KR20230050447A - Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체 및 이를 위한 제조방법 - Google Patents

Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체 및 이를 위한 제조방법 Download PDF

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Abstract

Cap2 구조를 갖는 5'Cap 유사체 및 이를 위한 제조방법. Cap2 구조를 갖는 5'Cap 유사체의 분자식은 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG), m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeG) 등 중 어느 하나로부터 선택된다. Cap2 구조를 갖는 5'Cap 유사체는 보다 높은 합성 효율, 보다 높은 캡핑 효율, 보다 낮은 면역원성 및 보다 높은 단백질 번역 효율을 갖는다.

Description

Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체 및 이를 위한 제조방법
본 출원은 "Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체 및 이를 위한 제조방법"이라는 발명의 명칭으로 2020년 8월 20일에 중국 특허청에 제출된 중국 특허 출원 제202010842263.2호에 대한 우선권을 주장한다. 이의 전체 내용은 본 출원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 유전공학 기술 분야에 관한 것이며, 구체적으로 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
번역 효율 및 면역원성은 mRNA 약물이 이들의 기능을 수행하는 두 가지 핵심 요소이다. RIG-I 및 IFIT와 같은 자가면역 단백질은 비정상적인 cap을 갖는 mRNA를 인식하여 외인성 mRNA의 세포내 활성 및 반감기를 감소시켜 mRNA 약물이 생체내에서 기능하기 어렵게 만든다. 따라서, mRNA cap 구조를 최적화하는 것은 mRNA의 생물학적 활성을 개선하고 면역원성을 감소시키는데 필수적이다.
현재 시험관내에서 cap 구조를 갖는 mRNA를 합성하는 두 가지 방법이 있다. 첫 번째 방법에서는, mRNA가 전사된 후, 이를 백시니아 바이러스 캡핑 효소(Vaccinia Virus Capping Enzyme)로 캡핑하여 Cap 0 구조 또는 Cap 1 구조를 갖는 RNA를 생산한다. 이 방법은 효율적이지만, 수율이 불안정하고 비용이 많이 든다. 또한, 효소 캡핑 방법은 Cap 2 구조 및 m6Am 구조를 갖는 cap을 생산하지 못한다. 두 번째 방법은 전사 동안 캡핑을 위해 과량의 Cap 유사체를 추가하는 것이다. 지금까지 가장 일반적으로 사용되는 구조적 Cap 유사체는 ARCA이며, 이를 사용하여 면역원성 Cap 0을 생산할 수 있지만 캡핑 효율이 70%에 불과하다. 이 방법의 수율도 비교적 낮으며, 전사 반응 시스템 ml당 최대 1.5mg RNA가 제조되고, 전사된 생성물은 매우 면역원성이다. Cleancap이라고 불리는 또 다른 신규한 공동-전사 캡핑 방법이 또한 널리 사용된다. Cleancap은 Cap 1에 속하며, T7 전사를 개시하기 위해 이량체(m7GpppG)를 사용하는 ARCA와 달리, Cleancap은 T7 전사를 개시하기 위해 삼량체(m7GpppAmG)를 사용한다. 상기 방법은 비교적 높은 수율을 가지며, 90%의 캡핑 효율로 전사 반응 시스템 ml당 4mg의 캡핑된 RNA를 제조하고, 이의 전사 생성물은 ARCA보다 덜 면역원성이다.
mRNA 합성 시스템에서 기존 Cap 유사체의 낮은 캡핑 효율, 합성 용적당 낮은 mRNA 수율 및 높은 면역원성의 단점에 기초하여, 본 발명자들은 Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체를 개발하였으며, 이는 상기 적용 단점을 보완할 뿐만 아니라 단백질 번역 효율을 크게 개선한다.
상기 이유에 기초하여, 본 발명은 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 의해 제공된 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체는 보다 높은 합성 효율, 보다 높은 캡핑 효율, 보다 낮은 면역원성 및 보다 높은 단백질 번역 효율을 나타낸다.
본 발명은 다음의 기술적 해결책에 의해 실현된다.
Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체로서, 상기 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체는 하기 식 중 어느 하나로부터 선택된 분자식을 갖는다:
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeG),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG),
3´-O-Me-m7G(5')ppp (5')(2'OMeG)p(2'OMeG),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU), 및
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU).
본 발명은 다음 단계들을 포함하는, 상기 기술적 해결책에 기재된 바와 같은 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체의 제조방법을 추가로 제공한다:
(1) 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP를 각각 RNase-비함유 물(RNase-free water)에 용해시키고, 인산염 가수분해효소 및 2× 반응 완충액과 각각 혼합한 다음, 배양하여 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 수득하는 단계;
(2) 단계 1)로부터 수득된 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 RNase-비함유 물에 용해시키고, 7-메틸구아노신, 7-메틸-3'-O 메틸구아노신, 구아노실트랜스퍼라제 및 2× 반응 완충액과 혼합한 다음, 배양하여 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)를 수득하는 단계; 및
3) 단계 2)로부터 수득된 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, T4 RNA 리가제 1(Ligase 1)과 혼합한 다음, 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP와 각각 혼합한 후, 2×T4 RNA 리가제 반응 완충액과 혼합하고 배양하여 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체를 수득하는 단계.
바람직하게는, 단계１에서 RNase-비함유 물의 용적에 대한 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP, 및 2'-O-메틸-UTP의 양의 비율은 1 내지 30 mmol:14 μL이다.
바람직하게는, 단계 1)에서 인산염 가수분해효소 및 2× 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비는 14:1:15이다.
바람직하게는, 인산염 가수분해효소는 50,000 U의 효소 활성을 갖는다.
2× 반응 완충액의 성분은 50mM Tris-HCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 및 1mM DTT를 포함하고, 8의 pH 값을 갖는다.
바람직하게는, 단계 1) 내지 3)의 배양 온도는 37℃이고, 이의 배양 시간은 각각 1시간이다.
바람직하게는, 단계 2)에서, 7-메틸-구아노신, 7-메틸-3'-O-메틸-구아노신, 구아노실트랜스퍼라제 및 2× 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비는 11:10:10:1:22이다.
바람직하게는, 단계 3)에서, T4 RNA 리가제 1 및 2× T4 RNA 리가제 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비는 11:1:22이다.
바람직하게는, 2×T4 RNA 리가제 반응 완충액의 성분은 60mM Tris-HCl, 20mM MgCl2, 20mM DTT 및 2mM ATP를 포함한다.
바람직하게는, T4 RNA 리가제 1의 효소 활성은 10,000 U이다.
본 발명의 유리한 효과는 다음과 같다.
본 발명에서 Cap2 구조를 갖는 32종의 Cap 유사체는 기존의 Cap 유사체인 ARCA 및 Cleancap에 비해 보다 높은 합성 효율을 갖고,
본 발명에서 Cap2 구조를 갖는 32종의 Cap 유사체는 기존의 Cap 유사체인 ARCA 및 Cleancap에 비해 보다 높은 캡핑 효율을 가지며,
본 발명에서 Cap2 구조를 갖는 32종의 Cap 유사체는 기존의 Cap 유사체인 ARCA 및 Cleancap에 비해 보다 낮은 면역원성을 나타내고,
본 발명에서 Cap2 구조를 갖는 32종의 Cap 유사체는 기존의 Cap 유사체인 ARCA 및 Cleancap에 비해 보다 높은 단백질 번역 효율을 갖는다.
도 1 내지 도 3에서, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP - HPLC)를 사용하여 25℃에서 각 최종 생성물의 구조 및 균질성을 확인하였다.
도 4 내지 7은 Cap 유사체와 결합하는 생성물에 대한 형광 적정 곡선을 보여준다. 리간드 농도가 증가함에 따라, 곡선의 변화는 eIF4E와 상응하는 Cap 유사체 사이의 보다 약한 결합을 나타낸다. 리간드 농도가 증가함에 따라 형광 신호가 증가하는 것은 용액에서 유리 Cap 유사체의 증가로 인한 것이다. 형광 강도는 상대적인 값으로 표현된다.
도 8은 토끼 망상적혈구 용해물 글로빈 mRNA의 번역의 억제에 대한 Cap 유사체의 효과를 보여준다; 천연 토끼 글로빈 mRNA를 토끼 망상적혈구 용해물 시스템에서 번역하고, [3H] Leu를 단백질에 혼입함으로써 글로빈 합성을 검출하였다.
도 9는 본 발명에 의해 제공되는 Cap 유사체의 일반 구조식을 보여준다.
도 10은 본 발명에 의해 제공되는 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규한 Cap 유사체가 mRNA 합성에 적용되어 mRNA 합성 효율을 효과적으로 증가시켰으며, Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체를 사용하여 합성된 생성물(4-6mg)은 합성 시스템 ml당 ARCA(1.5mg) 및 Cleancap(3.8mg)보다 유의하게 더 높았음을 보여준다.
도 11은 본 발명에 의해 제공되는 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규한 Cap 유사체가 mRNA 합성에 적용되어 mRNA의 캡핑 효율을 효과적으로 증가시켰음을 보여준다. 그리고 Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체를 사용하여 합성된 생성물의 95%가 동일한 합성 조건하에서 ARCA의 경우 70% 및 Cleancap의 경우 90%보다 높게 캡핑되었다.
도 12는 본 발명에 의해 제공되는 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규한 Cap 유사체가 mRNA 합성에 적용되어 면역원성을 효과적으로 감소시켰으며, Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체를 사용하여 합성된 생성물의 세포내 면역원성은 ACRA 구조를 사용한 동일한 mRNA의 면역원성의 9%-52%에 불과하였음을 보여준다.
도 13은 본 발명에 의해 제공되는 Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체가 mRNA 합성에 적용되어 단백질 번역 효율을 효과적으로 개선하였음을 보여준다. 루시퍼라제(Luc)를 암호화하는 mRNA를 각각 ARCA, Cleancap 및 Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체로 캡핑하였으며, 마우스에서 3개의 mRNA의 발현 강도를 비교하여, Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체를 사용한 Luc mRNA의 발현 강도가 가장 높았음을 발견할 수 있다.
본 발명은 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체를 제공하며, 여기서 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체는 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 분자식을 갖는다:
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeG),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU),
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG),
3´-O-Me-m7G(5')ppp (5')(2'OMeG)p(2'OMeG),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU),
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU), 및
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU).
본 발명에서, 기재된 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체의 공통성은 2'OMe의 메톡시 변형, A＼G＼C＼U 및 m7G 뉴클레오시드의 메톡시 변형, 즉 2'OMeA 또는 2'OMeG 또는 2'OMeC 또는 2'OMeU, 및 3'-O-Me-m7G에 기초한다. Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap은 효소 반응에 의해 형성된다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 상기 기술적 해결책에 기재된 바와 같은 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체의 제조방법을 제공한다:
(1) 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, 인산염 가수분해효소 및 2× 반응 완충액과 각각 혼합한 다음, 배양하여 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 수득하는 단계;
(2) 단계 1)로부터 수득된 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, 7-메틸구아노신, 7-메틸-3'-O 메틸구아노신, 구아노실트랜스퍼라제 및 2× 반응 완충액과 각각 혼합한 다음, 배양하여 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)를 수득하는 단계; 및
3) 단계 2)로부터 수득된 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, T4 RNA 리가제 1과 혼합한 다음, 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP와 각각 혼합한 후, 2×T4 RNA 리가제 반응 완충액과 혼합하고 배양하여 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체를 수득하는 단계.
본 발명에서는, 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, 인산염 가수분해효소 및 2× 반응 완충액과 각각 혼합한 다음, 배양하여 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 수득하였다. 본 발명에서, 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP는 시판품이다.
본 발명에서, RNase-비함유 물의 용적에 대한 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP의 양의 비율은 바람직하게는 모두 1 내지 30 mmol:14 μL, 보다 바람직하게는 10 mmol:14 μL이다. 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP는 공급원에 있어 특별히 제한되지 않으며, 이들은 시판품으로서 수득하거나 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서, 인산염 가수분해효소 및 2× 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비는 바람직하게는 14:1:15이다. 본 발명에서, 인산염 가수분해효소의 효소 활성은 바람직하게는 50,000 U이고; 2× 반응 완충액의 성분은 바람직하게는 50mM Tris-HCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2 및 1mM DTT를 포함하고, 8의 pH 값을 갖는다. 본 발명에서, 배양 온도는 바람직하게는 37℃이고 배양 시간은 바람직하게는 1시간이다. 본 발명에서, 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP는 바람직하게는 HPLC에 의해 정제된 다음 RNase-비함유 물에 용해된다.
본 발명에서는, 수득된 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, 7-메틸구아노신, 7-메틸-3'-O 메틸구아노신, 구아노실트랜스퍼라제 및 2× 반응 완충액과 각각 혼합하고, 배양하여 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)를 수득하였다.
본 발명에서, 7-메틸구아노신, 7-메틸-3'-O-메틸구아노신, 구아노실트랜스퍼라제 및 2× 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비는 바람직하게는 11:10:10:1:22이다. 본 발명에서, 구아노실트랜스퍼라제의 효소 활성은 바람직하게는 50,000 U이다. 본 발명에서, 2× 반응 완충액의 성분은 바람직하게는 50mM Tris-HCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2 및 1mM DTT를 포함하고, 8의 pH 값을 갖는다. 7-메틸구아노신 및 7-메틸-3'-O-구아노신의 공급원은 본 발명에서 특별히 제한되지 않으며, 이들은 통상적으로 상업적으로 이용 가능하거나 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서, 배양의 온도는 바람직하게는 37℃이고 배양의 시간은 바람직하게는 1시간이다.
본 발명에서는, 수득된 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, T4 RNA 리가제 1과 혼합한 다음, 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-Methyl-ATP 및 2'-O-Methyl-UTP와 각각 혼합한 후, 2×T4 RNA 리가제 반응 완충액과 혼합하고 배양하여 신규한 Cap2 구조적 5'Cap 유사체를 수득하였다.
본 발명에서, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)는 바람직하게는 HPLC에 의해 정제된 다음 RNase-비함유 물에 용해된다.
본 발명에서, T4 RNA 리가제 1 및 2×T4 RNA 리가제 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비는 바람직하게는 11:1:22이다. 본 발명에서, T4 RNA 리가제 1은 바람직하게는 10,000 U의 효소 활성을 갖는다. 본 발명에서, 2×T4 RNA 리가제 반응 완충액의 성분은 바람직하게는 60mM Tris-HCl, 20mM MgCl2, 20mM DTT 및 2mM ATP를 포함한다. 본 발명에서, 배양 온도는 바람직하게는 37℃이고 배양 시간은 바람직하게는 1시간이다.
본 발명에 의해 제공된 기술적 해결책은 실시양태와 관련하여 이하에서 상세하게 설명되지만, 이들은 본 발명의 보호 범위를 제한하기 위해 사용되어서는 안 된다.
실시예 1
1. 10 mmol의 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 또는 2'-O-메틸-UTP를 각각 총 14 μL의 용적으로 RNase-비함유 물에 용해시켰다. 1 μL(50,000 U)의 인산염 가수분해효소 및 15 μL의 2× 반응 완충액(50 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 값 8)을 첨가한 후, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하여 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 수득하였다.
2. 상기 수득된 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 각각 HPLC에 의해 정제하고, 총 11 μL의 용적으로 RNase-비함유 물에 용해시켰다.
3. 10 μL(10 mmol) 7-메틸구아노신, 10 μL(10 mmol) 7-메틸-3'-O-메틸구아노신 및 1 μL(50,000 U) 구아노실트랜스퍼라제를 단계 2에서 수득된 용액에 첨가하였다. 22 μL 2× 반응 완충액(50 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 및 1 mM DTT, pH 값 8)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하여 m7G(5')ppp(5') (2'OMeA/G/C/U) 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5') (2'OMeA/G/C/U)를 수득하였다.
4. 단계 3에서 수득된 용액을 HPLC로 정제하고 RNase-비함유 물에 용해시키고 총 11 μL의 용적으로 따로 보관하였다.
5. 10 μL(10 mmol)의 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 또는 2'-O-메틸-UTP를 각각 1 μL(10,000 U)의 T4 RNA 리가제 1(ssRNA 리가제 NEB M0437M)과 함께 단계 4에서 수득된 용액에 첨가하였다. 22 μL의 2× T4 RNA 리가제 반응 완충액(60 mM Tris-HCl(25℃에서 pH 7.8), 20 mM MgCl2, 20 mM DTT 및 2 mM ATP)을 첨가한 후, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하여 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체를 수득하였다.
6. 단계 5에서 수득된 용액을 다음과 같이 HPLC에 의해 정제하고 RNase-비함유 물에 용해시켰다:
1) RP HPLC 실험 파라미터는 1 mL/min(내경이 4.6 mm인 크로마토그래피 컬럼); 0.1 mL/min(내경이 2.1 mm인 크로마토그래피 컬럼)의 유속으로 설정하였고;
2) 100 μL의 샘플(0.1 mgL/ml)을 주입하고(즉, 측정하고자 하는 각각의 Cap 유사체의 양은 10 μg이었고, 여기서, l mL/min의 유속에서 1 μg = 100 mAU); 2.1 mm를 갖는 크로마토그래피 컬럼의 경우, 농도가 0.1 mg/mL인 표준 단백질 10 μL를 첨가하며, 즉 측정하고자 하는 각각의 Cap 유사체의 양은 1 μg이었고(0.1 mL/min의 유속에서 1 μg = 100 mAU); 및
3) 샘플 수집을 위해, 용출된 피크를 캡핑된 폴리프로필렌 미세원심분리관에 수집하고, 단단히 캡핑하고, -20℃에서 보관하였다.
분자식은 다음과 같다:
1. m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG),
2. m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeG),
3. m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG),
4. m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG),
5. m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA),
6. m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA),
7. m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA),
8. m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA),
9. m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC),
10. m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC),
11. m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC),
12. m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC),
13. m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU),
14. m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU),
15. m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU),
16. m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU),
17. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG),
18. 3´-O-Me-m7G(5')ppp (5')(2'OMeG)p(2'OMeG),
19. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG),
20. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG),
21. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA),
22. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA),
23. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA),
24. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA),
25. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC),
26. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC),
27. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC),
28. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC),
29. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU),
30. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU),
31. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU), 및
32. 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU).
제조된 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규한 Cap 유사체를 25℃에서 RP HPLC를 사용하여 확인하였다. 결과는 도 1 내지 도 3에 나타내어져 있다.
실시예 2
eIF4E에 대한 실시예 1에서 제조된 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규 Cap 유사체의 결합 능력을 시험함으로써, 결합 능력이 높을수록 번역 활성이 강해지는 것으로 결론지었다.
eIF4E에 대한 Cap 유사체의 결합 능력을 조사하였다. 진핵생물 개시 인자 4E(eIF4E)는 mRNA의 5' 말단에서 Cap 구조를 특이적으로 인식하고 진핵생물 번역의 개시에 중요한 역할을 하는 Cap-결합 단백질이다. 트립토판의 존재로 인해, eIF4E 자체는 280nm의 파장에서 여기될 수 있고 형광은 337nm의 파장에서 검출된다. Cap 구조에 결합한 후, 형광이 감소하므로 본 방법은 elF4E에 대한 Cap 구조의 결합 능력을 검출하기 위한 표준으로서 역할을 한다. 결과는 도 4 내지 7에 나타내어져 있다.
실험 방법: 상이한 농도의 Cap 구조 용액 1 μL를 0.1 μM eIF4E 단백질 1.4 mL(용매: 50 mM HEPES/KOH (pH 7.2), 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA 및 1 mM DTT)에 적가하고, 280nm의 파장에서 여기와 함께 337nm의 파장에서 형광 변화를 검출하였다.
실시예 3
실시예 1에서 제조된 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규한 Cap 유사체의 생물학적 활성은 글로빈 발현 수준에 대한 Cap2 구조를 갖는 Cap 유사체의 효과를 시험함으로써 결정하였다.
토끼 망상적혈구 용해물의 미구균 뉴클레아제 처리는 핵산을 제거하고 mRNA가 발현될 수 있는 mRNA에 대한 시험관내 번역 시스템으로서 작용한다. 천연 토끼 글로불린 mRNA를 3H-표지된 류신과 함께 5 ug/mL의 최종 농도로 시스템에 첨가하였다. Cap2 구조를 갖는 100 μmol Cap 유사체(대조군으로 ARCA 및 Cleancap)를 각 1mL의 반응 시스템에 첨가하고, 반응 시스템 중의 단백질을 24시간 후에 추출하고 글로불린 3H 함량에 대해 분석하였다.
Cap 유사체가 eIF4E에 결합하기 위해 경쟁하기 때문에, 혼입된 Cap 유사체가 eIF4E에 더 강하게 결합할수록, 혼입된 천연 mRNA의 번역 수준이 낮아지고 글로빈의 3H 함량이 낮아진다. 결과는 도 8에 나타내어져 있다.
실험 방법: 핵산을 제거하기 위한 토끼 망상적혈구 용해물의 미구균 뉴클레아제 처리를 mRNA가 발현될 수 있는 mRNA 시험관내 번역 시스템을 위한 반응 시스템으로서 사용하였다. 천연 토끼 글로불린 mRNA를 3H-표지된 류신과 함께 5 μg/ml의 최종 농도로 시스템에 첨가하였다. Cap2 구조를 갖는 cap 유사체 100 μmol(ARCA 및 Cleancap을 대조군으로 사용함)을 각 1 ml의 반응 시스템에 첨가하고, 반응 시스템 중의 단백질을 24시간 후에 추출하였다. 글로불린의 3H 함량을 측정하였다.
실시예 4
실시예 1에서 제조된 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규한 Cap 유사체를 mRNA 합성에 적용하여 mRNA 합성의 효율을 효과적으로 증가시켰다(4-6mg/mL).
실험 방법:
1. mRNA를 합성하기 전에, 플라스미드를 NotI로 선형화하고 4℃에서 밤새 소화시킨다;
2. DNA 주형으로 추출한다;
3. ARCA, Cleancap 및 본 발명의 32종의 Cap2를 각각 Cap 구조로서 사용하여 mRNA를 시험관내 전사 합성한다. 반응 시스템은 표 1에 나타내어져 있다;
표 1 반응 시스템
Figure pct00001
37℃에서 6시간 동안 반응시킨다. TURBO DNase로 15분 동안 소화시킨다.
4. LiCl 용액을 사용하여 전사 생성물을 정제하고 반응 수율을 계산한다.
결과는 표 2 및 도 10에 나타내어져 있다. 전사 반응 시스템의 ml당 최대 1.5 mg mRNA는 ARCA Cap 구조를 사용하여 제조되었고, 전사 반응 시스템의 ml당 최대 3.8 mg mRNA는 Cleancap을 사용하여 제조되었으며, 전사 반응 시스템의 ml당 최대 4 ~ 6 mg mRNA는 본 발명의 Cap2를 사용하여 제조되었다.
표 2 mRNA 합성 반응 시스템 1 ml로부터 수득된 최종 생성물의 질량(mg)
Figure pct00002
실시예 5
실시예 1에서 제조된 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규한 Cap 유사체를 mRNA 합성에 적용하여 캡핑 효율을 효과적으로 증가시켰다(95-98%).
실험 방법:
실시예 1에서 수득된 상이한 Cap 구조를 갖는 mRNA 분자를 효소 절단에 적용하고, 캡핑된 mRNA 분자와 캡핑되지 않은 mRNA 분자의 비율을 액체 크로마토그래피-질량분석법 분석 실험에서 결정할 수 있었다.
비즈 전처리:
1. 자석을 사용하여 비드를 농축시키고, 상청액 저장 용액을 흡인하고, 동일 용적의 0.1 M NaOH + 0.05 M NaCl을 첨가한다;
2. 상청액을 흡인하고 동일 용적의 0.1 M NaCl로 비드를 재현탁하고, 농도를 일정하게 유지시킨다;
3. mRNA 및 절단 태그를 어닐링하고, 다음 반응 시스템을 구성한다;
표 3 반응 시스템
Figure pct00003
구배 어닐링: 95℃ 5분
65℃ 2분
55℃ 2분
22℃ 유지
4. 절단 태그를 비드와 조합한다.
비드를 15,000g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 다음 120μl의 어닐링된 mRNA 및 태그를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였으며, 이 시간 동안 이들을 부드럽게 진탕시켜 적절한 결합을 보장하였다.
5. RNase H를 사용한 효소 절단;
10 μl RNase H를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양한다. 자석으로 비드를 침전시키고 상청액을 버린다.
세척 완충액 100μl를 첨가하고, 완전히 혼합하고, 2분 동안 자석 침전시키고, 상청액을 버린다. 3회 반복한다.
DI 물로 3회 세척한다.
6. RppH로 가수분해;
nebuffer 2 중의 10 단위 RppH를 사용하여 실온에서 1시간 동안 가수분해한다.
7. DI 물로 3회 세척한다;
8. 용리;
DI 물을 흡인하고, 80℃로 예열된 75% 에탄올 100 μl를 첨가하고, 3분 동안 배양하고, 3분 동안 자석 침전시켰다. 상청액을 취한 다음 증발시키고, 10 μl의 용적으로 되도록 45분 동안 원심분리하였다. 마지막으로, 샘플을 50 μl의 100M EDTA/1% MeOH에 재현탁시키고, LC-MS 분석을 위해 남겨두었다.
9. 합성된 상이한 Cap 유사체의 mRNA 캡핑율을 LC-MS로 분석하였다.
결과는 표 4 및 도 11에 나타내어져 있다. ARCA Cap 구조를 사용하는 경우 전사 생성물의 최대 캡핑율은 70%이고, Cleancap을 사용하는 경우 전사 생성물의 최대 캡핑율은 90%이며, 본 발명의 Cap2를 사용하는 경우 전사 생성물의 최대 캡핑율은 최대 95%이다.
표 4 상이한 Cap 구조를 사용할 경우의 mRNA 캡핑율
Figure pct00004
실시예 6
실시예 1에서 제조된 Cap2 구조를 갖는 32종의 신규한 Cap 유사체를 mRNA 합성에 적용하여 면역원성을 효과적으로 감소시켰다.
실험 방법: 세포내 면역단백질 TLR3, TLR7, TLR8 및 RIG-1을 RNA 면역침전에 의해 결합된 RNA와 함께 면역침전시키고, 마지막으로 이들 mRNA를 실시간 정량적 PCR에 의해 확인하였으며, 이들의 상대 존재비는 면역원성에 비례하였다.
실험 방법:
1. 세포 수집
인간-유래된 PBMC 세포를 106개 세포/웰로 배양하고, 세포를 각각 리포펙타민 2000을 사용하여 ARCA를 갖는 mRNA, Cleancap을 갖는 mRNA 및 Cap 2 구조를 갖는 mRNA의 5μg으로 형질감염시켰다. 세포를 24시간 후에 트립신 소화에 의해 수집하고, PBS에 재현탁시키고, 원심분리하고, 수집하였다.
2. 세포 고정 및 용해
세포에 고정제를 첨가하고, 15분 후 고정 종결을 위해 글리신을 첨가한 다음 원심분리하여 세포를 수집하였다. 용해물을 첨가하여 세포를 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 빙상에서 배양하고, 2400g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다.
3. RNA 면역침전
TLR3, TLR7, TLR8 및 RIG-1 항체(2-10 μg)를 상청액(6-10 mg)에 첨가한 다음 4℃에서 2시간 동안 부드럽게 배양하였다. 그후 이에 단백질 A/G 비드(40 μL)를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 부드럽게 배양하였다.
4. 결합되지 않은 물질 세척 제거
침전된 자성 비드로 2500 rpm에서 30초 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. 비드를 500 μL의 RIP 완충액에 재현탁시킨다. RIP 완충액에서 총 3회 세척한 다음 PBS에서 1회 세척한다.
5. 면역침전 후 RBP에 결합된 RNA의 정제
TRIzol RNA 추출 시약(1 mL)에 자성 비드를 재현탁시키고 공동-침전된 RNA를 단리한 다음 뉴클레아제-비함유 물(20 μL)을 사용하여 RNA를 용리한다.
6. RNA를 cDNA로 역전사(RT)하고 정량적 PCR 분석을 위해 mRNA 서열에 따라 프라이머를 설계한다. mRNA 면역원성은 자성 비드에 의해 침전된 mRNA 카피의 수에 비례한다.
결과는 표 5 및 도 12에 나타내어져 있다. 본 발명에서 Cap2 구조를 갖는 Cap을 포함하는 mRNA의 면역원성은 ARCA 구조를 갖는 Cap 및 Cleancap Cap을 갖는 Cap의 면역원성보다 유의하게 낮다.
표 5 상이한 Cap 구조를 사용한 경우의 mRNA의 세포내 면역원성, 모든 결과는 ARCA에 상대적이다.
표 5: Cap2 구조를 갖는 Caps에 대한 mRNA 면역원성 분석의 결과
Figure pct00005
실시예 7
mRNA 합성에 적용한 경우 실시예 1에서 제조된 Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체의 효과적인 단백질 번역 효율.
실험 방법:
동일한 양의 루시퍼라제를 암호화하는 mRNA를 마우스의 등에 피내 주사하고, 24시간 후에 루시퍼라제 기질을 꼬리 정맥에 주사하였으며, 발광 강도는 유효 표적 단백질 번역율에 비례하였다.
실험 결과는 도 13에 나타내어져 있다. 본 방법에서 Cap2 구조를 갖는 신규한 Cap 유사체의 유효 단백질 번역 효율은 mRNA 합성에 적용할 경우 ARCA 및 Cleancap Cap 구조의 유효 단백질 번역 효율보다 유의하게 높다.
상술한 내용은 단지 본 발명의 바람직한 실시형태이며, 당업계의 숙련가에게는 본 발명의 원리를 벗어나지 않으면서 다른 개선 및 수식이 이루어질 수 있고, 이러한 개선 및 수식도 본 발명의 보호 범위로서 간주되어야 한다.

Claims (10)

  1. Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체가 다음 중 어느 하나로부터 선택된 분자식을 가짐을 특징으로 하는, Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체:
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeG),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU),
    m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp (5')(2'OMeG)p(2'OMeG),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU),
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU), 및
    3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU).
  2. (1) 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP를 각각 RNase-비함유 물(RNase-free water)에 용해시키고, 인산염 가수분해효소 및 2× 반응 완충액과 각각 혼합한 다음, 배양하여 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 수득하는 단계;
    (2) 단계 1)로부터 수득된 2'-O-메틸-ADP, 2'-O-메틸-GDP, 2'-O-메틸-CDP 및 2'-O-메틸-UDP를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, 7-메틸구아노신, 7-메틸-3'-O-메틸구아노신, 구아노실트랜스퍼라제 및 2× 반응 완충액과 각각 혼합한 다음, 배양하여 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)를 수득하는 단계; 및
    3) 단계 2)로부터 수득된 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U) 및 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)를 각각 RNase-비함유 물에 용해시키고, T4 RNA 리가제 1(Ligase 1)과 혼합한 다음, 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-메틸-UTP와 각각 혼합한 후, 2×T4 RNA 리가제 반응 완충액과 혼합하고 배양하여 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체를 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 제1항의 Cap2 구조를 갖는 신규한 5'Cap 유사체의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 1)에서 RNase-비함유 물의 용적에 대한 2'-O-메틸-ATP, 2'-O-메틸-GTP, 2'-O-메틸-CTP 및 2'-O-O-메틸-UTP의 양의 비율이 1 내지 30 mmol:14 μL임을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 단계 1)에서 인산염 가수분해효소 및 2× 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비가 14:1:15임을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 인산염 가수분해효소가 50,000 U의 효소 활성을 갖고,
    2× 반응 완충액의 성분이 50 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 및 1 mM DTT를 포함하고 8의 pH 값을 가짐을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제2항에 있어서, 단계 1) 내지 3)의 배양 온도가 각각 37℃이고, 이의 배양 시간이 1시간임을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제2항에 있어서, 단계 2)에서, 7-메틸-구아노신, 7-메틸-3'-O-메틸-구아노신, 구아노실트랜스퍼라제 및 2× 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비가 11:10:10:1:22임을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제3항에 있어서, T4 RNA 리가제 1 및 2× T4 RNA 리가제 반응 완충액에 대한 RNase-비함유 물의 용적비가 11:1:22임을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제2항 또는 제8항에 있어서, 2× T4 RNA 리가제 반응 완충액의 성분이 60 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 20 mM DTT 및 2 mM ATP를 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제2항 또는 제8항에 있어서, T4 RNA 리가제 1의 효소 활성이 10,000 U임을 특징으로 하는 제조방법.
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