮＡベクター送達系を使用する方法を教示するにすぎない。

本発明は、伸長されたリピート領域にのみ相補的である、即ち、リピートを含む遺伝子のエキソン又はイントロン中の固有の配列へのハイブリダイゼーションを利用しない配列を含むか、又はかかる配列からなる短い一本鎖核酸分子を用いることによってこれらの問題の解決法を提供する。さらに、使用される核酸（オリゴヌクレオチド）が、ＲＮアーゼＨを介した分解機序によって転写物を減少させることは不可欠ではない。

様々なオリゴヌクレオチド又はモック対照をトランスフェクトした筋管から単離したＲＮＡのノーザンブロットを示す図である。筋管は、（ＣＴＧ）リピートを伴わない正常マウスＤＭＰＫ遺伝子の隣に長さ約５００個の（ＣＴＧ）ｎリピート伸長部分を有するトランスジェニックヒトＤＭＰＫ遺伝子を含む、不死化（immorto）マウス筋芽細胞株に由来した。ブロットは、ヒトＤＭＰＫｍＲＮＡ（上）、マウスＤＭＰＫ（ｍＤＭＰＫ）ｍＲＮＡ（中央）、及びマウスＧＡＰＤＨｍＲＮＡ（下）を示す。図１のヒト及びマウスのＤＭＰＫシグナルを、ホスホイメージャー解析によって定量し、且つＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した図である。結果は、モック処理を基準として（１００に設定）表している。ｍＤＭＰＫ遺伝子の３’部分が、（ＣＴＧ）_１１０リピートを含むヒトＤＭＰＫ遺伝子の同種セグメントによって置換されているマウス−ヒトキメラＤＭＰＫ遺伝子を含むマウス筋管から単離した全ＲＮＡのノーザンブロットを示す図である。ＤＭＰＫｍＲＮＡ（上のパネル）及びマウスＧＡＰＤＨｍＲＮＡ（下）に関してブロットをプローブした。アンチセンスオリゴヌクレオチドＰＳ５８又は対照で細胞をトランスフェクトした。様々な濃度のオリゴヌクレオチドＰＳ５８で処理したＤＭ５００筋管の応答を示す図である。ノーザンブロット解析とそれに続くホスホイメージャー解析によって、ｈＤＭＰＫの発現を定量した。ＧＡＰＤＨシグナルに対してシグナルを標準化し、且つモック処理後の応答と比較して表した。採取前の様々な時点（２時間前、４時間前、８時間前、及び４８時間前）に２００ｎＭＰＳ５８をトランスフェクトしたＤＭ５００筋管の全ＲＮＡのノーザンブロットを示す図である。採取する４８時間前にモック処理を実施した。ノーザンブロットは、ヒト及びマウスのＤＭＰＫ並びにマウスＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを示す。これらは、ホスホイメージャーによって定量し、且つ標準化したＤＭＰＫシグナルをモック処理と比較して表した。２００ｎＭＰＳ５８又はモック対照によるトランスフェクション後２日目、４日目、６日目、及び８日目に採取したＤＭ５００筋管の全ＲＮＡのノーザンブロットを示す図である。前述のようにノーザンブロット解析及び定量を実施した。オリゴヌクレオチドＰＳ５８（２０及び２００ｎＭ）又はモック対照で処理したＭｙｏＤ形質転換筋芽細胞に由来する全ＲＮＡのノーザンブロットを示す図である。筋芽細胞は、長さ約１５００個のトリプレットリピート伸長部分を有するｈＤＭＰＫ対立遺伝子及び正常な長さである１１リピートを有するｈＤＭＰＫ対立遺伝子を有する先天性の筋緊張性ジストロフィーＩ型患者から得た線維芽細胞に由来した。ノーザンブロットは、ヒトＤＭＰＫ（ｈＤＭＰＫ）プローブ及びＧＡＰＤＨｍＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ヒトＤＭＰＫシグナルをＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化し、且つモック対照と比較して表した。２００ｎＭの、（ＣＵＧ）リピート配列にのみ特異的なオリゴヌクレオチドＰＳ５８、エキソン１中の配列に特異的なオリゴヌクレオチドＰＳ１１３、又はモック対照をトランスフェクトしたＤＭ５００筋管のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、ｈＤＭＰＫｍＲＮＡ並びに天然の（ＣＵＧ）リピートを有する他の３種のマウス遺伝子転写物、即ち（ＣＵＧ）６を有するＰｔｂｐ１ｍＲＮＡ、（ＣＵＧ）６を有するシンデカン３ｍＲＮＡ、及び（ＣＵＧ）９を有するタキシリンβ ｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いて実施した。これらのシグナルの強度をアクチンシグナルに対して標準化し、且つモック対照と比較して表した。２００ｎＭＰＳ５８（Ｂ）又はモック対照（Ａ）をトランスフェクトしたＤＭ５００筋芽細胞のＦＩＳＨ解析を示す図である。処理開始後４８時間目に、細胞を洗浄及び固定し、続いて、蛍光標識したオリゴヌクレオチドＣｙ３−（ＣＡＧ）１０−Ｃｙ３とハイブリダイズさせた。Bio-Rad社製MRC1024共焦点レーザー走査型顕微鏡及びLaserSharp2000取得ソフトウェアを用いて、核中でのｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）_５００ｍＲＮＡ凝集を示すリボ核内フォーカスを可視化した。図９に示した実験から得られる、ＰＳ５８又はモック対照をトランスフェクトしたＤＭ５００筋芽細胞の核中のリボ核内フォーカスの存在に関する相対的な細胞計数値を示す図である。ＰＳ５８又はモック対照で処理したＤＭ５００マウスの筋肉中のｈＤＭＰＫｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。手短に言うと、ＰＳ５８（２ｎｍｏｌ）を１歳のＤＭ５００マウスのＧＰＳ複合体中に注射し、且つこの手順を２４時間後に繰り返した。１５日後、足底筋及び腓腹筋を単離し、全ＲＮＡに対してｈＤＭＰＫ及びマウスアクチンに関するＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｈＤＭＰＫシグナルの強度をアクチンシグナルに対して標準化し、且つモック対照と比較して値を表した。様々なオリゴヌクレオチド（２００ｎＭ）又はモック対照で処理したＤＭ５００筋管のノーザンブロット解析を示す図である。ＰＳ５８、ＰＳ１４６、及びＰＳ１４７は、完全な２’Ｏ−メチルホスホロチエート（phosphorothiate）主鎖を有するが、長さが異なり、それぞれ（ＣＡＧ）７、（ＣＵＧ）１０、及び（ＣＵＧ）５である。ＰＳ１４２は、（ＣＡＧ）７配列を有する完全体のホスホロチエートＤＮＡ主鎖を有する。ｈＤＭＰＫシグナル及びｍＤＭＰＫシグナルをマウスＧＡＰＤＨに対して標準化し、且つモック対照に対するパーセンテージとして表した。定量結果を下のパネルに示す。

特定の理論に拘泥するものではないが、本発明は、未成熟ＲＮＡの転写後プロセシング及び／又はスプライシングの変更によって転写物レベルの減少を引き起こすことができる。選択的スプライシング及び／又は転写後プロセシングを介した転写物レベルの減少により、過度に伸長された、又は不安定な（トリ）ヌクレオチドリピートを欠いているが、機能活性は引き続き備えている転写物が得られると考えられる。変更されたＲＮＡプロセシング及び／又はスプライシングによる異常転写物の減少により、細胞における、リピートが伸長した異常転写物の蓄積及び／又は翻訳が妨げられる場合がある。

特定の理論に拘泥するものではないが、本発明の方法はまた、伸長されたリピートへのハイブリダイゼーションの動態がより好適であるため、伸長されたリピートを有する影響を受けた転写物に対する特異性を提供するとも考えられる。リピートに特異的な相補的核酸オリゴヌクレオチド分子が、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子中の相補的ストレッチにハイブリダイズする可能性は、反復ストレッチの大きさと共に増大する。ＲＮＡ分子、特に反復配列を含むＲＮＡ分子は、通常、内部で対になって、開放したループ及び閉じたヘアピン部分を含む二次構造体を形成する。開放した部分のみが、相補的な核酸に相対的に接近し易い。疾患に関連していない野生型転写物の短いリピートストレッチは、わずか５個から約２０〜４０個のリピートであることが多く、その二次構造のために相対的に、相補的な核酸と接近しにくく、塩基対を形成しにくい。一方、伸長されたリピート及び疾患に関連した対立遺伝子のリピート単位は、通常、少なくとも２倍伸長しているが、普通はさらに多く、いくつかの不安定なリピートの障害の場合、３、５、１０倍、１００倍まで、さらには１０００倍を上回る伸長がある。この伸長により、リピートの一部分が、少なくとも一時的に、開放したループ構造中にあり、それによって、野生型対立遺伝子と比べてより接近し易くて、相補的な核酸分子と塩基対を形成する可能性が高くなる。したがって、オリゴヌクレオチドは野生型転写物とリピートの伸長した転写物の両方に存在するリピート配列に相補的であり、且つ理論的には両方の転写物にハイブリダイズし得るということにもかかわらず、本発明は、反復区域に相補的なオリゴヌクレオチドが、疾患に関連した又は疾患を引き起こす転写物に好んでハイブリダイズし、且つ正常な転写物の機能については比較的影響を受けないままにすることを教示する。この選択性は、異常転写物の減少機序に関係無く、リピートの不安定性に関連した疾患を治療するために有益である。

したがって、本発明は、反復配列にのみ相補的であり、且つ／又はそれらにのみハイブリダイズすることができる核酸分子を提供することによって、不安定なシスエレメントＤＮＡリピートに関連した遺伝的障害を治療するための方法を提供する。それによって、この方法は、伸長したリピート転写物を優先的に標的とし、且つ正常な野生型対立遺伝子の転写物については比較的影響を受けないままにする。正常な対立遺伝子が、特定の遺伝子について少なくとも望ましい正常な機能を提供でき、且つ前記機能は不安定なＤＮＡリピートを有する特定の遺伝子によっては、治療される細胞及び／又は個体にとって不可欠な場合が多いため、これは有利である。

さらに、このアプローチは、特定の不安定なＤＮＡリピートに関連した遺伝子障害に限定されず、任意の公知の不安定なＤＮＡリピートによる疾患に適用することができる。かかる公知の不安定なＤＮＡリピートによる疾患とは、ポリグルタミン（ＣＡＧ）リピートを有するコード領域のリピートによる疾患：ハンチントン病、ホーリバー（Haw River）症候群、ケネディ病／球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、又はポリアラニン（ＧＣＧ）リピートを有する疾患、例えば、点頭てんかん症候群、鎖骨頭蓋（deidocranial）異形成症、瞼裂縮小／眼瞼下垂／逆内眼角ぜい皮症候群、手足生殖器症候群、合多指症、眼咽頭型筋ジストロフィー、全前脳症等であるが、これらに限定されない。本発明に従って治療される、遺伝子の非コード領域中にリピートを有する疾患には、トリヌクレオチドリピートの障害（主にＣＴＧリピート及び／又はＣＡＧリピート及び／又はＣＣＴＧリピート）、即ち、筋緊張性ジストロフィー１型、筋緊張性ジストロフィータイプ２型、フリードライヒ失調症（主にＧＡＡ）、脊髄小脳失調症、自閉症が含まれる。さらに、本発明の方法は、様々な脆弱Ｘ染色体症候群を含む脆弱部位に関連したリピートの障害、ヤコブセン症候群、並びにミオクローヌスてんかん、顔面肩甲上腕ジストロフィー、及び２型真性糖尿病のいくつかの形態など他の不安定な反復エレメントの障害に適用することもできる。

本発明の別の利点は、リピート領域に特異的なオリゴヌクレオチドを細胞に直接投与することができ、ベクターに基づく送達系を利用しないということである。先行技術において説明されている技術、例えば、ＤＭ１の治療及びＤＭＰＫ転写物の細胞からの除去に関して前述したものは、十分なレベルのオリゴヌクレオチドを細胞に投与するために、ベクターに基づいた送達系の使用を必要とする。プラスミドベクター又はウイルスベクターの使用は、治療用の組換えＤＮＡベクターに対する現行の厳しい安全規制、幅広い臨床適用のために十分な組換えベクターの作製、並びに適用後の過度の（又は非特異的な）応答の制御及び可逆性の制限が原因となって、治療目的での妥当性はさらに低下する。それでもなお将来、これらの分野においても最適化が見込まれ、プラスミドのウイルス送達は、有利な長期にわたる効果をもたらし得る。本発明は、驚くべきことに、伸長されたリピート転写物の反復配列に相補的な配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドが、かかるオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションする分子標的が伸長しているため、転写物中の固有の配列に特異的なオリゴヌクレオチドと比較して、その標的に対してはるかに大きな親和性及び／又は結合活性を有することを発見した。リピートが伸長した標的転写物に対するこの高い親和性及び結合活性のため、より少量のオリゴヌクレオチドでも、ＲＮアーゼＨ分解、ＲＮＡ干渉分解、又は変更された転写後プロセシング（それだけには限らないが、スプライシング若しくはエキソンスキッピングを含む）の活動によって、リピートが伸長した対立遺伝子の十分な阻害及び／又は減少をもたらすのに十分である。反復配列にのみ相補的である本発明のオリゴヌクレオチドは、合成によって作製することができ、且つ、細胞及び／又は組織にオリゴヌクレオチドを直接送達するために一般に適用される技術を用いて細胞に直接送達した場合に有効となるのに十分に強力である。必要に応じ、本発明の方法及びオリゴヌクレオチド分子を用いることによって、組換えベクター送達系を回避することができる。

第１の態様において、本発明は、ヒトにおけるシスエレメントリピートの不安定性に関連した遺伝的障害を診断、治療、又は予防する医薬品を製造するための、ヒト遺伝子転写物中の反復配列にのみ相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用を開示及び教示する。したがって、本発明は、シスエレメントリピートの不安定性に関連した遺伝的障害を治療する方法を提供する。

第２の態様において、本発明はまた、本発明の第１の態様において使用する、且つ／又は本発明の方法において適用する、細胞中のリピートが伸長した転写物の蓄積及び／又は翻訳を妨げることができるオリゴヌクレオチドにも関する。

本発明のオリゴヌクレオチドは、下記に定義するような反復配列にのみ相補的である配列を含んでよい。好ましくは、反復配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％以上である。最も好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、下記に定義するような反復配列にのみ相補的である配列からなる。例えば、オリゴヌクレオチドは、下記に定義するような反復配列及び標的リガンドと以後呼ぶ標的部分にのみ相補的である配列を含んでよい。

リピート又は反復エレメント若しくは反復配列若しくは反復ストレッチとは、本明細書において、ヒト対象を含む対象のゲノム中の転写された遺伝子配列における、トリヌクレオチド反復単位、或いは４、５、又は６ヌクレオチドの反復単位を含む、反復単位又は反復ヌクレオチド単位若しくはリピートヌクレオチド単位の少なくとも３、４、５、１０、１００、１０００回以上の反復と定義される。

オリゴヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよい。二本鎖とは、ｓｉＲＮＡ中のもの等の、オリゴヌクレオチドが、２つの相補鎖でできているヘテロ二量体であることを意味する。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。一本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドと比べて、次のいくつかの利点を有する：（ｉ）その合成が、２つの相補的なｓｉＲＮＡ鎖よりも容易であると予想されること；（ii）細胞でのより効果的な取込み、より優れた（生理学的）安定性をもたらすように最適化し、且つ潜在的な一般的有害作用を低減するために、より多岐に及ぶ化学的改変が可能であること；並びに（iii）ｓｉＲＮＡは、非特異的な作用及び過度の薬効を示す潜在的可能性がより高いこと（例えば、治療スケジュール又は用量によって有効性及び選択性を制御できる程度が低い）及び（iv）ｓｉＲＮＡは、核中で作用する可能性がより低く、且つイントロンを対象とすることができない。したがって、第１の態様の好ましい実施形態では、本発明は、ヒトにおけるシスエレメントリピートの不安定性に関連した遺伝的障害を診断、治療、又は予防する医薬品を製造するための、ヒト遺伝子転写物中の反復配列にのみ相補的である配列を含むか、又はそれからなる一本鎖オリゴヌクレオチドの使用に関する。

これらのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、反復エレメントに相補的な少なくとも１０個〜約５０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは１２〜４５個のヌクレオチド、さらにより好ましくは１２〜３０個、及び最も好ましくは、トリヌクレオチドリピート単位又はテトラヌクレオチドリピート単位を好ましくは有する反復ストレッチに相補的な１２〜２５個のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、転写物のコード領域中の反復ストレッチ、好ましくはポリグルタミン（ＣＡＧ）又はポリアラニン（ＧＣＧ）コード区域に相補的であるか、且つ／又はそれにハイブリダイズすることができてよい。また、オリゴヌクレオチドは、非コード領域、例えば、５’若しくは３’非翻訳領域、又はＲＮＡ分子前駆体中に存在するイントロン配列に相補的であるか、且つ／又はそれにハイブリダイズすることができてもよい。

好ましい実施形態では、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、（ＣＡＧ）ｎ、（ＧＣＧ）ｎ、（ＣＵＧ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ（ＧＡＡ）ｎ、（ＧＣＣ）ｎ、及び（ＣＣＵＧ）ｎからなる群から選択される反復ヌクレオチド単位を反復ヌクレオチド単位として有する反復エレメントに相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなり、且つ、前記オリゴヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチドである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは二本鎖である。

転写物中のポリグルタミン（ＣＡＧ）ｎ区域に相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用は、ＨＤ、ＨＤＬ２／ＪＰＨ３、ＳＢＭＡ／ＡＲ、ＳＣＡ１／ＡＴＸ１、ＳＣＡ２／ＡＴＸ２、ＳＣＡ３／ＡＴＸ３、ＳＣＡ６／ＣＡＣＮＡＩＡ、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、ＡＲ、又はＤＲＰＬＡヒト遺伝子におけるリピート伸長が原因で生じるヒト障害、即ち、ハンチントン病、いくつかの形態の脊髄小脳失調症若しくはホーリバー症候群、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症、及び／又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症の診断、治療、及び／又は予防のために特に有用である。

転写物中のポリアラニン（ＧＣＧ）ｎ区域に相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用は、ＡＲＸ、ＣＢＦＡ１、ＦＯＸＬ２、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＤ１３、ＯＰＤＭ／ＰＡＢＰ２、ＴＣＦＢＲ１、又はＺＩＣ２ヒト遺伝子におけるリピート伸長が原因で生じるヒト障害、即ち、点頭てんかん症候群、鎖骨頭蓋（ｄｅｉｄｏｃｒａｎｉａｌ）異形成症、瞼裂縮小、手足生殖疾患、合多指症、眼咽頭型筋ジストロフィー、及び／又は全前脳症の診断、治療、及び／又は予防のために特に有用である。

転写物中の（ＣＵＧ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用は、それぞれＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８、又はＪＰＨ３遺伝子におけるリピート伸長が原因で生じるヒト遺伝子障害、即ち、筋緊張性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型、及び／又はハンチントン病様２型の診断、治療、及び／又は予防のために特に有用である。好ましくは、これらの遺伝子は、ヒトに由来する。

転写物中の（ＣＣＵＧ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用は、ＤＭ２／ＺＮＦ９遺伝子におけるリピート伸長が原因で生じるヒト遺伝子障害である筋緊張性ジストロフィー２型の診断、治療、及び／又は予防のために特に有用である。

転写物中の（ＣＧＧ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用は、ＦＲＡＸＡ／ＦＭＲ１、ＦＲＡＸＥ／ＦＭＲ２、及びＦＲＡＸＦ／ＦＡＭ１１Ａ遺伝子におけるリピート伸長が原因で生じるヒト脆弱Ｘ染色体症候群の診断、治療、及び／又は予防のために特に有用である。

転写物中の（ＣＣＧ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用は、ＦＲＡ１１Ｂ／ＣＢＬ２遺伝子におけるリピート伸長が原因で生じるヒト遺伝子障害であるヤコブセン症候群の診断、治療、及び／又は予防のために特に有用である。

転写物中の（ＧＡＡ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用は、ヒト遺伝子障害であるフリードライヒ失調症の診断、治療、及び／又は予防のために特に有用である。

イントロン中の（ＡＴＴＣＴ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドの使用は、ヒト遺伝子障害である脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０，Spinocerebellar ataxia type 10）の診断、治療、及び／又は予防のために特に有用である。

本発明の方法において使用される、リピートに相補的なオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ，Locked nucleic acid）、ペプチド核酸（ＰＮＡ，peptide nucleic acid）、モルホリノホスホロジアミデート（ＰＭＯ，morpholino phosphorodiamidate）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ，ethylene bridged nucleic acid）、又は天然に存在するＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチド並びに合成の改変ヌクレオチドの組合せを含むそれらの混合物／ハイブリッドを含むか、又はそれらからなってよい。このようなオリゴヌクレオチドにおいて、リン酸ジエステル主鎖の化学構造は、ホスホロチオエートやメチルホスホネートなど他の改変物によってさらに置換されてもよい。他のオリゴヌクレオチド改変が存在し、且つ新たなものが開発され、実際に使用される可能性がある。しかし、このようなオリゴヌクレオチドはすべて、ＲＮＡへの配列特異的結合能力を有するオリゴマーの特徴を有する。したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートを含む主鎖を有するか、若しくは有さないＲＮＡヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、モルホリノホスホロジアミデート、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、又はそれらの混合物を含むか、又はそれらからなる。

天然に存在するＤＮＡヌクレオチドを少なくとも部分的に含むオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ活性（ＥＣ．３．１．２６．４）によって、細胞中のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子の分解を誘導するために有用である。

天然に存在するＲＮＡリボヌクレオチド又はＲＮＡ様合成リボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを本発明の方法において適用して、センス−アンチセンス鎖の対形成を介した標的ＲＮＡ認識とそれに続くＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（RISC，RNA-induced silencing complex）による標的ＲＮＡ分解を伴う、ＲＮＡ干渉又はサイレンシング（ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ）経路（RNA interference or silencing pathway）を介して酵素依存性のアンチセンスとして作用する二本鎖ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させることができる。

或いは、又はさらに、立体的に妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮアーゼ−Ｈ非依存性アンチセンス）は、ＲＮＡ転写物の標的配列に結合し、且つ翻訳などのプロセスを妨害するか、又はスプライス供与部位若しくはスプライス受容部位を妨害することによって、遺伝子発現又はＲＮＡ前駆体若しくはメッセンジャーＲＮＡ依存性の他の細胞プロセス、特に、それだけには限らないがＲＮＡスプライシング及びエキソンスキッピングを妨げる。改変アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてスプライシング及びエキソンスキッピングを変更する技術については、十分に立証された文献があり、当業者には公知であり、例えば、米国特許第６，２１０，８９２号明細書、国際公開第９４２６８８７号パンフレット、国際公開第０４／０８３４４６号パンフレット、及び国際公開第０２／２４９０６号パンフレットにおいて見出すことができる。さらに、立体妨害は、タンパク質及び核因子などの結合を阻害し、それによって、ＤＭ１に類似した疾患における核蓄積又はリボ核内フォーカスの減少に寄与し得る。

合成ヌクレオチド又は改変ヌクレオチドを含んでよく、（伸長した）反復配列に相補的な本発明のオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡ干渉又はサイレンシング経路を介して、リピートを含む転写物を減少させるか又は不活性化させるための本発明の方法に有用である。

本発明の方法において使用される一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、アルキル置換及びメトキシエチル置換を含む２’−Ｏ置換リボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びモルホリノ（ＰＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びエチレン架橋ヌクレオチド（ＥＮＡ）、並びにそれらの組合せ、場合によってはＲＮＡｓｅＨ依存性アンチセンスとのキメラを含むか、又はそれらからなっていてもよい。オリゴヌクレオチド中にロックド核酸を組み込むと、塩基対形成後のらせん立体構造が変化し、二重鎖の安定性が高まる。したがって、オリゴヌクレオチド配列中へのＬＮＡ塩基の組込みを用いて、本発明の相補的オリゴヌクレオチドがインビトロ及びインビボで活性となって、ＲＮＡ分解を増大させて転写物の蓄積を阻害するか、又はエキソンスキッピング能力を増大させる能力を増大させることができる。主鎖が糖ではなく擬似ペプチドであるペプチド核酸（ＰＮＡ）、即ち人工ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体は、結合の増加及びより高い融解温度により、相補的ＤＮＡオリゴマーとの極めて安定な複合体を形成する能力を有する。ＰＮＡはまた、本発明のアンチセンス及びエキソンスキッピング用途において優れた反応物である。最も好ましくは、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも部分的に又は完全に、２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチドを含む。１０〜５０、より好ましくは１２〜３５、最も好ましくは１２〜２５ヌクレオチド長の（ＣＡＧ）ｎ、（ＧＣＧ）ｎ、（ＣＵＧ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＣＣＧ）ｎ、（ＧＡＡ）ｎ、（ＧＣＣ）ｎ、及び（ＣＣＵＧ）ｎからなる群から選択される反復配列に相補的であり、且つ２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、又はＰＭＯヌクレオチドを含む配列を含むか、又はそれからなるオリゴヌクレオチドは、シスエレメントリピートの不安定性による遺伝子障害を診断、治療、又は予防するために本発明において使用するために最も好ましい。

したがって、好ましい実施形態では、本発明の、且つ本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、（ＣＡＧ）ｎ、（ＧＣＧ）ｎ、（ＣＵＧ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＧＡＡ）ｎ、（ＧＣＣ）ｎ、及び（ＣＣＵＧ）ｎからなる群から選択される反復配列に相補的な、１０〜５０ヌクレオチド長の配列を含むか、又はかかる配列からなり、さらに以下の特徴を有する：
ａ）２’−Ｏ−メチルＲＮＡホスホロチオート（phosphorothiote）ヌクレオチドや２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡホスホロチオートヌクレオチドなどの２’−Ｏ−置換ＲＮＡホスホロチオエートヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、又はＰＭＯヌクレオチドを含む。これらのヌクレオチドは、任意の組合せで、且つ／又はＤＮＡホスホロチオエート若しくはＲＮＡヌクレオチドと共に使用されてよい；及び／或いは
ｂ）一本鎖オリゴヌクレオチドである。

したがって、別の好ましい実施形態では、本発明の、且つ本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、（ＣＡＧ）ｎ、（ＧＣＧ）ｎ、（ＣＵＧ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＧＡＡ）ｎ、（ＧＣＣ）ｎ、及び（ＣＣＵＧ）ｎからなる群から選択される反復配列に相補的であり、１０〜５０ヌクレオチド長の配列を含むか、又はかかる配列からなり、さらに以下の特徴を有する：
ｃ）２’−Ｏ−メチルＲＮＡホスホロチオートヌクレオチドや２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡホスホロチオートヌクレオチドなどの２’−Ｏ−置換ＲＮＡホスホロチオエートヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、又はＰＭＯヌクレオチドを含む。これらのヌクレオチドは、組み合わせて、且つ／又はＤＮＡホスホロチオエート若しくはＲＮＡヌクレオチドと共に使用されてよい；及び／又は
ｄ）二本鎖オリゴヌクレオチドである。

場合によって、本発明は、２つの相補鎖を有するヒト遺伝子転写物中の反復配列にのみ相補的な二本鎖オリゴヌクレオチド、アンチセンス鎖に関し、この二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、Wanzhao Liu et al (Wanzhao Liu et al, (2003), Proc. Japan Acad, 79: 293-298)において示されているような、ＧＦＰに融合させたヒトハンチントン遺伝子エキソン１を用いたトランスフェクションを実施して、又は実施せずに培養されたサル線維芽細胞株（ＣＯＳ−７）又はヒト神経芽細胞腫（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）細胞株に適用されたアンチセンスＲＮＡ鎖（ＣＵＧ）_７及びセンスＲＮＡ鎖（ＧＣＡ）_７を有するｓｉＲＮＡではない。より好ましくは、本発明は、（アンチセンス鎖（ＣＵＧ）_７及びセンス鎖（ＧＣＡ）_７を有する）二本鎖オリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡに関するものではなく、ハンチントン病の治療又は予防、さらにより好ましくは、ハンチントン病遺伝子エキソン１を含む構造の治療又は予防用の医薬品の製造のためのその使用にも関するものではない。

単一のオリゴヌクレオチドの使用は、核に蓄積したＤＭＰＫ転写物若しくはＺＮＦ９転写物又はそれらのセグメントなどリピートの伸長した転写物の量を減少させるのに、或いは、リピートの伸長したＨＤタンパク質の蓄積を十分に減少させるのに十分であり得るが、２、３、４、５個以上のオリゴヌクレオチドを組み合わせることもまた、本発明の範囲内である。転写物の反復部分に相補的な配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドは、有利には、リピートを含む転写物中の固有の配列に相補的であるか、且つ／又はそれらとハイブリダイズできることができる配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチドと組み合わせてもよい。本発明の方法及びリピートに特異的なオリゴヌクレオチドを含む本発明の医薬品はまた、シスエレメントリピートの不安定性による遺伝的障害に対する他の任意の治療薬又は医薬品と組み合わせてもよい。診断目的のために、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドを放射性標識又は蛍光標識して、試料中、細胞中、インサイチュー、インビボ、エクスビボ、又はインビトロでの転写物の検出を可能にすることができる。筋緊張性ジストロフィーの場合、診断目的で、ＤＭＰＫ又はＺＮＦ９のＲＮＡ転写物分子と関連タンパク質との核凝集体を可視化するために標識オリゴヌクレオチドを使用することができる。蛍光標識には、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、ローダミン（Rhodamine）、及びＧＦＰなどが含まれ得る。放射性標識には、^３Ｈ、^３５Ｓ、^{３２／３３}Ｐ、^１２５Ｉが含まれ得る。酵素及び／又はジゴキシゲニンなどの免疫原性ハプテン、ビオチン、並びに他の分子タグ（ＨＡ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＶＳＶ、ｌｅｘＡ）もまた、使用され得る。したがって、別の態様では、本発明は、上記に定義したオリゴヌクレオチドを使用する、ビトロ又はエクスビボの検出及び／又は診断方法を開示する。

本発明に従って使用するためのオリゴヌクレオチドは、シスエレメントリピートの不安定性の障害に冒されているか、又はそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織、及び／又は器官にインビボで直接投与するのに適しており、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで直接投与してもよい。或いは、これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの持続的な供給を可能にするために、ヒト細胞においてオリゴヌクレオチドの発現をもたらすことができる核酸ベクターによって提供してもよい。本発明によるオリゴヌクレオチド分子は、治療しようとする細胞、組織、器官、及び／又は対象に対し、ヒト細胞においてオリゴヌクレオチドの発現をもたらすことができる発現ベクターの形態で提供してよい。ベクターは、好ましくは、遺伝子送達運搬体によって細胞中に導入される。送達のために好ましい運搬体は、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，adeno-associated virus vector）、アデノウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター（ＳＦＶ，Semliki Forest virus vector）、及びＥＢＶベクターなどのウイルスベクターである。また、プラスミド、人工染色体、細胞のヒトゲノムにおける標的相同組換え及び組込みに適したプラスミドも、オリゴヌクレオチドの送達のために適切に適用することができる。転写がpolIIIプロモーターから推進（driven from）され、且つ／又は転写物がＵ１転写物若しくはＵ７転写物との融合物の形態であり、小型転写物を送達するのに優れた結果をもたらすようなベクターが、本発明のために好ましい。

好ましい実施形態では、約０．１ｎＭ〜約１μＭの範囲であるオリゴヌクレオチド濃度が使用される。より好ましくは、使用される濃度は、約０．３〜約４００ｎＭ、さらにより好ましくは、約１〜約２００ｎＭの範囲である。いくつかのオリゴヌクレオチドが使用される場合、この濃度は、オリゴヌクレオチドの合計濃度又は添加される各オリゴヌクレオチドの濃度を意味してよい。前述のオリゴヌクレオチド濃度の範囲は、インビトロ又はエクスビボでの使用に好ましい濃度である。当業者なら、使用されるオリゴヌクレオチド、治療しようとする標的細胞、遺伝子標的、及びその発現レベルに応じて、使用される媒体、並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件、使用されるオリゴヌクレオチド濃度はさらに変動してよく、且つ、さらに最適化される必要がある場合があることを理解するであろう。

より好ましくは、シスエレメントリピートの不安定性の障害を予防、治療、又は診断するために本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、合成によって作製され、且つ、薬学的に許容される組成物に調剤された形態で、細胞、組織、器官、及び／又は患者に直接投与される。対象への薬剤組成物の送達は、好ましくは、１回又は複数回の非経口注射、例えば、静脈内及び／又は皮下及び／又は筋肉内及び／又はくも膜下腔内及び／又は脳室内への投与、好ましくは、ヒト身体中の１つ又は複数の部位への注射によって実施される。くも膜下腔内又は脳室内への投与（脳脊髄液中）は、好ましくは、対象の身体中に拡散ポンプを導入することによって実現される。いくつかの拡散ポンプが当業者には公知である。

反復配列に相補的な配列を含むか、又はかかる配列からなるオリゴヌクレオチド分子を標的とするために使用される薬剤組成物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. において確認することができる、希釈剤、増量剤、保存剤、及び可溶化剤など様々な賦形剤を含んでよい。

細胞へ、及び細胞中へのオリゴヌクレオチドの送達を補助する賦形剤、特に、小胞又はリポソーム中に複合されるか又は閉じ込められた物質及び／又はオリゴヌクレオチドを、細胞膜を通過して送達する複合体、小胞、及び／又はリポソームを形成することができる賦形剤の使用が、本発明の方法のために特に好ましい。これらの物質のうち多くは、当技術分野において公知である。適切な物質には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，polyethylenimine）、ExGen 500、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ、及び／又は、自己集合して、細胞にオリゴヌクレオチドを送達できる粒子になることができるウイルスカプシドタンパク質が含まれる。リポフェクチンは、リポソームのトランスフェクション剤の例である。これは、２つの脂質成分、即ちカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ，N-[1-(2,3 dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride）（硫酸メチル塩であるＤＯＴＡＰと比較されたい）及び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ，dioleoylphosphatidylethanolamine）からなる。中性成分は、細胞内放出を媒介する。別のグループの送達系は、ポリマーナノ粒子である。ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知であるジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ，diethylaminoethylaminoethyl）−デキストランのようなポリカチオンを、ブチルシアノアクリラート（ＰＢＣＡ，butylcyanoacrylate）及びヘキシルシアノアクリラート（ＰＨＣＡ，hexylcyanoacrylate）と組み合わせて、細胞膜を通過して細胞中にオリゴヌクレオチドを送達することができるカチオン性ナノ粒子を調製することができる。これらの一般的なナノ粒子材料の他に、カチオン性ペプチドプロタミンは、コロイドとしてオリゴヌクレオチドを調製する代替アプローチを提供する。このコロイド性ナノ粒子系は、いわゆるプロティクル（proticle）を形成することができ、これは、パッケージングする単純な自己集合プロセスによって調製され得、且つオリゴヌクレオチドの細胞内放出を媒介し得る。当業者は、上記のいずれか、又は市販されている他の代替賦形剤及び送達系を選択し、且つ適合させて、本発明において使用するためのオリゴヌクレオチドをパッケージングし、且つ送達して、ヒトのシスエレメントリピートの不安定性の障害を治療するためにオリゴヌクレオチドを送達することができる。

さらに、オリゴヌクレオチドは、細胞、細胞質及び／又はその核中への取込みを促進するように特異的に設計された標的リガンドに共有結合的に又は非共有結合的に連結させてもよい。このようなリガンドには、（ｉ）細胞取込みを促進する、細胞、組織、若しくは器官特異的エレメントを認識する化合物（それだけには限らないが、ペプチド（様）構造体を含む）、並びに／又は（ii）細胞中への取込み、及び／又は小胞、例えば、エンドソーム若しくはリソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学化合物が含まれ得る。また、このような標的リガンドは、血液脳関門を通過して脳中にオリゴヌクレオチドを取込むのを促進する分子を包含する。したがって、好ましい実施形態では、医薬品中のオリゴヌクレオチドは、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達及び／若しくは送達器具のため、且つ／又はその細胞内送達を促進するための、少なくとも１つの賦形剤及び／又は標的リガンドと共に提供される。したがって、本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドを含み、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達及び／若しくは送達器具のため、且つ／又はその細胞内送達を促進するための、少なくとも１つの賦形剤及び／又は標的リガンドをさらに含む、薬学的に許容される組成物も包含する。

本発明はまた、細胞中のリピートを含む遺伝子転写物を減少させるための方法であって、２’−Ｏ−メチルＲＮＡホスホロチオエートヌクレオチドや２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡホスホロチオエートヌクレオチドなどの２’−Ｏ−置換ＲＮＡホスホロチオエートヌクレオチド、又はＬＮＡヌクレオチド若しくはＰＭＯヌクレオチドを好ましくは含み、且つ、反復配列にのみ相補的である１０〜５０ヌクレオチドの長さを有する一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチド分子の投与を含む方法にも関する。これらのヌクレオチドは、組み合わせて、且つ／又はＤＮＡホスホロチオエートヌクレオチドと共に使用されてよい。

本文書及びその特許請求の範囲において、「含むこと（to comprise）」という動詞及びその活用型は、非限定的な意味で使用され、その言葉に続く品目が含まれることを意味するが、組合せ及び／又は具体的に言及されない品目は除外されない。さらに、本明細書において、ある要素への言及は、文脈において明らかに１つ及び唯一の要素であることが必要とされない限りは、複数の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、単数での記載は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
［実施例］

当業者に公知の標準的技術を用いて、ＤＭ５００マウス又はＣＴＧ１１０マウスから不死化筋芽細胞株を得た。ＤＭ５００マウスは、パリのde Gourdonグループから得たマウスに由来した。ＣＴＧ１１０マウスは後述し、ナイメーヘンのWieringa及びWansinkのグループに存在する。ＤＭＰＫ遺伝子中に様々な長さの（ＣＴＧ）ｎリピートを有する不死化筋芽細胞株ＤＭ５００又はＣＴＧ１１０をサブコンフルエントになるまで増殖させ、且つ３３℃、５％ＣＯ_２雰囲気中、０．１％ゼラチンでコーティングされたシャーレ上で維持した。２０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、及びγ−インターフェロン２０ユニット／ｍｌを添加したＤＭＥＭ中で、サブコンフルエントになるまで筋芽細胞を増殖させた。Matrigel（BD Biosciences社製）でコーティングしたシャーレ上で筋芽細胞を増殖させ、且つ３７℃、５％ウマ血清及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ中にコンフルエントな筋芽細胞培養物を入れることによって、筋管形成を誘導した。この低血清培地で５日間経過した後、収縮した筋管が培養中に生じ、これらに所望のオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションのために、ＮａＣｌ（５００ｍＭ、フィルター滅菌済み）、オリゴヌクレオチド、及びトランスフェクション試薬PEI（ExGen 500、Fermentas社製）をこの特定の順番で添加し、且つ直接混合した。オリゴヌクレオチドトランスフェクション溶液は、取扱い説明書（ExGen 500、Fermentas社製）に従って、オリゴヌクレオチド１μｇ当たり５μｌの比率のExGen500を含めた。室温で１５分間インキュベーションした後、オリゴヌクレオチドトランスフェクション溶液を、培養した筋管を含む低血清培地に添加し、且つ穏やかに混合した。オリゴヌクレオチドの最終濃度は２００ｎＭであった。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクション溶液を用いて、モック対照処理を実施する。３７℃で４時間インキュベーションした後、新鮮な培地を培養物に添加し（約２．３倍の希釈をもたらす）、且つ３７℃で一晩、インキュベーションを延長した。翌日、オリゴヌクレオチドを含む培地を除去し、新鮮な低血清培地を筋管に添加し、３７℃でさらに１日、培養状態で維持した。筋管にオリゴヌクレオチドを添加してから４８時間後（低血清条件に切り換えて筋管形成を誘導してから７日後である）に、「Total RNAミニキット（Bio-Rad社製）」を用いてＲＮＡを単離し、且つノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ解析のために調製した。ノーザンブロットは、放射性ヒトＤＭＰＫ（ｈＤＭＰＫ）プローブ及びマウスＧＡＰＤＨプローブとハイブリダイズさせた。ＤＭＰＫのために使用されるプローブは、３’ＵＴＲ全体及び１１個のＣＴＧを有するＤＭＰＫオープンリーディングフレームからなるヒトＤＭＰＫｃＤＮＡである。

ヒト及びマウスのＤＭＰＫシグナルは、ホスホイメージャー解析によって定量し、且つＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した。ｈＤＭＰＫｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲのために使用したプライマーは、３’非翻訳部分に位置し、配列は5'-GGGGGATCACAGACCATT-3'及び5'-TCAATGCATCCAAAACGTGGA-3'であり、マウスアクチンに対しては、プライマーは以下のとおりであった：アクチンセンス5'-GCTAYGAGCTGCCTGACGG-3'及びアクチンアンチセンス5'-GAGGCCAGGATGGAGCC-3'。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で泳動させ、且つLabworks 4.0（UVP社製BioImaging systems、ケンブリッジ、イギリス）を用いてシグナルを定量した。各バンドの強度を対応するアクチンバンドの強度に対して標準化し、且つモック対照と比較して表した。

（ＣＴＧ）ｎリピートの長さが約５００であるトランスジェニックヒトＤＭＰＫ遺伝子及び（ＣＴＧ）リピートを伴わない正常なマウスＤＭＰＫ遺伝子を含む不死化筋芽細胞株ＤＭ５００において、１３種の異なるオリゴヌクレオチドを前述したようにして試験した（概要については表１を参照されたい）。図１は、ｈＤＭＰＫプローブ及び添加量対照のためのＧＡＰＤＨプローブを用いて可視化した、オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした筋管から単離されたＲＮＡのノーザンブロットを示す。ノーザンブロットにおける（ＣＴＧリピートを有する）ヒトＤＭＰＫ及び（ＣＴＧリピートを伴わない）マウスＤＭＰＫのシグナルの定量を図２に示す。シグナルは、マウスＧＡＰＤＨに対して標準化し、且つモック対照と比較して表した。

表２は、特定のオリゴヌクレオチドによって引き起こされるｈＤＭＰＫｍＲＮＡの減少レベルを示す。マイナス（−）は、減少が無かったことを表し、プラス記号（＋）の数は、ｈＤＭＰＫｍＲＮＡ破壊の相対的レベルを表す。明らかに、リピート配列を特異的に標的とするオリゴヌクレオチドＰＳ５８は、ｈＤＭＰＫ転写物中の固有の配列に相補的な他のオリゴヌクレオチドよりも、ｈＤＭＰＫ転写物を減少又は変更するにあたって、はるかに強力である。

図３は、ＣＴＧ１１０マウス、即ち、約１１０個の（ＣＴＧ）リピートを含むヒトＤＭＰＫ遺伝子の３’部分を有するＤＭＰＫ遺伝子を含むノックインマウスに由来するマウス不死化筋管におけるＰＳ５８の効果を示す。ノーザンブロット解析により、（ＣＴＧ）１１０リピートを含むＤＭＰＫ転写物は、オリゴヌクレオチドＰＳ５８による処理によって減少するが、モック処理後には減少しないことが示された。

（図４）
前述したように（実施例１を参照されたい）、約５００個の（ＣＴＧ）リピート伸長を含むヒトＤＭＰＫ遺伝子を有するＤＭ５００不死化筋芽細胞株を培養し、調製し、且つトランスフェクトした。本実施例では、様々な濃度のＰＳ５８を用いてトランスフェクションを実施した。前述したように（実施例１を参照されたい）、処理開始後４８時間目に、筋管を採取し、且つ、単離したＲＮＡに対してノーザンブロット解析を実施した。

図４は、ホスホイメージャー解析によって実施し、且つ、様々な濃度においてＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化した、ｈＤＭＰＫｍＲＮＡシグナルの定量を示す。これらの条件下で、最大半減効果は約１ｎＭで観察された。

（図５及び６）
前述したように（実施例１を参照されたい）、約５００個の（ＣＴＧ）リピート伸長を含むヒトＤＭＰＫ遺伝子を有するＤＭ５００不死化筋芽細胞株を培養し、調製し、且つトランスフェクトした。ただし、本実施例では、様々な時点に２００ｎＭのＰＳ５８によるトランスフェクションを実施した。通常、低血清条件に切り換えて筋管形成を誘導してから７日目に、ＤＭ５００筋管を採取した。（実施例１及び２のような）標準手順は、採取する４８時間（２日）前に処理（トランスフェクション）を開始するものであった。ここでは、採取する２時間〜４８時間前（図５）又は２日〜８日前（図６）に、ＰＳ５８による処理を開始した。前述のようにノーザンブロット解析及び定量を実施した。

図５は、ＤＭ５００筋管中の伸長したｈＤＭＰＫｍＲＮＡが、モック対照による処理と比べて、オリゴヌクレオチドＰＳ５８による処理から２時間以内に急速に減少したことを示す。

図６は、少なくとも８日間、ＤＭ５００筋管中の伸長したｈＤＭＰＫｍＲＮＡが持続的に減少したことを示す。８日間の実験の場合、細胞は筋芽細胞段階（約６０％コンフルエント、３３℃、高血清）でトランスフェクトし、それらは、（トランスフェクション後２日目の３７℃、低血清への変更を含めて）採取するまで様々な機会に新鮮な培地を与えられたことに留意されたい。実施例２及び３は、リピート伸長部分のみを対象とするオリゴヌクレオチドによる著しく効率的な阻害介入を示す。この効果の大きさは、ヒトにおいても通常認められる、これらのモデル細胞系における比較的低レベルのｈＤＭＰＫ発現によって影響され得る。

（図７）
本実施例では、先天性筋緊張性ジストロフィー１型（ｃＤＭ１，congenital myotonic dystrophy type 1）のヒト患者から得た線維芽細胞を使用した。これらの患者細胞は、長さ１５００個のトリプレットリピート伸長部分を有する、疾患を引き起こすＤＭＰＫ対立遺伝子を１つ、リピートの長さが１１である正常なＤＭＰＫ対立遺伝子を１つ有する。両方の対立遺伝子上の（ＣＴＧ）ｎ伸長の大きさをＰＣＲ及びサザンブロット法を用いて確認した。

線維芽細胞をサブコンフルエントになるまで増殖させ、且つ３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中、０．１％ゼラチンでコーティングされたシャーレ上で維持した。１０％ＦＣＳ及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ中で、サブコンフルエントになるまで線維芽細胞を増殖させた。Matrigel（BD Biosciences社製）でコーティングしたシャーレ上で線維芽細胞を増殖させ、且つ、７５％コンフルエンシーの細胞を、２％ＨＳ及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭに溶かしたＭｙｏＤ発現アデノウイルス（Ad5Fib50MyoD、Crucell社製、レイデン）（ＭＯＩ＝１００）に２時間感染させることによって、筋管形成を誘導した。インキュベーション期間の後、ＭｙｏＤアデノウイルスを除去し、１０％ＦＣＳ及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭを添加した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中、この培地中で、コンフルエンシーが１００％になるまで維持した。この時点で、２％ＦＣＳ及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ中に細胞を播種した。この低血清培地で５日間経過した後、取扱い説明書（ExGen 500、Fermentas社製）に記載の手順に従って、且つ前述したようにして、ＰＳ５８を細胞にトランスフェクトした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は２００ｎＭ及び２０ｎＭであった。処理を開始してから４８時間後（低血清条件に切り換えてから７日後である）に、「Total RNAミニキット」（Bio-Rad社製）を用いてＲＮＡを単離し、且つノーザンブロット用に調製した。ノーザンブロットは、放射性ヒトＤＭＰＫ（ｈＤＭＰＫ）プローブ及びマウスＧＡＰＤＨｍＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ヒトＤＭＰＫシグナルをホスホイメージャー解析によって定量し、且つ、ＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化し、モック対照と比較して表した。

図７は、オリゴヌクレオチドＰＳ５８（２０及び２００ｎＭ）で処理したＭｙｏＤ形質転換筋芽細胞のノーザンブロット解析を示す。これらの結果から、疾患を引き起こすｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）１５００ＲＮＡ転写物の有効で完全な阻害が実証されるが、より小型の正常なｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）１１ＲＮＡ転写物は、２種の濃度において、ほんのわずか影響を受ける。したがって、リピート領域を対象とするオリゴヌクレオチドは、より大型のリピートサイズ（又は疾患を引き起こす伸長）に対する選択性を提示する。

（図８）
本実施例では、実施例１において前述したように、約５００個の（ＣＴＧ）リピート伸長を含むヒトＤＭＰＫ遺伝子を有するＤＭ５００不死化筋芽細胞株を培養し、トランスフェクトし、且つ解析した。採取する４８時間前に、２００ｎＭの、（ＣＵＧ）リピート配列にのみ特異的なオリゴヌクレオチドＰＳ５８、エキソン１中の配列に特異的なオリゴヌクレオチドＰＳ１１３、又はモック対照でＤＭ５００筋管を処理した。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、このマウス細胞株において発現されるｈＤＭＰＫｍＲＮＡ（プライマーについては実施例１を参照されたい）に対して、且つ天然の（ＣＵＧ）リピートを有する他の３種のマウス遺伝子転写物、即ち（ＣＵＧ）６を有するＰｔｂｐ１、（ＣＵＧ）６を有するシンデカン３、及び（ＣＵＧ）９を有するタキシリンβに対して実施した。

使用したＰＣＲプライマーは、Ｐｔｂｐ１に対しては、5'-TCTGTCCCTAATGTCCATGG-3'及び5'-GCCATCTGCACAAGTGCGT-3'、シンデカン３に対しては、5'-GCTGTTGCTGCCACCGCT-3'及び5'-GGCGCCTCGGGAGTGCTA-3'、タキシリンβに対しては5'-CTCAGCCCTGCTGCCTGT-3'及び5'-CAGACCCATACGTGCTTATG-3'であった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で泳動させ、且つLabworks 4.0プログラム（UVP社製BioImaging systems、ケンブリッジ、イギリス）を用いてシグナルを定量した。各シグナルの強度を対応するアクチンシグナルに対して標準化し、且つモック対照と比較して表した。

図８は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、ＰＳ５８によってｈＤＭＰＫｍＲＮＡ発現は最大限に阻害されている。天然の小規模な（ＣＵＧ）リピートを有する他の遺伝子転写物は、これらの遺伝子転写物に相補的な配列を有さないオリゴヌクレオチドＰＳ１１３と比べて、（ＣＵＧ）リピートに特異的なオリゴヌクレオチドＰＳ５８によって影響を受けなかったか、又はほんのわずか影響を受けた。

本実施例により、リピート領域のみを対象とするオリゴヌクレオチドが、天然に存在するより短いリピートサイズと比べて長いリピートサイズ（又は疾患を引き起こす伸長）に対して選択性を示すことが確認される。

（図９及び１０）
本実施例では、約５００個の（ＣＴＧ）リピート伸長を含むヒトＤＭＰＫ遺伝子を有するＤＭ５００不死化筋芽細胞株を培養し、且つＰＳ５８（２００ｎＭ）をトランスフェクトした。この場合、ＦＩＳＨ解析をこれらの細胞に対して実施した。処理開始後４８時間目に、４％ホルムアルデヒド、５ｍＭＭｇＣｌ_２、及び１×ＰＢＳで細胞を３０分間固定した。湿気のあるチャンバー中、３７℃で一晩、蛍光標識したオリゴヌクレオチドＣｙ３−（ＣＡＧ）１０−Ｃｙ３とのハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後、材料を洗浄し、モビオール（mowiol）中にマウントし、一晩乾燥させた。Bio-Rad社製MRC1024共焦点レーザー走査型顕微鏡及びLaserSharp2000取得ソフトウェアを用いて、核封入体（リボ核内フォーカス）を可視化した。合計で５０個の細胞を計数し、且つこれらの細胞の核中の封入体の存在について記録した。

文献により、伸長した（ＣＵＧ）リピートを含むＤＭＰＫｍＲＮＡが核中で蓄積及び凝集して、調節性の核タンパク質及び転写因子と共にリボ核内フォーカスを形成することが示されている。したがって、正常な核遺伝子プロセシング及び細胞機能が障害される。

図９は、モック処理細胞は核中にリボ核内封入体を含むが、ＰＳ５８で処理した後には、細胞核中にこれらはもはや存在しないことを示す。図１０は、ＤＭ５００筋管において対照条件下で認められる、リボ核内フォーカスを含む核のパーセンテージが、ＰＳ５８処理によって大きく減少することを示す。この結果から、ｈＤＭＰＫｍＲＮＡ発現の阻害もまた、疾患に関連したトリプレットリピート（ＣＵＧ）の豊富な封入体を阻害することが実証される。

（図１１）
この場合、約５００トリプレットの（ＣＴＧ）ｎ伸長部分を有するｈＤＭＰＫを含むＤＭ５００マウスにおいて、インビボでＰＳ５８の効果を評価した。ＤＭ５００マウスは、体細胞性伸長により、ＤＭ３００マウスに由来した（例えば、Gomes-Pereira M et al (2007) PLoS Genet. 2007 3(4): e52を参照されたい）。サザンブロット及びＰＣＲ解析によって、約５００個の（ＣＴＧ）トリプレットリピート伸長を確認した。

要するに、インビボで使用するために、添付の取扱い説明書に従ってトランスフェクション剤ExGen 500 （Fermentas社製）とＰＳ５８を混合した。ＰＳ５８（２ｎｍｏｌ、Exgen 500を含むトランスフェクション溶液中）を１歳のＤＭ５００マウスのＧＰＳ複合体中に注射し（４０μｌ）、且つこの手順を２４時間後に繰り返した。対照として、ＰＳ５８を含まないトランスフェクション溶液でＤＭ５００マウスを同様に処理した。１５日後、マウスを屠殺し、筋肉を単離し、（Trizol（Invitrogen社製）を用いて）組織から全ＲＮＡを単離した。前述したのと同様にして、ＲＴ−ＰＣＲ解析を実施して、筋肉中のｈＤＭＰＫｍＲＮＡを検出した。Labworks 4.0プログラム（UVP社製BioImaging systems、ケンブリッジ、イギリス）を用いて、各バンドの強度測定を実施し、且つ、対応するアクチンバンドの強度に対して標準化した。プライマーの位置は図面に示す。

図１１は、足底筋及び腓腹筋におけるモック処理と比べて、ＰＳ５８によるＤＭ５００マウスのインビボ処理により、（ＣＵＧ）ｎリピート伸長部分を含むｈＤＭＰＫｍＲＮＡの存在が大きく減少したことを示す。

（図１２）
本実施例では、（長さ及び主鎖の化学的性質が）異なるが、（ＣＴＧ）ｎリピート伸長部分のみを対象とする配列をいずれも有するオリゴヌクレオチドを比較した。実施例１において前述したように、ＤＭ５００筋管を培養し、トランスフェクトし、且つ解析した。ホスホイメージャー解析によってノーザンブロットを定量し、且つＧＡＰＤＨに対してＤＭＰＫシグナルを標準化した。

この場合、完全なホスホロチオエート主鎖をいずれも有する以下のオリゴヌクレオチド（２００ｎＭ）（表３を参照されたい）でＤＭ５００筋管を処理した。

図１２は、ＤＭ５００筋管を処理すると、試験したすべてのオリゴヌクレオチドにおいて、（ＣＵＧ）ｎが伸長したｈＤＭＰＫｍＲＮＡが完全に減少することを示す。本発明の条件下で、得られる最大の効果は、オリゴヌクレオチドの長さにも、主鎖の改変にも、使用される一本鎖オリゴヌクレオチドによる潜在的な阻害機序にも依存しない。

ハンチントン病の男性患者に由来する線維芽細胞（ＧＭ００３０５）をCoriell Cell Repository（キャムデン、ニュージャージー州、アメリカ）から入手し、添付の取扱い説明書及び当業者に公知の標準技術に従って培養した。ハンチントン病患者は、ハンチントン遺伝子の健常な対立遺伝子１つ及び疾患を引き起こす対立遺伝子１つを保有し、それぞれ正常な数の（ＣＡＧ）リピート及び伸長により数の増加した（ＣＡＧ）リピートをそれぞれ有する両方のｍＲＮＡの発現がもたらされる。

ハンチントンｍＲＮＡ中の（ＣＡＧ）トリプレットリピートに相補的な、（ＣＵＧ）７配列を有する２１量体の２’Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドＰＳ５７を線維芽細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造業者によって指定されるように、ＰＥＩの存在下で１００又は２００ｎＭで生じた。トランスフェクション後２４時間目に細胞を採取し、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって解析した。下流のエキソン６４中のプライマー（5' GAAAG TCAGT CCGGG TAGAA CTTC 3'及び5' CAGAT ACCCG CTCCA TAGCA A 3'）を用いて、ハンチントン転写物を決定した。この方法では、両方のタイプのハンチントンｍＲＮＡ、即ち正常転写物及び付加的に（ＣＡＧ）が伸長した変異転写物が検出される。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ（ハウスキーピング遺伝子）も同様に決定した。シグナルを定量し、且つ、同じ試料中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡの量に対してハンチントンｍＲＮＡの総量を標準化した。これらの結果は、線維芽細胞に由来する（オリゴヌクレオチドを用いずに）処理した対照試料（１００％に設定した）と比べて表した。

１００又は２００ｎＭいずれかのＰＳ５７をトランスフェクトした線維芽細胞に由来する試料では、対照処理細胞におけるレベルと比べて、それぞれ約５３％及び６６％という有意に低いレベルのハンチントンｍＲＮＡの合計レベルが観察された。

したがって、（ＣＡＧ）リピートのみを対象とするオリゴヌクレオチドＰＳ５７は、ハンチントンｍＲＮＡレベルの低下を誘導し、これらの結果は、正常なハンチントンｍＲＮＡよりも変異体を選択的に阻害することと一致している。

Claims

ヒトのシスエレメントリピートの不安定性に関連した遺伝的障害を治療又は予防する医薬品を製造するための、遺伝子転写物中の反復配列にのみ相補的である配列を含むか、又は該配列からなる一本鎖オリゴヌクレオチドの使用。
反復エレメントが、遺伝子転写物のコード配列中に存在する、請求項１に記載の使用。
反復エレメントが、遺伝子転写物の非コード配列中に存在する、請求項１に記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、（ＣＡＧ）ｎ、（ＧＣＧ）ｎ、（ＣＵＧ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＣＣＧ）ｎ、（ＧＡＡ）ｎ、（ＧＣＣ）ｎ、及び（ＣＣＵＧ）ｎからなる群から選択される反復エレメントに相補的である配列を含むか、又は該配列からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、ポリグルタミン（ＣＡＧ）ｎ区域に相補的である配列を含むか、又は該配列からなり、リピートの不安定性の障害が、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、ホーリバー症候群、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症、及び／又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症である、請求項２に記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、ポリアラニン（ＧＣＧ）ｎ区域に相補的である配列を含むか、又は該配列からなり、リピートの不安定性の障害が、点頭てんかん症候群、鎖骨頭蓋（deidocranial）異形成症、瞼裂縮小、手足生殖器疾患、合多指症、眼咽頭型筋ジストロフィー、及び／又は全前脳症からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、（ＣＵＧ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又は該配列からなり、リピートの不安定性の障害が、筋緊張性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型、及び／又はハンチントン病様２型である、請求項３に記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、（ＣＣＵＧ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又は該配列からなり、リピートの不安定性の障害が、筋緊張性ジストロフィー２型である、請求項３に記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、（ＣＧＧ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又は該配列からなり、リピートの不安定性の障害が、脆弱Ｘ染色体症候群である、請求項３に記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、（ＧＡＡ）ｎリピートに相補的である配列を含むか、又は該配列からなり、リピートの不安定性の障害が、フリードライヒ失調症である、請求項３に記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、約１０〜約５０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートを含む主鎖を有するか、又は有さない、ＲＮＡヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、モルホリノホスホロジアミデート、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、又はそれらの混合物からなる、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−置換ＲＮＡホスホロチオエートヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の使用。
医薬品中のオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの発現をもたらすことができる核酸ベクターによって提供される、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
医薬品中のオリゴヌクレオチドが、細胞へ前記オリゴヌクレオチドを送達し、且つ／又はその細胞内送達を促進するための少なくとも１つの賦形剤及び／又は標的リガンドと共に提供される、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
（ＣＡＧ）ｎ、（ＧＣＧ）ｎ、（ＣＵＧ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＧＡＡ）ｎ、（ＧＣＣ）ｎ、及び（ＣＣＵＧ）ｎからなる群から選択される反復配列に相補的である配列を含むか、又は該配列からなり、１０〜５０ヌクレオチド長である一本鎖オリゴヌクレオチド。
２’−Ｏ−置換ＲＮＡホスホロチオエートヌクレオチド、ＤＮＡホスホロチオエートヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、若しくはモルホリノヌクレオチド、及び／又はそれらの組合せをさらに含む、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
放射性標識又は蛍光標識された、請求項１〜１７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
請求項１〜１８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む、薬学的に許容される組成物。
細胞へオリゴヌクレオチドを送達し、且つ／又はその細胞内送達を促進するための少なくとも１種の賦形剤及び／又は標的リガンドをさらに含む、請求項１９に記載の薬学的に許容される組成物。
ヒト細胞において請求項１〜１８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの発現をもたらすことができる核酸ベクター、好ましくはウイルスベクター。
請求項１〜１８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの投与を含む、細胞中のリピート含有遺伝子転写物を減少させるための方法。
請求項１７又は１８に記載のオリゴヌクレオチドを使用する、インビトロ又はエクスビボの検出方法及び／又は診断方法。