CN117721151A - 一种基于CRISPR-dcas13d-eIF4G的蛋白翻译激活系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR‑dcas13d‑eIF4G的蛋白翻译激活系统及其应用，涉及人工基因应用技术领域，本发明所述蛋白翻译激活系统由相互连接的载体1和载体2组成，所述载体1由翻译调控结构域和推动该翻译调控结构域的CMV启动子组成，所述翻译调控结构域由pSP4GI与dRfxCas13d的C端融合形成；所述载体2由sgRNA的cDNA序列和推动该序列的U6启动子组成，所述sgRNA的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。该系统在HK‑2细胞的细胞质中可以稳定工作并增加目标基因GPX4的翻译水平，使得在蛋白翻译激活方面有了新的进展。
Description
技术领域
本发明涉及人工基因应用技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-dcas13d-eIF4G的蛋白翻译激活系统及其应用。
背景技术
工程化的CRISPR-Cas系统现已广泛应用于基因编辑及转录调控工作中，尤其是经典的CRISPR-Cas9可在DNA生物工程技术中对特定基因位点进行编辑或对相关致病基因突变进行纠正，具有较为广泛的应用。但目前针对RNA水平的简易可编辑工具的开发及研究较少，直接研究特定RNA位点的功能作用及对其进行工程化编辑的方法十分有限。研究人员发现VI型CRISPR-Cas系统中包含可编程的单效应器RNA定向引导酶Cas13，可靶向及引导RNA而非DNA，且通过催化失活的Cas13(dCas13)工具可进行RNA编辑工作。Cas13是一个标志性的单效应酶家族，分别由4个不同亚型(Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d)的定向引导RNA核糖核酸酶组成，除了两个结构相同的的R-X4–6-HHEPN外，四个亚型间没有表现出显著的序列相似性。其中Cas13d(930aa)是目前最小的CRISPR-Cas13亚型，比其他亚型小20-30％，更有利于相关病毒载体的包装。Cas13d与其他亚型相似，具有双重RNA酶活性，一方面可通过順式切割模式，Cas13d能够以引导序列依赖的方式有效切割与gRNA互补的目的单链RNA(ssRNA)。另一方面通过反式切割模式，通过gRNA引导对非目的RNA进行HEPN依赖性的旁观者切割。Cas13d不能切割ssRNA靶标对应的单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)，表明Cas13d是一种RNA特异性核酸酶。通过在不同温度下测试切割效能发现Cas13d在21-42℃范围内具有较高的酶活性，此温度范围适用于大部分原核及真核宿主，使得Cas13d作用于不同细胞和生物体中发挥RNA靶向功能的可能性得到提高。Silvana等通过对原核基因组及宏基因组序列进行相关分析后从Ruminococcus flavefaciens xpd3002中获得了一个在哺乳动物细胞中具有强大活性的Cas13d家族的核糖核酸酶效应物(RfxCas13d)。后续研究发现，相对于传统的RNA干扰技术，RfxCas13d介导的RNA敲降在不影响内源基因组转录的情况下，对不同的内源性转录本均表现出较高的切割效率和靶向特异性。同时，Silvana等还发现目的基因的表达降低依赖于RfxCas13d中HEPN结构域的催化活性。野生型RfxCas13d可有效介导目标mRNA的敲降，但催化失活性的RfxCas13d(dRfxCas13d)，对目标mRNA及其蛋白的表达水平并没有显著变化，这表明dRfxCas13d在高效靶向mRNA的编码部分的同时并不会干扰蛋白质的翻译过程，这为Cas13d家族在RNA编辑和蛋白质翻译调控相关研究中提供了很多的可能性。Silvana等通过d RfxCas13d融合剪接效应器来调节选择性剪接及调节蛋白质异构体的比率，并将其应用于额颞叶痴呆的神经元模型，证明了这一概念的实用性。CRISPR-Cas13d的发现和dRfxCas13d等工程化融合工具的出现将基因组编辑工具平台从DNA水平扩展到RNA水平，为各类基因工程技术提供了更多的可能，但也仅仅是提供了各种可能，在蛋白翻译激活上并未有新的进展。但现有研究没有探讨如何通过明确地靶向目标mRNA序列来提高真核细胞中特定目标蛋白质的翻译水平。因此，我们想设计一类工程调控工具，可以通过将dRfxCas13d与eIF4G融合，由特定的gRNAs引导，以靶向绑定特定目标RNA序列，从而增加它们的相应蛋白质的翻译水平。
发明内容
本发明提供了一种基于CRISPR-dcas13d-eIF4G的蛋白翻译激活系统及其应用，该系统在HK-2细胞的细胞质中可以稳定工作并增加目标基因GPX4的翻译水平，使得在蛋白翻译激活方面有了新的进展。
真核翻译起始因子4G(eIF4G)是一种重要的模块化融合蛋白，通过结合RNAhelicase(eIF4A)及cap-binding protein(eIF4E)形成翻译起始复合物(eIF4F)，是很多生物过程中翻译调控的重要靶点。eIF4G作为翻译起始重要的功能蛋白，主要通过三段功能区域发挥功能，即N端、中央区和C端。eIF4G的N端包含polyA binding protein(PABP)和eIF4E的结合位点。eIF4G的中央区的结构是eIF4G最高度保守的区域，包含eIF3、eIF4A和mRNArecognition motif的结合结构域。eIF4G的C端包含eIF4A的另一个结合结构域和通过磷酸化激活eIF4E的激酶结合结构域。eIF4G通过上述主要功能区域，结合eIF4E,eIF4A和eIF3形成一个支持翻译起始的最简结构，此为翻译起始复合物的核心功能区域。eIF4G可同时结合eIF3和eIF4E，其复合物被认为是mRNA的5’端和核糖体亚基相结合的分子桥接，能够募集40S核糖体亚基到mRNA 5’端的帽状结构。40S核糖体亚基与Met-tRNA和真核翻译起始因子等结合形成43S复合体，并沿5’UTR移动直到它遇到第一个AUG密码子后停止，继续招募60S亚基连接形成80S核糖体并开始多肽的合成，因此eIF4G被认为是翻译调控的重要靶点。既往研究中还未探讨过如何通过特异性靶向特定目的RNA序列提高真核细胞中其对应蛋白的翻译水平，因此我们想通过dRfxCas13d与eIF4G进行融合，通过特定gRNA的引导，设计一类可以靶向结合特定目的RNA的序列并提高其对应蛋白翻译水平的工程化调控工具。eIF4G存在两类保守性较低的同工亚型，eIF4GI和eIF4GII，两者均可与eIF4E,eIF4A和eIF3形成功能完整的eIF4F复合物，但eIF4GI在哺乳动物细胞中是eIF4G的主要存在形式，约占其eIF4F复合物总量的85％。因此我们使用eIF4G的I型同工亚型eIF4GI进行后续实验研究。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于CRISPR-dcas13d-eIF4G的蛋白翻译激活系统，所述蛋白翻译激活系统由相互连接的载体1和载体2组成，所述载体1由翻译调控结构域和推动该翻译调控结构域的CMV启动子组成，所述翻译调控结构域由pSP4GI与dRfxCas13d的C端融合形成；所述载体2由sgRNA的cDNA序列和推动该序列的U6启动子组成，所述sgRNA的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示：TTTCTACATTTTATTCCCACAAG。
所述的基于CRISPR-dcas13d-eIF4G的蛋白翻译激活系统在HK-2细胞的细胞质中作为提升目标基因GPX4的翻译水平的药物的应用。
综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及益效果：
本发明利用专门设计的sgRNA的cDNA序列、特定的翻译调控结构域以及特定的启动子，制备了一种双载体蛋白翻译激活系统，该双载体工具在HK-2细胞中可以稳定工作并增加目标基因GPX4的翻译水平，使得dRfxCas13d相关理论在实际应用中有了实质进步。
本发明提供了RNA编辑和蛋白质翻译调控领域的新方法，通过融合dRfxCas13d与eIF4G，并由特定的gRNAs引导，有针对性地提高特定目标RNA序列的蛋白质翻译水平。这一创新为研究人员开辟了一条崭新的道路，使他们能够精确地调控细胞内特定蛋白质的表达水平，为各种基因工程技术和生物医学研究提供了巨大的潜力，从而推动了科学和医学领域的进一步突破。
本发明的重要性在于，它可以帮助科学家更好地理解细胞内基因表达和蛋白质合成的精细机制。通过有针对性地提高RNA的翻译水平，研究人员可以探索特定基因的功能，解决许多生物学和医学研究中的关键问题。此外，这项技术还具有治疗潜力，可以用于治疗一些与蛋白质异常合成有关的遗传性疾病。
附图说明
图1是eIF4G与eIF4E、eIF4A、PABP和eIF3结合形成一个最小结构的示意图；
图2是CRISPR-dRfxCas13d-eIF4G的设计示意图；
图3是蛋白翻译激活系统的连接示意图；
图4是针对GPX4的CRISPR-dRfxCas13d-eIF4G工具的GPX4蛋白表达水平的WB结果图；
图5为构建的针对GPX4的CRISPR-dRfxCas13d-eIF4G工具的GPX4mRNA表达水平qRT-PCR分析结果图；
图6为插入核定位信号的蛋白翻译激活系统的连接示意图；
图7为针对GPX4的CRISPR-dRfxCas13d-eIF4G核定位信号工具的GPX4蛋白表达水平的WB结果图；
图8为构建的针对GPX4的CRISPR-dRfxCas13d-eIF4G核定位信号工具的GPX4 mRNA表达水平qRT-PCR分析结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请进行详细说明。
实施例1
本实施例设计了一组sgRNA的cDNA序列：TTTCTACATTTTATTCCCACAAG。并结合特定的翻译调控结构域以及特定的启动子，制备了一种双载体蛋白翻译激活系统，具体制备过程如下：
如图1所示，为eIF4G与eIF4E、eIF4A、PABP和eIF3结合形成一个最小结构的过程，通过中央功能区支持翻译起始，该区域是翻译起始复合物的核心功能区。并且40S和60S核糖体亚基被招募参与肽链合成。真核生物翻译起始因子(eIF)4G是许多生物过程中翻译调控的关键目标，也是一个必要的模块化融合蛋白，通过与RNA解旋酶(eIF4A)和帽结合蛋白(eIF4E)结合形成翻译起始复合物(eIF4F)。该复合物被认为是mRNA 5'端和核糖体亚基结合的分子桥梁，能够将40S核糖体亚基招募到mRNA 5'端的帽子结构上。40S核糖体亚基继续招募60S亚基以开始肽链合成，这是翻译起始的重要步骤。基于以上机制，我们设计和构建了一种翻译调控系统。先前的研究报道称，来自黄单胞菌Ruminococcus flavefaciensXPD3002的RfxCas13d蛋白在哺乳动物细胞中具有较高的RNA靶向特异性和切割活性。因此，考虑到我们研究的目的，我们选择催化失活的RfxCas13d(dRfxCas13d)作为RNA靶向元件，并选择pSP4GI(全长eIF4GI cDNA克隆DKFZp762O191Q3，存取号AL120751)作为翻译功能增强元件，如图2所示，其中pSP4GI与dRfxCas13d的C端融合以形成翻译调控结构域，选择eIF4G的I型亚型eIF4GI与失活的RfxCas13d融合。然后，CRISPR-dRfxCas13d-eIF4G工具通过sgRNA引导靶向特定目标RNA，增加其相应蛋白的翻译水平。如图3所示，dRfxCas13d-eIF4G融合蛋白和相关基因sgRNA的互补DNA序列克隆到含有CMV启动子和U6启动子的质粒中，用于打包成慢病毒载体。此外，如图6所示，我们还通过在dRfxCas13d-eIF4G融合蛋白的两端插入核定位信号(NLS)组成了插入核定位信号的蛋白翻译激活系统。两端插入或不插入核定位信号(NLS)的蛋白翻译激活系统就此分为了核入组和细胞质组。
为了验证本实施例制备的蛋白翻译激活系统在HK-2细胞中的作用，我们还进行了如下操作：
1、HK-2细胞培养与转染
从国家认证细胞培养集中购买HK-2细胞，培养在37℃、5％CO2环境中，维持在含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中。对于稳定转染实验，HK-2细胞在转染前一天接种到6孔板中。在达到50％融合后，使用制造商的说明书配置双载体翻译调控系统的转染试剂，使用本实施例制备的核入组和细胞质组蛋白翻译激活系统分别转染HK-2细胞，MOI配置为50:50。转染8-12小时后，通过去除转染试剂来终止转染。通过使用含有10ug/mL嘌呤霉素的DMEM/F12培养基进行2周的间断筛选，获得了稳转细胞系。
2、蛋白质印迹
使用冷的RIPA缓冲液(G2002，Servicebio Technology co.，Ltd.，武汉，中国)完全裂解上述稳转细胞系的总蛋白质。使用BCA分析法(PC0020，Solarbio Science&Technology Co.，Ltd.，北京，中国)定量总蛋白质至30ug，使用10-12％SDS-PAGE分离，然后转移到Immun-Blot PVDF膜(1620177，BIO-RAD，USA)。膜被迅速阻滞缓冲液(PS108P，Epizyme Biomedical Technology Co.，Ltd.，上海，中国)阻滞10分钟，用TBST洗涤四次，然后与以下主要抗体在4℃孵育12小时：抗-GPX4(A1933，1:1000，ABclonal Technology Co.，Ltd.，武汉，中国)，抗-GAPDH(10494-1-AP，1:20000，Proteintech Group，Inc，USA)和抗-β-Actin(20536-1-AP，1:4000，Proteintech Group，Inc，USA)。然后，用TBST缓冲液洗涤膜，如前所述，与次级抗体(5151，1:20000，Cell Signaling Technology，Inc，USA)孵育1小时室温。最后，使用Odyssey双色红外激光成像仪(LI COR，USA)观察每个蛋白质的相对表达水平，结果如图4/7所示，并使用ImageJ软件(ImageJ 1.51j8版本，USA)分析灰度值。
3、qRT-PCR分析
使用Trizol试剂(15596026，Thermo Fisher)根据制造商的说明书从上述稳转细胞系中分离总RNA。RNA(2ug)被转化为cDNA，使用III 1st Strand cDNA合成试剂盒(gDNA消化酶)(11139ES60，Yeasen Biotechnology Co.，Ltd.，上海，中国)。在LightCycler480(Roche Diagnostics，USA)上使用Hieff/>Universal Blue qPCRSYBR Green Master Mix(11184ES08，Yeasen Biotechnology Co.，Ltd.，上海，中国)进行实时PCR。将所示基因的相对表达水平与GAPDH相比较，使用2-△△Ct方法计算表达折叠变化每个qRT-PCR反应均在三重复中执行，结果如图5/8所示。
qRT-PCR分析所使用的引物表1所示。
表1 qRT-PCR分析所使用的引物
| 项目 | SEQ ID NO： | 序列 |
| GAPDH上引物 | 2 | 5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’ |
| GAPDH下引物 | 3 | 5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’ |
| GPX4上引物 | 4 | 5’-GTAAACTACACTCAGCTCGTCGA-3’ |
| GPX4下引物 | 5 | 5’-TTGATCTCTTCGTTACTCCCTGG-3’ |
以上实验表明，在稳定转染和筛选后，与阴性对照组相比，两组GPX4的mRNA表达水平没有明显变化。相反，细胞质组中GPX4的蛋白水平明显上调，而核入组中没有明显变化。以上结果表明，翻译调控主要发生在细胞质，并且双载体工具在HK-2细胞中可以稳定工作并增加目标基因GPX4的翻译水平。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (2)
1.一种基于CRISPR-dcas13d-eIF4G的蛋白翻译激活系统，其特征在于，所述蛋白翻译激活系统由相互连接的载体1和载体2组成，所述载体1由翻译调控结构域和推动该翻译调控结构域的CMV启动子组成，所述翻译调控结构域由pSP4GI与dRfxCas13d的C端融合形成；所述载体2由sgRNA的cDNA序列和推动该序列的U6启动子组成，所述sgRNA的cDNA序列如SEQID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的基于CRISPR-dcas13d-eIF4G的蛋白翻译激活系统在HK-2细胞的细胞质中作为提升目标基因GPX4的翻译水平的药物的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311464286.4A CN117721151A (zh) | 2023-11-06 | 2023-11-06 | 一种基于CRISPR-dcas13d-eIF4G的蛋白翻译激活系统及其应用 |
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Citations (2)
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| CN111328343A (zh) * | 2017-08-22 | 2020-06-23 | 萨克生物研究学院 | Rna靶向方法和组合物 |
| US20230032369A1 (en) * | 2019-12-07 | 2023-02-02 | Scribe Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the targeting of htt |
-
2023
- 2023-11-06 CN CN202311464286.4A patent/CN117721151A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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