CN113136372A - 一种重组噬菌体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种重组噬菌体的构建方法。一种重组噬菌体的构建方法，包括以下步骤(1)提取丝状噬菌体复制型DNA；(2)制备带有目的基因的Tn5转座子DNA；(3)体外插入转座子DNA；(4)转化大肠杆菌DH5αλpir；(5)制备混合质粒文库；(6)转化宿主细胞；(7)筛选重组噬菌体；(8)检测目的基因的表达。本发明的构建方法操作简单，在不依赖目标丝状噬菌体功能基因组研究的情况下就可以构建重组丝状噬菌体，对研究目标重组丝状噬菌体的应用具有重要意义。

Description

一种重组噬菌体的构建方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种重组噬菌体的构建方法。

背景技术

噬菌体，是专一性感染细菌、古菌和藻类等微生物的病毒。对噬菌体进行遗传改造，可以获得重组噬菌体；通过遗传改造可以强化、改变或赋予噬菌体某方面特性，在抗细菌感染、病原物检测和植物细菌病害生物防治等多方面都具有重要应用价值。如类T7噬菌体尾部基因的替换，改变了其宿主范围；又如在噬菌体基因组中插入荧光蛋白编码基因或荧光素酶基因，所获得的重组噬菌体可用于病原细菌的快速检测。目前，有尾噬菌体的遗传改造方法包括宿主细菌内同源重组和噬菌体基因组片段体外组装，但这两种方法操作相对复杂，技术门槛高。

丝状噬菌体是一类呈丝状结构的噬菌体，其基因组一般小于10Kbs，如大肠杆菌的M13噬菌体。虽然丝状噬菌体基因组为单链DNA，但其复制循环过程中会出现双链环状形状的DNA，即复制型DNA。提取丝状噬菌体的复制型DNA后，可在体外进行酶切和连接等分子操作，插入外源目的基因，随后转化宿主细菌，即可获得重组噬菌体。但该构建该方法的前提是：目标丝状噬菌体的基因组功能清晰，即要求目标丝状噬菌体为模式噬菌体；而非模式丝状噬菌体由于尚缺失功能基因组研究，基因功能还不清晰，不能够通过上述方法构建重组噬菌体。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组噬菌体的构建方法，以解决非模式丝状噬菌体由于尚缺失功能基因组研究，基因功能还不清晰，不能够通过现有方法构建重组噬菌体的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种重组噬菌体的构建方法，包括以下步骤

(1)提取丝状噬菌体复制型DNA；

(2)制备带有目的基因的Tn5转座子DNA；

(3)体外插入转座子DNA：取等摩尔量的丝状噬菌体复制型DNA和转座子DNA，在Tn5转座酶的作用下，37℃孵育2h；

(4)转化大肠杆菌DH5αλpir：采用热激法，利用步骤(3)获得的反应物转化经氯化钙处理制备的大肠杆菌DH5αλpir感受态细胞；

(5)制备混合质粒文库：收集步骤(4)的大肠杆菌转化子，加入液体培养基，混匀，利用SDS碱裂法提取混合菌液中的质粒；

(6)转化宿主细胞：采用电激法，利用步骤(5)提取的混合质粒文库转化丝状噬菌体的宿主细菌，经筛选，获得转化子；

(7)筛选重组噬菌体：随机挑取多个经步骤(6)的转化子，接种于液体培养基中，震荡培养，离心，滤过上清液；将滤液与丝状噬菌体的指示细菌混合培养，于不同时间点检测指示细菌的抗性来判断重组噬菌体的活性；

(8)检测目的基因的表达：将具有活性的重组噬菌体感染宿主细菌，提取感染后细菌的总蛋白，使用外源目的基因所编码蛋白的抗体，通过蛋白免疫印迹检测目的基因的表达情况。

作为优选，步骤(1)中丝状噬菌体为青枯雷尔氏菌的丝状噬菌体RSCq，其复制型双链环状DNA共计7480bp，序列见SEQ ID No.1。

作为优先，步骤(2)中Tn5转座子DNA两侧为Tn5转座酶的识别序列，且内部包含丝状噬菌体复制型DNA在大肠杆菌中复制所需的复制起始位点ori、用于筛选卡那霉素抗性的Kan^R基因、以及带启动子和翻译元件的目的基因。

作为优先，步骤(2)中目的基因为通过商业化基因合成服务合成的由lac启动子控制的降解青枯雷尔氏菌群体感应信号分子的酯酶elp104 DNA，序列见SEQ ID No.2。

作为优先，步骤(3)的反应体系为：RSCq复制型DNA 5μL、转座子DNA 3μL、EZ-Tn510X反应缓冲液1μL、EZ-Tn5转座酶1μL，总计10μL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的重组噬菌体的构建方法操作简单，在不依赖目标丝状噬菌体功能基因组研究的情况下就可以构建重组丝状噬菌体，对研究目标重组丝状噬菌体的应用具有重要意义。

附图说明

图1为转座子DNA的结构图；

图2为重组噬菌体的构建流程图；

图3为不同时间点检测青枯雷尔氏菌的卡那霉素抗性；

图4为重组噬菌体中目的基因的表达检测结果；

图5为重组噬菌体感染菌株的酶活检测结果；

具体实施方式

下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一种重组噬菌体的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取丝状噬菌体复制型DNA，丝状噬菌体为青枯雷尔氏菌的丝状噬菌体RSCq，该丝状噬菌体尚未报道和研究，其基因组为单链DNA，复制型双链环状DNA共计7480bp，序列见SEQ ID No.1；

(2)制备带有目的基因的Tn5转座子DNA：目的基因为通过商业化基因合成服务合成的由lac启动子控制的降解青枯雷尔氏菌群体感应信号分子的酯酶elp104 DNA，序列见SEQ ID No.2；

转座子DNA的结构图见图1；Tn5转座子DNA两侧为Tn5转座酶的识别序列，且内部包含丝状噬菌体复制型DNA在大肠杆菌中复制所需的复制起始位点ori、用于筛选卡那霉素抗性的Kan^R基因、以及带启动子和翻译元件的目的基因；

制备的具体方法为：以R6Kf和R6Kr为引物，以EZ-Tn5<R6Kγori/KAN-2>为模板，扩增获得R6K；其中，EZ-Tn5<R6Kγori/KAN-2>购于lucigen公司；

以elp104f和elp104r为引物，以elp104 DNA为模板，扩增获得elp104M；

以R6Kf和elp104r为引物，以R6K和elp104M模板，扩增获得带有目的基因elp104的转座子DNA，通过DNA胶回收试剂盒，纯化扩增所获得的的转座子DNA；扩增所用引物的序列见下表1。

表1扩增引物序列

(3)体外插入转座子DNA：配制下表2的反应体系

表2反应体系

将反应体系置于37℃水浴锅中孵育2h，随后加入1μL EZ-Tn5 10X反应终止液，70℃水浴锅加热10min，终止反应；其中EZ-Tn5 10X反应缓冲液、EZ-Tn5 10X反应终止液和EZ-Tn5转座酶购于lucigen公司；

(4)转化大肠杆菌DH5αλpir：将步骤(3)反应物全部加入100μL由氯化钙处理制备的大肠杆菌DH5αλpir感受态细胞中，冰浴加热30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入800μLLB液体培养基，37℃恢复培养1h，涂布至9个含有卡那霉素的LB固体培养基表面，37℃过夜培养；

(5)制备混合质粒文库：用细胞刮铲收集步骤(4)的大肠杆菌DH5αλpir转化子，加入适量的LB液体培养基，混匀，获得混合菌液，采用SDS碱裂法提取混合菌液中的质粒；

(6)转化宿主细胞：取步骤(5)提取的质粒100ng，加入100μL青枯雷尔氏菌GMI1000菌株的电转化感受态细胞，冰浴10min后加入经预冷的1mm电激杯中，1.8KV电压电激处理，利用800μL BG液体培养基将电激后的青枯雷尔氏菌吸出至无菌的1.5mL离心管中，28℃恢复培养3h，随后涂布至4个含有卡那霉素的BG固体培养基表面，28℃培养48h；

BG培养基配方为：10g/L蛋白胨，1g/L酸水解络蛋白，1g/L酵母提取物，5g/L葡萄糖，pH 7.0；

(7)筛选重组噬菌体：随机挑取步骤(6)获得的青枯雷尔氏菌转化子10个，分别接种至1mL BG液体培养基，并编号区分，28℃震荡培养24h，12000转/min离心3min，取上清用0.22μm过滤器过滤；将滤液按1％比例加入接种有指示青枯雷尔氏菌GMI1000的BG培养基中，置于28℃中震荡培养，于0h、2h、5h和8h时间点检测青枯雷尔氏菌的卡那霉素抗性，结果见图3；

从图3可以看出，青枯雷尔氏菌GMI1000与1#和3#转化子培养的上清共培后获得了对卡那霉素的抗性，说明1#和3#转化子可以分泌产生具有感染活性的重组噬菌体，分别命名为RSCqelp104-1和RSCqelp104-3；

(8)检测目的基因的表达：由于在合成酯酶elp104基因时，在3'端添加有6His标签的编码序列(该部分可以从序列表中看出)，所以通过6His标签抗体检测酯酶elp104基因表达，具体为：分别用RSCqelp104-1和RSCqelp104-3感染青枯雷尔氏菌GMI1000，提取被RSCqelp104-1和RSCqelp104-3感染的青枯雷尔氏菌GMI1000细菌总蛋白，以无感染的青枯雷尔氏菌GMI1000为对照，SDS聚苯稀酰胺凝胶电泳分离总蛋白，转膜后进行蛋白质免疫印迹，使用6His标签的单克隆抗体作为一抗进行免疫印迹，结果见图4；

从图4中可以看出，RSCqelp104-1和RSCqelp104-3感染的青枯雷尔氏菌GMI1000中都有表达含有6His标签的蛋白，且蛋白大小与elp104酯酶相符，说明酯酶elp104基因可通过重组噬菌体在宿主细菌中表达。

另外，重组噬菌体中表达的目的基因为可降解青枯雷尔氏菌群体感应系统的酯酶，所以本实施例检测了RSCqelp104-1和RSCqelp104-3对青枯雷尔氏菌群体感应系统的降解作用，具体为：以群体感应系统下游的多糖合成基因epsA为指示基因，将epsA基因启动子克隆至β半乳糖苷酶基因lacZ编码区前，以指示青枯雷尔氏菌的群体感应强度来检测lacZ酶活，结果见图5；

从图5中可以看出，相比于无噬菌体感染的群体感应报告菌株，以及原始噬菌体RSCq感染的报告菌株，重组噬菌体RSCqelp104-1和RSCq104-3的感染降低了报告菌株的lacZ酶活。说明elp104基因可以通过重组噬菌体，降解青枯雷尔氏菌的群体感应系统，在对青枯雷尔氏菌所引起的植物青枯病的生物防治中具有重要价值。

综上，可以看出本发明不依赖目标丝状噬菌体的功能基因研究情况就可以构建重组丝状噬菌体。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种重组噬菌体的构建方法

<130> 2021

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7480

<212> DNA

<213> 青枯雷尔氏菌(Ralstonia sp.)

<400> 1

cgtttacccc tcgcccgggt taaccggcta tatttacgcc agaatcacgg gcgtaattca 60

tcacggacat aatattaatt acatccttca tgccgtcaag caaagaggtg cttagatgag 120

aattgagaaa tacttagatc aggcgatcga acgccacggc ctgaagaacg acagcaagct 180

ggcagagatg ctaggtgtgg tgcaaagcgc ggtcagccac taccgcaccg gccgccgcac 240

ggcggacaac gaagtgtgcc tccgcctggc gcagctgctc gagatggaga acccgctgcc 300

gatcatcatg gcggccgaca tggaccgcgc cgaacgtgct ggccagcact ctctctggga 360

agttttttcg acgaggatgg cagccagtaa cgcgacagcc gccctcctcc tggtactggt 420

cgcgagcgca acaaattttg ttgcgccctc tcccgccaaa gccgcgccgt tgagccattc 480

gacagctcaa cgattattgt tatgtaaaat agctcgccga cttcgggagc gcctacagca 540

agcgctgcgt gcagtccaaa caagcccgaa aacggcaccg tgctgatcga cagcacagca 600

gcagatctag cacctcccgt tccgaaacgc ctacagcaag cgctgcgtgc agtccaaaca 660

agcccgaaaa cggcaccgtg ctgatcgaca gcacagcagc agatctagca cctcccgttc 720

cgaaacgcct gcatctagca ggcgtttttt tttcgtgcgg atctttcgat agtaccgatg 780

ccgagcggca tcctggtagc cccggcgcag tgtccggata tgccagtaca gatgcctgat 840

ctcgcgcgcc acggccttca gttcgtcgtc tgacactgcc gattttggtt gttctgagca 900

gcgtagcatc ggcacgcgaa gcgatccgcc acagccagcg caaccgaaga tcgtaagcgt 960

ttcgaaagct ggcttgcagg aaagggggtg tttgtatgtg ggcggccctg tatgtacgta 1020

cctggtcata cccgctgctc ggtcccgcca ggcgccctcc gggcatcaac cgtcctgcac 1080

ctggtcaact ctcccatgtc cccagagggg ccccctagcg gctccgacta cggcgcggac 1140

actcccgacg ctggacgcaa aaaaaggccg gcgatccgca cggcctttct atttttcgtt 1200

accttttcgt tactccgggt agaactccgg cgacagcacc tgctcgggta tccacggcca 1260

ctgctcgggg aacacgtcca ggccagtctc gtccacagcc gccgagaccg catccgccca 1320

gatctcttcc ttccaatccg gatcagccaa catcggctgc aggctgggcg tccgatgcaa 1380

ccgcgccaga attgcgcgac gctgttcctt gatcgtgcgc tgccagctcg aaccccggcg 1440

gcccggctga tattgccact tgagcaaatg cgccagcagt accgccatgc ggcttgccaa 1500

ctcccgctgt tcgctcttgc ccacgtcctc aatctcctcc gcgatgtgcc gaatgtcgat 1560

gtctgaaagc ttgccggccc gcaacagcgc cgcctgctca ctggcccacg ccaccacgtc 1620

cacttcgtag ctcgttccca taacgcgctc cctccaataa ccggatcatt ttagacgttt 1680

cgcgttacgc cttgcgcgta acgactttgc gatcaccata aattgcctcg ccagccgctt 1740

gcatctgcgc ctcactcacg gccacagaac ggacaaacga agcgcgccac aactcggact 1800

cccgcacctt ctggcgctgt tcgaacgtat tcgccttcgc agccaacgcg agcaagtcca 1860

gcattgcgtc gaacgaaacg ggatttccgt tactcggcgt aacggatttt tgctgcgact 1920

caaacatcgc aaccttctct tccaagacgc caacataacg caacgcttcc tgacgcccgt 1980

cctcgcacgt cataagctgc cggcgcaacg cctcaatctc cgcaagattt ccgttactca 2040

gcgtaacgga tttggcggca tcgctgatct cttccctcag ccgcctattc tcagcaaacg 2100

ccttattgcg ttcagcctcc gccagctcca cctggcgacg catgctcacc agatcagcgc 2160

gaaacttctc gacctccagg cggcattcat cgtaagcatc cacgtcggaa agcatttccg 2220

ttacggtcat acgcttagta acggatttag cctcaacagg ctgctgagcc ttacggcgag 2280

ctcgatatgc ggcttgacgc tccgcgttgg tcatagcgtg cgccttacgc ggacgaccgc 2340

ggccacgcct ttgctccatc cccggcagat cgaccgtcac attatccgtt acgtcacgca 2400

tattcggctc ccgatttgat gattccattt tacgttactg gtaacggcaa ttcaattatc 2460

gttacaattt agttcgtaac ggaaatttcg cgagcagccc cggcgctaga cgccctcagc 2520

gggctttgga gccgtttttt ctgactgggc ggtcgcaggg gtcagctgcg ccgaaattgg 2580

ctcctgcgcc gcttgtggct cgcggtaggg gtcaaacggc ggcctcctga tccactcccg 2640

acactgcatg tcatcgaggc cggcatccgt gccttgagcc gtgtagcacg tgcacctggt 2700

cgacgtgcag gcaccgccga tcaccgtcgg catcgagcga atctggcgca actgcgcata 2760

ggccggcgcc gtctcaggcc ggccagagac agcagggacg aacgccgcga ggatctccgc 2820

cccgtccgtc gccgcggcgg acggacccgc cttgaccgct accgctagag ctgaagccac 2880

accgcccctg ccctgctcgg ccgcaacagg cttagccgga gtcgccgtcg tcaactggcc 2940

ggtacggtaa tagacccggt acgccaagaa cgccgcgatc aacacgcagg cgatgaacag 3000

catcagcacc ggcggtacgg tgtacttgcg cttgatgtgc agactggagg acttgtacag 3060

gccgaaactg gacttcggca ggctccactt cttcttgatc ggcgcggtgt tgaacgtctc 3120

cgggttcgcg cactccggcc attcgtagta ccagcgtccg agcaagccag cgtcccgcag 3180

gtggacatgc tgccccacca gcttgcggat atgactgtcc aagaacgtcg ggttctgcgt 3240

gatcagaaca aacgtcacgc cggtatgccg caccgtctca aacgccgcca cgtggtcagg 3300

caccttggac ccggccgtgc ggacgcgaaa cacccgctgc gcctcatcca acacgatcag 3360

cgagttcggc gggaaggtga agtacggcag catcatccct gggttttcag ggtcttcgcg 3420

cagctccgtc cagtccgaaa ccgccggcgt cgggatatac ggcagcttca gctccgggat 3480

gcccatgacg aagagcggac gcccctggtc gacggctgcc ttcatcatct ggaccgccaa 3540

cgcggtcttc ccgccaccag gcgtggccgt gatcagcgtg atcggttgcg ttgcgctcat 3600

gtcagcttgc ccagccgctt cagagtgatc atggagatgc gcgcggtgat gccgccggcg 3660

atgatcgaca gcccggtgaa gacaccgccc cgcgccagga tggccgcagc aacggcaggc 3720

atgccggcca ggctactctt ggccgcgccc agggcagcgc tcaccgccgc atccaacccg 3780

acataggtga tcagaccgat cccgagcgac accagtagct gacgcgcgag tggcccaacg 3840

agggccatga ggaacccagc gagcggcatc actcctcccc tttacggcct acgccgatga 3900

cgatcagcgc agcgcccaac catgcgcacg cgatgatgac cggtcgaaac atgtcagcac 3960

cgtcacagac cggtttgagc gaccaagaga tcggcatgcc gtggatggag gcggtcagat 4020

cggacggaca cggtgcggta tctgcgcccc aaccgctgtc cggcatgacc ttgacgttga 4080

cctgctgctc cttcagatcg ggcccgtccg gtatctcgcc ttgctcgata caacccatgc 4140

gcgtctcatg gcccgagcac tggtcgtcct gccgctccgg agccttgccg ttaccagtcg 4200

ccggatccgt cgccggattg ccgttcgcat ccacctcctg cttagcggtc gtcaacgtgg 4260

ctgtcttgcc atcggaattt ggcgtgaccg tagcaacatc gcggtaacgc ttacctgtaa 4320

cgggatcaac gtacgggtcg ctcagattga cgttgactgg agtggtggac ggcgtgagct 4380

tcaccggaat cggcaccttg gctgcggcca tatcgctagc aacagcagcg ggcagcggat 4440

acgtcaaacc tttgttccaa tccgcatcgc ttgcgcccac cgtcggaccg gcagggtcgg 4500

gcacacatgc cgagccactc acgacatagc catcaacgca gctggacgcc tgactcgtgc 4560

ccgcatagaa attgtcgccg ccatcgttgg tgtaatggca ctcatagctc gtcccattac 4620

cggtagcttt catacccgcg aacttagcct tctgcccagc caaatacgcg tctgccgcca 4680

acatcgcaga gcacgcggcg ccaggagaag cagcaacgcc attcgcgata ttgccgccgg 4740

tggcggacgt gttgtagccg taattccagc cccagccatt gaaccccgtg tcgccagcag 4800

ccggtgaccg cttcgatgtg caccacgtac cgtccaggca cttctggatg ccgagctgcg 4860

ccaagtaggc caacgacgtc gcggtcgcga tcgcaggcgt cgcacgaagc gcggccagcg 4920

caacggcagc agcgccttcg cccaccgtca tcgttgcggc gatcgtggcg gcacctgcgc 4980

caaccgcggc acgcatctcg gtagccgtcg caacttcaga cagcgtcaca gcaccagtcg 5040

tgacataccc agtccccgtc aacacgatgt tcggcggcgg aatcaacggg atggtcgaag 5100

cccacgcgga cgacgcccac cagcagagca gcagcacgag cacgcgcatc acagccccct 5160

gaaaatgatt actgccggca gaaccggcag caggaatccg gcccagagcc agaaatcgat 5220

cgcgagcatc acagcccctt tttcatcacc accagcgccc aggccgccac catcgcggca 5280

acgacgcccc accccatcgt catgccatcc ttgaagctct cttgcgggtc acatgccgga 5340

aacgacagcg acggcaacga cgcatcggtc aacgtgccga cgctcccatc actgcccacc 5400

tgataccgcc gcagcaccca cccgcccgtg gtcttgacga actcagacag ataggtgact 5460

gccccaggtg tctgcgacgg agcgacggcg ctgtaatagg catccgtggc catgcccaca 5520

tcggcaaagc accgtgcgcc caccaacgcg ccgtcagcag ccatcacacg ctccgacgca 5580

tgtacttgaa cgtcgcaatg ccgatcacga tgatcagcgc caggcccgcc agcgtggcgg 5640

tgtccgcctt cgaatcggac atggcggtag caacgtcggt cggcaccgca gccatcgccg 5700

aaccggccag tgcaacggta cccgcggcaa cagcagccgc cttgctcttg atgctcttga 5760

acatggtttt ctccttgaga tggaggttga gaaaagctcc gggccgttca actcccagag 5820

ccagggaaca tcacgccttc ttgggctcag cctcagcacg ctgcagcggc ttgatgctcg 5880

taacgacctt ctgaccgccc ttatccttgc cgttgctcgt ctcgaccatc gagacttccg 5940

cgatgaacgg gaacgggttg tggatgatcg ccttcacaac cgcagagctc tcgcacttca 6000

gctcctgcgt gcaggtgccc ttcgagtctt cgccacgcag ctccacatcc gtgtagatct 6060

tcccggtgtc cagctgcttg ccatccatgt tgccaaccca cgtcttggcg ccccggatgg 6120

tcacgcgtgc aatcatttcc atggtttcac tcctcaggtt tcggcactgg atcgtgcgtg 6180

ccgtacacgt gcctcgccag ggcggatttg tgcagctgag ccggtacgcc ctgacggcgt 6240

atcgcgacaa ccagcgcagc gatgtcttcc tctgtgcagc gcagctcgta atcgaccgta 6300

gggccgaact gcgtctggat gtgcttgagc ttgcgttcgc ggatggtctc gtcctgaagc 6360

tccaaggcct tgacctggtc agtaggaacg cgctgcggat ccgcagccat gaaggcctcc 6420

agggccttgt acgcaccagc gaagtactgg tcgcgcttga taaggatttc gtgcggaatc 6480

acgcgatcct tggcgccgaa ctcgatctcg agacgcaccc actcgctatc ctgattgccg 6540

agctggcggc ccttctcgta agcccgcagc atcttgccgt tcgcccgacg gccaatctcg 6600

aacgtcgtac cgcgacagcc cttgctgccc gccacgccgc tctcgatctt gcgatacgtc 6660

gggatacgcc cgcccgcgtt gaagtcgccg gcgtagtaca gctcttccat ctgcgcgatg 6720

ctcacctcgc cctggcagaa gtccatcgcc aggtcgcacc gcgtgatccg cgcgtcgagg 6780

tcctgcacca tcgcgtagac ggcttgccag tcgccaatcg cggtgcagcc ctgccccggc 6840

cagtccacca ggatcgtgcc gccaacgtgc tcgccgccgc aggcaacgat cccgagcttc 6900

atcgtctcgc cgttgatgaa cgccagcagg tcgtagctga actcataccg gcggaaccct 6960

ttgcccgcag gcttcatcgt caccggcacc gagaacacca gctggaagta cctgcgcagc 7020

tgctccaggg cgtcgctgat gctgccgtcg ggcaggaacg tgaacttgaa ccagtccacg 7080

atcgcacctg ccttgcgttc tggactttcc ccgggtttta ccggacccgg ggaacggcct 7140

gtcggccgcc cagcctcgct ccgctcggcc cggtcggccg ccatgccgtt ctcgcgtgcg 7200

agcgccggcc catgaactcc atacgcaatg cctgtgggat caagatgacg agagggggtg 7260

ggacggacgc gcatcagcgt gcgccctcgc agcgatacca gttcgccaga tcggcctggc 7320

gcgagttctt caggaggtcg tcaatgcgat gcatcgcagg acgcgattgc aggcagcagg 7380

cgccgcgcag aacggcagcc atcacgatgg ccagctgcgc accgtgcggg tgaagcacgt 7440

cgccaatcag gtccagctgc ctatggtctc tctgctgcat 7480

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

cgcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta 60

tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca 120

catatgaatc aatggctact ggtaggtgcc ttggcagcgc ttgccgtggg actgcgccgc 180

cactatctgg atcggccgac gcagccgatc tatgccaagg attttgaggg cgagatctac 240

cggatcgggg cctgccatgc cctggtgcgg cgggcgcatg gcaagccgcg caccagcgtg 300

gtctgcgtgc ccggattcct ggaggaagtc tggtatttcg acggtttata cgacgatccc 360

cacaccgaat gcatctatct caacaacgcc gattaccacg tcaccaccgt gtcgcccgag 420

gcgcgcaccc agcagcccga atgggatcga cccttgccct atgccgtggg caccatcgcc 480

catgacgcgg ccgtactgaa tctcgtgctt gaacatctgg ttcatgccga tcaggtccga 540

ttgcatggtc attctcgcgg cggcgccgtg gtgctggaag cggcgctgca gcgccccgac 600

ctgcaccacc gtgcgggacg cgacatcgaa tatgtcctgg aggcgcctgt gttgccgcag 660

ggacgcattc atcccagcct gggggtggca gccaccgggg tcgggctctg gctgctgccg 720

gcgttgatgc cgctgttaca gcgcctgccc atgcggcgac tgggtcgcct ggtcttcggc 780

ccccccagcg gccagaagct ggagctggcc tcccggctgt ggttcaacgc caaacgggcg 840

cgcaccatcg tcacgaacgt gcgcgatatc gaatcctgga tggcctcgcg gaccacggct 900

gcctatgaag tcctgcgggg cgcgcgtggg tggatcatgg tggccgagat ggatctgatc 960

ctcagccgtc gccacatggc ccgcagcgcc catcaggcgg ggggcacgat caccgtcctg 1020

gaaattccgg ccacctccca catgctggcc caggatgccc caggcgagat tcccatgctg 1080

accggcagcg aacctgcctc tcgcaaaacg ggttcccatc atcatcatca tcactga 1137

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ctgtctctta tacacatctc aaccatcatc g 31

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tcactgatct agaccgccac ggttgatgag agct 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gtggcggtct agatcagtga tgatgatgat gatg 34

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

ctgtctctta tacacatctc gcgcaacgca attaatgtga g 41

Claims (5)

1.一种重组噬菌体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取丝状噬菌体复制型DNA；

(2)制备带有目的基因的Tn5转座子DNA；

(3)体外插入转座子DNA：取等摩尔量的丝状噬菌体复制型DNA和转座子DNA，在Tn5转座酶的作用下，37℃孵育2h；

(4)转化大肠杆菌DH5αλpir：采用热激法，利用步骤(3)获得的反应物转化经氯化钙处理制备的大肠杆菌DH5αλpir感受态细胞；

(5)制备混合质粒文库：收集步骤(4)的大肠杆菌转化子，加入液体培养基，混匀，利用SDS碱裂法提取混合菌液中的质粒；

(6)转化宿主细胞：采用电激法，利用步骤(5)提取的混合质粒文库转化丝状噬菌体的宿主细菌，经筛选，获得转化子；

(7)筛选重组噬菌体：随机挑取多个经步骤(6)的转化子，接种于液体培养基中，震荡培养，离心，滤过上清液；将滤液与丝状噬菌体的指示细菌混合培养，于不同时间点检测指示细菌的抗性来判断重组噬菌体的活性；

(8)检测目的基因的表达：将具有活性的重组噬菌体感染宿主细菌，提取感染后细菌的总蛋白，使用外源目的基因所编码蛋白的抗体，通过蛋白免疫印迹检测目的基因的表达情况。

2.根据权利要求1所述的重组噬菌体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中丝状噬菌体为青枯雷尔氏菌的丝状噬菌体RSCq，其复制型双链环状DNA共计7480bp，序列见SEQ IDNo.1。

3.根据权利要求1所述的重组噬菌体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中Tn5转座子DNA两侧为Tn5转座酶的识别序列，且内部包含丝状噬菌体复制型DNA在大肠杆菌中复制所需的复制起始位点ori、用于筛选卡那霉素抗性的Kan^R基因、以及带启动子和翻译元件的目的基因。

4.根据权利要求1所述的重组噬菌体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中目的基因为通过商业化基因合成服务合成的由lac启动子控制的降解青枯雷尔氏菌群体感应信号分子的酯酶elp104 DNA，序列见SEQ ID No.2。

5.根据权利要求1所述的重组噬菌体的构建方法，其特征在于，步骤(3)的反应体系为：RSCq复制型DNA 5μL、转座子DNA 3μL、EZ-Tn5 10X反应缓冲液1μL、EZ-Tn5转座酶1μL，总计10μL。

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