JP2023540427A - Ｈｓｖ－１遺伝子編集のためのガイドｒｎａおよびその方法 - Google Patents

Abstract

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が提供され、そのｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）のＩＣＰ６遺伝子中の標的配列に標的化して特異的切断事象を提供可能であるガイド配列を含み、その標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む。ＨＳＶ－１遺伝子編集システム、および上記ｇＲＮＡを使用することによって所望される組換えＨＳＶ－１を生成するための遺伝子編集方法もまた、提供される。

Description

（分野）
本明細書において開示される実施形態は、遺伝子編集の分野に関し、特に、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）のＣａｓ９媒介性遺伝子編集のための人工ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に関する。上記ｇＲＮＡを使用することによるＣａｓ９媒介性遺伝子編集方法が、さらに開示される。

（背景）
１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１；その分類学的名称であるヒトアルファヘルペスウイルス１によってもまた公知である）は、ヘルペスウイルス科シンプレックスウイルス属の二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＳＶ－１は、１５２，０００ヌクレオチドを含む。過去数十年間において、ＨＳＶ－１は、がんを処置するための種々の腫瘍溶解性ウイルスを生成するために改変されてきた。それらのうち、組換えＨＳＶ－１株ＯｒｉｅｎＸ０１０（ＩＣＰ３４．５－／－、ＩＣＰ４７－、ＩＣＰ６－）は、臨床試験進行中である腫瘍溶解性ウイルスであり、元のＩＣＰ３４．５遺伝子に２コピー挿入されたヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子と、ＩＣＰ６遺伝子内の未公開の不活性化改変とを含む。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換えが、特に遺伝子挿入のために、ＨＳＶ－１の遺伝子編集を改善するために使用されている（Ｄｏｎｇ Ｗａｎｇら（２０１８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２５（５～６）：９３～１０５）。しかし、種々のＨＳＶ－１変異体の間の差異に起因して、既存の遺伝子編集方法は、全ての種類のＨＳＶ－１変異体に適用可能であるわけではない。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して上記ＨＳＶ－１変異体ＯｒｉｅｎＸ０１０の改変されたＩＣＰ６遺伝子領域を編集することは、容易には達成できない。
現在、そのような種類のＨＳＶ－１変異体のための効率的な遺伝子編集方法を開発する必要性が、依然として存在する。

Ｄｏｎｇ Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２０１８）２５（５～６）：９３～１０５

（要旨）
本明細書において開示される実施形態は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に関し、そのｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）のＩＣＰ６遺伝子中の標的配列に標的化して特異的な切断事象を提供可能であるガイド配列を含み、その標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む。

一部の実施形態は、上記のｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドに関する。

一部の実施形態はまた、ベクターに関し、そのベクターは、適切なプロモーターに作動可能に連結された上記の第１のポリヌクレオチドを含み、そのベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを必要に応じてさらに含む。

一部の実施形態はまた、１つの上記のベクターと、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む。ベクターシステムに関する

一部の実施形態はまた、ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である上記のベクターまたはベクターシステムで形質転換された、形質転換体細胞に関する。

一部の実施形態はまた、上記のｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを含む、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体に関する。

一部の実施形態はまた、ＨＳＶ－１のための遺伝子編集システムに関し、そのシステムは、
（ａ）ＩＣＰ６遺伝子中に標的配列を含むＨＳＶ－１株であって、その標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む、ＨＳＶ－１株；
（ｂ）ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である、上記のベクターまたはベクターシステム；ならびに
（ｃ）上流相同性アームと外因性遺伝子と下流相同性アームとを順次に含む標的化ポリヌクレオチドであって、その上流相同性アームおよび下流相同性アームは、別々に、上記ＨＳＶ－１の標的ドメインの５’領域および３’領域と相同であり、その標的配列は上記ＨＳＶ－１の標的ドメイン内に位置する、標的化ポリヌクレオチド；
を含む。

本発明はまた、組換えＨＳＶ－１を生成するための遺伝子編集方法に関し、その方法は、
（ａ）ＨＳＶ－１株を提供する工程であって、そのＨＳＶ－１株はＩＣＰ６遺伝子中に標的配列を含み、その標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む、工程；
（ｂ）ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である上記のベクターまたはベクターシステムを構築する工程；
（ｃ）相同組換えを介して上記ＨＳＶ－１の標的ドメイン中に外因性遺伝子を挿入可能である、標的化ポリヌクレオチドを含む直鎖ＤＮＡを調製する工程；
（ｄ）そのベクターまたはベクターシステムを細胞に形質転換して第１の形質転換体細胞を得る工程；
（ｅ）その直鎖ＤＮＡをその第１の形質転換体細胞に形質転換して第２の形質転換体細胞を得る工程；および
（ｆ）その第２の形質転換体細胞にそのＨＳＶ－１株を感染させてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換えをその第２の形質転換体細胞において生じさせる工程であって、そのｇＲＮＡはそのＣａｓ９タンパク質をその標的配列に標的化して特異的切断事象を提供し、その後、その外因性遺伝子は相同組換えを介してその標的ドメインに挿入される、工程；
を含む。

本発明はまた、上記の遺伝子編集方法によって生成された、組換えＨＳＶ－１に関する。

図１は、ＨＳＶ－１標的株の部分的ＩＣＰ６配列（配列番号１７）およびＨＳＶ－１株１７の配列アラインメント比較を示す。

図２は、ｇＲＮＡ切断効率アッセイのゲル電気泳動結果を示す。レーン１はＤＮＡマーカーを含み、レーン２～７はｇＲＮＡ１～６についての結果を示し、レーン８は、Ｃａｓ９インビトロ切断キット（Ｉｎｏｖｏｇｅｎ Ｔｅｃｈ．Ｃｏ．、カタログ番号ＰＣ１４００）において提供された陽性対照を含む。

図３は、プラスミド「ｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒ」の遺伝子地図を示す。

図４は、ＨＳＶ－１のＩＣＰ６座位にＥＧＦＰを挿入するための本発明のＣａｓ９／ｇＲＮＡ媒介性相同組換えの概念を示す図式である。

図５は、得られた組換えＨＳＶ－１の２段階ＰＣＲ同定のゲル電気泳動結果を示す。レーン２～６は（プライマー対ＨＳＶ１－ＧＦＰ－ＫＩ－Ｆ１およびＨＳＶ１－ＧＦＰ－ＫＩ－Ｒ１を用いた）第１段階ＰＣＲの結果であり、レーン２～５は、それぞれ組換えＨＳＶ－１サンプル１～４からのＰＣＲ産物を含み、レーン６はＨＳＶ－１標的株からのＰＣＲ産物を含む。レーン８～１２は（プライマー対ＨＳＶ１－ＧＦＰ－ＫＩ－Ｆ２およびＨＳＶ１－ＧＦＰ－ＫＩ－Ｒ２を用いた）第２段階ＰＣＲの結果であり、レーン８～１１は、それぞれ組換えＨＳＶ－１サンプル１～４からのＰＣＲ産物を含み、レーン１２はＨＳＶ－１標的株からのＰＣＲ産物を含む。レーン１，７および１３はＤＮＡマーカーを含む。

図６はプラーク精製の結果を示す。緑色蛍光プラークが灰色の矢印によって示されており、緑色蛍光のないプラークが黒色の矢印によって示されている。上側のパネルは、蛍光顕微鏡によって観察された結果を示した。下側のパネルは、非蛍光式光学顕微鏡によって観察された結果を示した。

（発明の詳細な説明）
別な様式で定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、以下の定義は、本発明を記載するために使用される種々の用語の意味および範囲を示し定義するために示される。

（定義）
本明細書において使用される場合、用語「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」は、本明細書において互換可能に使用され、Ｃａｓタンパク質に結合し得てそのＣａｓタンパク質を標的配列（例えばＤＮＡ配列）内の特定の位置に標的化するのを助け得るＲＮＡ分子（または集団としての一群のＲＮＡ分子）を指す。「ｇＲＮＡ機能性」を有する天然に存在しない（人工）ｇＲＮＡは、天然に存在するガイドＲＮＡの機能（例えばＣａｓタンパク質と会合すること、または特異的切断事象を提供するためにＣａｓタンパク質と会合したそのガイドＲＮＡによって行われる機能）のうちの１つもしくはそれ以上を有する、ｇＲＮＡである。

用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」とは、野生型Ｃａｓタンパク質、そのフラグメント、またはそれらのバリアントを指す。用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９タンパク質」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」または「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」とは、ｇＲＮＡと会合可能であり標的ＤＮＡ配列を切断する、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、そのフラグメント、またはそれらの変異体もしくはバリアントを指す。概して、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインとを含む。

一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列（すなわちＮＧＧ）を認識するＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼである。

用語「Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体」とは、標的ＤＮＡにて特異的切断事象を協同的に提供し得る、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとを含む複合体を指す。

用語「ガイド配列」とは、標的ＤＮＡの標的配列と相補的な、ガイドＲＮＡの配列を指す。概して、ガイド配列は、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる約２０ヌクレオチドのＲＮＡ分子である。

用語「標的配列」とは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によって標的化されて切断される、ＤＮＡ配列を指す。その標的配列は、ｇＲＮＡのガイド配列と相補的であり、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５’末端に位置する。その標的配列は、約１５～約２５ヌクレオチドの配列である。一部の実施形態において、その標的配列は、２０ヌクレオチドの配列である。

用語「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」とは、Ｃａｓ９タンパク質によって標的化される標的配列のすぐ後に続く２～６塩基対のＤＮＡ配列を指し、そのＣａｓ９タンパク質が特異的切断事象を提供するのを助ける。例えば、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（例えば、ＣＧＧ、ＡＧＧ、ＴＧＧおよびＧＧＧ）である。

用語「特異的切断事象」とは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によって引き起こされる特異的ＤＮＡ切断を指し、その切断プロセス中に生じるオフターゲット効果は存在しない。

用語「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、それは、さらなるＤＮＡセグメントが、例えば標準的分子クローニング技術によって挿入され得る、環状二本鎖ＤＮＡループを指す。

用語「形質転換体細胞」とは、細胞外ＤＮＡ（外因性、人工または改変型）で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を指し、その中に含まれている遺伝子を発現し得る。

用語「相同組換え修復（ＨＤＲ）」とは、修復を誘導するために相同性テンプレートを使用して二本鎖ＤＮＡ切断を正確におよび精密に修復する、細胞中の機構を指す。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組換え（ＨＲ）であり、これは、ヌクレオチド配列が２つの類似または同一のＤＮＡ分子間で交換される型の遺伝的組換えである。

用語「相同組換え（ＨＲ）」とは、２つの相同なＤＮＡ分子間で生じるＤＮＡの交差を指す。相同組換えは、細胞において外因性遺伝子を挿入するためまたは所望される遺伝子を欠失させるための、一般的な方法である。

用語「標的化ポリヌクレオチド」とは、相同組換えを介するＤＮＡの交差のために使用される合成された配列を指し、それは、上流相同性アームと下流相同性アームとを概して含み、（挿入または欠失の目的に依存して）外因性遺伝子を必要に応じて含む。用語「標的化ベクター」とは、標的化ポリヌクレオチドを含むベクターを指す。

用語「標的ドメイン」とは、相同組換えのために選択されるＨＳＶ－１の配列を指す。その標的ドメインは、標的化ポリヌクレオチドの上流相同性アームに相同な５’領域と、その標的化ポリヌクレオチドの下流相同性アームに相同な３’領域とを通常は含む。標的配列がＨＳＶ－１の標的ドメイン内に位置し、その標的配列において生じた特異的切断事象は、その標的ドメインにおける相同組換えを増強する。

（詳細な説明）
詳細には、本発明は、Ｃａｓタンパク質を１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）のＩＣＰ６遺伝子中の標的配列に標的化して特異的切断事象を提供可能であるガイド配列を含む、人工ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に関し、その標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む。特に、本明細書において使用されるＣａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。

一局面において、本発明は、上記のｇＲＮＡに関し、そのＩＣＰ６遺伝子は、ＧＡＴＣ配列を挿入することによって引き起こされた不活性化ＩＣＰ６タンパク質を発現する。別の局面において、そのＩＣＰ６遺伝子は不活性化ＩＣＰ６遺伝子である。

一実施形態において、そのＩＣＰ６遺伝子は、配列番号１７のヌクレオチド２５～６４に対応する配列を含む。別の実施形態において、そのＩＣＰ６遺伝子は配列番号１７を含む。

本明細書において適用されるＨＳＶ－１は、上記のＩＣＰ６遺伝子特徴（すなわちＧＡＴＣ挿入）を有するあらゆるＨＳＶ－１変異体であり得る。一実施形態において、本明細書において適用されるＨＳＶ－１は、配列番号１７のヌクレオチド２５～６４に対応する配列を含む。一実施形態において、本明細書において適用されるＨＳＶ－１は配列番号１７を含む。例えば、使用されるＨＳＶ－１は、配列番号１７を生じるようにそのＩＣＰ６遺伝子中にＧＴＡＣ配列を挿入されている、野生型ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－１株ＣＬ－１（ＣＧＭＣＣ １７３６）またはＨＳＶ－１株１７であり得る。

別の局面において、使用されるＨＳＶ－１は、配列番号１７を生じるようにそのＩＣＰ６遺伝子中にＧＴＡＣ配列を挿入されている、あらゆる既存の改変型ＨＳＶ－１であり得る。例えば、使用されるＨＳＶ－１は、配列番号１７を生じるようにそのＩＣＰ６遺伝子中に挿入されたＧＡＴＣ配列を含む、株ＯｒｉｅｎＸ０１０であり得る。

別の局面において、本発明は、上記のｇＲＮＡに関し、その標的配列は、配列番号１７のヌクレオチド２５～６４のうちの２０ヌクレオチドセグメントの配列である。一実施形態において、その標的配列は、配列番号１７のうちの２０ヌクレオチドセグメントの配列を含む。

別の実施形態において、その標的配列は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３からなる群より選択される配列を含む。特定の実施形態において、その標的配列は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３からなる群より選択される。例えば、その標的配列は配列番号２１である。

別の局面において、本発明は、上記のｇＲＮＡに関し、そのガイド配列は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８および２９からなる群より選択される配列を含む。一実施形態において、そのガイド配列は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８および２９からなる群より選択される配列である。例えば、そのガイド配列は配列番号２７である。

概して、人工ｇＲＮＡは、標的遺伝子中の標的配列と相補的なガイド配列と、Ｃａｓ９タンパク質に結合し、標的配列切断を引き起こすためのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成するＣａｓ９関連配列とを含む。一部の実施形態において、そのガイド配列は、ＨＳＶ－１のＩＣＰ６遺伝子中の標的配列と相補的である。ｇＲＮＡのＣａｓ９関連配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、
である。

特定の局面において、本発明は、ｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドに関し、そのｇＲＮＡは、上記のガイド配列およびＣａｓ９関連配列を含む。

特定の局面において、本発明は、適切なプロモーターに作動可能に連結された上記のｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドを含むベクターに関し、それは、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを必要に応じてさらに含む。

特に、本発明は、適切なプロモーターに作動可能に連結された上記のｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドと、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む、ベクターに関する。例えば、本発明のベクターは、実施例３において構築されるプラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒであり得る。別の局面において、ｇＲＮＡを発現するための適切なプロモーターはＵ６プロモーターであり得る。

特定の局面において、本発明は、第１のベクターと第２のベクターとを含むベクターシステムに関し、その第１のベクターは、上記のｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドを含み、その第２のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。

別の局面において、本発明は、ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である上記のベクターまたはベクターシステムで形質転換された、形質転換体細胞に関する。特に、本明細書において使用される形質転換体細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞またはＨＥＫ２９３細胞が挙げられるがこれらに限定はされない。一実施形態において、その形質転換体細胞はＶｅｒｏ細胞である。

特定の局面において、本発明は、上記のｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを含む、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体に関する。

特定の局面において、本発明は、ＨＳＶ－１のための遺伝子編集システムに関し、その遺伝子編集システムは、
（ａ）ＩＣＰ６遺伝子中に標的配列を含むＨＳＶ－１株であって、その標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む、ＨＳＶ－１株；
（ｂ）上記のｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である、上記のベクターまたはベクターシステム；ならびに
（ｃ）上流相同性アームと外因性遺伝子と下流相同性アームとを順次に含む標的化ポリヌクレオチドであって、その上流相同性アームおよび下流相同性アームは、別々に、上記ＨＳＶ－１の標的ドメインの５’領域および３’領域と相同であり、その標的配列は上記ＨＳＶ－１の標的ドメイン内に位置する、標的化ポリヌクレオチド；
を含む。

特定の局面において、本発明は、組換えＨＳＶ－１を生成するための遺伝子編集方法に関し、その遺伝子編集方法は、
（ａ）ＨＳＶ－１株を提供する工程であって、そのＨＳＶ－１株はＩＣＰ６遺伝子中に標的配列を含み、その標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む、工程；
（ｂ）上記のｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である上記のベクターまたはベクターシステムを構築する工程；
（ｃ）相同組換えを介して上記ＨＳＶ－１の標的ドメイン中に外因性遺伝子を挿入可能である、標的化ポリヌクレオチドを含む直鎖ＤＮＡを調製する工程；
（ｄ）そのベクターまたはベクターシステムを形質転換体細胞に形質転換して第１の形質転換体を得る工程；
（ｅ）その直鎖ＤＮＡをその第１の形質転換体に形質転換して第２の形質転換体を得る工程；
（ｆ）その第２の形質転換体にそのＨＳＶ－１株を感染させてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換えをその形質転換体において生じさせる工程であって、そのｇＲＮＡはそのＣａｓ９タンパク質をその標的配列に標的化して特異的切断事象を提供し、その後、その外因性遺伝子は相同組換えを介してその標的ドメインに挿入される、工程；
を含む。

本発明の遺伝子編集方法において、そのＩＣＰ６遺伝子は、ＧＡＴＣ配列を挿入することによって引き起こされた不活性化ＩＣＰ６遺伝子である。別の実施形態において、そのＩＣＰ６遺伝子は部分的に欠失されている。特定の実施形態において、そのＩＣＰ６遺伝子は、配列番号１７のヌクレオチド２５～６４に対応する配列を含む。特に、そのＩＣＰ６遺伝子は配列番号１７を含む。

本発明の遺伝子編集方法において、その標的配列は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３からなる群より選択される配列を含む。一実施形態において、その標的配列は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３からなる群より選択される。特定の実施形態において、その標的配列は配列番号２１である。

特に、工程（ｃ）の直鎖ＤＮＡは、上記標的化ポリヌクレオチドを含む相同組換え（ＨＲ）標的化ベクターを制限酵素で消化することによって得られる。所望される標的化ポリヌクレオチドを挿入するために使用されるＨＲ標的化ベクターは、市販のベクター（例えばｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔクローニングベクター）であり得る。

特に、工程（ｃ）の標的化ポリヌクレオチドは、上流相同性アームと上記外因性遺伝子と下流相同性アームとを順次に含み、その上流相同性アームおよび下流相同性アームは、別々に、上記ＨＳＶ－１の標的ドメインの５’領域および３’領域と相同であり、その標的配列は上記ＨＳＶ－１の標的ドメイン内に位置する。

特に、上記ＨＳＶ－１の標的ドメインは、５’領域にある上流相同性アームと、３’領域にある下流相同性アームとを含み、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムによって切断される標的配列が、その標的ドメイン内に位置する。一実施形態において、上記ＨＳＶ－１の標的ドメインは、部分的ＩＣＰ６遺伝子セグメントとＵＬ４０遺伝子とを含み、その上流相同性アームはその部分的ＩＣＰ６遺伝子セグメントの上流配列と相同であり、その下流相同性アームはその部分的ＩＣＰ６遺伝子セグメントの下流配列およびＵＬ４０遺伝子と相同であり、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムによって切断される標的配列が、その部分的ＩＣＰ６遺伝子セグメント内に位置する（図４において示されるとおり）。

上記上流相同性アームは、上記ＨＳＶ－１の標的ドメインの５’領域と相同である。一実施形態において、その上流相同性アームは配列番号１２の配列を含む。上記下流相同性アームは、上記ＨＳＶ－１の標的ドメインの３’領域と相同である。一実施形態において、その下流相同性アームは配列番号１３の配列を含む。

本明細書において使用される外因性遺伝子としては、以下をコードし得る遺伝子が挙げられるが、これらに限定はされない：（１）レポーター（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ｔｄＴｏｍａｔｏもしくはＺｓＧｒｅｅｎ）；（２）免疫調節性サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキン（すなわち、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９およびＩＬ－１０）、インターフェロン（ＩＦＮ）ならびに腫瘍壊死因子（すなわち、ＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－β））；（３）治療抗体もしくはその機能的フラグメント（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＬＡＧ３抗体および抗ＴＩＭ３抗体）；４）免疫応答を調節するための融合タンパク質；（５）ケモカイン（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０およびＣＣＬ２１）；（６）腫瘍アポトーシス関連因子（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）およびＰ５３遺伝子）；（７）抗血管形成因子（例えば、エンドスタチンおよび血管内皮増殖インヒビター（ＶＥＧＩ））；（８）腫瘍関連遺伝子発現を阻害するためのスモールＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡ）；または（９）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくは腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＡ、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、ＣＤ４０、およびＰＤ－Ｌ１）。

特定の局面において、本発明は、上記の遺伝子編集方法によって生成された、組換えＨＳＶ－１に関する。

（実施例）
本発明は、本発明のｇＲＮＡおよびＨＳＶ－１遺伝子編集方法を示す以下の実施例によってさらに例証されるが、これらに限定はされない。

（材料）
ＨＳＶ－１株ＣＬ－１を、２００６年６月１４日に受託番号ＣＧＭＣＣ １７３６でＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ）に寄託した。ＨＳＶ－１株ＣＬ－１は、ＨＳＶ－１株１７（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＣ＿００１８０６）と９９．５％配列類似性を有する。

ＨＳＶ－１株ＣＬ－１のゲノム（１５１１８０ｂｐ）を、ＣＮ１２８３８０３ＣまたはＣＮ１０１３７６８９３Ｂにおいて記載された相同組換え方法を使用することによって改変して、ＨＳＶ－１株ＯｒｉｅｎＸ０１０（ＩＣＰ３４．５^－／－、ＩＣＰ４７^－、ＩＣＰ６^－）（本明細書において以後は「ＨＳＶ－１標的株」と呼ぶ）を得た。簡単に述べると、そのような遺伝的改変は、ＩＣＰ３４．５遺伝子の欠失（５１３～１２５９ヌクレオチドおよび１２３９９９～１２４７４５ヌクレオチドにて２コピー）およびＩＣＰ４７遺伝子の欠失（１４４２３０～１４４４９６ヌクレオチドにて）、ならびに元のＩＣＰ３４．５遺伝子位置へのヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子の挿入を含んだ。さらに、ＧＡＴＣ配列を８８２５１～８８２５２ヌクレオチド間の部位（元のＩＣＰ６遺伝子は８５３２７～８８７４０ヌクレオチドに位置した）に挿入して、フレームシフト変異および上記ＩＣＰ６遺伝子の不活性化を生じた。従って、得られたＨＳＶ－１標的株は、配列番号１７に示される部分的ＩＣＰ６配列を有し、配列番号１７は上記ＧＡＴＣ挿入を含む。

図１において示されるとおり、ＨＳＶ－１標的株の部分的ＩＣＰ６配列（配列番号１７）とＨＳＶ－１株１７（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＣ＿００１８０６）との配列アラインメント比較を、実施した。ＨＳＶ－１標的株の部分的ＩＣＰ６配列（配列番号１７）は、ＨＳＶ－１株１７のゲノムＤＮＡの８９３２４～８９３９０ヌクレオチドと、上記ＧＡＴＣ挿入以外は同一である。得られたＨＳＶ－１標的株およびそのゲノムＤＮＡを精製し、以下の実験のために適切な条件で保存した。

本明細書において使用される配列を、手早い概説のために表１に要約する。
表１

（実施例１）
（ｇＲＮＡのガイド配列の設計）
ＧＡＴＣ挿入を含むＨＳＶ－１のＩＣＰ６部分的配列（配列番号１７）を標的として選択し、それを使用してｇＲＮＡのガイド配列を設計した。それらのガイド配列は、そのＧＡＴＣ挿入を網羅する２０ヌクレオチドのＩＣＰ６標的配列と相補的である。

生成されたＤＮＡ配列プールのうち、上記ＧＡＴＣ挿入を網羅する６個のＩＣＰ６標的配列を、候補として選んだ。６個のＩＣＰ６標的配列およびそれらの対応するＰＡＭ配列を表１に示した。
表１
（注記：「＋」はＤＮＡのセンス鎖を意味する。「－」はＤＮＡのアンチセンス鎖を意味する。ＰＡＭはプロトスペーサー隣接モチーフを意味する。下線は、挿入されたＧＴＡＣまたはその部分を意味する。）

表１のＩＣＰ６標的配列１～６のうちの１つを各々が標的にするｇＲＮＡ１～６の６個のガイド配列を、表２に示す。これらのガイド配列を含むｇＲＮＡ１～６をさらに分析して、それらの切断効率を評価した。
表２

（実施例２）
（設計したｇＲＮＡのインビトロ切断効率アッセイ）
切断効率アッセイを、Ｃａｓ９インビトロ切断キット（Ｉｎｏｖｏｇｅｎ Ｔｅｃｈ．Ｃｏ．、カタログ番号ＰＣ１４００）を使用し製造者の指示に従うことによって、実施した。簡単に述べると、Ｃａｓ９タンパク質（キット由来）と表２の設計したｇＲＮＡとＩＣＰ６標的ＤＮＡフラグメントとを、Ｃａｓ９反応緩衝液（キット由来）中で温度３７℃にて３０分間、共インキュベートすることによって、Ｃａｓ９切断反応を実施し、その後、その反応を、温度８５℃にて１０分間インキュベートすることによって停止させた。それらの結果を、ＤＮＡゲル電気泳動によって観察した。

それらのｇＲＮＡを、市販のｓｇＲＮＡインビトロ転写キット（Ｉｎｏｖｏｇｅｎ Ｔｅｃｈ．Ｃｏ．、カタログ番号ＰＣ１３８０）を使用することによって、合成されたポリヌクレオチドテンプレート（以下に示すとおり）から転写および取得し、その後、精製プロセスを行った。
（Ｎ^２０は、表１に示される、選択したＩＣＰ６標的配列であった）。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ＤＮＡテンプレートとしての材料の節において開示したＨＳＶ－１標的株のゲノムＤＮＡと、プライマー対ＩＣＰ６－ＦおよびＩＣＰ６－Ｒ（配列番号３０および３１）とを使用することによって実施して、ＩＣＰ６標的ＤＮＡフラグメント（５９４ｂｐ）を合成した。その際、変性温度、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度は、それぞれ９８℃、６１℃、および７２℃であり、反応サイクルは３５回であった。

その切断効率アッセイの結果を、図２に示す。ゲル電気泳動は、ｇＲＮＡ４（レーン５）が高い切断活性を示し、５９４ｂｐよりも小さい２つのバンドのＤＮＡ切断産物を生成したことを、明らかにした。その５９４ｂｐのバンドは、切断されていないＩＣＰ６標的ＤＮＡフラグメントを示した。ｇＲＮＡ１、２、３、５および６（すなわち、レーン２、３、４、６および７）は全て、弱い切断活性を示し、少量のＤＮＡ切断産物しか生成しなかった。

上記の結果によれば、ｇＲＮＡ４が、ＨＤＲを増強するｇＲＮＡである最も高い可能性を有する。従って、ＩＣＰ６標的配列４（配列番号２１）を、以下の発現プラスミド構築およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換えのために選択した。

（実施例３）
（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒの構築）
ＩＣＰ６標的配列４（配列番号２１）をプラスミドｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号４２２３０）中にクローニングするために、２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドＩＣＰ６ｇＲＮＡ４－ＦおよびＩＣＰ６ｇＲＮＡ４－Ｒ（配列番号１および２）を、４ヌクレオチド突出とともに、以下のとおりに合成した

それらの部分的に相補的なオリゴを、アニーリングプログラムによってアニーリングさせて、４ヌクレオチド突出を有する二本鎖ＤＮＡを形成させた。付着末端を有するその二本鎖ＤＮＡ（所望されるＩＣＰ６標的配列４を含む）を、ＢｂｓＩで予め消化したプラスミドｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９中にクローニングして、ｐＸ３３０－ＩＣＰ６ｇＲＮＡと呼ぶプラスミドを得た。そのＩＣＰ６標的配列４の首尾良いクローニングを、プライマー対Ｕ６－ｓｅｑ－Ｆ２およびＩＣＰ６ｇＲＮＡ４－Ｒ（配列番号１６および２）を用いたＰＣＲと、アガロースゲル電気泳動（ＰＣＲ産物は２４３ｂｐである）とによって確認した。

その後、プラスミドｐＸ３３０－ＩＣＰ６ｇＲＮＡをＤＮＡテンプレートとして使用し、プライマー対ＭｌｕＩ－ｇＲＮＡ－ＦおよびＳｐｅＩ－ｓｇＲＮＡ－Ｒ（配列番号３および４）を使用することによってＰＣＲを実施して、Ｕ６－ＩＣＰ６ｇＲＮＡフラグメント（配列番号５）を増幅した。その際、変性温度、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度は、それぞれ９８℃、５８℃、および７２℃であり、反応サイクルは３５回であった。そのＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル電気泳動によって分析および確認した（４７４ｂｐ）。増幅されたＵ６－ＩＣＰ６ｇＲＮＡフラグメントを再利用し、さらなる使用のために制限酵素ＭｌｕＩおよびＳｐｅＩによって消化した。

Ｃａｓ９遺伝子をプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ７９０２０）中にクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｃａｓ９と呼ぶプラスミドを得た。その後、得られたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－Ｃａｓ９を、制限酵素ＭｌｕＩおよびＳｐｅＩによって消化した。

その後、そのＭｌｕＩ／ＳｐｅＩで予め切断したＵ６－ＩＣＰ６ｇＲＮＡフラグメントとプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－Ｃａｓ９とをＴ４ ＤＮＡリガーゼを介して連結して、（図３および配列番号３６において示される）「ｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒ」と呼ぶプラスミドを得た。

その後、プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒを、Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１ファージ耐性化学的コンピテント細胞（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＤ５０１）中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、選択用培養培地において３７℃にて一晩インキュベートした。トランスフェクトされた細胞のシングルコロニーを選択し、そのようなトランスフェクションを、プライマー対ＭｌｕＩ－ｇＲＮＡ－ＦおよびＳｐｅＩ－ｓｇＲＮＡ－Ｒ（配列番号３および４）を用いるＰＣＲと、１％アガロースゲル電気泳動（ＰＣＲ産物は４７４ｂｐである）とによって確認した。プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒを含む得られたトランスフェクトされた細胞を、さらなる使用のために保存した。

（実施例４）
（プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^ＲでトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞の調製）
実施例３において得られた、プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒを含むトランスフェクトされた細胞を、ＬＢ培地において３７℃にて一晩培養し、その後、ＥａｓｙＰｕｒｅ（登録商標）ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭａｘｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＥＭ１２１）を使用し製造者のプロトコルに従うことによって、プラスミドＤＮＡ抽出に供した。抽出されたプラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒを、ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）における制限酵素ＭｌｕＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）の使用によって処理して直鎖にし、その後、精製した。

得られた直鎖プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒを、市販の試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号Ｌ３０００００８）を使用し製造者のプロトコルに従うことによって、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８１（商標））中にトランスフェクトした。簡単に述べると、５μｇの直鎖プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒ、５μｌのＰ３０００（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号Ｌ３０００００８）と２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、カタログ番号３１９８５０８８）とを混合することによって、希釈したプラスミドＤＮＡを調製した。５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００試薬と２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地とを混合することによって、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００試薬を得た。ＤＮＡ－脂質複合体を、上記の希釈したプラスミドＤＮＡと希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００試薬とを混合した後に室温にて５分間インキュベーションを行うことによって、調製した。

その後、トランスフェクションのために、そのＤＮＡ－脂質複合体（直鎖プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒを含む）をＶｅｒｏ細胞とともに共インキュベートし、それらを、２ｍＬの完全増殖培地を含む６ウェルプレートに細胞密度４×１０^５細胞／ウェルにて播種した。２４時間インキュベートした後、選択用抗生物質Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（商標）、Ｇｉｂｃｏ（商標）、カタログ番号１０１３１０２７）を最終濃度８００μｇ／ｍｌで含む５～１０ｍＬの増殖培地を、細胞増殖条件に依存して２日毎または３日毎に新しくした。約１５日間のインキュベーションの後、プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^ＲでトランスフェクトしたそのＶｅｒｏ細胞（本明細書において以後は「Ｖｅｒｏ－ＩＣＰ６細胞」と呼ぶ）は安定に増殖した。これを以下の実験のために保存した。

（実施例５）
（相同組換え標的化ベクターの構築）
相同組換え（ＨＲ）標的化ベクターを構築するために、上流／下流相同性アーム（配列番号１２および１３）と外因性ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号１４）とを含む標的化ポリヌクレオチド（配列番号１５）を、以下のとおりに調製した。

上流相同性アーム（ＵＨＡ；配列番号１２）をＰＣＲによって合成し、その際、材料の節において開示したＨＳＶ－１標的株のゲノムＤＮＡをＤＮＡテンプレートとして使用し、プライマー対はＩＣＰ６－ＳＯＥ－Ｆ１およびＩＣＰ６－ＳＯＥ－Ｒ１（配列番号６および７）であり、変性温度、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度は、それぞれ９８℃、６３℃、および７２℃であり、反応サイクルは３５回であった。そのＰＣＲ産物（１５３４ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動によって確認し、その後、さらなる使用のために回収した。

下流相同性アーム（ＤＨＡ；配列番号１３）をＰＣＲによって合成し、その際、材料の節において開示したＨＳＶ－１標的株のゲノムＤＮＡをＤＮＡテンプレートとして使用し、プライマー対はＩＣＰ６－ＳＯＥ－Ｆ３およびΜＬ４０－ＳＯＥ－Ｒ３（配列番号８および９）であり、変性温度、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度は、それぞれ９８℃、６２℃、および７２℃であり、反応サイクルは３５回であった。そのＰＣＲ産物（１１９４ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動によって確認し、その後、さらなる使用のために回収した。

外因性ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号１４）をＰＣＲによって合成し、その際、ｐＥＧＦＰＮ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＤＮＡテンプレートとして使用し、プライマー対はＥＧＦＰ－ＳＯＥ－Ｆ２およびＥＧＦＰ－ＳＯＥ－Ｒ２（配列番号１０および１１）であり、変性温度、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度は、それぞれ別個に９８℃、６０℃、および７２℃であり、反応サイクルは３５回であった。そのＰＣＲ産物（１６２８ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動によって確認し、その後、さらなる使用のために回収した。

その後、その上流相同性アーム（ＵＨＡ；配列番号１２）と外因性ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号１４）とをオーバーラップ・エクステンション（ｏｖｅｒｌａｐ－ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲによって一緒に連結して、ＵＨＡ－ＥＧＦＰフラグメント（３１３３ｂｐ）を生成した。そのＵＨＡ－ＥＧＦＰフラグメントと下流相同性アーム（ＤＨＡ；配列番号１３）とを別のオーバーラップ・エクステンションＰＣＲによって一緒に連結して、ＵＨＡ－ＥＧＦＰ－ＤＨＡフラグメント（本明細書において以後は「標的化ポリヌクレオチド」と呼ぶ；配列番号１５）を生成した。最終的なオーバーラップしたＰＣＲ産物（４３００ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動によって確認し、その後、さらなる使用のために回収した。

ＨＲ標的化ベクターを、その標的化ポリヌクレオチド（配列番号１５）を市販のｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＢ１０１－０１）中にクローニングすることによって得、その後、それをＴｒａｎｓ１－Ｔ１ファージ耐性化学的コンピテント細胞（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＤ５０１）中にトランスフェクトした。そのトランスフェクトされた細胞を、選択用ＬＢ培地において３７℃にて一晩インキュベートした。トランスフェクトされた細胞のシングルコロニーを選択し、そのようなトランスフェクションを、プライマー対ＩＣＰ６－ＳＯＥ－Ｆ１およびΜＬ４０－ＳＯＥ－Ｒ３（配列番号６および９）を用いるＰＣＲと、その後の１％アガロースゲル電気泳動（ＰＣＲ産物は４３００ｂｐである）とによって確認した。そのようにして得られた、そのＨＲ標的化ベクターを含むトランスフェクトされた細胞を、さらなる使用のために保存した。

（実施例６）
（ＨＳＶ－１におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換え）
そのＨＲ標的化ベクターを、ＥａｓｙＰｕｒｅ（登録商標）ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭａｘｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＥＭ１２１）を使用することによって、実施例５において得られたトランスフェクトされた細胞から収集し、その後、ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）における制限酵素ＥｃｏＲＶ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ３１９５Ｓ）の使用によって処理して、直鎖にした。そのようにして得られた直鎖ＨＲ標的化ベクターを、一般的な精製方法を使用することによって精製した。

その直鎖ＨＲ標的化ベクターを、市販の試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号Ｌ３０００００８）を使用し製造者のプロトコルに従うことによって、実施例４において得られたＶｅｒｏ－ＩＣＰ６細胞中にトランスフェクトした。簡単に述べると、５μｇの直鎖ＨＲ標的化ベクターと５μｌのＰ３０００（商標）試薬と１２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地とを混合することによって、希釈したプラスミドＤＮＡを調製した。５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００試薬と１２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地とを混合することによって、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００試薬を得た。ＤＮＡ－脂質複合体を、上記の希釈したプラスミドＤＮＡと希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００試薬とを混合した後に室温にて１５分間インキュベーションを行うことによって、調製した。

その後、トランスフェクションのために、そのＤＮＡ－脂質複合体（直鎖ＨＲ標的化ベクターを含む）をＶｅｒｏ－ＩＣＰ６細胞（直鎖プラスミドｐＣａｓ９－ＩＣＰ６ｇＲＮＡ－Ｎｅｏ^Ｒを含む）とともに共インキュベートし、それらを、２ｍＬの完全増殖培地を含む６ウェルプレートに細胞密度４×１０^５細胞／ウェル、温度３７℃にて８時間播種した。８時間のインキュベーションの後、上記の培養培地に、材料の節において開示したＨＳＶ－１標的株を含む２ｍＬの基本培養培地を添加し（ＭＯＩ＝１）、ウイルス感染を引き起こした。ウイルス誘導性細胞変性効果が、培養期間中に観察された。細胞変性効果が８０％にまで増加した時点（約４８時間）で、ウイルス感染したＶｅｒｏ細胞を含む培養培地を収集し、さらなる使用のために－８０℃にて保存した。

（実施例７）
（組換えＨＳＶ－１の同定）
同定のために、実施例６において収集した上記ウイルス感染したＶｅｒｏ細胞を３回の凍結／融解サイクル（－８０℃／３０℃）に供し、その後、３０００ｒｐｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、遠心分離機参照番号７５００５２９７；ローターカタログ番号７５００３３３１）にて１０分間遠心分離して、組換えＨＳＶ－１を含む上清を得た。プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）および１０％のＳＤＳをその上清に添加し、その後、それを５８℃にて２時間、９８℃にて１０分間、４℃にて５分間インキュベートした。インキュベーションの後、１５０００ｇで遠心分離を５分間実施し、その上清を、以下のＰＣＲ実験におけるＤＮＡテンプレートとしての使用のために収集した。

２つのＰＣＲを使用して、ＨＳＶ－１の正確な相同組換えを確認した。図４において示すとおり、外因性遺伝子（ＥＧＦＰ）を正確な相同組換えによって挿入し、図４において示すとおり、２つのプライマー対の各々を、そのＥＧＦＰ遺伝子の部分および下流ＨＲアームのセグメントを増幅するために設計した。

第１段階ＰＣＲにおいて、材料の節において得られたＨＳＶ－１標的株のゲノムＤＮＡをＤＮＡテンプレートとして使用し、プライマー対はＨＳＶ１－ＧＦＰ－ＫＩ－Ｆ１およびＨＳＶ１－ＧＦＰ－ＫＩ－Ｒ１（配列番号３２および３３）であり、変性温度、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度は、それぞれ９８℃、６０℃、および７２℃であり、反応サイクルは３５回であった。そのＰＣＲ産物（２２１４ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動によって確認し、その後、次のＰＣＲのためのＤＮＡテンプレートとしての使用のために回収した。

第２段階ＰＣＲにおいて、得られた第１のＰＣＲ産物（２２１４ｂｐ）をＤＮＡテンプレートとして使用し、プライマー対はＨＳＶ１－ＧＦＰ－ＫＩ－Ｆ２およびＨＳＶ１－ＧＦＰ－ＫＩ－Ｒ２（配列番号３４および３５）であり、変性温度、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度は、それぞれ９８℃、６０℃、および７２℃であり、反応サイクルは３５回であった。そのＰＣＲ産物（２０６３ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動によって確認した。

組換えＨＳＶ－１の第１のＰＣＲについてのサンプル１～４に関する結果を、それぞれ図５のレーン２～５に示し、第２段階ＰＣＲの結果をそれぞれレーン８～１１に示す。ＥＧＦＰ遺伝子中で開始して下流ＨＲアームにまで伸長する、意図したアンプリコンに対応するバンドが組換えＨＳＶ－１サンプル３および４について観察され（第１段階ＰＣＲについてレーン４～５、同様に第２段階ＰＣＲについてレーン１０～１１）、これは、相同組換えがそれらのサンプルにおいて首尾良く完了したことを示した。

（実施例８）
（組換えＨＳＶ－１の精製）
その組換えＨＳＶ－１を、プラーク精製方法を使用することによって精製した。簡単に述べると、上記Ｖｅｒｏ細胞を、完全増殖培地を含む６ウェルプレートに細胞密度８×１０^５細胞／ウェルで播種し、３７℃にて一晩培養した。その後、元の培地を取り除き、１ｍＬの希釈した組換えウイルス溶液を各ウェルに添加して、３７℃にて２時間、共インキュベートした。共インキュベーションの後、残りのウイルス溶液を捨て、１．８％の低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９０４５）を含む２ｍＬの完全増殖培地を添加して、カバー層を形成した。そのプレートを逆さにし、３７℃にてインキュベートした。そのプレートを、細胞変性効果について毎日点検した。

明白な細胞損傷が観察された後（約４８時間）、１．８％の低融点アガロースと希釈したニュートラルレッド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｎ２８８９）とを含む２ｍＬの完全増殖培地を添加して、別のカバー層を形成した。そのプレートを再び逆さにし、３７℃にて２４時間インキュベートした。緑色蛍光プラークを、蛍光顕微鏡を使用することによって観察した。

図６において示すとおり、それらの緑色蛍光プラークを収集した。その後、それらの緑色蛍光プラークを選択し精製し、プラーク全てが緑色蛍光プラークになるまで、プラーク精製を少なくとも３回実施した。それらの緑色蛍光プラークは、ＨＶＳ－１標的株のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換えが、開示したｇＲＮＡの使用によって首尾良く完了したことを示した。

Claims (30)

1. ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、
   Ｃａｓ９タンパク質を１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）のＩＣＰ６遺伝子中の標的配列に標的化して切断事象を提供可能であるガイド配列
   を含み、該標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む、ｇＲＮＡ。
2. 前記ＩＣＰ６遺伝子が、ＧＡＴＣ配列を挿入することによって引き起こされた不活性化ＩＣＰ６タンパク質を発現する、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
3. 前記ＩＣＰ６遺伝子が不活性化ＩＣＰ６遺伝子である、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
4. 前記ＩＣＰ６遺伝子が、配列番号１７のヌクレオチド２５～６４に対応する配列を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
5. 前記ＩＣＰ６遺伝子が配列番号１７を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
6. 前記標的配列が、配列番号１７のヌクレオチド２５～６４に対応する配列範囲から選択される２０ヌクレオチドの配列である、請求項５に記載のｇＲＮＡ。
7. 前記標的配列が、配列番号１７から選択される２０ヌクレオチドの配列を含む、請求項５に記載のｇＲＮＡ。
8. 前記標的配列が、配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３からなる群より選択される配列を含む、請求項５に記載のｇＲＮＡ。
9. 前記標的配列が配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３からなる群より選択される、請求項５に記載のｇＲＮＡ。
10. 前記標的配列が配列番号２１である、請求項５に記載のｇＲＮＡ。
11. 前記ガイド配列が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８および２９からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
12. 前記ガイド配列が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８および２９からなる群より選択される配列である、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
13. 前記ガイド配列が配列番号２７である、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡをコードする、第１のポリヌクレオチド。
15. 適切なプロモーターに作動可能に連結された請求項１４に記載の第１のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
16. Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５に記載のベクター。
17. 請求項１５に記載の１種のベクターと、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含む、ベクターシステム。
18. ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である請求項１６に記載のベクターまたは請求項１７に記載のベクターシステムで形質転換された、形質転換体細胞。
19. Ｖｅｒｏ細胞である、請求項１８に記載の形質転換体細胞。
20. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを含む、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体。
21. ＨＳＶ－１のための遺伝子編集システムであって、
    （ａ）ＩＣＰ６遺伝子中に標的配列を含むＨＳＶ－１株であって、該標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む、ＨＳＶ－１株；
    （ｂ）ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である、請求項１６に記載のベクターまたは請求項１７に記載のベクターシステム；ならびに
    （ｃ）上流相同性アームと外因性遺伝子と下流相同性アームとを順次に含む標的化ポリヌクレオチドであって、該上流相同性アームおよび該下流相同性アームは、別々に、該ＨＳＶ－１の標的ドメインの５’領域および３’領域と相同であり、該標的配列は該ＨＳＶ－１の標的ドメイン内に位置する、標的化ポリヌクレオチド；
    を含む、遺伝子編集システム。
22. 組換えＨＳＶ－１を生成するための遺伝子編集方法であって、
    （ａ）ＨＳＶ－１株を提供する工程であって、該ＨＳＶ－１株はＩＣＰ６遺伝子中に標的配列を含み、該標的配列は野生型ＨＳＶ－１と比較してＧＡＴＣ挿入を含む、工程；
    （ｂ）ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを発現可能である請求項１６に記載のベクターまたは請求項１７に記載のベクターシステムを構築する工程；
    （ｃ）相同組換えを介して該ＨＳＶ－１の標的ドメイン中に外因性遺伝子を挿入可能である、標的化ポリヌクレオチドを含む直鎖ＤＮＡを調製する工程；
    （ｄ）該ベクターまたは該ベクターシステムを形質転換体細胞に形質転換して第１の形質転換体を得る工程；
    （ｅ）該直鎖ＤＮＡを該第１の形質転換体に形質転換して第２の形質転換体を得る工程；および
    （ｆ）該第２の形質転換体に該ＨＳＶ－１株を感染させてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同組換えを該第２の形質転換体において生じさせる工程であって、該ｇＲＮＡは該Ｃａｓ９タンパク質を該標的配列に標的化して特異的切断事象を提供し、その後、該外因性遺伝子は相同組換えを介して該標的ドメインに挿入される、工程；
    を含む、遺伝子編集方法。
23. 前記ＩＣＰ６遺伝子が配列番号１７を含む、請求項２２に記載の遺伝子編集方法。
24. 前記標的配列が、配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３からなる群より選択される配列を含む、請求項２２に記載の遺伝子編集方法。
25. 前記標的配列が、配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３からなる群より選択される、請求項２２に記載の遺伝子編集方法。
26. 前記標的配列が配列番号２１である、請求項２２に記載の遺伝子編集方法。
27. 工程（ｃ）の標的化ポリヌクレオチドが上流相同性アームと前記外因性遺伝子と下流相同性アームとを順次に含み、該上流相同性アームおよび該下流相同性アームは、別々に、前記ＨＳＶ－１の標的ドメインの５’領域および３’領域と相同であり、前記標的配列は該ＨＳＶ－１の該標的ドメイン内に位置する、請求項２２に記載の遺伝子編集方法。
28. 前記上流相同性アームが配列番号１２を含む、請求項２７に記載の遺伝子編集方法。
29. 前記下流相同性アームが配列番号１３を含む、請求項２７に記載の遺伝子編集方法。
30. 請求項２２に記載の遺伝子編集方法によって生成された組換えＨＳＶ－１。