CN115667513A - 用于调节Ataxin 3表达的化合物、方法和药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种修饰寡核苷酸，其具有阻碍Ataxin 3表达的活性且具有下述任一个的核酸碱基序列或该核酸碱基序列中包含的连续的17个碱基的核酸碱基序列。1)TCGGGTAAGTAGATTTTC(序列号239)、2)GAAGTATCTGTAGGCCTA(序列号240)、3)GGACTGTATAGGAGATTA(序列号241)4)GGTTATAGGATGCAGGTA(序列号242)、5)AGGTTATAGGATGCAGGT(序列号243)、6)GAAGCTAAGTAGGTGACT(序列号244)、7)TGAAGCTAAGTAGGTGAC(序列号245)、8)CCTAGTCACTTTGATAGA(序列号246)、9)GGAACATCTTGAGTAGGT(序列号247)、10)GGTGTTCAGGGTAGATGT列)(序列号248)、11)GGATACTCTGCCCTGTTC(序列号249)、12)GGTGTCAAACGTGTGGTT(序列号250)、13)CCGTGTGCTAGTATTTGT(序列号251)、14)TAGTAGAGTTTTGCTTGG(序列号252)、15)GATGTAGTAGAGTTTTGC(序列号253)、16)TGATGTAGTAGAGTTTTG(序列号254)、17)CTGATGTAGTAGAGTTTT(序列号255)、19)GCAAGTTGGTTTGTGGTA(序列号256)、20)TCTAGGCAATTGTGGTGG(序列号257)、21)GTAACTCTGCACTTCCCA(序列号258)、22)GTCATCCCTATGTCTTAT(序列号259)、23)GTCATATGGTCAGGGTAT(序列号260)、24)TGTCATATGGTCAGGGTA(序列号261)、25)ATGTCATATGGTCAGGGT(序列号262)及26)TATGTCATATGGTCAGGG(序列号263)。
Description
技术领域
本发明涉及用于降低动物中的Ataxin 3(ATXN3)的pre mRNA水平、mRNA水平和蛋白水平中的至少1种的化合物、使用该化合物的方法、以及含有该化合物的药物组合物。本发明的方法对于治疗、预防ATXN3相关疾病、例如脊髓小脑变性症3型(也称为SCA3、马查多-约瑟夫病、MJD)或使其进展延缓是有用的。
背景技术
脊髓小脑变性症3型是频度最高的常染色体显性遗传性脊髓小脑变性症中的一型。该疾病平均36岁发病，初期出现眼振、深部肌腱反射的亢进、构音障碍等。之后，病情进行性地恶化，出现步行困难、吞咽障碍、眼肌麻痹、复眼等症状，因吸入性肺炎、跌倒事故等而在20年左右死亡。尚不存在抑制病情进展的根治治疗，仅存在针对运动功能障碍、锥体外路障碍、有痛性肌痉挛、抑郁、倦怠感的对症疗法、和用于抑制病情进展的康复治疗。
1993年报告了脊髓小脑变性症3型的相关基因(responsible gene)与14q24.3-q32连锁(非专利文献1：Takiyama等，Nature Genetics，1993，4，300-304)。随后，1994年在新基因ATXN3(或MJD1)中发现CAG重复伸长，并鉴定为相关基因(非专利文献2：Kawaguchi等，Nature Genetics，1994，8，221-228.)。报告了该CAG重复在正常等位基因中为14至37，与此相对，伸长等位基因为61至84(非专利文献3：Takiyama等，Neurology，1997，49，604-606)，CAG重复伸长与发病年龄存在负相关(非专利文献2：Kawaguchi等，Nature Genetics，1994，8，221-228)。认为CAG重复伸长其自身的RNA毒性、或者作为其翻译产物的poly-谷氨酰胺引起的线粒体障碍、转录异常、钙稳态异常、自噬异常、轴突输送异常等各种病理假说的结果(非专利文献4：M.M.Evers等，Molecular Neurobiology，2014，49，1513-1531)是，引起小脑purkinje细胞的功能降低、脱落，进而引起运动功能障碍。
反义寡核苷酸作为用于调节某种基因产物的表达的有效手段相继被用于临床。近年来已清楚，如Spinraza那样，对中枢性的基因性疾病也显示出非常优异的效果(非专利文献5：Aartsma-Rus，A.Nucleic Acid Ther.2017，27，67)。反义寡核苷酸因此有可能清楚了对于用于调节ATXN3 mRNA的一些治疗性、诊断性、以及研究性应用是有用的。
迄今为止，进行了开发使用反义寡核苷酸对脊髓小脑变性症3型的根本治疗方法的尝试。DE KIMPE等进行了利用以ATXN3的编码区域中的CAG重复部分为靶的反义寡核苷酸，选择性地使异常等位基因表达降低的尝试(专利文献1：WO2008/018795、及专利文献2：WO2009/099326)。另外，UZCATEGUI等还制备了与脊髓小脑变性症3型患者的一部分含有共同的单核苷酸多态性(G987C)的区域互补的反义寡核苷酸，进行了异常等位基因选择性的表达降低的尝试(专利文献3：WO2013/138353)。VAN ROON-MOM等报告了与外显子跳读CAG重复存在的外显子10、及9的ATXN3 mRNA互补的反义寡核苷酸(专利文献4：WO2015/053624)。但是，这4件报告例仅验证了针对ATXN3 mRNA的极其有限的区域的反义寡核苷酸的效果，并没有报告在转基因动物模型(脊髓小脑变性症3型动物模型)中的有效性。近年来，对等位基因非选择性地进行了针对ATXN3 mRNA整个区域的反义寡核苷酸的探索，例如报告了等位基因非选择性的反义寡核苷酸(专利文献5：WO2018/089805、专利文献6：WO2019/217708、及专利文献7：WO2020/172559)，确认了在转基因动物模型(脊髓小脑变性症3型动物模型)中的有效性(非专利文献6：Hayley S.McLoughlin等、Annals of Neurology，2018，84，64-77)。但是，此时的药效给药量是每1只小鼠700μg，对于临床应用而言不能说保持充分的药用潜力。如上所述，迄今为止正在积极地进行以脊髓小脑变性症3型的根本治疗为目标的反义寡核苷酸的开发，但它们尚不能说具有充分的效果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/018795
专利文献2：WO2009/099326
专利文献3：WO2013/138353
专利文献4：WO2015/053624
专利文献5：WO2018/089805
专利文献6：WO2019/217708
专利文献7：WO2020/172559
非专利文献
非专利文献1：Takiyama等，Nature Genetics 1993，4，300-304
非专利文献2：Kawaguchi等，Nature Genetics 1994，8，221-228.
非专利文献3：Takiyama等，Neurology 1997，49，604-606
非专利文献4：M.M.Evers等，Molecular Neurobiology，2014，49，1513-1531
非专利文献5：Aartsma-Rus，A.Nucleic Acid Ther.2017，27，67
非专利文献6：Hayley S.McLoughlin等，Annals of Neurology，2018，84，64-77
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供用于抑制ATXN3表达的、和/或用于治疗、预防、延缓或改善ATXN3相关疾病的化合物、方法及药物组合物。
用于解决课题的手段
本发明者们进行了深入研究，发现了强烈地抑制ATXN3表达的修饰寡核苷酸，从而完成了本发明。
本发明的主旨如下。
[1]一种修饰寡核苷酸，其是具有抑制Ataxin 3(ATXN3)表达的活性的修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸的核酸碱基序列为选自下述组中的任一个的核酸碱基序列或该核酸碱基序列中包含的连续的17个碱基的核酸碱基序列(需要说明的是，本说明书中，碱基序列以5’至3’的顺序记载)：
1)TCGGGTAAGTAGATTTTC(序列号1的2159～2176的互补序列)(序列表的序列号239)
2)GAAGTATCTGTAGGCCTA(序列号1的2513～2530的互补序列)(序列表的序列号240)
3)GGACTGTATAGGAGATTA(序列号1的2646～2663的互补序列)(序列表的序列号241)
4)GGTTATAGGATGCAGGTA(序列号1的5844～5861的互补序列)(序列表的序列号242)
5)AGGTTATAGGATGCAGGT(序列号1的5845～5862的互补序列)(序列表的序列号243)
6)GAAGCTAAGTAGGTGACT(序列号1的15115～15132的互补序列)(序列表的序列号244)
7)TGAAGCTAAGTAGGTGAC(序列号1的15116～15133的互补序列)(序列表的序列号245)
8)CCTAGTCACTTTGATAGA(序列号1的19163～19180的互补序列)(序列表的序列号246)
9)GGAACATCTTGAGTAGGT(序列号1的19737～19754的互补序列)(序列表的序列号247)
10)GGTGTTCAGGGTAGATGT(序列号1的20835～20852的互补序列)(序列表的序列号248)
11)GGATACTCTGCCCTGTTC(序列号1的21482～21499的互补序列)(序列表的序列号249)
12)GGTGTCAAACGTGTGGTT(序列号1的22200～22217的互补序列)(序列表的序列号250)
13)CCGTGTGCTAGTATTTGT(序列号1的27389～27406的互补序列)(序列表的序列号251)
14)TAGTAGAGTTTTGCTTGG(序列号1的31570～31587的互补序列)(序列表的序列号252)
15)GATGTAGTAGAGTTTTGC(序列号1的31574～31591的互补序列)(序列表的序列号253)
16)TGATGTAGTAGAGTTTTG(序列号1的31575～31592的互补序列)(序列表的序列号254)
17)CTGATGTAGTAGAGTTTT(序列号1的31576～31593的互补序列)(序列表的序列号255)
19)GCAAGTTGGTTTGTGGTA(序列号1的32008～32025的互补序列)(序列表的序列号256)
20)TCTAGGCAATTGTGGTGG(序列号1的32127～32144的互补序列)(序列表的序列号257)
21)GTAACTCTGCACTTCCCA(序列号1的36411～36428的互补序列)(序列表的序列号258)
22)GTCATCCCTATGTCTTAT(序列号1的36607～36624的互补序列)(序列表的序列号259)
23)GTCATATGGTCAGGGTAT(序列号1的40453～40470的互补序列)(序列表的序列号260)
24)TGTCATATGGTCAGGGTA(序列号1的40454～40471的互补序列)(序列表的序列号261)
25)ATGTCATATGGTCAGGGT(序列号1的40455～40472的互补序列)(序列表的序列号262)及
26)TATGTCATATGGTCAGGG(序列号1的40456～40473的互补序列)(序列表的序列号263)。
[2]根据[1]的修饰寡核苷酸，其为单链。
[3]根据[1]或[2]的修饰寡核苷酸，其中，构成修饰寡核苷酸的至少1个核苷包含修饰糖。
[4]根据[3]的修饰寡核苷酸，其中，修饰糖选自由双环式糖、2’-MOE(2’-O-甲氧基乙基)修饰的糖、及2’-OMe修饰的糖组成的组。
[5]根据[4]的修饰寡核苷酸，其中，双环式糖选自LNA、GuNA、ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]、或ALNA[Trz]的糖部分。
[6]根据[1]～[5]中任一项的修饰寡核苷酸，其中，构成所述修饰寡核苷酸的至少1个核苷包含修饰核酸碱基。
[7]根据[6]的修饰寡核苷酸，其中，修饰核酸碱基为5-甲基胞嘧啶。
[8]根据[1]～[7]中任一项的修饰寡核苷酸，其中，构成所述修饰寡核苷酸的至少1个核苷间键为修饰核苷间键。
[9]根据[8]的修饰寡核苷酸，其中，修饰核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
[10]根据[1]～[9]中任一项的修饰寡核苷酸，其中，所述修饰寡核苷酸包含，
1)间隙片段(gap segment)，
2)5’侧翼片段(5’wing segment)及
3)3’侧翼片段(3’wing segment)，
所述间隙片段位于所述5’侧翼片段与所述3’侧翼片段之间，
构成所述5’侧翼片段及3’侧翼片段的核苷包含修饰糖。
[11]一种修饰寡核苷酸，其是具有抑制ATXN3表达的活性的由12～24个残基构成的修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸的核酸碱基序列与序列表的序列号1的核酸碱基序列的等长部分具有至少85％的互补性，构成该寡核苷酸的核苷中的至少1个具有选自ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]、或ALNA[Trz]的糖部分中的修饰糖。
[12]一种药物组合物，其含有[1]～[11]中任一项的修饰寡核苷酸或其医药上可容许的盐、以及药学上可容许的载体。
[13]根据[12]的药物组合物，其用于ATXN3相关疾病的治疗、预防、或使其进展延缓。
[14]根据[13]的药物组合物，其中，所述ATXN3相关疾病为神经变性疾病。
[15]根据[14]的药物组合物，其中，所述神经变性疾病为脊髓小脑变性症3型。
[16]一种用于治疗、预防对象中的ATXN3相关疾病或使其进展延缓的方法，其特征在于，将[1]～[13]中任一项的修饰寡核苷酸的有效量给药至需要其的对象。
[17][1]～[11]中任一项的修饰寡核苷酸在制造用于ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓的药物中的用途。
[18]用于ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓的[1]～[11]中任一项的修饰寡核苷酸。
发明效果
根据本发明，提供能够改善ATXN3相关疾病、例如脊髓小脑变性症3型的症状的对该疾病的预防、治疗有效的药物。本发明的修饰寡核苷酸在抑制ATXN3表达的活性方面优异，毒性等副作用也少，因此作为ATXN3相关疾病的预防或治疗药的有效成分优异。
具体实施方式
上述的概要以及以下的详细说明这两者只不过是例示性的并且是说明性的，并不是为了对所请求的本发明进行限制。在本说明书中，只要没有特别的记载，单数形式的使用也包括复数形式。在本说明书中，用语“包含(including)”以及其他方式、例如“含有(includes)”以及“所包含的(included)”的使用并不是限定性的。此外，只要没有特别的记载，“要素”等用语包括包含1个单元的要素和包含超过1个的子单元的要素。
本说明书中使用的部分(section)的标题仅用于构成上的目的，不应该被解释为对所记载的主题进行限制。并不限定于这些，对于包括专利、专利申请、报告、书籍及论文在内的本申请中所引用的所有文件或文件的一部分，涉及本说明书中讨论的文件的一部分及其整体通过参照明确地纳入本说明书中。
(定义)
只要不给出具体的定义，则本说明书中记载的分析化学、有机合成化学、以及与医化学及药化学相关地利用的命名法、及它们的顺序及技术方法在本技术领域中是公知的，是通常使用的。可以将标准的技术方法用于本说明书中使用的化学合成和化学分析。在容许的情况下，贯穿本说明书的公开整体而提及的所有的专利、申请、公开申请以及其他出版物、通过国立生物技术信息中心(NCBI)等数据库可获得的GenBank保藏编号以及相关的序列信息以及其他数据，涉及本说明书中讨论的文件的一部分及其整体通过参照而纳入。
另外，虽然本说明书与电子格式的序列表一起提交申请，但该电子格式中记载的序列表的信息通过参照将其整体纳入本说明书中。
只要没有特别的指示，以下的用语具有以下的含义。
“核酸碱基”是指能够与其他核酸的碱基形成对的杂环部分。
“核酸碱基序列”是指构成本发明的寡核苷酸的连续的核酸碱基的顺序。
“核苷”是指将糖和核酸碱基连接而成的分子。在一种实施方式中，核苷与磷酸基连接。
“核苷酸”是指在核苷的糖部分上键合有磷酸基的分子。天然存在的核苷酸的糖部分为核糖或脱氧核糖，经由磷酸基通过磷酸二酯键共价键合。
“寡聚物化合物”或“寡聚物”是指能够与核酸分子的至少一个区域杂交的、连接单体子单元的聚合物。
“寡核苷酸”是指各核苷和各核苷间键相互独立地连接而成的核苷的聚合物。
“核苷间键”是指核苷间的化学键。
“天然存在的核苷间键”是指3'-5'磷酸二酯键。
“修饰核苷间键”是指源自天然存在的核苷间键(即磷酸二酯核苷间键)的取代或任意的变化。例如有硫代磷酸酯核苷间键，但并不限定于此。
“硫代磷酸酯核苷间键”是指通过用硫原子替换未交联氧原子中的1个而磷酸二酯键被修饰的核苷间的键。硫代磷酸酯键是该修饰核苷间键中的1例。
“修饰碱基”是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶以外的任意核酸碱基。例如有5-甲基胞嘧啶，但并不限定于此。“非修饰核酸碱基”是指嘌呤碱基的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)、以及嘧啶碱基的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰寡核苷酸”是指包含至少1个该修饰核苷和/或该修饰核苷间键的寡核苷酸。
“盐”是指将酸中含有的1个以上的可解离的氢离子替换为金属离子、铵离子等阳离子而成的化合物的总称，作为修饰寡核苷酸的盐，可举出在硫代磷酸酯或磷酸二酯上、或修饰核酸碱基内的官能团(例如氨基)上与无机物离子(例如钠离子、镁离子)形成的盐(例如钠盐、镁盐)，但并不限定于这些。
“糖”或“糖部分”是指天然糖部分或修饰糖部分。
“修饰糖”是指源自天然的糖的取代或变化。作为修饰糖，例如可举出取代糖部分和双环式糖。
“取代糖部分”是指RNA或DNA的除天然糖以外的呋喃糖基(Furanosil)。
“双环式糖”是指通过存在于同一环上的2个不同的碳原子的交联而修饰的呋喃糖基环。“双环式核酸”是指核苷或核苷酸的呋喃糖(furanose)部分包含“双环式糖”的核苷或核苷酸。
“单链寡核苷酸”是指未与互补链杂交的寡核苷酸。
“ATXN3”是指也被称为Ataxin 3的核酸或蛋白。ATXN3例如可以包括从ATXN3基因转录的各种剪切突变体、单碱基替换物(SNP)或CAG重复伸长。
“互补”是指第一核酸与第二核酸的核酸碱基间的形成对的能力。在一种实施方式中，腺嘌呤与胸苷或尿嘧啶互补。在一种实施方式中，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。在一种实施方式中，5-甲基胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
“完全互补(也称为互补性)”或“100％互补(也称为互补性)”是指第一核酸的核酸碱基序列的各核酸碱基全部具有与第二核酸的第二核酸碱基序列互补的核酸碱基。在一种实施方式中，第一核酸为修饰寡核苷酸，靶核酸为第二核酸。
“错配”或“非互补性核酸碱基”是指第一核酸的核酸碱基不能与第二核酸或靶核酸的对应的核酸碱基形成对的情况。
“靶核酸”、“靶RNA”和“靶RNA转录产物”全部是指可以将修饰寡核苷酸作为靶的核酸。在一种实施方式中，靶核酸包含ATXN3 mRNA或ATXN3 pre-mRNA的区域。
“基序”是指修饰寡核苷酸中的化学上异质的区域的组合。
“直接邻接”是指在直接邻接的要素间没有介入性的要素。
“医药上可容许的盐”是指本发明的修饰寡核苷酸的生理学和药学上可容许的盐、即保持修饰寡核苷酸所期望的生物活性，不给其带来不期望的毒性效果的盐。
“给药”是指将药剂给予动物，并不限定于这些，例如可举出由医疗专家或家人进行的给药和自给药。
“改善”是指减少相关的疾病、障碍或状态中的至少1个指标、症候或症状。指标的重度可以根据本领域技术人员已知的主观或客观的尺度来确定。
“动物”是指人，或者包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪在内的非人动物，但并不限定于这些，以及包括猴、黑猩猩在内的非人灵长类，但并不限定于这些。
“有效量”是指足以在需要药剂的个体中实现所期望的生理回转的本发明的修饰寡核苷酸的量。有效量可以根据需处置的个体的健康和身体状态、需处置的个体的分类组、组合物的制剂、个体的医学状态的评价以及其他相关因素而在个体之间变动。
“个体”是指对处置或疗法选择的人或非人动物。
“预防”是指在几分钟至无期限的期间，使疾病、障碍或不优选的健康状态、或者与该疾病、障碍或不优选的健康状态相关的1个以上的症状、发病或发生延缓或防范于未然。预防是指使发生疾病、障碍或不优选的健康状态的危险性降低。
“治疗”是指减轻或排除疾病、障碍或不优选的健康状态、或者与该疾病、障碍或不优选的健康状态相关的1个以上的症状，或者抑制其进展，或者部分消除或根除该疾病、障碍、或不优选的健康状态本身的1个或1个以上的原因。
(具体实施方式)
下述所示的某种具体实施方式提供用于阻碍ATXN3的表达的化合物、使用该化合物的方法、以及含有该化合物的药物组合物，但并不限定于这些。
(1)修饰寡核苷酸
本发明的修饰寡聚核苷酸(以下，有时称为“本发明化合物”或“本发明修饰寡聚核苷酸”)为具有阻碍ATXN3表达的活性的ATXN3的反义寡核苷酸。本发明中的ATXN3表达(水平)的阻碍是指，抑制从ATXN3基因转录得到的pre-mRNA水平、从pre-mRNA剪切得到的mRNA水平和从mRNA翻译得到的ATXN3蛋白水平中的至少1个。ATXN3 pre-mRNA可以包括在SNP和/或脊髓小脑变性症3型的患者中可见的CAG重复伸长，例如可举出NC_000014.9：c92106621-92058552 Homo sapiens chromosome 14，GRCh38.p13 Primary Assembly中记载的序列(序列表的序列号1)所示的序列。ATXN3 mRNA可以包括突变体、在SNP及脊髓小脑变性症3型的患者中可见的CAG重复伸长中的至少1种，例如可举出由GenBank保藏编号NM_004993.5中记载的序列(序列表的序列号2)所示的序列。另外，序列号1和2表示DNA的碱基序列，但在RNA序列的情况下，将T替换地读作U。
本发明化合物所具有的ATXN3表达的阻碍程度，只要是ATXN3的pre-mRNA水平、mRNA水平及蛋白水平中的至少1个与不给药该化合物的情况相比降低，作为其结果，可见伴随ATXN3相关疾病的症状的预防和/或改善的程度，则可以为任意程度，具体而言，例如在后述的体外(in vitro)ATXN3表达测定方法中使用下述程度：使本发明化合物与细胞接触后，与未接触时或与阴性对照物质接触时相比，ATXN3表达水平为至少70％以下、优选为50％以下、更优选为40％以下、进一步优选为30％以下、特别优选为20％以下。
本发明化合物只要是具有阻碍ATXN3表达的活性的由12～24个残基、优选16～18个残基、更优选18个残基构成的修饰寡核苷酸、且包含与从序列表的序列号1的核酸碱基序列的5’末端起的256～273位、404～427位、541～558位、647～665位、697～716位、767～784位、2043～2066位、2092～2109位、2159～2177位、2502～2530位、2646～2667位、4011～4029位、4038～4063位、4259～4292位、5179～5196位、5762～5777位、5843～5870位、7203～7225位、7535～7553位、7602～7617位、7741～7758位、7788～7810位、10273～10288位、10997～11014位、11642～11672位、11734～11759位、11799～11825位、12710～12727位、13136～13156位、14325～14340位、15114～15139位、15703～15723位、18108～18123位、18749～18766位、19061～19078位、19163～19181位、19355～19372位、19736～19756位、20833～20854位、21059～21077位、21482～21502位、22109～22126位、22192～22220位、22913～22930位、22998～23013位、23046～23074位、24651～24670位、26470～26485位、27388～27412位、30559～30582位、31570～31595位、31841～31858位、32006～32029位、32127～32144位、33630～33647位、35710～35729位、36411～36441位、36607～36624位、37690～37705位、38556～38576位、38587～38624位、40452～40492位、40539～40557位、41281～41300位、41392～41410位、42805～42820位、43091～43106位或45892～45909位中的任一个等长部分互补的至少8个连续的核酸碱基序列(以下称为“ATXN3互补性核酸碱基序列”)的化合物均可。另外，上述ATXN3互补性核酸碱基序列优选为8～18个连续的核酸碱基序列，进一步优选为16、17或18个连续的核酸碱基序列。
或者，作为ATXN3互补性核酸碱基序列，也可以是与从序列表的序列号1的核酸碱基序列的5’末端起的1512～1536位、1568～1583位、3931～3946位、5668～5683位、7817～7832位、9925～9940位、10409～10424位、10556～10571位、10584～10599位、11002～11017位、11617～11632位、12076～12091位、14074～14089位、14213～14228位、16211～16226位、16740～16755位、18015～18030位、18033～18048位、20832～20847位、20848～20863位、22116～22131位、22194～22225位、27062～27077位、27271～27286位、29393～29408位、30535～30550位、30556～30571位、30930～30945位、33237～33252位、34900～34915位、35841～35856位、41294～41309位、42110～42125位、43182～43197位、43209～43233位、43933～43948位或44050～44065位中的任一个等长部分互补的16个或16个以上的连续的核酸碱基序列。
在此，本发明的修饰寡核苷酸只要是除了上述ATXN3互补性核酸碱基序列以外，其全长在12～24个残基、优选16～18个残基、更优选18个残基的范围内、且其全长的核酸碱基序列与序列表的序列号1的核酸碱基序列的等长部分具有至少85％的互补性的寡核苷酸，则也可以在其5’末端侧和/或3’末端侧具有附加序列。此外，只要本发明的修饰寡核苷酸具有阻碍ATXN3表达的活性，则附加序列可以是任意的。
上述修饰寡核苷酸的全长的核酸碱基序列与序列表的序列号1的等长部分具有至少85％的互补性，其互补性优选为90％、更优选为95％、进一步优选为100％。在此，等长部分是指，将本发明的修饰寡核苷酸的核酸碱基序列与ATXN3 pre-mRNA或mRNA的核酸碱基序列使用例如BLAST、Genetyx软件(GENETYX CORPORATION)等软件对比时，检测为具有同源性的部分的部分。即，本发明的寡核苷酸的核酸碱基序列优选与ATXN3 pre-mRNA或mRNA的核酸碱基序列的等长部分完全互补，但也可以使用具有1个或多个错配核酸碱基，具有85％以上、90％以上、优选95％以上的互补性的寡核苷酸。
上述错配核酸碱基可以连续，也可以夹着ATXN3互补性核酸碱基序列。本发明的反义寡核苷酸与ATXN3 pre-mRNA或mRNA的互补性百分比例如可以使用本技术领域已知的BLAST程序(basic local alignment searchtools)及PowerBLAST程序(Altschul et al.，J.Mol.Biol.，1990，215，403 410；Zhang and Madden，Genome Res.，1997，7，649 656)、Genetyx软件(GENETYX CORPORATION)，依照惯例确定。同源性百分比、序列同源性或互补性例如可以通过Cap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，Madison Wis.)使用Smith andWaterman(Adv.Appl.Math.，1981，2，482 489)的算法的缺省(default)设定、Genetyx软件(GENETYX CORPORATION)来确定。例如，修饰寡核苷酸的20个核酸碱基中的18个与ATXN3pre-mRNA的等长部分互补而进行杂交时，修饰寡核苷酸具有90％的互补性。
作为本发明化合物的活性的验证方法，只要是能够验证本发明化合物阻碍ATXN3表达的方法，则可以是任意的方法，具体而言，例如可以使用后述的体外(in vitro)ATXN3表达测定方法。
作为如此选择的本发明的修饰寡核苷酸，可举出由与选自从序列表的序列号1的核酸碱基序列的5’末端起的256～273位、404～421位、405～422位、407～424位、408～425位、409～426位、410～427位、541～558位、647～664位、648～665位、697～714位、698～715位、699～716位、767～784位、1512～1527位、1521～1536位、1568～1583位、2043～2060位、2045～2062位、2046～2063位、2047～2064位、2048～2065位、2051～2066位、2092～2109位、2159～2176位、2162～2177位、2502～2519位、2513～2530位、2646～2663位、2650～2667位、3931～3946位、4011～4028位、4012～4029位、4038～4053位、4041～4058位、4046～4063位、4259～4274位、4267～4284位、4268～4285位、4269～4286位、4277～4292位、5179～5196位、5668～5683位、5762～5777位、5843～5860位、5844～5861位、5845～5862位、5853～5870位、7203～7220位、7208～7225位、7535～7552位、7536～7553位、7602～7617位、7741～7758位、7788～7805位、7792～7809位、7793～7810位、7817～7832位、9925～9940位、10273～10288位、10409～10424位、10556～10571位、10584～10599位、10997～11014位、11002～11017位、11617～11632位、11642～11659位、11643～11660位、11644～11661位、11645～11662位、11646～11663位、11648～11665位、11649～11666位、11650～11665位、11650～11667位、11651～11668位、11654～11669位、11655～11672位、11734～11751位、11735～11752位、11738～11753位、11741～11758位、11744～11759位、11799～11816位、11800～11817位、11810～11825位、12076～12091位、12710～12727位、13136～13153位、13141～13156位、14074～14089位、14213～14228位、14325～14340位、15114～15129位、15115～15132位、15116～15133位、15124～15139位、15703～15720位、15704～15721位、15705～15722位、15706～15723位、16211～16226位、16740～16755位、18015～18030位、18033～18048位、18108～18123位、18749～18766位、19061～19078位、19163～19180位、19166～19181位、19355～19372位、19736～19753位、19737～19754位、19738～19755位、19739～19756位、20832～20847位、20833～20850位、20835～20852位、20836～20853位、20837～20854位、20838～20855位、20839～20854位、20848～20863位、21059～21076位、21060～21077位、21482～21499位、21483～21500位、21487～21502位、22109～22126位、22116～22131位、22192～22209位、22193～22210位、22194～22209位、22194～22211位、22195～22212位、22196～22213位、22197～22214位、22197～22214位、22198～22215位、22198～22215位、22199～22214位、22199～22216位、22200～22217位、22201～22218位、22202～22219位、22203～22220位、22203～22218位、22210～22225位、22913～22930位、22998～23013位、23046～23063位、23047～23064位、23048～23065位、23049～23066位、23050～23067位、23055～23072位、23056～23073位、23057～23074位、24651～24668位、24652～24669位、24653～24670位、26470～26485位、27062～27077位、27271～27286位、27388～27405位、27389～27406位、27391～27408位、27392～27409位、27393～27410位、27394～27411位、27395～27412位、29393～29408位、30535～30550位、30556～30571位、30559～30576位、30560～30577位、30561～30578位、30564～30581位、30565～30582位、30930～30945位、31570～31587位、31574～31591位、31575～31592位、31576～31591位、31576～31593位、31577～31594位、31578～31595位、31580～31595位、31841～31858位、32006～32021位、32006～32023位、32007～32024位、32008～32025位、32009～32026位、32010～32027位、32011～32028位、32012～32029位、32127～32144位、33237～33252位、33630～33647位、34900～34915位、35710～35725位、35711～35728位、35712～35729位、35841～35856位、36411～36428位、36412～36429位、36413～36428位、36413～36430位、36417～36432位、36426～36441位、36607～36624位、36609～36624位、37690～37705位、38556～38571位、38559～38576位、38587～38604位、38588～38605位、38589～38606位、38590～38607位、38593～38610位、38594～38611位、38596～38613位、38597～38614位、38598～38615位、38599～38616位、38600～38617位、38601～38618位、38604～38621位、38606～38623位、38607～38624位、40452～40467位、40453～40470位、40454～40471位、40455～40472位、40456～40473位、40470～40485位、40475～40492位、40539～40556位、40540～40557位、41281～41298位、41285～41300位、41294～41309位、41392～41409位、41393～41410位、42110～42125位、42805～42820位、43091～43106位、43182～43197位、43209～43224位、43218～43233位、43933～43948位、44050～44065位或45892～45909位中的任一个的核酸碱基序列、优选2159～2176位、5668～5683位、5845～5862位、11650～11665位、12076～12091位、14213～14228位、15115～15132位、16740～16755位、18033～18048位、22199～22214位、22203～22218位、27062～27077位、31575～31592位、31576～31591位、31576～31593位、32006～32021位、35841～35856位、36607～36624位、36609～36624位、37690～37705位、40453～40470位、40454～40471位、40455～40472位、40456～40473位、40470～40485位或41294～41309位中的任一个的核酸碱基序列、更优选12076～12091位、22199～22214位、22203～22218位、27062～27077位、31576～31591位、32006～32021位、35841～35856位、36609～36624位、40453～40470位或41294～41309位中的任一个的核酸碱基序列互补的序列构成的修饰寡核苷酸、或者由与该核酸碱基序列中包含的连续的16或17个碱基的核酸碱基序列互补的序列构成的修饰寡核苷酸。在此，如果修饰寡核苷酸的全长的核酸碱基序列与序列表的序列号1的核酸碱基序列的等长部分具有100％的互补性，则也可以在其5’末端侧和/或3’末端侧具有1个或2个残基的附加序列。
作为如此选择的修饰寡核苷酸中的、向SH-SY5Y细胞以终浓度达到3μM的方式利用gymnosis法添加，将ATXN3 mRNA水平与修饰寡核苷酸未接触时相比，阻碍在70％以下的修饰寡核苷酸的核酸碱基序列，例如可举出由与选自从序列表的序列号1的核酸碱基序列的5’末端起的698～715位、699～716位、2043～2060位、2046～2063位、2047～2064位、2092～2109位、2159～2176位、2513～2530位、2646～2663位、2650～2667位、4041～4058位、5843～5860位、5844～5861位、5845～5862位、7792～7809位、11642～11659位、11643～11660位、11644～11661位、11645～11662位、11649～11666位、11650～11667位、11655～11672位、11734～11751位、11735～11752位、12710～12727位、13136～13153位、15115～15132位、15116～15133位、15704～15721位、15706～15723位、19163～19180位、19737～19754位、20835～20852位、20836～20853位、20837～20854位、21482～21499位、21483～21500位、22192～22209位、22194～22211位、22199～22216位、22200～22217位、22201～22218位、22202～22219位、23056～23073位、27388～27405位、27389～27406位、27392～27409位、27393～27410位、27394～27411位、30559～30576位、30560～30577位、30564～30581位、31570～31587位、31574～31591位、31575～31592位、31576～31593位、31577～31594位、31578～31595位、31841～31858位、32006～32023位、32007～32024位、32008～32025位、32009～32026位、32011～32028位、32127～32144位、35711～35728位、35712～35729位、36411～36428位、36412～36429位、36607～36624位、38559～38576位、38587～38604位、38588～38605位、38589～38606位、38590～38607位、38593～38610位、38594～38611位、38604～38621位、38607～38624位、40453～40470位、40454～40471位、40455～40472位、40456～40473位、40475～40492位、41281～41298位、41392～41409位、41393～41410位或45892～45909位中的任一个的核酸碱基序列互补的序列构成的修饰寡核苷酸、或者由与该核酸碱基序列中包含的连续的16或17个碱基的核酸碱基序列互补的序列构成的修饰寡核苷酸。
作为本发明的修饰寡核苷酸的具体的核酸碱基序列，例如可举出下述序列中记载的核酸碱基序列或该核酸碱基序列中包含的连续的17个碱基的核酸碱基序列：
TCGGGTAAGTAGATTTTC(序列号1的2159～2176的互补序列)(序列表的序列号239)、
GAAGTATCTGTAGGCCTA(序列号1的2513～2530的互补序列)(序列表的序列号240)、
GGACTGTATAGGAGATTA(序列号1的2646～2663的互补序列)(序列表的序列号241)、
GGTTATAGGATGCAGGTA(序列号1的5844～5861的互补序列)(序列表的序列号242)、
AGGTTATAGGATGCAGGT(序列号1的5845～5862的互补序列)(序列表的序列号243)、
GAAGCTAAGTAGGTGACT(序列号1的15115～15132的互补序列)(序列表的序列号244)、
TGAAGCTAAGTAGGTGAC(序列号1的15116～15133的互补序列)(序列表的序列号245)、
CCTAGTCACTTTGATAGA(序列号1的19163～19180的互补序列)(序列表的序列号246)、
GGAACATCTTGAGTAGGT(序列号1的19737～19754的互补序列)(序列表的序列号247)、
GGTGTTCAGGGTAGATGT(序列号1的20835～20852的互补序列)(序列表的序列号248)、
GGATACTCTGCCCTGTTC(序列号1的21482～21499的互补序列)(序列表的序列号249)、
GGTGTCAAACGTGTGGTT(序列号1的22200～22217的互补序列)(序列表的序列号250)、
CCGTGTGCTAGTATTTGT(序列号1的27389～27406的互补序列)(序列表的序列号251)、
TAGTAGAGTTTTGCTTGG(序列号1的31570～31587的互补序列)(序列表的序列号252)、
GATGTAGTAGAGTTTTGC(序列号1的31574～31591的互补序列)(序列表的序列号253)、
TGATGTAGTAGAGTTTTG(序列号1的31575～31592的互补序列)(序列表的序列号254)、
CTGATGTAGTAGAGTTTT(序列号1的31576～31593的互补序列)(序列表的序列号255)、
GCAAGTTGGTTTGTGGTA(序列号1的32008～32025的互补序列)(序列表的序列号256)、
TCTAGGCAATTGTGGTGG(序列号1的32127～32144的互补序列)(序列表的序列号257)、
GTAACTCTGCACTTCCCA(序列号1的36411～36428的互补序列)(序列表的序列号258)、
GTCATCCCTATGTCTTAT(序列号1的36607～36624的互补序列)(序列表的序列号259)、
GTCATATGGTCAGGGTAT(序列号1的40453～40470的互补序列)(序列表的序列号260)、
TGTCATATGGTCAGGGTA(序列号1的40454～40471的互补序列)(序列表的序列号261)、
ATGTCATATGGTCAGGGT(序列号1的40455～40472的互补序列)(序列表的序列号262)、或
TATGTCATATGGTCAGGG(序列号1的40456～40473的互补序列)(序列表的序列号263)。
作为上述本发明的修饰寡核苷酸的具体的核酸碱基序列，优选可举出下述序列中记载的核酸碱基序列或该核酸碱基序列中包含的连续的17个碱基的核酸碱基序列：
TCGGGTAAGTAGATTTTC(序列号1的2159～2176的互补序列)(序列表的序列号239)、
AGGTTATAGGATGCAGGT(序列号1的5845～5862的互补序列)(序列表的序列号243)、
GAAGCTAAGTAGGTGACT(序列号1的15115～15132的互补序列)(序列表的序列号244)、
GTCATCCCTATGTCTTAT(序列号1的36607～36624的互补序列)(序列表的序列号259)、
GTCATATGGTCAGGGTAT(序列号1的40453～40470的互补序列)(序列表的序列号260)、
TGTCATATGGTCAGGGTA(序列号1的40454～40471的互补序列)(序列表的序列号261)、
ATGTCATATGGTCAGGGT(序列号1的40455～40472的互补序列)(序列表的序列号262)、或
TATGTCATATGGTCAGGG(序列号1的40456～40473的互补序列)(序列表的序列号263)。
更优选可举出下述序列中记载的核酸碱基序列或该核酸碱基序列中包含的连续的17个碱基的核酸碱基序列：
GTCATATGGTCAGGGTAT(序列号1的40453～40470的互补序列)(序列表的序列号260)。
这些序列中，1个以上的胞嘧啶也可以是后述的修饰核酸碱基的5-甲基胞嘧啶，具体而言，例如可举出序列号23、序列号38、序列号63、序列号131、序列号148、序列号149、序列号150或序列号151所示的序列，优选可举出序列号148所示的序列。
另外，作为本发明的修饰寡核苷酸的16个碱基的核酸碱基序列，例如可举出序列号264、序列号179、序列号265、序列号266、序列号192、序列号267、序列号268、序列号204、序列号269、序列号214、序列号220、序列号270、序列号271、序列号228或序列号230所示的序列，优选可举出序列号265、序列号268、序列号204、序列号269、序列号214、序列号220、序列号270、序列号271或序列号230所示的序列。
这些序列中，1个以上的胞嘧啶也可以是后述的修饰核酸碱基的5-甲基胞嘧啶，具体而言，例如可举出序列号168、序列号184、序列号187、序列号194、序列号203、序列号208、序列号224、或序列号225所示的序列，优选可举出序列号184、序列号203、序列号208、序列号224或序列号225所示的序列。
本发明修饰寡核苷酸可以是双链修饰寡核苷酸，优选使用单链修饰寡核苷酸。
(修饰糖)
本发明修饰寡核苷酸优选使用构成其的至少1个核苷含有修饰糖的寡核苷酸。本发明中修饰糖是指，糖部分被修饰的糖，含有1个以上该修饰糖的修饰寡核苷酸具有核酸酶稳定性的增强、结合亲和性的增大等有利的特征。修饰糖中的至少一个优选选自由双环式糖、2’-MOE修饰的糖、及2’-OMe修饰的糖组成的组中。作为双环式糖，例如如以下所示，可举出LNA、GuNA、ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]、或ALNA[Trz]的糖部分，优选使用ALNA[Ms]的糖部分。
作为取代糖部分的例子，可举出包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH3(2’-OMe)、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F及2’-O(CH2)2OCH3(2’-MOE)取代基的核苷，但并不限定于这些。2'位的取代基可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫、O-烯丙基、O-C1～C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)及O-CH2-C(＝O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)(式中，各R1、Rm及Rn独立地为H或者取代或未取代的C1～C10烷基)。
作为具有双环式糖的核苷的例子，可举出包含4’与2’的核糖环原子间的交联的核苷，但并不限定于这些。在一种实施方式中，本说明书中提供的寡核苷酸包含交联包含下式中的1个的具有1个或多个双环式糖的核苷：4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’及4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及它们的类似物。参见美国专利7，399，845号)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及它们的类似物。参见WO2009/006478)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(及它们的类似物。参照WO2008/150729号)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(及它们的类似物。参照US2004-0171570号)；4’-CH2-N(R)-O-2’(式中，R为H、C1～C12烷基或保护基)(参照美国专利7，427，672号)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(及它们的类似物。参照Chattopadhyaya etal.，J.Org.Chem.，2009，74，118-134)；以及4’-CH2-C(＝CH2)-2’(及它们的类似物。参照WO2008/154401号)。
在发表文献中报告了具有进一步的双环式糖的核苷(例如参照：Srivastava etal.，J.Am.Chem.Soc.，2007，129(26)8362-8379；Frieden et al.，Nucleic AcidsResearch，2003，21，6365-6372；Elayadi et al.，Curr.Opinion Invens.Drugs，2001，2，558-561；Braasch et al.，Chem.Biol.，2001，8，1-7；Orum et al.，Curr.OpinionMol.Ther.，2001，3，239-243；Wahlestedt et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638；Singh et al.，Chem.Commun.，1998，4，455-456；Koshkin et al.，Tetrahedron，1998，54，3607-3630；Kumar et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222；Singh et al.，；美国专利US7，399，845号；6，770，748号；6，525，191号；6，268，490号；美国US2008-0039618号；US2007-0287831号；US2004-0171570号；US2009-0012281号；WO2010/036698；WO2009/067647号；WO2009/067647号；WO2007/134181号；WO2005/021570号；WO2004/106356号；WO94/14226号；WO 2009/006478号；WO2008/154401号；及WO2008/150729号)。上述具有双环式糖的核苷分别可以通过具有例如含有α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖的1个或多个光学活性的糖构型而制备。
具有双环式糖的核苷的GuNA被报告为具有胍交联的人工核苷(参照WO2014/046212号、WO2017/047816号)。双环式核苷的ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Trz]及ALNA[Oxz]被报告为交联型人工核酸氨基LNA(ALNA)(参照国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826))。
在一种实施方式中，具有双环式糖的核苷在戊呋喃糖基糖部分的4'与2'的碳原子之间包含交联，包括独立地选自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-N(Ra)-、-O-、-Si(Ra)2-及-S(＝O)x-中的1个或1个～4个连接基团的交联，式中，X为0、1或2；n为1、2、3或4；各Ra及Rb独立地为H、保护基、羟基、C1～C12烷基、取代C1～C12烷基、C2～C12烯基、取代C2～C12烯基、C2～C12炔基、取代C2～C12炔基、芳香环基、取代芳香环基、杂环基、取代杂环基、C5～C7脂环基、取代C5～C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚硫酰基(S(＝O)-J1)，各J1和J2独立地为H、C1～C12烷基、取代C1～C12烷基、C2～C12烯基、取代C2～C12烯基、C2～C12炔基、取代C2～C12炔基、芳香环基、取代芳香环基、酰基(C(＝O)-H)、取代酰基、杂环基、取代杂环基、C1～C12氨基烷基、取代C1～C12氨基烷基或保护基，但并不限定于这些。
在一种实施方式中，双环式糖部分的交联为-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或C(RaRb)-O-N(R)-。在一种实施方式中，交联是4’-CH2-2’、4’-(CH2)2-2’、4’-(CH2)3-2’、4’-CH2-O-2’(此时的具有双环式糖的核苷也称为LNA)、4’-(CH2)2-O-2’、4’-CH2-O-N(R)-2’及4’-CH2-N(R)-O-2’-，式中，各R独立地为H、保护基或C1～C12烷基。
在一种实施方式中，双环式糖部分的交联是4’-CH2-O-2’-(LNA)或CH2-N(R)-，式中，各R独立地为-SO2-CH3(ALNA[Ms])、-CO-NH-CH3(ALNA[mU])、1,5-二甲基-1,2,4-三唑-3-基(ALNA[Trz])、-CO-NH-CH(CH3)2(ALNA[ipU])、5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基(ALNA[Oxz])(国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826))。
在一种实施方式中，具有双环式糖的核苷通过异构体立体构型进一步进行定义。例如，包含4'-(CH2)-O-2'交联的核苷可以以α-L-立体构型存在，也可以以β-D-立体构型存在。
在一种实施方式中，具有双环式糖的核苷包含具有4’-2’交联的核苷，作为这样的交联，可举出α-L-4’-(CH2)-O-2’、β-D-4’-CH2-O-2’、4’-(CH2)2-O-2’、4’-CH2-O-N(R)-2’、4’-CH2-N(R)-O-2’、4’-CH(CH3)-O-2’、4’-CH2-S-2’、4’-CH2-CH(CH3)-2’及4’-(CH2)3-2’(式中，R为H、保护基、C1～C12烷基、或可被C1～C12烷基取代的脲或胍)，但并不限定于这些。
在一种实施方式中，具有双环式糖的核苷具有以下式：
[化学式1]
式中，
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为氢原子、羟基的保护基、可被取代的磷酸基、与磷部分或支撑体的共价键等；
Za为C1～C6烷基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、取代C1～C6烷基、取代C2～C6烯基、取代C2～C6炔基、酰基、取代酰基、取代酰胺、硫醇或取代硫醇。
在一种实施方式中，各取代基可独立地被独立地选自卤素、氧代、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc及NJeC(＝X)NJcJd(式中，各Jc、Jd及Je独立地为H、C1～C6烷基或取代C1～C6烷基，X为O或NJc)中的取代基单取代或多取代。
在一种实施方式中，具有双环式糖的核苷具有以下式：
[化学式2]
式中，
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为氢原子、羟基的保护基、可被取代的磷酸基、与磷部分或支撑体的共价键等；
Zb为C1～C6烷基、C2～C6烯基、C2～C6炔基、取代C1～C6烷基、取代C2～C6烯基、取代C2～C6炔基或取代酰基(C(＝O))。
在一种实施方式中，具有双环式糖的核苷具有以下式：
[化学式3]
式中，
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为氢原子、羟基的保护基、可被取代的磷酸基、与磷部分或支撑体的共价键等；
Rd为C1～C6烷基、取代C1～C6烷基、C2～C6烯基、取代C2～C6烯基、C2～C6炔基或取代C2～C6炔基；
各qa、qb、qc和qd独立地为H、卤素、C1～C6烷基、取代C1～C6烷基、C2～C6烯基、取代C2～C6烯基、C2～C6炔基或取代C2～C6炔基、C1～C6烷氧基、取代C1～C6烷氧基、酰基、取代酰基、C1～C6氨基烷基或取代C1～C6氨基烷基。
在一种实施方式中，具有双环式糖的核苷具有以下式：
[化学式4]
式中，
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为氢原子、羟基的保护基、可被取代的磷酸基、与磷部分或支撑体的共价键等；
qa、qb、qe和qf各自独立地为氢、卤素、C1～C12烷基、取代C1～C12烷基、C2～C12烯基、取代C2～C12烯基、C2～C12炔基、取代C2～C12炔基、C1～C12烷氧基、取代C1～C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)-NJjJk或者N(H)C(＝S)NJjJk；
或者，qe及qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg及qh各自独立地为H、卤素、C1～C12烷基或取代C1～C12烷基。
具有4’-CH2-O-2’交联的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶双环式核苷(也称为LNA)的合成和制备与它们的寡聚物化和核酸识别特性一起有记载(Koshkin et al.，Tetrahedron，1998，54，3607-3630)。具有双环式糖的核苷的合成也记载于WO98/39352及WO99/14226中。
4’-CH2-O-2’(此时的双环式核苷也称为LNA)和4’-CH2-S-2’等具有4’-2’交联基的各种双环式核苷的类似物也有制备(Kumar et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222)。还记载有用作核酸聚合酶的底物的包含双环式核苷的寡聚脱氧核糖核苷酸双链的制备(Wengel et al.，WO99/14226)。此外，在本技术领域中还记载有2’-氨基-LNA(此时的双环式核苷也称为ALNA)、即立体结构上受到限制的高亲和性寡核苷酸类似物的合成(Singh et al.，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039)。此外，还制备了2’-氨基-及2’-甲基氨基-LNA，并在以前报告了互补的RNA链和DNA链这样的双链的热稳定性。
在一种实施方式中，具有双环式糖的核苷具有以下式：
[化学式5]
式中，
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为氢原子、羟基的保护基、可被取代的磷酸基、与磷部分或支撑体的共价键等；
各qi、qj、qk及ql独立地为H、卤素、C1～C12烷基、取代C1～C12烷基、C2～C12烯基、取代C2～C12烯基、C2～C12炔基、取代C2～C12炔基、C1～C12烷氧基、取代C1～C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk，
qi及qj或者ql及qk一起为＝C(qg)(qh)，式中，qg和qh各自独立地为H、卤素、C1～C12烷基或取代C1～C12烷基。
记载了具有4’-(CH2)3-2’交联和烯基类似物交联4’-CH＝CH-CH2-2’的1个碳环式双环式核苷(Frier et al.，Nucleic Acids Research，1997，25(22)，4429-4443及Albaeket al.，J.Org.Chem.，2006，71，7731-7740)。碳环式双环式核苷的合成和制备也与其寡聚物化和生物化学研究一起有记载(Srivastava et al.，J.Am.Chem.Soc.2007，129(26)，8362-8379)。
在一种实施方式中，作为具有双环式糖的核苷，可举出以下所示的化合物，但并不限定于这些。
[化学式6]
式中，Bx为碱基部分，R独立地为保护基、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基。
在一种实施方式(LNA)中，具有双环式糖的核苷可举出以下通式所示的核苷(参照WO98/39352)：
[化学式7]
式中，
B为核酸碱基；
X和Y各自独立地可举出氢原子、羟基的保护基、可被取代的磷酸基、与磷部分或支撑体的共价键等。
典型的具体例可举出下式所示的核苷酸：
[化学式8]
在一种实施方式(GuNA)中，含有双环式的核苷为下述通式所示的核苷(例如，参照国际公开第2014/046212号、国际公开第2017/047816号)：
[化学式9]
式中，B为核酸碱基，R3、R4、R5、R6各自独立地为氢原子、或可被1个以上的取代基取代的C1-6烷基，R7、R8各自独立地为氢原子、羟基的保护基、可被取代的磷酸基、与磷部分或支撑体的共价键等，而且R9、R10、R11各自独立地为氢原子、可被1个以上的取代基取代的C1-6烷基、或氨基的保护基。
在一种实施方式(ALNA[mU])中，含有双环式糖的核苷为下述通式(I)所示的核苷(例如，参照国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826))：
[化学式10]
式中，
B为核酸碱基；
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢原子、或可以被1个以上的取代基取代的C1-6烷基；
R5和R6各自独立地为氢原子、羟基的保护基、可被取代的磷酸基、与磷部分或支撑体的共价键等；
m为1或2；
X表示下述式(II-1)所示的基团：
[化学式11]
式(II-1)中记载的下述符号表示与2’-氨基的结合点：
[化学式12]
R7和R8中的一个为氢原子，另一个为可被1个以上的取代基取代的甲基。
典型的具体例是R7和R8中的一个为氢原子、另一个为未取代的甲基的核苷。
在一种实施方式(ALNA[ipU])中，含有双环式糖的核苷是具有在上述的ALNA[mU]中定义的通式(I)的核苷(例如，参照国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826))，在该式中，
X为下述式(II-1)所示的基团：
[化学式13]
R7和R8中的一个为氢原子，另一个为可被1个以上的取代基取代的异丙基。
典型的具体例是R7和R8中的一个为氢原子、另一个为未取代的异丙基的核苷。
在一种实施方式(ALNA[Trz])中，含有双环式的核苷为具有上述通式(I)的核苷(例如，参照国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826))，在该式中，X为下述式(II-2)所示的基团：
[化学式14]
A为可被1个以上的取代基取代的三唑基。
ALNA[Trz]的典型的具体例是A为可具有1个或多个甲基的三唑基的核苷，更具体而言，是A为1,5-二甲基-1,2,4-三唑-3-基的核苷。
在一种实施方式(ALNA[Oxz])中，具有在上述的ALNA[mU]中定义的通式(I)的核苷(例如，参照国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826))，在该式中，
X为下述式(II-2)所示的基团：
[化学式15]
A为可被1个以上的取代基取代的噁二唑基。
典型的具体例是A为可具有1个或多个甲基的噁二唑基的核苷或核苷酸，更具体而言，是A为5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基的核苷或核苷酸。
在一种实施方式(ALNA[Ms])中，含有双环式的核苷为具有上述通式(I)的核苷(例如，参照国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826))，在该式中，X为下述通式(II-3)所示的基团：
[化学式16]
M为被可被1个以上的取代基取代的甲基取代的磺酰基。
ALNA[Ms]的典型的具体例是M为被未取代的甲基取代的磺酰基的核苷。
在一种实施方式中，核苷通过与糖代用物的核糖环的替换来修饰。作为这样的修饰，可举出与代用环系(有时也称为DNA类似物)、例如吗啉代环、环己烯环、环己基环或四氢吡喃环、例如具有以下式中的1个的环的核糖环的替换，但并不限定于这些：
[化学式17]
在一种实施方式中，选择具有以下式的糖代用物：
[化学式18]
式中，
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接于寡聚物化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接于寡聚物化合物或寡核苷酸的核苷间连接基团，T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接共轭基团或5’或3’-末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7各自独立地为H、C1～C6烷基、取代C1～C6烷基、C2～C6烯基、取代C2～C6烯基、C2～C6炔基或取代C2～C6炔基；
R1及R2中的一个为氢，另一个选自卤素、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2及CN(式中，X为O、S或NJ1、各J1、J2及J3独立为H或C1～C6烷基)。
在一种实施方式中，q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7分别为H。在一种实施方式中，q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7中的至少1个为H以外。在一种实施方式中，q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7中的至少1个为甲基。在一种实施方式中，提供R1及R2中的一个为F的THP核苷。在一种实施方式中，R1为氟，且R2为H；R1为甲氧基，且R2为H，以及R1为甲氧基乙氧基，且R2为H。
作为这样的糖代用物，在本技术领域中，可举出被称为己糖醇核酸(HNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)和甘露糖醇核酸(MNA)的物质(参见Leumann，C.J.，Bioorg.&Med.Chem.，2002，10，841-854)，但并不限定于这些。
在一种实施方式中，糖代用物包含具有超过5个原子及超过1个杂原子的环。例如，报告了包含吗啉代糖部分的核苷和寡聚物化合物的其用途(例如参见Braasch et al.，Biochemistry，2002，41，4503-4510；以及美国专利5，698，685；5，166，315；5，185，444；及5，034，506)。
在本说明书中使用的情况下，术语“吗啉代”是指具有以下结构的糖代用物：
[化学式19]
在一种实施方式中，例如可以通过从上述的吗啉代结构中添加或改变各种取代基来修饰吗啉代。这样的糖代用物在本说明书中被称为“修饰吗啉代”。
在一种实施方式中，寡核苷酸包含代替天然存在的核苷的戊呋喃糖基基残基而具有6元环己烯基的核苷、即1个或多个的修饰环己烯基核苷。作为修饰环己烯基核苷，可举出本技术领域中记载的修饰环己烯基核苷(例如，参照共有的2010年4月10日公开的WO2010/036696；Robeyns et al.，J.Am.Chem.Soc.，2008，130(6)，1979-1984；Horvath et al.，Tetrahedron Letters，2007，48，3621-3623；Nauwelaerts et al.，J.Am.Chem.Soc.，2007，129(30)，9340-9348；Gu etal.，Nucleosides，Nucleotides&Nucleic Acids，2005，24(5-7)，993-998；Nauwelaerts et al.，Nucleic Acids Research，2005，33(8)，2452-2463；Robeyns et al.，Acta Crystallographica，Section F：Structural Biology andCrystallization Communications，2005，F61(6)，585-586；Gu et al.，Tetrahedron，2004，60(9)，2111-2123；Gu et al.，Oligonucleotides，2003，13(6)，479-489；Wang etal.，J.Org.Chem.，2003，68，4499-4505；Verbeure et al.，Nucleic AcidsResearch，2001，29(24)，4941-4947；Wang etal.，J.Org.Chem.，2001，66，8478-82；Wang et al.，Nucleosides，Nucleotides&Nucleic Acids，2001，20(4-7)，785-788；Wang et al.，J.Am.Chem.，2000，122，8595-8602；WO06/047842号；及WO01/049687号；各文本通过参照将其整体纳入本说明书中)，但并不限定于这些。
一种修饰环己烯基核苷具有以下式：
[化学式20]
式中，
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将环己烯基核苷类似物连接于寡核苷酸化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接于寡核苷酸化合物的核苷间连接基团，T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接共轭基团或5’-或3’-末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8及q9分别独立地为H、C1～C6烷基、取代C1～C6烷基、C2～C6烯基、取代C2～C6烯基、C2～C6炔基、取代C2～C6炔基或其它糖取代基。
可用于修饰用于组入寡聚核苷酸的核苷的许多其他双环式及三环式糖代用环系在本技术领域是已知的(例如，参照综述：Leumann，Christian J.，Bioorg.&Med.Chem.，2002，10，841-854)。这样的环系为了增强活性而能够接受各种进一步的替换。
修饰糖的制备方法对本领域技术人员来说是公知的。教示这样的修饰糖的制备的几个代表性的U.S.专利可举出U.S.：4，981，957；5，118，800；5，319，080；5，359，044；5，393，878；5，446，137；5，466，786；5，514，785；5，519，134；5，567，811；5，576，427；5，591，722；5，597，909；5，610，300；5，627，053；5，639，873；5，646，265；5，670，633；5，700，920；5，792，847及6，600，032以及WO2005/121371号，但并不限定于这些；这些分别通过参照将其整体纳入本说明书。
在具有修饰糖部分的核苷酸中，核酸碱基部分(天然、修饰或它们的组合)维持在与适当的核酸靶的杂交之间。
优选的修饰糖为ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]、或ALNA[Trz]的糖部分，其中更优选ALNA[Ms]的糖部分。这些修饰糖是新的，针对包含这些修饰糖的ATXN3的修饰寡核苷酸可以是与ATXN3的任意区域杂交的修饰寡核苷酸。
即，在一种实施方式中，本发明的修饰寡核苷酸为具有阻碍ATXN3表达的活性的由12～24个残基、优选16、17或18个碱基构成的修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸的核酸碱基序列与序列表的序列号1的核酸碱基序列的等长部分具有至少85％、至少90％、或至少95％的互补性，构成该寡核苷酸的核苷中的至少1个具有选自ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]、或ALNA[Trz]的糖部分的修饰糖。
(修饰核酸碱基)
核酸碱基(或碱基)的修饰或取代可与天然存在的或合成的非修饰核酸碱基从结构上识别，与这样的非修饰核酸碱基进一步在功能上具有互换性。天然和修饰核酸碱基这两者都可以参与氢键。这样的核酸碱基修饰可以将核酸酶稳定性、结合亲和性或一些其他有益的生物学特性赋予给寡聚核苷酸化合物。本发明修饰寡核苷酸优选使用构成其的至少1个核苷包含修饰核酸碱基的修饰寡核苷酸。作为修饰核酸碱基，例如可举出5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。5-甲基胞嘧啶是指被键合于5位的甲基修饰的胞嘧啶。包含5-甲基胞嘧啶取代的某种核酸碱基取代对于增大寡核苷酸的结合亲和性特别有用。例如，5-甲基胞嘧啶取代显示使核酸的双链稳定性增大0.6～1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，eds.，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)。
作为进一步的修饰核酸碱基，可举出5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(伪尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代、特别是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤、3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。
杂环碱基部分也可以包含嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环、例如7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂鸟苷、2-氨基吡啶及2-吡啶酮取代的部分。作为对于增大修饰寡核苷酸的结合亲和性特别有用的核酸碱基，可举出5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。
(修饰核苷间键)
在RNA和DNA的天然存在的核苷间键为3’-5’磷酸二酯键。具有1个或多个修饰的、即天然不存在的、具有核苷间键的寡核苷酸例如以细胞摄入的增强、与靶核酸的亲和性的增强以及核酸酶存在下的稳定性的增大等特性为理由，大多比具有天然存在的核苷间键的寡核苷酸更优选。
具有修饰核苷间键的寡核苷酸包含保持磷原子的核苷间键及不具有磷原子的核苷间键。作为代表性的含磷的核苷间键，可举出磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯中的1种以上，但并不限定于这些。含磷和不含磷键的制备方法是公知的。
本发明修饰寡核苷酸的核苷间键只要是修饰寡核苷酸具有阻碍ATXN3表达的活性的核苷间键，可以是任意的核苷间键，但优选使用至少1个核苷间键包含硫代磷酸酯核苷间键的核苷间键，例如可以全部核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
(修饰寡核苷酸基序)
在一种实施方式中，为了获得对由核酸酶引起的分解的抵抗性的增大、细胞摄入的增大、对靶核酸的结合亲和性的增大和/或ATXN3表达阻碍活性的增大，本发明的修饰寡核苷酸可以具有Gapmer基序。
“Gapmer”是指具有辅助基于RNase H的剪切的多个核苷的内部区域位于具有1个或多个核苷的外部区域间的修饰寡核苷酸。内部区域可以称为“间隙片段”，外部区域可以称为“侧翼片段”。可以将存在于比间隙片段更靠5’侧的侧翼片段称为“5’侧翼片段”，将存在于比间隙片段更靠3’侧的侧翼片段称为“3’侧翼片段”。在Gapmer中，接近Cap的各个侧翼的核苷(5’侧翼的最靠3’侧的核苷和3’侧翼的最靠5’侧的核苷)的糖部分与邻接的Cap核苷的糖部分不同。例如，5’侧翼的最靠3’侧的核苷和3’侧翼的最靠5’侧的核苷的糖部分是修饰糖，相邻的Cap核苷的糖部分是天然的DNA的糖部分。
侧翼-Cap-侧翼基序可以记载为“X-Y-Z”，“X”表示5′侧翼区域的序列长度，“Y”表示Cap区域的序列长度，“Z”表示3′侧翼区域的序列长度。
在一种实施方式中，本发明修饰寡核苷酸为下述的修饰寡核苷酸，其包含1)间隙片段、2)5’侧翼片段及3)3’侧翼片段，所述间隙片段位于所述5’侧翼片段与所述3’侧翼片段之间，所述5’侧翼片段及3’侧翼片段的核苷包含修饰糖。间隙片段的核苷的糖部分可以仅是天然的DNA的糖部分，也可以包含1个或1个以上的修饰糖。作为修饰糖，优选选自由双环式糖、2’-MOE修饰的糖和2’-OMe修饰的糖组成的组，作为双环式糖，例如可举出LNA、GuNA、ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]和ALNA[Trz]中的至少1个的糖部分。
间隙片段、5’侧翼片段以及3’侧翼片段所包含的核苷的数量只要具有ATXN3表达阻碍活性，可以是任意数量，例如可举出间隙片段为12个、5’侧翼片段为3个及3’侧翼片段为3个、或者间隙片段为10个、5’侧翼片段为3个及3’侧翼片段为3个，更优选间隙片段为12个、5’侧翼片段为3个及3’侧翼片段为3个。
在一种实施方式中，为了增强核酸酶稳定性等特性，在修饰寡核苷酸的一方或双方的末端包含Cap结构。优选的Cap结构有4’,5’-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃酰基)核苷酸、4’-硫代核苷酸、碳环式核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键、苏式-戊呋喃糖基核苷酸、非环式3’,4’-断核苷酸(3’,4’-seconucleotides)、非环式3,4-二羟基丁基核苷酸、非环式3,5-二羟基戊基核苷酸、3’-3’-逆位核苷酸部分、3’-3’-逆位脱碱基部分、3’-2’-逆位核苷酸部分、3’-2’-逆位脱碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3’-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3’-磷酸酯、3’-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、交联甲基膦酸酯部分和未交联甲基膦酸酯部分、5’-氨基-烷基磷酸酯、1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯、6-氨基己基磷酸酯、1,2-氨基十二烷基磷酸酯、羟基丙基磷酸酯、5’-5’-逆位核苷酸部分、5’-5’-逆位脱碱基部分、5’-氨基磷酸酯、5’-硫代磷酸酯、5’-氨基、交联和/或未交联5’-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、以及5’-巯基部分。
(本发明化合物的评价方法)
作为本发明化合物的评价方法，只要是能够验证本发明化合物阻碍ATXN3在细胞内的表达水平的方法，则可以是任意方法，具体而言，例如可以使用以下所示的体外(invitro)和体内(invivo)ATXN3表达测定方法。
关于用于评价本发明化合物抑制细胞内的ATXN3表达的体外ATXN3表达测定方法，只要是表达ATXN3的细胞(以下，有时称为“ATXN3表达细胞”)，则可以使用任意的细胞，例如可举出SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞，例如ATCC CRL-2266)。
使本发明化合物与ATXN3表达细胞接触的方法也没有特别限制，可举出通常用于将核酸导入细胞内的方法。具体而言，例如为脂转染法、电穿孔法、Gymnosis法等。就Gymnosis法而言，本发明化合物例如可以以0.3、1、3、10或30μM的终浓度进行处理。
ATXN3在细胞内的mRNA水平可以通过本技术领域已知的各种方法进行分析。具体而言，例如可举出Northern blot分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或定量性实时PCR等。
ATXN3在细胞内的蛋白水平可以通过本技术领域已知的各种方法进行分析。具体而言，可举出例如免疫沉降法、Western blot分析(免疫印迹法)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、定量性蛋白分析、蛋白活性分析(例如胱天蛋白酶活性分析)、免疫组织化学法、免疫细胞化学法或荧光活化细胞分选(FACS)等。
关于用于评价本发明化合物阻碍细胞内的ATXN3表达的体内ATXN3表达测定方法，例如可举出对表达ATXN3的动物给予本发明化合物，在该细胞中进行上述ATXN3表达水平的分析的方法。
本发明化合物可以使用市售的DNA/RNA合成用亚磷酰胺化合物(amidite，也包括LNA)通过亚磷酰胺法合成。人工核酸ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]及ALNA[Trz]可以通过国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826)中记载的方法来合成寡聚物(参照后述的参考例)。
(使用本发明化合物的ATXN3相关疾病的治疗)
本发明化合物通过阻碍ATXN3表达，可以治疗ATXN3相关疾病。作为ATXN3相关疾病，只要是由ATXN3的异常引起的疾病就没有特别限制，可以例示出神经变性疾病。
另外，本发明化合物能够改善神经变性疾病的1个或多个症状，作为症状，例如可举出运动失调症、神经病变及聚集体形成。作为神经变性疾病，例如可举出脊髓小脑变性症3型。
在脊髓小脑变性症3型中，由于ATXN3上发生CAG重复伸长，引起由RNA毒性、或作为其翻译产物的poly谷氨酰胺引起的线粒体障碍、转录异常、钙稳态性异常、自噬异常、轴突输送异常等，发生小脑purkinje细胞的功能降低、脱落、进而引起运动功能障碍等。已知对于使ATXN3的CAG重复伸长表达的脊髓小脑变性症3型模型动物，通过引起ATXN3 mRNA表达阻碍的ATXN3的反义寡核苷酸给药，运动功能障碍得到抑制。因此，强力地阻碍ATXN3表达的本发明修饰寡核苷酸能够对脊髓小脑变性症3型进行治疗、预防或使其进展延缓。
因此，本发明提供：用于ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓的修饰寡核苷酸；用于ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓的药物组合物；修饰寡核苷酸用于治疗、预防ATXN3相关疾病或使其进展延缓的用途；修饰寡核苷酸在制造ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓用药物中的用途；用于制造ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓用药物的修饰寡核苷酸；ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓的方法，其包含将有效量的修饰寡核苷酸给药至需要其的对象的工序。
(2)含有修饰寡核苷酸的药物组合物
包含本发明化合物或其医药上可容许的盐、及药学上可容许的载体在内的本发明化合物可用作药物组合物。为了制备药物组合物，可以将修饰寡核苷酸与1个以上的医药上可容许的活性或惰性的物质混合。用于药物组合物的制剂化的组合物和方法可以根据包括给药途径、疾病的程度或给药的剂量在内的几个判断基准来选择。
例如，作为用于非经口给药的组合物，例如使用注射剂。该注射剂按照自身公知的方法，例如通过将上述修饰寡核苷酸溶解、悬浮或乳化于通常注射剂中使用的无菌的水性或油性液中来制备。作为注射用水性液，例如可以使用包括磷酸缓冲盐水、生理盐水、葡萄糖或其他辅助药在内的等渗液等，可以与适当的溶解辅助剂，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨糖醇80、HCO-50(polyoxyethylene(50mo1)adduct of hydrogenated castor oil，氢化蓖麻油聚氧乙烯醚(50mol)加合物)]等并用。另外，还可以含有缓冲剂、pH调节剂、等渗剂、无痛化剂、防腐剂、稳定剂等。该组合物可以通过公知的方法制造。
作为非经口给药，例如可举出皮下给药、静脉内给药、肌内给药、动脉内给药、腹腔内给药、颅内给药、髓腔内给药、脑室内给药，但并不限定于这些。给药可以是持续的或长期的，也可以是短期的或间断的。
作为用于经口给药的组合物，可举出固体或液体的剂型，具体而言，可举出片剂(包括糖衣片、膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。该组合物通过公知的方法来制造，可含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。作为片剂用的载体、赋形剂，例如使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等，作为稀释剂，例如使用生理盐水。
另外，本发明的医药组合物中可以含有核酸导入用试剂。作为该核酸导入用试剂，可以使用脂质体、Lipofectin、Lipofectamine、DOGS(Transfectam)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、凝聚胺(polybrene)、或者聚(乙烯亚胺)(PEI)等阳离子性脂质等。
另外，本发明的药物组合物中所含的修饰寡核苷酸优选使用在1个或多个位点与和脂肪酸、胆固醇、糖质、磷脂、抗体等生物体内分子具有亲和性的蛋白、生物素、吩嗪、维生素、肽、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素及色素的共轭基团共轭而得到的物质。上述共轭的修饰寡核苷酸可以通过公知的方法制造，选择增强其活性、组织分布、细胞分布或细胞摄入的寡核苷酸。
上述共轭基团直接与修饰寡核苷酸键合、或共轭基团通过选自氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和部分(例如双键或三键)、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、叠氮基、取代C1～C10烷基、取代或未取代C2～C10烯基、及取代或未取代C2～C10炔基中的连接部分与修饰寡核苷酸键合。其中，取代基选自氨基、烷氧基、羧基、叠氮基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
作为本发明的药物组合物的给药方式，可以是经口给药、静脉内给药或动脉内给药等全身给药，也可以是颅内给药、髓腔内给药或脑室内给药等局部给药，但并不限定于这些。本发明的药物组合物的给药量可以根据使用目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别等适当变更，通常，作为修饰寡核苷酸量，可以从0.1ng～100mg/kg/天、优选1ng～10mg/kg/天的范围中选择。
通过非限定公开及参照的纳入
本说明书中记载的某种化合物、组合物及方法按照某种实施方式进行了特异性的记载，但以下的实施例只不过起到例示本说明书中记载的化合物的作用，并不是为了对其进行限定。本申请中记载的参考文献分别通过参照将其整体纳入本说明书中。
实施例1
体外评价用修饰寡核苷酸化合物的合成及精制
使用ALNA[Ms]亚磷酰胺化合物(通过国际申请PCT/JP2019/044182号(WO2020/100826)中记载的方法合成)，利用DNA/RNA寡核苷酸自动合成机nS-8II(株式会社GeneDesign制)以0.5μmol规模使用CPG或聚苯乙烯载体合成修饰寡核苷酸化合物。亚磷酰胺化合物全部制备成0.1M的乙腈溶液，非天然型核苷中的偶联时间以10分钟进行，除此以外的工序以nS-8II的标准条件进行。活化剂使用了Activator42(Sigma-Aldrich)、硫化使用了Sulfurizing ReagentII(Gren Research Corporation)、氧化使用了Oxidizer(Sigma-Aldrich)。合成的寡核苷酸加入28％氨水溶液，在85℃下使其反应8小时，由此进行从载体的切出和碱基部的脱保护。将氨浓缩馏去后，用NAP10进行简易精制后，进行反相HPLC精制。
将合成的修饰寡核苷酸化合物示于表1(18个残基的修饰寡核苷酸)和表2(16个残基的修饰寡核苷酸)。关于化合物的表述，各核苷酸以3个字符表示。其中3’末端的核苷酸由于没有核苷间键而以2个字符表示。
1)第一个字符用大写字母表示，表示下述核酸碱基：
A＝腺嘌呤、T＝胸腺嘧啶、G＝鸟嘌呤、C＝胞嘧啶、U＝尿嘧啶、M＝5-甲基胞嘧啶，
2)第二个字符表示下述各糖部分：
m＝ALNA[Ms]，d＝2’-脱氧核糖，
3)第三个字符表示下述核苷间键：
s＝硫代磷酸酯、p＝磷酸二酯。
目标开始位置表示修饰寡核苷酸的ATXN3 pre-mRNA5’目标部位(与修饰寡核苷酸的3’末端对应的序列表的序列号1的位置)，目标结束位置表示修饰寡核苷酸的ATXN3 pre-mRNA3’目标部位(与修饰寡核苷酸的5’末端对应的序列表的序列号1的位置)。
实施例2
修饰寡聚核苷酸化合物的精制及纯度确认
合成的修饰寡聚核苷酸化合物的精制及纯度确认通过反相HPLC在以下的条件下进行。
反相HPLC(精制)
流动相：
A液：400mM六氟异丙醇、15mM三乙胺
B液：甲醇
梯度：A：B＝83：17→70：30(10min)
使用柱：
分取Waters XBridge@Oligonucleotide BEH C18 OBDTM Prep Column，
2.5μm，10mm*50mm
流速：
分取5mL/min
柱温：60℃
检测：UV(260nm)
反相HPLC(纯度确认)
流动相：
A液：400mM六氟异丙醇、15mM三乙胺水溶液
B液：甲醇
梯度：A：B＝82：18→73.5：26.5(5min)
使用柱：
Waters XBridge@Oligonucleotide BEH C18 OBDTM Prep Column，
2.5μm，4.6mm*50mm
流速：1mL/min
柱温：60℃
检测：UV(260nm)
实施例3
体外ATXN3表达比试验(Gymnosis法)
每1孔接种3×103个SH-SY5Y细胞，同时将合成的修饰寡核苷酸以3或10μmol/L的终浓度添加，用CO2培养箱孵育3天。从细胞中提取RNA后，进行逆转录反应，得到cDNA。使用所得到的cDNA，进行利用针对ATXN3或GAPDH的引物和探针进行的定量实时PCR。ATXN3 mRNA水平通过计算相对于GAPDH的量比而得到。ATXN3表达比如下算出：与未添加修饰寡核苷酸的细胞中的ATXN3 mRNA水平相比，以百分率算出添加了修饰寡核苷酸的细胞中的ATXN3mRNA水平。将添加了终浓度为3μmol/L的18个残基的修饰寡核苷酸时的ATXN3表达比的结果示于表1和表3，将添加了终浓度为10μmol/L的16个残基的修饰寡核苷酸时的ATXN3表达比的结果示于表2。
实施例4
体外ATXN3表达比试验(Gymnosis法)
合成WO2018/089805中记载的代表修饰寡核苷酸650528、WO2019/217708中记载的代表修饰寡核苷酸1100673或WO2020/172559中记载的代表修饰寡核苷酸1287095。这些修饰寡核苷酸的目标开始位置和目标结束位置如表4所记载。合成使用2’-MOE(2’-O-甲氧基乙基)亚磷酰胺化合物，与实施例1及实施例2同样地进行。每1孔接种3×103个SH-SY5Y细胞，同时将合成的修饰寡核苷酸以3或10μmol/L的终浓度添加，用CO2培养箱孵育3天。从细胞中提取RNA后，进行逆转录反应，得到cDNA。使用所得到的cDNA，进行使用针对ATXN3或GAPDH的引物和探针进行的定量实时PCR。ATXN3 mRNA水平通过计算相对于GAPDH的量比而得到。ATXN3表达比如下算出：与未添加修饰寡核苷酸的细胞中的ATXN3mRNA水平相比，以百分率算出添加了修饰寡核苷酸的细胞中的ATXN3mRNA水平。将结果示于表4。
表1-1
表1-2
表1-3
表2-1
表2-2
表3
表4
| 化合物ID | 目标开始位置 | 目标结束位置 | 3μM | 10μM | |
| WO2018/089805 | 650528 | 44828 | 44845 | 82.0 | 61.8 |
| WO2019/217708 | 1100673 | 43010 | 43029 | 52.4 | 35.4 |
| WO2020/172559 | 1287095 | 44221 | 44240 | 41.7 | 29.0 |
参考例
以下示出含有ALNA[Ms]的核苷、含有ALNA[mU]的核苷、含有ALNA[ipU]的核苷、含有ALNA[Trz]的核苷、含有ALNA[Oxz]的核苷的合成法的流程。需要说明的是，起始化合物1a、1d、1g可以通过国际公开第2017/047816号中记载的方法来合成。
ALNA[Ms]-T的合成
[化学式21]
ALNA[Ms]-mC的合成
[化学式22]
ALNA[Ms]-G的合成
[化学式23]
ALNA[Ms]-A的合成
[化学式24]
ALNA[mU]-T的合成
[化学式25]
ALNA[mU]-mC的合成
[化学式26]
ALNA[mU]-G的合成
[化学式27]
ALNA[mU]-A的合成
[化学式28]
ALNA[ipU]-T的合成
[化学式29]
ALNA[ipU]-mC的合成
[化学式30]
ALNA[ipU]-G的合成
[化学式31]
ALNA[ipU]-A的合成
[化学式32]
ALNA[Trz]-T的合成
[化学式33]
ALNA[Trz]-mC的合成
[化学式34]
ALNA[Trz]-G的合成
[化学式35]
ALNA[Trz]-A的合成
[化学式36]
ALNA[Oxz]-T的合成
[化学式37]
ALNA[Oxz]-mC的合成
[化学式38]
在本说明书中，只要没有特别的记载，单数形式的使用包括复数形式。在本说明书中，只要没有特别的记载，“或”的使用是指“和/或”。此外，用语“包含(including)”以及其他方式、例如“含有(includes)”以及“所包含的(included)”的使用并不是限定性的。此外，只要没有特别的记载，“要素”等用语包括包含1个单元的要素和包含超过1个的子单元的要素。
本说明书中使用的部分(section)的标题仅用于构成上的目的，不应该被解释为对所记载的主题进行限制。对于包括专利、专利申请、报告、书籍及论文在内的本申请中所引用的所有文件或文件的一部分，但并不限定于这些，涉及本说明书中讨论的文件的一部分及其整体通过参照明确地纳入本说明书中。
只要不给出具体的定义，本说明书中记载的分析化学、有机合成化学、以及与医化学及药化学相关地利用的命名法、及它们的顺序及技术方法在本技术领域中是公知的，是通常使用的。可以将标准的技术方法用于本说明书中使用的化学合成和化学分析。在容许的情况下，贯穿本说明书的公开整体而提及的所有的专利、申请、公开申请以及其他出版物、通过国立生物技术信息中心(NCBI)等数据库可获得的GenBank保藏编号以及相关的序列信息以及其他数据，涉及本说明书中讨论的文件的一部分及其整体通过参照而纳入。
另外，虽然本说明书与电子格式的序列表一起提交申请，但该电子格式中记载的序列表的信息通过参照将其整体纳入本说明书中。
Claims (18)
1.一种修饰寡核苷酸，其是具有阻碍Ataxin 3(ATXN3)表达的活性的修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸的核酸碱基序列为选自下述组中的任一个的核酸碱基序列或该核酸碱基序列中包含的连续的17个碱基的核酸碱基序列：
1)TCGGGTAAGTAGATTTTC(序列号1的2159～2176的互补序列)(序列表的序列号239)
2)GAAGTATCTGTAGGCCTA(序列号1的2513～2530的互补序列)(序列表的序列号240)
3)GGACTGTATAGGAGATTA(序列号1的2646～2663的互补序列)(序列表的序列号241)
4)GGTTATAGGATGCAGGTA(序列号1的5844～5861的互补序列)(序列表的序列号242)
5)AGGTTATAGGATGCAGGT(序列号1的5845～5862的互补序列)(序列表的序列号243)
6)GAAGCTAAGTAGGTGACT(序列号1的15115～15132的互补序列)(序列表的序列号244)
7)TGAAGCTAAGTAGGTGAC(序列号1的15116～15133的互补序列)(序列表的序列号245)
8)CCTAGTCACTTTGATAGA(序列号1的19163～19180的互补序列)(序列表的序列号246)
9)GGAACATCTTGAGTAGGT(序列号1的19737～19754的互补序列)(序列表的序列号247)
10)GGTGTTCAGGGTAGATGT(序列号1的20835～20852的互补序列)(序列表的序列号248)
11)GGATACTCTGCCCTGTTC(序列号1的21482～21499的互补序列)(序列表的序列号249)
12)GGTGTCAAACGTGTGGTT(序列号1的22200～22217的互补序列)(序列表的序列号250)
13)CCGTGTGCTAGTATTTGT(序列号1的27389～27406的互补序列)(序列表的序列号251)
14)TAGTAGAGTTTTGCTTGG(序列号1的31570～31587的互补序列)(序列表的序列号252)
15)GATGTAGTAGAGTTTTGC(序列号1的31574～31591的互补序列)(序列表的序列号253)
16)TGATGTAGTAGAGTTTTG(序列号1的31575～31592的互补序列)(序列表的序列号254)
17)CTGATGTAGTAGAGTTTT(序列号1的31576～31593的互补序列)(序列表的序列号255)
19)GCAAGTTGGTTTGTGGTA(序列号1的32008～32025的互补序列)(序列表的序列号256)
20)TCTAGGCAATTGTGGTGG(序列号1的32127～32144的互补序列)(序列表的序列号257)
21)GTAACTCTGCACTTCCCA(序列号1的36411～36428的互补序列)(序列表的序列号258)
22)GTCATCCCTATGTCTTAT(序列号1的36607～36624的互补序列)(序列表的序列号259)
23)GTCATATGGTCAGGGTAT(序列号1的40453～40470的互补序列)(序列表的序列号260)
24)TGTCATATGGTCAGGGTA(序列号1的40454～40471的互补序列)(序列表的序列号261)
25)ATGTCATATGGTCAGGGT(序列号1的40455～40472的互补序列)(序列表的序列号262)及
26)TATGTCATATGGTCAGGG(序列号1的40456～40473的互补序列)(序列表的序列号263)。
2.根据权利要求1所述的修饰寡核苷酸，其为单链。
3.根据权利要求1或2所述的修饰寡核苷酸，其中，构成修饰寡核苷酸的至少1个核苷包含修饰糖。
4.根据权利要求3所述的修饰寡核苷酸，其中，修饰糖选自由双环式糖、2’-MOE(2’-O-甲氧基乙基)修饰的糖、及2’-OMe修饰的糖组成的组。
5.根据权利要求4所述的修饰寡核苷酸，其中，双环式糖选自LNA、GuNA、ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]、或ALNA[Trz]的糖部分。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的修饰寡核苷酸，其中，构成所述修饰寡核苷酸的至少1个核苷包含修饰核酸碱基。
7.根据权利要求6所述的修饰寡核苷酸，其中，修饰核酸碱基为5-甲基胞嘧啶。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的修饰寡核苷酸，其中，构成所述修饰寡核苷酸的至少1个核苷间键为修饰核苷间键。
9.根据权利要求8所述的修饰寡核苷酸，其中，修饰核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的修饰寡核苷酸，其中，所述修饰寡核苷酸包含：
1)间隙片段，
2)5’侧翼片段，及
3)3’侧翼片段，
所述间隙片段位于所述5’侧翼片段与所述3’侧翼片段之间，
构成所述5’侧翼片段及3’侧翼片段的核苷包含修饰糖。
11.一种修饰寡核苷酸，其是具有阻碍ATXN3表达的活性的由12～24个残基构成的修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸的核酸碱基序列与序列表的序列号1的核酸碱基序列的等长部分具有至少85％的互补性，构成该寡核苷酸的核苷中的至少1个具有选自ALNA[Ms]、ALNA[mU]、ALNA[ipU]、ALNA[Oxz]、或ALNA[Trz]的糖部分中的修饰糖。
12.一种药物组合物，其含有权利要求1～11中任一项所述的修饰寡核苷酸或其医药上可容许的盐、以及药学上可容许的载体。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其用于ATXN3相关疾病的治疗、预防、或使其进展延缓。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述ATXN3相关疾病为神经变性疾病。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述神经变性疾病为脊髓小脑变性症3型。
16.一种用于治疗、预防对象中的ATXN3相关疾病或使其进展延缓的方法，其特征在于，将权利要求1～13中任一项所述的修饰寡核苷酸的有效量给药至需要其的对象。
17.权利要求1～11中任一项所述的修饰寡核苷酸在制造用于ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓的药物中的用途。
18.用于ATXN3相关疾病的治疗、预防或使其进展延缓的权利要求1～11中任一项所述的修饰寡核苷酸。
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