CN117511980A - 一种利用原核系统制备rna的方法及其应用 - Google Patents

一种利用原核系统制备rna的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用原核系统制备RNA的方法及其应用。所述方法包括：将目标基因和RNA结合蛋白的编码基因导入宿主细胞中进行培养及表达，进行产物纯化，得到RNA；所述目标基因的序列的5’端还包括RNA结合蛋白结合基序的序列；所述RNA结合蛋白的编码基因的序列还包括His标签的序列。本发明在目标RNA中引入RNA结合蛋白结合基序，与RNA结合蛋白在细胞中共表达，便于富集纯化，可实现任意目标RNA的高效制备。

Description

一种利用原核系统制备RNA的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用原核系统制备RNA的方法及其应用。
背景技术
近年来，随着小RNA、mRNA、长链非编码RNA、环状RNA、核酶等RNA研究技术的快速进步，RNA在生物学和医学领域引起了日益广泛的关注(Sasso,J.M.,et al.,2022，Journalof Medicinal Chemistry 65(10):6975-7015；Zhu,Y.,et al.,2022，Cell Death&Disease13(7):644)。然而，随着RNA在科研试验和药物研发中应用的范围不断扩大，特别是涉及越来越多种类和序列的RNA时，一些RNA，尤其是长链RNA，目前仍无法通过现有的合成方法有效获得。这极大地限制了研究人员对这些复杂RNA的深入研究和应用。
目前RNA合成方法仍然主要是化学合成和酶法合成两种(Ryczek,M.，et al.,2022,Applied Sciences 12(3),1543)。另外，杨忠等人发明了通过大肠杆菌合成目的真核细胞mRNA的方法(CN1563377A)。
对于化学合成法，该方法最大的优点就是可以规模化合成，但是也存在明显的缺点和技术限制，其一就是价格昂贵，其二是现有合成技术水平只能合成100nt左右的短链RNA分子，并且合成RNA长度一旦超过40nt，其合成效率大幅降低，副产物序列增多，大大增加了下游纯化的难度，推高了成本。因此，研究人员往往通过酶法获得大于40nt的RNA，即使用T7、T3或SP6 RNA聚合酶转录带有其启动子的双链DNA模板获得长链RNA(如CN109628442A)。然而，酶法合成RNA也存在一些问题，首先，因为需要大量制备DNA转录模板、RNA聚合酶以及后续消化DNA模板的DNA酶，使得酶法无法实现稳定的规模化生产。其次，由于酶法合成RNA的体系较为简单，缺少体内转录所需的一些辅助蛋白，因此容易产生截短的转录中止副产物，甚至可能无法获得预期的目的RNA，限制了该方法在RNA合成方面的应用。CN1563377A利用大肠杆菌表达系统这一常用的原核表达系统构建了一种获得目的mRNA的方法，该方法是将目的基因进行改造，在其3’末端引入oligo(dT)序列，然后分别在5’端和3’端加上限制性内切酶识别序列，并与载体结合，转化到大肠杆菌感受态细胞中，促使其高表达，提取大肠杆菌的总RNA，然后用oligo(dT)纤维素进行分离纯化，获得所需的目的mRNA，虽然能够获得相对较纯的mRNA，但是对于一些没有poly(A)尾巴的RNA分子的合成及后续纯化问题仍然无法解决。
综上所述，开发新型的制备RNA的方法，高效制备RNA，具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种利用原核系统制备RNA的方法及其应用，以期高效制备RNA。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种利用原核系统制备RNA的方法，所述方法包括：
将目标基因和RNA结合蛋白的编码基因导入宿主细胞中进行培养及表达，进行产物纯化，得到RNA；所述目标基因的序列的5’端还包括RNA结合蛋白结合基序的序列；所述RNA结合蛋白的编码基因的序列还包括His标签的序列。
本发明中，在宿主细胞中同时导入目标基因和RNA结合蛋白的编码基因，所述目标基因的序列的5’端还包括RNA结合蛋白结合基序的序列；所述RNA结合蛋白的编码基因的序列还包括His标签的序列，所述目标基因表达目标RNA带有RNA结合蛋白结合基序，能够与RNA结合蛋白结合，而RNA结合蛋白具有His标签，可通过磁珠等快速收集，继而高效获得目标RNA。
优选地，所述利用原核系统制备RNA的方法具体包括：
将所述目标基因和RNA结合蛋白编码基因插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞进行培养及表达，进行产物纯化，得到RNA。
优选地，所述RNA结合蛋白结合基序的序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
SEQ ID NO.1：ggggcattgcactccgcccc。
可以理解，本发明利用RNA结合蛋白与其结合基序之间存在极强的互作(Kd＝2×10-11)，因此，所述RNA结合蛋白序列可以为RNA结合蛋白全序列或RNA结合蛋白结构域序列。
优选地，所述RNA结合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
SEQ ID NO.2：
AVPETRPNHTIYINNLNEKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVSRSLKMRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDSDIIAKMK。
优选地，所述RNA结合蛋白的编码基因的序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
SEQ ID NO.3：
gcagttcccgagacccgccctaaccacactatttatatcaacaacctcaatgagaagatcaagaaggatgagctaaaaaagtccctgtacgccatcttctcccagtttggccagatcctggatatcctggtatcacggagcctgaagatgaggggccaggcctttgtcatcttcaaggaggtcagcagcgccaccaacgccctgcgctccatgcagggtttccctttctatgacaaacctatgcgtatccagtatgccaagaccgactcagatatcattgccaagatgaaa。
RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合蛋白结构域序列。
优选地，所述His标签包括6×His标签。
优选地，所述His标签位于RNA结合蛋白的编码基因的5’端。
优选地，所述表达载体包括pET15b质粒或pET28a质粒等。
优选地，所述目标基因和RNA结合蛋白的编码基因由T7启动子启动表达。
优选地，所述目标基因和RNA结合蛋白的编码基因由T7终止子终止表达。
优选地，所述T7启动子的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
优选地，所述T7启动子的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
SEQ ID NO.4：taatacgactcactata。
SEQ ID NO.5：ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。
可以理解，为实现在细胞中共表达所述目标基因和RNA结合蛋白的编码基因，可采用本领域通用的外源基因表达方法，例如可将二者插入宿主基因组，或可将二者构建在同一载体或两个载体中等等。
优选地，所述宿主细胞包括原核细胞。
优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌BL21或大肠杆菌Rosetta等。
可以理解，本发明中可针对任意的目标RNA进行设计，任意带有RNA结合蛋白结合基序的RNA均可与RNA结合蛋白结合，继而被富集和分离纯化。
本发明具体实施例中，所述目标基因可以为编码B5 RNA的基因(SEQ ID NO.6)、编码V1 RNA的基因(SEQ ID NO.8)
优选地，所述产物纯化包括：
收集细胞，进行裂解，裂解后离心取上清，将上清与磁珠孵育，获取RNA结合蛋白-目标RNA复合物，利用Trizol抽提法或异硫氰酸胍法提取目标RNA。
优选地，所述磁珠包括Ni-NTA磁珠或IDA-Cobalt磁珠等。
优选地，所述利用原核系统制备RNA的方法包括：
将所述目标基因和RNA结合蛋白编码基因插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞进行培养及表达，收集细胞，进行裂解，裂解后离心取上清，将上清与磁珠孵育，获取RNA结合蛋白-目标RNA复合物，利用Trizol抽提法或异硫氰酸胍法提取目标RNA；所述目标基因的序列的5’端还包括RNA结合蛋白结合基序的序列，所述目标RNA结合蛋白结合基序的序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；所述目标RNA结合蛋白的编码基因的序列包括SEQ ID NO.3所示的序列，所述RNA结合蛋白的编码基因的序列还包括6×His标签的序列。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计全新的利用原核系统制备RNA的方法，在目标RNA中引入RNA结合蛋白结合基序，与带His标签的RNA结合蛋白在细胞中共表达，转录得到的目标RNA含有稳定的RNA结合蛋白结合基序，与共同表达的带His标签的RNA结合蛋白结合，可进行高效分离纯化，此外，任何一段外源碱基序列加上结合基序碱基序列后都可以运用本发明方法获得其所编码的RNA，打破了现有酶法无法合成特定RNA的限制。
附图说明
图1A为B5 RNA表达载体示意图；
图1B为V1 RNA表达载体示意图；
图2为诱导RNA结合蛋白表达的Westernblot分析图；
图3A为纯化后B5 RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图3B为纯化后B5 RNART-PCR检测结果；
图4A为纯化后V1 RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图4B为纯化后V1 RNA RT-PCR检测结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例制备B5 RNA。
1.pET15b-U1A-B5载体系统的构建。
从Genbank accession number：NM_004596得到人类RNA结合蛋白(U1A蛋白)基因序列的210位至500位(SEQ ID NO.3)。
在U1A蛋白基因序列(SEQ ID NO.3)的5’端和3’端分别添加限制性内切酶NdeI和XhoI序列，最终其全基因序列为(SEQ ID NO.10)。
SEQ ID NO.10：
CATATGgcagttcccgagacccgccctaaccacactatttatatcaacaacctcaatgagaagatcaagaaggatgagctaaaaaagtccctgtacgccatcttctcccagtttggccagatcctggatatcctggtatcacggagcctgaagatgaggggccaggcctttgtcatcttcaaggaggtcagcagcgccaccaacgccctgcgctccatgcagggtttccctttctatgacaaacctatgcgtatccagtatgccaagaccgactcagatatcattgccaagatgaaaCTCGAG。
使用NdeI和XhoI酶将pET15b质粒和U1A基因DNA序列分别进行双酶切操作，经切胶回收试剂盒切胶回收后，使用T4 DNA连接酶16℃连接2小时。连接液直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化后的DH5α细胞涂布在含50μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上37℃过夜培养。从培养基上挑取单菌落，提取质粒并进行测序。测序引物采用载体自身引物T7启动子(SEQ ID NO.4)和T7终止子(SEQ ID NO.5)。测序正确的质粒即为pET15b-U1A。
合成T7启动子序列(SEQ ID NO.4)、U1A结合基序碱基序列(SEQ ID NO.1)、编码B5RNA的碱基序列(SEQ ID NO.6)、T7转录终止子序列(SEQ ID NO.5)，然后通过在5’端和3’端加上同源重组序列，最终其全基因序列如SEQ ID NO.7所示。
SEQ ID NO.6：
acggtcggtcgcccatatggagaccctcgaatggaattggttctacataaatgcctaacgactatccctttggggagtagggtcaagtgactcgaaacgatagacaacttgctttaacaagttggagatatagtctgctctgcatggtgacatgcagctggatataattccggggtaagattaacgaccttatctgaacataatgctgaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccaagcttatgaaaacgatttccgttgttacgttgttatgcgtactacctgctgttgtttattcaacatgtactgtacccactatgaataacgctaaattaacgtctaccgaaacatcgtttaatgataaacagaaagttacgtttacatgtgattcaggatatcattctttggatccaaatgctgtctgtgaaacagataaatggaaatacgaaaatccatgcaagaaaatgtgcacagtttctgattatgtctctgaactatatgataagccattatacgaagtgaattccaccatgacactaagttgcaacggtgaaacaaaatattttcgttgtgaagaaaaaaatggaaatacttcttggaatgatactgtcacgtgtcctaatgcggaatgtcaacctcttcaattagaacacggatcgtgtcaaccagttaaagaaaaatactcatttggggaatatatgactatcaactgtgatgttggatatgaggttattggtgtttcgtatataagttgtacggctaattcttggaatgttattccatcatgtcaacaaaaatgtgatataccgtccctatctaatggattaatttccggatctacattttctatcggtggcgttatacatcttagttgtaaaagtggttttacactaacggggtctccatcatccacatgtatcgacggtaaatggaatcccatactcccaacatgtgtacgatctaacgaagaatttgatccagtggatgatggtcccgacgatgagacagatctgagcaaactctcgaaagacgttgtacaatatgaacaagaaatagaatcgttagaagcaacttatcatataatcataatggcgttgacaattatgggtgtcatatttctaatctccattatagtattagtttgttcctgtgacaaaaataatgaccaatataagttccataaattgctaccggtcgaccatcatcatcatcatcactgatgactcgagctggtactgcatgcacgcaatgctagctgcccctttcccgtcctgggtaccccgagtctcccccgacctcgggtcccaggtatgctcccacctccacctgccccactcaccacctctgctagttccagacacctcccaagcacgcagcaatgcagctcaaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattaacctttagcaataaacgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccacaccctggagctagcttgggttaattgaggcctgagtataaggtgacttatacttgtaatctatctaaacggggaacctctctagtagacaatcccgtgctaaattgtaggactaattccatttatcagatttctaga。
SEQ ID NO.7：
TGATAAACTACCGCATTAAAGCTTtaatacgactcactataggggcattgcactccgccccacggtcggtcgcccatatggagaccctcgaatggaattggttctacataaatgcctaacgactatccctttggggagtagggtcaagtgactcgaaacgatagacaacttgctttaacaagttggagatatagtctgctctgcatggtgacatgcagctggatataattccggggtaagattaacgaccttatctgaacataatgctgaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccaagcttatgaaaacgatttccgttgttacgttgttatgcgtactacctgctgttgtttattcaacatgtactgtacccactatgaataacgctaaattaacgtctaccgaaacatcgtttaatgataaacagaaagttacgtttacatgtgattcaggatatcattctttggatccaaatgctgtctgtgaaacagataaatggaaatacgaaaatccatgcaagaaaatgtgcacagtttctgattatgtctctgaactatatgataagccattatacgaagtgaattccaccatgacactaagttgcaacggtgaaacaaaatattttcgttgtgaagaaaaaaatggaaatacttcttggaatgatactgtcacgtgtcctaatgcggaatgtcaacctcttcaattagaacacggatcgtgtcaaccagttaaagaaaaatactcatttggggaatatatgactatcaactgtgatgttggatatgaggttattggtgtttcgtatataagttgtacggctaattcttggaatgttattccatcatgtcaacaaaaatgtgatataccgtccctatctaatggattaatttccggatctacattttctatcggtggcgttatacatcttagttgtaaaagtggttttacactaacggggtctccatcatccacatgtatcgacggtaaatggaatcccatactcccaacatgtgtacgatctaacgaagaatttgatccagtggatgatggtcccgacgatgagacagatctgagcaaactctcgaaagacgttgtacaatatgaacaagaaatagaatcgttagaagcaacttatcatataatcataatggcgttgacaattatgggtgtcatatttctaatctccattatagtattagtttgttcctgtgacaaaaataatgaccaatataagttccataaattgctaccggtcgaccatcatcatcatcatcactgatgactcgagctggtactgcatgcacgcaatgctagctgcccctttcccgtcctgggtaccccgagtctcccccgacctcgggtcccaggtatgctcccacctccacctgccccactcaccacctctgctagttccagacacctcccaagcacgcagcaatgcagctcaaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattaacctttagcaataaacgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccacaccctggagctagcttgggttaattgaggcctgagtataaggtgacttatacttgtaatctatctaaacggggaacctctctagtagacaatcccgtgctaaattgtaggactaattccatttatcagatttctagactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgGAATTC TTGAAGACGAAAGGGCCT。
使用HindIII和EcoRI酶将pET15b-U1A质粒进行双酶切操作，经切胶回收试剂盒切胶回收后，酶切后的pET15b-U1A质粒和SEQ ID NO.7DNA序列使用同源重组酶(翌圣，10922ES50)50℃连接15分钟。连接液直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化后的DH5α细胞涂布在含50μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上37℃过夜培养。从培养基上挑取单菌落，提取质粒并进行测序。测序引物采用载体自身引物T7启动子(SEQ ID NO.4)和T7终止子(SEQ ID NO.5)。测序正确的质粒即为pET15b-U1A-B5质粒(图1A)。
2.B5 RNA的转录和纯化。
(1)RNA结合蛋白(U1A蛋白)表达检测
取100ng pET15b-U1A-B5质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞。转化后的BL21细胞涂布在含50μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上37℃过夜培养。从培养基上挑取单菌落接种到5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃摇菌过夜。按照1/100的比例转接到100mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600值达到0.6后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导。U1A蛋白的表达情况通过Western blot检测(图2)，其中泳道1为未经诱导的菌体蛋白；泳道M为蛋白分子量标准(Thermo fisher,PageRulerTMPrestained ProteinLadder,10 to 180kDa)；泳道2-3为IPTG诱导2小时和5小时后的U1A蛋白，其分子量为15kDa。
(2)B5 RNA的纯化
取诱导后5小时的菌液100mL，然后4℃，10,000g离心10分钟收集菌体。随后重悬于10mL破壁缓冲液(20mM HEPES-KOH，pH 7.4，115mM NaCl，5.4mM KCl，1.8mM CaCl2,0.8mMMgCl2,13.8mM蔗糖，20mM VRC)中。将大肠杆菌悬浮液置于高压细胞破碎器中，4℃，高压800bar～1,000bar破碎细胞。然后4℃，12,000g离心30分钟收集上清，并与100μL Ni-NTA磁珠4℃旋转孵育30分钟。弃上清，加入1mL破壁缓冲液4℃旋转孵育5分钟，重复5次。然后，加入1mL Trizol，25℃静置5分钟。加入0.2mL氯仿，温和振荡后25℃静置2分钟，然后4℃10,000g离心10分钟分层。将分层后的上层水溶液转移到一个RNase-free的离心管中，加0.5mL异丙醇沉淀其中RNA。25℃静置10分钟后4℃，12,000g离心30分钟收集沉淀的RNA。RNA用1mL75％乙醇清洗后4℃，12,000g离心10分钟再次离心收集。风干后，最终得到的RNA溶于DEPC水中。
3.B5 RNA纯化产物的检测：
B5 RNA样品的纯度通过2％的琼脂糖凝胶电泳检测(图3A)，其中，泳道1为使用本发明方法纯化后的B5 RNA，其长度为1684nt；泳道2为以SEQ ID NO:7为模板，使用T7 RNA聚合酶1(NEB,E2040)体外转录后的产物；泳道3为以SEQ ID NO.7为模板，使用T7 RNA聚合酶2(Thermo fisher,K0441)体外转录的产物，结果表明可以得到体外转录无法获得的目标RNA。
RNA浓度使用NanoDrop微量分光光度计260nm波长测定，并作为RT-PCR的模板进行检测。
RT-PCR检测过程按照翌圣公司的RT-PCR试剂盒(11139ES60)说明书操作。
RT-PCR的结果用琼脂糖电泳分析(图3B)，泳道1为阴性对照(以pET15b-U1A为模板)，泳道2为使用本发明方法纯化后的B5 RNA的RT-PCR结果(以本发明方法纯化后的B5RNA的反转产物为模板)，泳道3为阳性对照(以pET15b-U1A-B5为模板)，结果表明纯化后的RNA产物为目标B5 RNA。
实施例2
本实施例制备V1 RNA。
1.pET15b-U1A-V1载体系统的构建。
质粒pET15b-U1A的构建参照实施例1。
合成T7启动子序列(SEQ ID NO.4)、U1A结合基序碱基序列(SEQ ID NO.1)、编码V1RNA的碱基序列(SEQ ID NO.8)、T7转录终止子序列(SEQ ID NO.5)，然后通过在5’端和3’端加上限制性内切酶HindIII和EcoRI的识别序列，最终其全基因序列为(SEQ ID NO.9)。V1RNA含有Group I intron，在GTP存在的条件下可以形成环状RNA。上述部分序列如下：
SEQ ID NO.8：
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatatgtgaccctatttttggaacggcagaccagtgacctccacaggccacgcttgttcctttttgggtcggttttgtgggagaccctcgaatggaattggttctacataaatgcctaacgactatccctttggggagtagggtcaagtgactcgaaacgatagacaacttgctttaacaagttggagatatagtctgctctgcatggtgacatgcagctggatataattccggggtaagattaacgaccttatctgaacataatgctaccgtttaatattgcgtcagaatttttgtttaactttaagaaggagaggatccatggctcagtcaaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggctgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggcaagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatcttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtcgactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgaggacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatgtaccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaagatgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatcttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccagttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatccagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgaccgagcacgccatcgcctccggatctgcattgccctgaaattcggggcattgcactccgcccctctagaagatgttttcttgggttaattgaggcctgagtataaggtgacttatacttgtaatctatctaaacggggaacctctctagtagacaatcccgtgctaaattgtaggactaattccatttatcagatttctagtgttttggctgggtttttccttgttcgcaccggacacctccagtgaccagacggcaaggtttttatcccagtgtataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。
SEQ ID NO.9：
AAGCTTtaatacgactcactataggggcattgcactccgccccacggtcggtcgcccatatgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatatgtgaccctatttttggaacggcagaccagtgacctccacaggccacgcttgttcctttttgggtcggttttgtgggagaccctcgaatggaattggttctacataaatgcctaacgactatccctttggggagtagggtcaagtgactcgaaacgatagacaacttgctttaacaagttggagatatagtctgctctgcatggtgacatgcagctggatataattccggggtaagattaacgaccttatctgaacataatgctaccgtttaatattgcgtcagaatttttgtttaactttaagaaggagaggatccatggctcagtcaaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggctgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggcaagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatcttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtcgactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgaggacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatgtaccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaagatgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatcttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccagttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatccagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgaccgagcacgccatcgcctccggatctgcattgccctgaaattcggggcattgcactccgcccctctagaagatgttttcttgggttaattgaggcctgagtataaggtgacttatacttgtaatctatctaaacggggaacctctctagtagacaatcccgtgctaaattgtaggactaattccatttatcagatttctagtgttttggctgggtttttccttgttcgcaccggacacctccagtgaccagacggcaaggtttttatcccagtgtataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaGAATTC。
使用HindIII和EcoRI酶将pET15b-U1A质粒和SEQ ID NO.9DNA序列分别进行双酶切操作，经割胶回收试剂盒割胶回收后，用T4 DNA连接酶16℃连接2小时。连接液直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化后的DH5α细胞涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基上37℃过夜培养。从培养基上挑取单菌落，提取质粒并进行测序。测序正确的质粒即为pET15b-U1A-V1质粒(图1B)。
2.V1 RNA的转录和纯化。
(1)U1A蛋白表达检测
参照实施例1方法。
(2)V1 RNA的纯化
参照实施例1方法。
3.V1 RNA纯化产物的检测：
V1 RNA样品的纯度通过2％的琼脂糖凝胶电泳检测(图4A)，其中，泳道1为使用本发明方法纯化后的V1 RNA，1349nt，环化后产物长度为798nt；泳道2为以SEQ ID NO.9为模板，使用T7 RNA聚合酶1(NEB,E2040)体外转录后的产物；泳道3为以SEQ ID NO.9为模板，使用T7 RNA聚合酶2(Thermo fisher,K0441)体外转录的产物，结果表明可以得到体外转录无法获得的目标RNA。
RNA浓度使用NanoDrop微量分光光度计260nm波长测定，并作为RT-PCR的模板进行检测。
RT-PCR检测过程按照翌圣公司的RT-PCR试剂盒(11139ES60)说明书操作。
RT-PCR的结果用琼脂糖电泳分析(图4B)，泳道1为阴性对照(以pET15b-U1A为模板)，泳道2为使用本发明方法纯化后的V1 RNA的RT-PCR结果(以本发明方法纯化后的V1RNA的反转产物为模板)，泳道3为阳性对照(以pET15b-U1A-V1为模板)，结果表明纯化后的RNA产物为目标V1 RNA。
综上所述，在5’末端人为引入RNA结合蛋白结合基序的目标RNA在大肠杆菌表达系统中获得了高效转录，含结合基序的目标RNA成功地通过与带His标签的RNA结合蛋白互作，并可利用Ni-NTA磁珠进行纯化，最终实现高效制备RNA。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种利用原核系统利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
将目标基因和RNA结合蛋白的编码基因导入宿主细胞中进行培养及表达，进行产物纯化，得到RNA；
所述目标基因的序列的5’端还包括RNA结合蛋白结合基序的序列；
所述RNA结合蛋白的编码基因的序列还包括His标签的序列。
2.根据权利要求1所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述方法具体包括：
将所述目标基因和RNA结合蛋白编码基因插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞进行培养及表达，进行产物纯化，得到RNA。
3.根据权利要求1或2所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述RNA结合蛋白结合基序的序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述RNA结合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；
优选地，所述RNA结合蛋白的编码基因的序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述His标签包括6×His标签；
优选地，所述His标签位于RNA结合蛋白的编码基因的5’端。
6.根据权利要求2所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述表达载体包括pET15b质粒或pET28a质粒；
优选地，所述目标基因和RNA结合蛋白的编码基因由T7启动子启动表达；
优选地，所述目标基因和RNA结合蛋白的编码基因由T7终止子终止表达。
7.根据权利要求6所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述T7启动子的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列；
优选地，所述T7启动子的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
8.根据权利要求1-7所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌BL21或大肠杆菌Rosetta。
9.根据权利要求1-8所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述产物纯化包括：
收集细胞，进行裂解，裂解后离心取上清，将上清与磁珠孵育，获取RNA结合蛋白-目标RNA复合物，利用Trizol抽提法或异硫氰酸胍法提取目标RNA；
优选地，所述磁珠包括Ni-NTA磁珠或IDA-Cobalt磁珠。
10.根据权利要求1-9任一项所述的利用原核系统制备RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
将所述目标基因和RNA结合蛋白编码基因插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞进行培养及表达，收集细胞，进行裂解，裂解后离心取上清，将上清与磁珠孵育，获取RNA结合蛋白-目标RNA复合物，利用Trizol抽提法或异硫氰酸胍法提取目标RNA；
所述目标基因的序列的5’端还包括RNA结合蛋白结合基序的序列，所述目标RNA结合蛋白结合基序的序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
所述目标RNA结合蛋白的编码基因的序列包括SEQ ID NO.3所示的序列，所述RNA结合蛋白的编码基因的序列还包括6×His标签的序列。
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