MXPA04002095A - Creacion de elementos artificiales del sitio de entrada interno del ribosoma (ires). - Google Patents

Abstract

Un metodo para la obtencion de una secuencia de acido nucleico que tiene un conjunto de acido nucleico abundante en adenina de al menos nucleotidos en longitud se proporciona, con lo cual la secuencia del acido nucleico es capaz de originar la traduccion mediante el (elemento IRES) de entrada de ribosoma interna. El conjunto del acido nucleico abundante en adenina comprende de desde 40 a 100 % por mol de adenina.

Description

CREACION DE ELEMENTOS ARTIFICIALES DEL SITIO DE ENTRADA INTERNO DEL RIBOSOMA (IRES) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para a obtención de elementos de sitio de entrada de ribosoma internos (IRES) artificiales capaces de originar una traducción independiente cubierta de una secuencia de nucleótido de interés en células eucarióticas u organismos. Además, un procedimiento para la expresión de una secuencia de nucleótido de interés en las células eucarióticas bajo el control de traducción de un elemento IRES de conformidad a la invención se proporciona. La invención se refiere además a un vector y a un cartucho de expresión, que comprende tal elemento IRES y a las células eucarióticas transformadas o transíectadas con tal vector o con el cartucho de expresión.

ANTECEDNTES DE LA INVENCIÓN.

Existe un interés cada vez mayor en el uso de los elementos de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para la expresión de genes extraños en las células eucarióticas . Aunque el número de las secuencias del nucleótido que son capaces de proporcionar la traducción independiente cubierta incrementa constantemente, la identificación de IRESes novedosos ha sido ocasional o incidental sin la metodología distinta de la predicción de los elementos de IRES. En la mayoría de los casos, la regulación de la traducción en células eucarióticas ocurre en la etapa de iniciación mediante un mecanismo de exploración. Esto comprende el enlazamiento del factor de iniciación eucariótico 4F (elF4F) , un complejo de proteína las cuales incluyen elF4F (la proteína de enlazamiento cubierta) , elF4G (una proteína larga la cual actúa como una plataforma para las proteínas en el complejo y que tiene sitios de enlazamiento para elF4E, elF4a, elF3, y una proteína de poli (A) enlazamiento ) , y elF4A (helicasa de ARN) a la estructura cubierta de m7GpppN, el registro de las sub-unidades ribosomales 40S, y la exploración para el primer codón en el contexto correcto (Pain, V.M. 1996, Eu . J. Biochem. 236, 747-771) . La iniciación de la traducción también se puede realizar mediante un mecanismo que no requiere de la estructura cubierta. En este caso, el ribosoma entra al mARN en una región terminada en un sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) que es de hasta 1, 000 b . de longitud. Los IRES son originalmente identificados en los ARNs de picornavirus y durante la infección de picornavirus, existe frecuentemente una interrupción de traducción desde el mARN celular codificado del clón a las transcripciones virales (Jackson and Kaminski, 1995, ARN 1, 985-1000) . En mARNs animal que contiene IRES puede presumiblemente registrar ribosomas 40S ya sea mediante sus extremos 5' cubiertos o sus elementos IRES, los cuales similarmente permiten la traducción bajo condiciones, cuando la traducción dependiente cubierta se reduce, como por ejemplo durante la infección viral, en la fase G2/M del ciclo de la célula, apoptosis o las condiciones de tensión (Johannes y col., (1999) Proc. Nati Acad. Sci USA 96, 13118-13123; Cornelis y col; (2000) Molecular Cell 5, 597-605; Pyronnet y col.; (2000) Molecular Cell 5, 607-616; Stein y col., 1998 Mol and Cell Biol 18, 3112-3119; Holcick y col., 2000 Oncogene 19, 4179-4177; Stoneley y col., 2000 Mol. And Cell. Biol. 20, 1162-1169) . Hasta 3 % del mARNS celular Animal se traducen hasta que el enlazamiento de elF4 F-ARN se inhibe. (Johannes y col., 1999) . Por el contrario, al mARN celular animal, no existen reportes publicados que se refieran a la iniciación regulada-IRES de la traducción en células de planta in vivo. Sin embargo, las guias 5' no cubiertas de varios ARNs genómicos virales de plantas, incluyendo poli-, como-, y luteovirus son responsables para la traducción independien e cubierta (Carrigton and Freed, 1990; Gallie y col. , 1995; Niepel and Gallie, 1999: Tacke y col., 1990) ; Thomas y col., 1991) . Los Tobamovirus y los potexivirus X son los únicos ejemplos de IRESes localizados en partes internas de los genomas virales (Hefferson y col., 1997., J. Gen. Virol 78, 3051-3059; Hefferson y col., 2000 Aren. Virol 145, 945-956; Ivanov y col; (1997) Virology 232, 32-43; Skulachev y col., (1999) Virology 263, 139-154) . Los tobamovirus del mosaico del tabaco (T V) es un virus de la planta de ARN de cadena positiva con un genoma monopartita de 6395 nucleótidos (nt) en longitud (Goelet y col., 1982 Proc. Nati Acad. Sci USA 79 5818-5822) . Los ORFs próximos 5' que codifican las proteínas de replicación se expresan directamente desde el ARN genómico y el nivel de la síntesis de la proteína más pequeña (126 kDa) es aproximadamente 10 veces más grande que el nivel de la proteina de 183 kDa, la cual se produce por trans-lectura ocasional del codón de tope para el ORF de 126-kDa (Siegel y col., 1976 Virology 73, 363-371) . Aunque parte de la replicación puede ocurrir, con la proteina mas larga solamente, ambas proteínas son requeridas para la replicación eficiente (Ishikawa y col., 1986) . Los productos de gen de TMV restantes, la proteína de movimiento (MP) y la proteína de revestimiento (CP) son expresadas del mARNs sub-genómico 3' co-t erminal (sgARNs) (revisado por Palukaitís and Zaitlin, 1986 en: "Los virus de las plantas". M. H. V. Van Regenmortel and M. Fraenkel-Conrat , Eds. Vol., 2, pp 105-131. Plenum Press, N. Y. ) . Por lo tanto, el gen de proteína de movimiento interno (MP) y el gen de proteína revestida 3'-próxima no puede ser traducida a partir del ARN genómico de los tobamovirus típicos (TMV Ul es el miembro del tipo del género Tobamovirus) . 1E1 ARN-2 de longitud intermedia di-cistrónica llamada sgARN I2 ANR se traduce para producir el MP 30-kDa (Bruening y col., 1976 Virology 71, 498-517; Higgins y col., 1976 Virology 71, 486-497; Beachy and Zaitilin, 1977 Virology 81, 160-169; Goelet and Kam, 1982 J. Mol. Biol., 154 , 541-550) , en donde en gen de la proteína revestida 3' -próxima (CP) del ARN I2 no se presenta para la traducción. Este gen se expresa solo de sgARN mono-ci strónico pequeño (Beachy and Zaitilin, 1977) . Se ha mostrado (Ivanov y col., (1997) Virology 232, 32-43) , que diferente a los tobamovirus típicos, la traducción del gen CP de un tobamovirus de infección- de crucifera (crTMV) se realiza in vitro mediante el mecanismo de entrada del ribosoma interno. El genoma de crTMV (6312 nts) contiene cuatro genes tradicionales que codifican dos componentes de la replicasa (proteínas de 122 kDa y 178-kDa, el producto de translectura de la proteína de 122-kDa) , un MP de 30-kDa y un CP de 17-kDa ( Dorokhov y col., 1993 Dokl. Russina Acad. Sci 332, 518-52; Dorokhov y col., 1994 FEBS Lett . , 350, 5.8) . Se ha encontrado que la región de 148-nt en dirección del gen de CP de crTMV ARN contiene un sitio de entrada de ribosoma interno ( IRESCp-i48CR) que promueve la iniciación de de la traducción interna del gen CP y genes informadores diferentes (Ivanov y col. 1997) . Por analogía con crTMV, el gen CP 3' -próximo del virus X de la papa se obtiene mediante un mecanismo de iniciación interna (Hefferon y col., 1997) . La capacidad del crTMV IRESCRCp para regular la iniciación interna de traducción que distingue este tobamovirus del miembro del tipo bien conocido del género, TMV ül . La secuencia 148-nt equivalente del TMV Ul ARN es incapaz de regular la iniciación interna de traducción (ÜICp,i48SP) (Ivanov y col., 1997) . Recientemente, se ha mostrado que en las regiones 228-y 75-nt en dirección del gen MP del crTMV y TMV ül ARNs contiene los elementos IRES, IRESMP,75 E IRESMP, 228 r respectivamente, los cuales dirigen la expresión de los genes informadores 3'-próximos de las construcciones di-cistrónicas en los sistemas de traducción libres de células y en protoplastos aislados (Skulachev y col., 1999) . Además la secuencia equivalente de TMV ül ARN usado como el espaciador inter-cistrónico ( IRESMp, 75U1 ) es adecuado para regular la traducción del segundo gen en transcripciones di-cistrónicas. Estudios recientes sobre virus de plantas también proporcionan ejemplos novedosos de la iniciación independiente-cubierta de traducción sin IRES. El ARNs de los virus y virus satélites en el genero Luteovirus y Necrovirus y de la familia grande de Tombusviridae carecen de un 5' cubierta y un 3' de poli (A) extremo. Sin embargo se puede traducir eficientemente, debido a las secuencias incrementadas de traducción diferente localizadas en la región de codificación cercana al 3' UTR. Estas secuencias son diferentes de los elementos IRES en dos caminos fundamentales: no proporcionan la entrada al ribosoma interno y estén localizados en la región 3' sin traducir (3' UTR) . La estructura y el mecanismo supuesto de accionamiento de estas secuencias se describen en detalle para el virus enano amarillo de la cebada ( BYDV) (GÜO y col 2000 ARN 6, 1808, 1820) . Los IRES han sido identificados dentro de algún mARNs viral y celular de eucariotas superiores (mamíferos y plantas), sin embargo permanece sin aclarar si los IRESes pueden existir dentro del mARNs de eucariotas inferiores. Recientemente las secuencias guías de 5' de 2 mANRs de levadura funcionan como IRES gue son identificados (Zhou y col., 2001 Proc. Nati. Acad. Sci; USA 98, 1531-1536) . Las secuencias de los IRES de animal se caracterizan por se diferentes ( Jackson 2000 ver también Figura 3) pero en un caso existe la evidencia de una función importante de las secuencias de nucleótidos cortos en la funcionabilidad de IRES de la proteina de homodominio Gtx. La Gtx IRES contiene varios segmentos no sobrepuestos que tiene complementariedad a 18S rARN que se muestran para regular la iniciación interna (Hu y col., 1999 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 1339-1344) . Dentro de uno de estos segmentos una secuencia abundante-GC 9-nt CCGGCGGGU la cual es 100% complementaria a 18S rARN en los nucleótidos 1132-1124 que son identificados y que muestran los IRESes sintéticos (Figura 4) compuesto de copias similares múltiples de éste modulo 9-ntIRES, que soporta la iniciación interna en células de animales en un nivel muy elevado (Chappel y col., 2000 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 1536-1541) . La actividad baja de los IRESes virales de animal (IRES del virus de encefalomiocarditis , IRESEMCV) en plantas se informa (Urwing y col., 2000 Plant J. 24, 583-589) . Hasta ahora no existe evidencia para la actividad del reino-cruzado (plantas, animales y levaduras) de cualquier elemento IRES. Aunque un determinado número de las secuencias del nucleótido que son capaces de proporcionar la traducción independiente-cubierta aumenta constantemente, la identificación de IRESes novedosos que han sido ocasionales y accidentales, sin metodología de predicción. Además los IRESes conocidos no permiten un ajuste fino de eficiencia. Ellos son limitados taxonómicamente y distintos altamente estructural . Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar un método para la obtención de elementos IRESes artificiales. Es otro objeto proporcionar elementos IRES artificiales que tienen actividad del reino-cruzado.

Es otro objeto de la invención proporcionar un método para la obtención de elementos IRES de un grado deseado de eficiencia. Es un objeto adicional proporcionar un procedimiento de expresión de una secuencia de nucleótido de interés en células eucarióticas bajo el control de traducción de un elemento IRES novedoso de la invención. Es otro objeto proporcionar un método para la identificación de elementos del ácido nucleico que tienen actividad IRES mediante la investigación de las secuencias de nucleótidos, por ejemplo bases de datos .

DESCRIPCION GENERAL DE LA INVENCION. Los objetos anteriores son resueltos de conformidad a las reivindicaciones. Esta invención proporciona un método para la obtención de una secuencia de ácido nucleico que tiene un conjunto de ácido nucleico abundante-de adenina de al menos 25 nucleótidos en longitud, con lo cual la secuencia del ácido nucleico es capaz de originar la traducción de una secuencia de codificación en dirección mediante la entrada del ribosoma interno (elemento IRES) . Los inventores de la presente invención han identificado sorprendentemente el criterio simple para la obtención de las secuencias del ácido nucleico los cuales presentan actividad IRES (elementos IRES) por ejemplo secuencias que son capaces de proporcionar la traducción independiente-cubierta de un gen en dirección ó la secuencia de codificación mediante un mecanismo de entrada de ribosoma interno. Los inventores han encontrado que las secuencias de ácido nucleico tienen un conjunto de al menos 25 nucleótidos con un contenido elevado de adenina que tiene una predisposición elevada de presentar actividad IRES en células eucariót ica s . Esto permite por un primer tiempo la obtención de elementos IRES artificiales los cuales son activos en células eucarióticas . Además estos tienen sorprendentemente actividad de reino-cruzado, es decir están activos en células de hongos, animales y plantas. Un elemento IRES de conformidad a la invención puede ser ensayado para la actividad de IRES (el grado de) por: Insertar el elemento IRES en una construcción di-cistrónica lineal entre un gen en dirección y un gen informador GUS en dirección, con lo cual el elemento IRES está colocado para la traducción dependiente-IRES del gen GUS en dirección y con lo cual el gen en dirección esta precedido por una estructura de gancho estable para prevenir la traducción independiente- IRES del gen GUS; La determinación de la traducción dependiente-IRES del gen GUS en un lisado de reticulocitos de conejo ó en un ensayo de traducción in vitro del extracto de germen de trigo, con lo cual la expresión del gen GUS se cuantifica de preferencia en relación a una construcción que tiene un elemento IRES de referencia ó un elemento sin IRES entre el gen en dirección y el gen GUS; Y La selección de un elemento IRES el cual proporciona la elevación a la expresión GUS en al menos uno de los ensayos de traducción in vitro con la eficiencia deseada. Esto ó una prueba similar puede además ser usada para la obtención de un elemento IRES de una actividad deseada, la cual se hace de preferencia mediante la regulación de la proporción de la adenina al contenido del nucleótido de pirimidina .

Las pruebas sobre la actividad de un elemento IRES artificial de conformidad a la invención puede ser del curso que también se lleva a cabo en células de plantas ó animales ó in vivo. En la presente "el contenido abundante en adenina" ó "el contenido de adenina elevado" significan un contenido de adenina que está más elevado que 30 mol-%. Dentro de esta invención el conjunto del ácido nucleico abundante en adenina tiene p eferiblemente al menos adenina-abundante que preferiblemente tiene al menos 40 mol-% de adenina.

El contenido de "pirimidina bajo" ó "pirimidina escasa" significa un contenido de timina (uracilo) + citidina que es inferior a 40 mol-% de timina (uracilo) + citidina. Según el criterio aplicado cuándo la obtención de un elemento IRES de conformidad a la invención, un conjunto de al menos 25 nucleótidos con un contenido de adenina de al menos 30, preferiblemente de al menos 60 y más preferiblemente de al menos 80mol-% se proporciona. Las actividades 1RES más elevadas se pueden lograr si el contenido de adenina está entre 90 y 100 mol-%. El contenido de pirimidina preferiblemente está bajo es decir menos que 40mol%, de preferencia menos que 30 mol-% y más preferiblemente menos que 20 mol-%. Los métodos preferidos son definidos como sigue con el fin de aumentar la eficiencia IRES: un método, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es al menos 30 nucleótidos de largo con al menos 40 mol-% de adenina y menos que 40 mol-% de pirimidina. Un método en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es al menos 30 nucleótidos de largo con al menos 50 mol-% de adenina y menos que 30 mol-% de pirimidina. Un método en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es al menos 30 nucleótidos de largo con al menos 60 mol-% de adenina y menos que 20 mol-% de pirimidina. Cualquier sub-conjunto de pirimidina dentro del conjunto del ácido nucleico abundante en adenina preferiblemente será de al menos 3 nucleótidos en longitud, más preferible a lo más de 2 nucleótidos en longitud. Cualquier sub-conjunto de las bases sin adenina separan dos bases de adenina dentro del conjunto del ácido nucleico abundante en adenina que tiene p eferiblemente una longitud de al menos 10 bases, más preferible de a lo más de 5 bases. El criterio proporcionado anteriormente con relación al contenido de bases del elemento IRES de la invención se refiere a ARN ó a la cadena de codificación correspondiente sobre el nivel de ADN. No existe un limite superior estricto para la longitud del ácido nucleico. Para propósitos prácticos, el conjunto se puede seleccionar para que sea más corto que 500 nucleótidos. Se prefiere obtener conjuntos de menos que 200 nucleótidos. Más preferiblemente el conjunto tiene entre 30 y 100 nucleótidos y más preferiblemente tiene entre 30 a 70 nucleótidos. La longitud mínima del conjunto del ácido nucleico es 25 nucleótidos. Sin embargo, su longitud es preferiblemente de al menos 40, más preferiblemente al menos 50 nucleótidos. El conjunto de ácido nucleico de conformidad a la invención tiene una propuesta elevada para proporcionar la actividad IRES a una secuencia que lo comprende. El criterio anterior para la obtención de un elemento IRES artificial conduce a muchas posibilidades diferentes para la obtención de elementos IRES de variación de actividad. Esta libertad se puede usar para la actividad de IRES reaj ust ada-fina a un nivel deseado, preferiblemente en combinación con un ensayo de traducción in vitro.

Con lo cual esta invención abarca un elemento IRES que se obtiene de un conjunto de ácido nucleico abundante en adenina único, mencionando que 2, 3 ó aún más conjuntos de ácido nucleico abundante en adenina se pueden incorporar en una secuencia de ácido nucleico con el fin de obtener la actividad IRES. Tales secuencias tienen particularmente una propuesta elevada de tener actividad IRES fuerte. Si dos ó más conjuntos de ácido nucleico abundante en adenina se usa, buena actividad de IRES se puede lograr . La mayoría de procedimientos diferentes se puede emplear para la construcción del elemento IRES de la invención. La construcción es en general realizada en el nivel del ADN. Un elemento IRES de la secuencia de la cual ha sido designado de conformidad a los principios de la invención, se puede obtener mediante la síntesis automatizada para el ADN. La cadena complementaria puede ser sintetizada de conformidad. Este procedimiento es más adecuado para los elementos IRES de hasta una longitud de 40 a 100 nucleótidos . El elemento IRES designado puede también ser sintetizado en partes de longitud adecuada mediante la síntesis automatizada para el ADN y anillar después de la síntesis. Estos y otros métodos para la construcción de un elemento de ADN son conocidos en la técnica. Por lo tanto separaciones adecuadas del ADN pueden ser cortadas desde las separaciones más largas ó a partir de las secuencias del genoma . La invención además proporciona un procedimiento de expresión de una secuencia de nucleótido de interés en células eucarióticas mediante la introducción en las células de un vector que comprende la secuencia del nucleótido de interés que se enlaza funcionalmente a una secuencia del ácido nucleico en dirección (elemento IRES) obtenido de conformidad a la invención, con lo cual la secuencia de ácido nucleótido de interés se traduce independientement e-cubierto por vía del elemento IRES en dirección. La secuencia del nucleótido de interés se puede expresar en células de plantas ó en las plantas. También se puede expresar en un animal ó en células de un animal. Entre los animales, células de mamíferos ó mamíferos incluyendo humanos (por ejemplo terapia de gen) son preferidos. Además la secuencia del nucleótido de interés se puede expresar en células de hongos, de preferencia en células de levaduras. El elemento IRES contenido en el vector puede ser cualquier elemento IRES artificial obtenido de conformidad a la invención. Puede ser por ejemplo ( GAAA ) 16 ó el elemento poli (A) IRES como se menciona específicamente en los ejemplos ó en los elementos IRES equivalentes funcionalment e . Además los ejemplos de los elementos IRES artificiales son conocidos en las figuras 5, 6 , 10 y 12 a 19 (ver también los ejemplos) . Dicho p ocedimiento de expresión no comprende el uso de los elementos IRES naturales ó conocidos. Particularmente no comprende el uso de elementos IRES virales conocidos. La secuencia del nucleótido de interés puede ser expresada a partir del mARN ?a???-cistrónico. Sin embargo el potencial de la tecnología IRES está en la expresión bi-cis trónica ó poli-cistrónica , lo cual permite la expresión de todas las sub-unidades de un complejo de proteína ó de una cascada completa bioquímica ó trayectoria. Por lo tanto la secuencia del nucleótido de interés se expresa de preferencia a partir de un mARN bi-cistrónico ó poli-ci stróni co .

Las células eucarióticas u organismos eucarióticos pueden ser transformados establemente ó transfectados temporalmente con el vector. Los métodos de transformación ó transfección de las células de animales ó plantas son bien conocidos en la técnica. Varios métodos se pueden usar para suministrar un vector ARN ó ADN en una célula de planta, que incluye la introducción directa del vector en una célula de planta por medio de bombardeo de micro-proyectiles, electroporación ó un tratamiento regulado-PEG de protoplastos (para revisar ver: Gelvin, S.B. 1998 , Curr Opin. Biotechnol , 9_, 227-232 ; Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci., _4_, 226-231) . Los virus de plantas ARN y ADN son también sistemas de suministro eficientes (Hayes y col. 1988 , Nature, 334 , 179-182; Palmer y col., 1999, Arch Virol . ,144, 1345-1360; Lindbo y col., 2001, Curr. Opin. Plant. Biol.,4_, 181-185) . Los vectores pueden suministrar un transgen ya sea para la integración estable en el genoma/plastome de la plantta (integración del ADN r gulado-Agroba cteri um ó directo) ó para la expresión temporal del transgen ( "Agroinfil ración" ) . Símil ármente las células de los animales pueden ser sometidos a electroporesis, infectadas mediante vectores virales ó transfectadas usando Lipofectin. La construcción de los vectores para el procedimiento de expresión de la invención se puede hacer de conformidad a los procedimientos estándar de biología molecular. Los elementos IRES de la invención son colocados en dirección de la secuencia del nucleótido de interés en el vector para la traducción dependiente-IRES de la secuencia del nucleótido de interés. Modalidades específicas se dan en las Figuras y en la sección de los ejemplos.

La invención comprende células eucarióticas modificadas temporalmente ó transgénicas que contienen una secuencia de ácido nucleico (elemento IRES) obtenido de conformidad a la invención y enlazado funcionalmente a una secuencia del nucleótido de interés La invención además comprende un vector que contiene un elemento IRES obtenido de conformidad a la invención y un cartucho de expresión que contiene el elemento IRES para la construcción del vector de la invención. El vector puede ser un vector ARN que contiene una secuencia IRES ARN así como también un vector ADN que contiene una copia cADN de una secuencia IRES ARN novedosa. La invención es útil lo que permite a un experto en la materia obtener elementos de traducción artificiales con la actividad IRES. Lo que permite identificar los elementos IRES que son más activos que los descritos anteriormente. Además, permite la obtención ó iden ificación de los elementos IRES que son universales con actividad del reino-cruzado y actividad de hecho natural. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS. La Figura 1 ilustra el modelo simplificado de la iniciación de la traducción dependiente-cubierta eucariótica canónica. La interacción de elF4E-elF4G asigna la sub-unidad ribosomal pequeña al 5' extremo del inARN . El elF4G también interactúa con Pablp, elF3 y la helicasa ARN de el F4A para regular el proceso de iniciación. ORF: marco de lectura abierto; PABP: proteina poli (A) -enlazamiento . Figura 2 ilustra el mecanismo de modelo simplificado del registro del ribosoma al mARN durante la iniciación de traducción regulada-IRES del virus de la hepatitis C. El elemento IRES desvia la necesidad para una interacción elF4E-elF4G mediante la proporción de elementos de alternativa por lo cual el ribosoma se registra al mARN. Las flechas indican las varias interacciones directas entre los elementos IRES y el complejo 40S de iniciación. Figura 3 Ilustra las secuencias de nucleótidos de IRESes conocidos. Figura 4. Ilustra el mARN di-cistrónico que contiene IRES sintético basado en las copias similares múltiples de CCGGCGGGU del Gtx 5'UTR (Chappel y col., 2000. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 1536-1541) . Figura 5 Ilustra las secuencias iniciadoras del nucleótido y las etapas de clonación de un IRES artificial que contiene 4 copias de los elementos Ecp. Los sitios de restricción están subrayados. Figura 6 ilustra las secuencias iniciadoras del nucleótido y las etapas de clonación de un IRES artificial que contiene 16 copias del elemento GAAA. Los sitios de restricción están subrayados. Figura 7 Ilustra las secuencias iniciadoras del nucleótido y las etapas de clonación de una secuencia artificial que contiene 16 copias del elemento GUUÜ . Los sitios de restricción están subrayados . Figura 8 Ilustra las secuencias iniciadoras del nucleótido y etapas de clonación de una secuencia artificial que contiene 4 copias del elemento UUÜGCUÜUÜÜGÜAGÜA ( Emp x 4) . Los sitios de restricción están subrayados. Figura 9 Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y etapas de clonación de una secuencia artificial que contiene un elemento abundant e-GCU . Los sitios de restricción están subrayados. Figura 10 Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y las etapas de clonación de un IRES artificial que contiene una secuencia poli (A) . Los sitios de restricción están subrayados. Figura 11 Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y las etapas de clonación de una secuencia poli (G) artificial. Los sitios de restricción están subrayados . Figura 12. Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y las etapas de clonación de un IRES artificial que contiene 16 copias del elemento AAAC . Los sitios de restricción están subrayados. Figura 13. Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y las etapas de clonación de un IRES artificial que contiene 16 copias del elemento AAAU . Los sitios de restricción están subrayados. Figura 14 Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y las etapas de clonación de un IRES contiene 16 copias del elemento GAAC Los sitios de restricción están subrayados. Figura 15. Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y etapas de clonación de un IRES contiene 16 copias del elemento GAAÜ Los sitios de restricción están subrayados. Figura 16 Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y las etapas de clonación del IRES artificial que contiene 12 copias del elemento AAAAC . Los sitios de restricción están subrayados.

Figura 17 Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y las etapas de clonación de IRES artificial que contiene 12 copias del elemento AAAAU . Los sitios de restricción están subrayados. Figura 19 Ilustra las secuencias del iniciador del nucleótido y las etapas de clonación del IRES contiene 16 copias del elemento AGGG Los sitios de restricción están subrayados. Figura 20 Muestra una autoradiografia de proteínas traducidas en RRL mediante H-GFP-GUS que contiene las secuencias artificiales como espaciadores inter-cistrónicos. Las flechas indican la colocación de GüS y las colocaciones esperadas de la proteína RRL 46K endogénica y GFP. Figura 21 Ilustra un diagrama de la expresión del gen GUS en células de protoplastos del tabaco transfectados con las construcciones GFP-GUS bi-cistrónicas basadas-35S que carecen de la estructura de gancho y que contienen secuencias de nucleótido como se indica bajo las barras del diagrama. Los valores de la actividad GUS de cada una de las muestras son normalizadas al contenido GFP en la misma muestra de protoplasto determinado mediante densitomet ria de las bandas GFP a partir de la transferencia Western. Al menos 3 experimentos independien es se usan para el cálculo de los valores promedio y de los errores estándar. Figura 22. Muestra un diagrama de la expresión del gen GUS en células HeLa transfectados con transcripciones H-GFP-GÜS basados-T7. La medición de GUS se conduce como se describe en los Ejemplos y se normaliza a los contenidos de proteina de las muestras. Al menos 3 experimentos independientes se usan para el cálculo de los valores promedio y de los errores estándar. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION. Existen varias invenciones las cuales describen los elementos IRES que son usados para la expresión independiente-cubierta de genes extraños en mARN mult i-cistrónico en células de mamíferos (USA 6060273; USA 6114146; USA 5358856; USA 6096505; USA 171821; USA 5766903), células de plantas ( O 98/54342) y generalmente, en células eucarióticas (USA 171821; USA 5766903; USA 5925565; USA 6114146) . También el ARN circular está comprendido para proporcionar la expresión regulada-IRES independiente-cubierta de un gen (USA 5766903) .La traducción independiente-cubierta del mARN eucariótico será regulada mediante la secuencia incrementada de traducción que se toma del ARN del virus amarillo enano de la cebada el cual es diferente principalmente de los IRESes conocidos (USA 5910628). Generalmente, todas las invenciones publicadas en el campo describen IRESes naturales aisladas de animales (ver por ejemplo, USA 5358856) ó virus de plantas (WO 98/54342) sin dirigirlos a la pregunta para su actividad de reino-cruzado, por ejemplo la actividad de los IRESes conocidos que se limita a ya sea las células de plantas ó de animales. Ningún procedimiento para la obtención de IRESes artificiales, no naturales que son capaces de proporcionar la expresión del gen extraño independiente-cubierto eficiente en células de plantas y en células de animales que han sido descritos. Además no hay métodos disponibles para la obtención ó la identificación de elementos IRES novedosos que tienen actividad de reino-cruzado. La WO 01/55369 describe la obtención de los elementos IRES sintéticos basados en los fragmentos de elementos IRES naturales que interactúan con el ARN ribosomal 18S. Sin embargo el procedimiento se limita a la identificación de los elementos IRES funcionales en los sistemas animales. Además las construcciones di-cistrónicas imaginarias que son propuestas en esta invención no fueron analizadas para eliminar la posibilidad de que el elemento IRES supuesto inter-cistrónico abundante-GC funcione como un iniciador trans c ipcional , con lo cual se produce un mARN mono-cistrónico a partir de lo cual el cistrón se traduce actualmente (Kozak, 2001, Mol. Cell. Biol.21_, 1899-1907) . Sin tener que eliminar esto y otras explicaciones de alternativa los autores concluyen que la secuencia derivada-Gtx es un IRES. Esto postula que la actividad IRES resulta del apareamiento entre mARN y rARN, citando como evidencia la habilidad del elemento CCGGCGGGü para ser entrelazado fotoquimicament e al 18S rARN (Hü y col. 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA. 96, 1339-1444) . Este entrelazado sin embargo, puede estar sin relacionar a la función IRES supuesta, como no requiere formación de un complejo de iniciación del mARN-ribosoma . Por supuesto, el entrelazado ocurre aún cuándo la secuencia derivada-Gtx se incuba con 18S rARN desproteini zada . Por el contrario la WO 01/55369, la posibilidad de la actividad del iniciador transcripcional del IRESes de la presente invención se investiga. Lo que es proporcionado por la transferencia Northern que los elementos IRES artificiales de esta invención usados en los ensayos di-cistrónicos no actúan como iniciadores transcripcionales. Además se muestra evidencia de que las secuencias abundantes de poli-urina (A) (PARS) no actúan como iniciadores en las células de plantas a partir de los experimentos con las plantas transgénicas que expresan IRESCp,i48CR abundante-PARS (Dorokhov y col., 2002. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 9_9, 5301-53' 6). Por el contrario a las tecnologías conocidas, la presente invención proporciona los principios para la obtención de IRESes artificiales que pueden ser sintetizados fácilmente de conformidad a los métodos conocidos en la técnica. Estos IRES de preferencia tienen un nivel elevado de la actividad de reino-cruzado en las células eucarióticas , incluyendo células de hongos (por ejemplo levaduras), mamíferos y plantas. Además propiamente al hecho de que los IRESes de la invención tienen analogía a los sitios de enl a z amiento del ribosoma procariótico (RVS) de las bacterias, por ejemplo E. Coli como análogos funcionales de los IRESes eucariót icos , los IRESes artificiales de la invención que son activos en procariotas así como también los cloroplastos y mitocondria. Para ensayar un elemento IRES obtenido de conformidad a la invención, un sistema de ensayo se plantea tal que comprende H-GFP-GUS de la construcción de ADN bi-ci stróni co que tiene los siguientes elementos en este orden: una estructura que forma un gancho estable (H) sobre el nivel de mARN, un gen de una proteína fluorescente verde (GFP) (secuencia de codificación GFP) , un espaciador inter-cistróni co con sitios de restricción para los elementos IRES potenciales de inserto, y el gen de GUS (secuencia de codificación GUS) un elemento IRES potencial se inserta en el espaciador entre GUS y GFP. Esta construcción luego se transcribe in vitro usando por ejemplo polimerasa ARN T7 para obtener mARN. El mARN luego se traduce in vitro usando un lisado de reticulocito de conejo (RRL) ó un sistema de traducción del extracto del germen de trigo (WGE) in vitro. Ambos sistemas de traducción in vitro están comer cialmente disponibles por ejemplo en Promega y Roche Diagnostics y se pueden usar de conformidad a las instrucciones del fabricante. Después de la traducción, la expresión GüS se determina por ejemplo mediante su actividad enzimática y una detección colorimétrica , mediante auto-radiografía, ó mediante transferencia Western. La expresión del gen GÜS se cuantifica de preferencia en relación a una construcción que tiene un elemento IRES de referencia ó un elemento sin IRES entre el gen en dirección y el gen GÜS. Como un elemento IRES de referencia se tiene la actividad de IRES fuerte del conjunto de ácido poli (A) nucleico (ver ejemplos) que se puede usar. Como un elemento sin IRES el conjunto del ácido poli (G) nucleico (ver ejemplos) puede ser por ejemplo usado ó los conjuntos de ácido nucleico se describen en las Figuras 7 , 8 6 9. La estructura de gancho en la construcción del ADN bi-cistrónico evita la traducción dependiente-cubierta, tal que toda la expresión GUS puede ser descrita para la actividad de traducción del elemento IRES potencial insertado en el espaciador inter-cistrónico de la construcción. Tal estructura de gancho tiene que ser estable debido a que se evita eficientemente la traducción dependiente-cubierta. Preferiblemente su estabilidad es mayor que 30kcal/mol (ver Kozak, M. (1986) Proc. Nati. ñcad. Sci. EUA 83, 2850-2850) , estabilidad insuficiente de la estructura de gancho que puede ser reconocida por cualquier expresión del gen GFP. La traducción de GFP se puede detectar, por ejemplo por via de su fluorescencia, mediante la transferencia Western ó mediante auto-radiografía. La construcción H-GFP-GUS usada en la presente está estructurada a partir de pBlues cript 11 SK+, una secuencia del nucleótido GUS y una secuencia GFP (Ejemplo 1) . La estructura de gancho tiene la secuencia: ggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataccgtgacctcgaggg ggggcccggt acc . Las estructuras equivalentes se pueden fácilmente obtener por cualquier experto en la materia. Todos los aspectos en relación con los sistemas de traducción in vitro están bien estudiados y conocidos en la técnica anterior. Los detalles se pueden encontrar en los siguientes documentos y las referencias citadas en la presente: Anderson, C, y col (1985) Meth. Enzymol. 101, 635; Krieg. P. y Melton, D . (1994) Nucí . Asid. Res 12, 7057; King, R.W. y col (1997) Science 277, 973; DiDonato, J. A. y Karim, M. (1993) . Promega Notes 42, 18; Pelham, H. R. B. y Jackson, R.J. (1976) EUR. J. Biochem. 67, 247; Jackson, R. J. y Hunt, T. (1983) Meth Enzymol 96, 50; Boletines Técnicos de Promega Corp. Nos.126 y 165 y el Manual Técnico No. 232 de la misma compañi a . Los elementos IRES potenciales los cuales proporcionan la elevación para la expresión del gen GUS en un WGE ó en el ensayo de traducción de RRL son elementos IRES de conformidad a la invención. Los elementos IRES obtenidos ó identificados de acuerdo a la invención típicamente tienen actividad del reino-cruzado, por ejemplo se pueden usar para expresar un gen de interés bajo el control de traducción del IRES en plantas y en animales. A pesar de la actividad del reino-cruzado, la actividad del elemento IRES no es normalmente el mismo cuándo la expresión de un gen de interés se compara en los sistemas de plantas ó de animales. Las variaciones en los niveles de expresión naturalmente existen entre los dos sistemas de traducción in vitro mencionados anteriormente. En los sistemas in vivo, estas variaciones son en general aún más elevadas. Aún, los elementos IRES de esta invención muestran sorp endentemente actividad IRES elevada tanto en los sistemas in vitro como en células de animales y en células de plantas . La invención además proporciona un método de identificación de los elementos de ácido nucleico que tienen actividad IRES mediante la investigación de las secuencias del nucleótido, secuencias de nucleótido notablemente de las bases de datos del genoma, aplicando el grupo de criterio antes descrito . La investigación se puede llevar a cabo sobre cualquier secuencia de nucleótido conocido y en las secuencias que se harán conocidas en el futuro. Las secuencias del nucleótido de origen eucariótico por ejemplo las secuencias de plantas y animales son de preferencia investigadas y aquellas de plantas superiores ó animales superiores son las más preferidas . Mientras que las secuencias del genoma incluyen genomas nucleares y genomas de estructura interna similares a los genomas mitocondriales ó plástidos pueden ser investigados. Las secuencias del genoma nuclear eucariótico son preferidas. La investigación se puede llevar a cabo en secuencias de ADN ó de ARN . Si el ADN de cadena doble se usa, ambas cadenas pueden ser seleccionadas. La cadena de codificación se selecciona de preferencia. La investigación se puede restringir a las secuencias 5'UTR de los genes. Su equivalente selecciona las secuencias 5'UTR en el nivel de mAR . La investigación se puede llevar a cabo en el caso más simple, por ver mediante la exploración a lo largo de las secuencias del nucleótido escritas ó impresas. Este procedimiento puede ser exitoso, especialmente si se enfoca en las secuencias 5'UTR. Es más conveniente emplear un método de selección automático, por ejemplo usando una computadora y un programa de computación adecuado. De esta manera las bases de datos grandes de las secuencias de nucleótidos pueden ser seleccionadas con potencial de búsqueda de muchos elementos IRES. La invención por lo tanto comprende el uso de una computadora y un programa de computadora para la investigación antes descrita para los elementos IRES en las secuencias del nucleótido. El programa de computadora comprende un algoritmo basado en el grupo del criterio como se define en las reivindicaciones . Una ventaja esencial de la presente invención es la posibilidad de expresar 2 ó más genes en cartuchos multi-cistrónicos en las células de las plantas ya sean temporalmente ó mediante la transformación estable (plantas transgénicas ) . Otra ventaja de la presente invención es la posibilidad de expresar 2 ó más genes en cartuchos multi-cistrónicos en células de humanos ó en otras células de mamíferos mediante la transformación estable ó temporal (animales t ransgénicos ) . Una ventaja adicional de la presente invención es la posibilidad de expresar dos ó más genes en cartuchos multi-cistrónicos en células de levadura.

Una ventaja más de la presente invención es la posibilidad de obtener vectores virales para la expresión del gen extraño mediante el IRESes abundante-adenina en mamíferos y especialmente en células humanas. Otra modalidad preferida de la presente invención es la obtención de IRES novedosos en base de mARN 5'-UTR eucariótico que contiene AGNB(S) . El análisis de 5'UTRs de la proteína de choque excitada (HSF) mARNs revela las guías 5 ' abundantes en adenina. Además, los ensayos experimentales de la guía de mARN (NTHSF) factor de choque excitado de Nicotiana tahacum confirma esta predicción. El NtHSF 5'-UTR eliminado para tener actividad IRES no sólo en las células de las plantas sino también en las células de humanos. Esta invención proporciona regiones sin traducir 5' del mARN eucariótico que contiene secuencias abundantes de adenina como los IRESes para la expresión de varios genes en cartuchos multi-cistrónicos en células de plantas ó en células de animales ya sea temporalmente ó mediante transformación estable (organismos transgénicos ) . Además tales IRES se pueden usar para la expresión de genes naturales y extraños en vectores basados en virus de animales por ejemplo en terapia de gen. En lo siguiente, la invención se describe además usando ejemplos específicos. Las técnicas biológicas moleculares estándar se llevan a cabo de conformidad a Sambrook y col (1989, Molécula Cloning: un Manual de Laboratorio 2a Ed. Col. Spring Hargor, N. Y.) . Todos los plásmidos utilizados en la invención se pueden preparar de conformidad a las direcciones en la descripción por una persona experta en la técnica.

EJEMPLO 1 Un método para la obtención de IRESes * no naturales que contienen un conjunto de nucleótidos abundante en adenina. En este ejemplo se muestra que es posible obtener elementos IRES artificiales que tienen un conjunto de nucleótido abundante en adenina. Estrategia de clonación: Los plásmidos bi-cistrónicos basados 35-S y el iniciador de transcripción T7 del bacteriófago de las series H-CP-ICS-GUS- ó CP-ICS-GUS en dónde la expresión del gen crTMV CP como un cistrón 5' próximo se bloquea mediante una estructura de gancho artificial estable (H) . Por el contrario, la expresión del gen GüS está bajo el control de unas secuencias inter-cistrónicas (ICS) que incluye una secuencia basada-polienlazador sintético (72 nts en longitud) , IRESMP/ 228CR/ IRESMp,75CR e IRESCPi48CR, ÜICpSP, e IRESCPi48ÜI los cuales han sido descritos previamente (Ivanov y col., 1997; Skulachev y col, 1999) . La construcción de los plásmidos H-GFP-ICS-GUS es como sigue. La construcción de pH-Cla se obtienen mediante la clonación del fragmento del polienlazador (PL)+ (Strategem) y pBlueskrip SK+ en el mismo vector. El fragmento se divide a partir de SK + por Clal y Kpml (el Kpml se transfiere con la polimerasa ADN T4) y se clona en reversa en el vector SK + usando los sitios Clal y Smal . Luego un fragmento polienlazador BamHI-Sacl a partir del plásmido pGEM-3Z se clona en pH-Cla mediante los sitios BamHI y Sacl obteniendo el vector phClaPoli. Este vector contiene dos repeticiones 45-nt reversas seguido por los sitios de clonación múltiples. En la siguiente etapa, el plásmido phGFP se obtienen mediante la clonación del gen GFP en el plásmido pH-ClaPoli mediante los sitios BamHI y HindIII (el gen GFP se obtiene como un producto PCR que usa los oligonucleó idos ccggat cctt at ggt gagcaagggcgaggag y cgcaagcttacttgt cagctcgtccatg y el plásmido GFP-241 (Solovyev y col., 1999 como un patrón. Para obtener pH-GFP-IRESCp,i48CR~GnS, el fragmento EcoRI-Sacl del plásmido pH-CP-IRESCP, i48CR_GOS ( Skulachev y col., 1999) se clona en el vector Phgfp usando los sitios EcoRI y Sacl. El plásmido pH-GFP-Pl-GUS se obtiene mediante la digestión de pH-GFP-IRESCp, i48-GUS con las enzimas EcoRI y Ncol, llenando los extremos salientes con los fragmentos Kleno seguido por el auto-enlazamient o del plásmido. Como un resultado, este plásmido contiene los genes GFP y GÜS con los sitios HindIII, Small, pnl y EcoRI entre los mismos . Para la producción de un IRES artificial, no natural que tiene un conjunto de nucleótido abundante en adenina, dos pares de oligonucleót idos son anillados uno al otro (ver Figura 5) . Los fragmentos ADN obtenidos se someten a digestión con restrictasa Pstl y se unen uno al otro. Los fragmentos unidos se aislan usando electrof oresis de agarosa y se someten a digestión con las restrictasas HindIII y EcoRI . El plásmido pH-GFP-PPx4-GUS se obtiene mediante la clonación del fragmento PPx4 en el vector pH-GFP-PL-GUS usando los sitios HindIII y EcoRI. Ensayos de traducción in vitro: El ensayo de traducción WGE y RRL se puede llevar a cabo como se describe en el Boletín Técnico No. 165 y No. 126, respectivamente de Promega Corporation usando los sistemas de traducción/transcripción acoplados de los Nos. de catálogo L4140 y L4610, respectivamente. Alternativamente un sistema RRL convencional de Promega, No. de catálogo L4960 (Manual Técnico No. 232 se emplea) . Los vectores H-GFP-GUS lineales tienen elementos IRES potenciales insertados entre GFP y GUS que se transcriben usando el sistema de polimerasa ARN/iniciador T7. Las transcripciones ARN se precipitan con LiCl, se disuelven en agua, y se precipitan con etanol . Las concentraciones ARN se miden mediante espectrometría y 5µg de la transcripción se toman para la muestra de traducción in vitro de 25µ1. La expresión GFP y GUS se detecta mediante auto-radiografía. Sistema de ensayo temporal de los protoplastos de plantas Los siguientes procedimientos para la preparación y transfección de protoplastos son usados: (i) los protoplastos se aislan de las hojas de N. tabacum (cv. W 38) como se describe en (Saalbach y col., 1996 Plant Physiol. 112, 975-985) . Las alícuotas de los protoplastos 4xl05 se transfectan con 30 g de "GFP-espaciador-GUS" de las construcciones de ADN di-cistrónicas basadas en pFF19 y se incuban por 36 horas a 25°C en la oscuridad. La actividad de GUS se mide como unidades de luz relativas (RLÜ) . La actividad GÜS se determina de conformidad a (Jefferson 1987. Plant. Mol. Biol. Rep. 5' 387-405) usando MÜG. Para cada uno de los campos del experimento la actividad GUS se asocia con los protoplastos sin transfectar que se restan. Las concentraciones de la proteína se estiman usando un paquete de ensayo de proteína Bio-Rad basado en el método de Bradford (1976 Anal. Biochem. 72, 243-254) . La expresión GFP se detecta con el análisis de transferencia Western usando anticuerpos de ratón monoclonales (Boe ringer Mannheim No. 1814460) de conformidad al manual del fabricante. Las cantidades GFP en las bandas de transferencia Western se calculan usando el Software Quality-One de Bio-Rat. Transfección de las células HeLa usando los virus de vacuna y el iniciador T7 que contiene plásmidos que codifican GUS . Las monocapas HeLa se cultivan en cajas Petri de 3.5cm en un medio esencial mínimo modificado Dulbecco complementado con suero de bovino fetal inactivado-caliente y 100 unidades/ml de estreptomicina y penicilina. Las cantidades del virus de la vacuna modificada Ankara (MBA) expresan el gen de polimerasa de ARN T7 de bacteriófago que se prepara de conformidad a los métodos usuales. Las cajas Petri con células HeLa son confluentes de 80-90% los cuales están infectados con virus que usa 30-40 pfu/célula. Después de 45 min. del periodo de absorción, las células se lavan y se transfectan usando ADN de el plásmido Opti-MEM (Life Technologies, Inc. ) y lipofectín (Life Technologies Inc) . Unas mezclas de transfección de 2µg del ADN en 5µ1 de lipofectín se usan para una caja Petri de 3.5 cm. Para cada una de las construcciones, 6 cajas Petri se usan en cada uno de los experimentos. Las células se incuban a 37°C por 6 horas. Después de la incubación el medio se elimina, las células se lavan dos veces con PVS y se somete a lisis directamente sobre al placa Petri en una solución reguladora de lisis de 250 µ? (lOOmM de KHP03, de pH 7.8, Tritón X-100 al 0.2% y 0.5mM de DTT) por 10 min. El lisado se recoge, se clarifica mediante centrifugación a 2000g por 10 min. y se almacena a -70°C. La actividad GUS se detecta en 20µ1 del lisado usando el sistema del reactivo GUS Light(R> (Tropicx, A, EUA) de conformidad a los protocolos del fabricante. EJEMPLO 2. Un método para la obtención de IRES artificial, no naturales que contienen 16 copias del elemento GAAA.

El objetivo principal de este ejemplo es para demostrar la posibilidad de la obtención de un elemento IRES artificial no natural, que tiene un conjunto del ácido nucleico abundante en adenina de 16 copias de la secuencia GAAA, con lo cual los contenidos del nucleótido A y G son de 75% y 25% respectivamente . Estrategia de clonación. Para producir un IRES artificial, no natural que contiene copias múltiples de la secuencia GAAA, 2 pares de los oligonucleótidos son anillados (ver Figura 6) . Los fragmentos ADN obtenidos se someten a digestión con la restrictasa Pstl y se unen una a la otra. Los fragmentos unidos se aislan usando electroforesis de agarosa y se someten a digestión con las restrictasas HindIII y EcoRI . El plásmido pH-GFP- (GAAA) 16-GUS que se obtiene mediante la clonación del fragmento (GAAA)i6) en el vector pfi-GFP-PL-GUS usando los sitios HindIII y EcoRI (Figura 6) . Las etapas de clonación de las secuencias artificiales contienen 16 copias del elemento GUÜU, 4 copias del elemento UUUGCÜUUUÜGÜAGUA y una secuencia abundante en GCU usada como controles negativos que se muestran en las Figuras 8-10, respectivamente . Procedimientos para los ensayos de los IRESes es se describen en el Ejemplo 1. EJEMPLO 3. Un método para la obtención de IRES artificial no naturales que contiene un conjunto de ácido poli (A) nucleico . Un objetivo principal de este ejemplo es para el ensayo de la posibilidad de la obtención de un IRES artificial no natural, que contiene una secuencia poli (A) con un contenido del nucleótido A de 100%. Esta secuencia se compara a una secuencia poli (G) con un contenido de G del 100%. El resultado principal de estos ejemplos es que una secuencia artificial que contiene la secuencia poli (A) funciona como un IRES, con lo cual la secuencia artificial no contiene la secuencia poli (G) . Estrategia de clonación, del IRES que contiene poli (A) y la secuencia poli (G) que están presentes en la Figura 10 y 11 respectivamente. Los métodos para el ensayo de las construcciones obtenidas se describen en el Ejemplo 1. EJEMPLO 4 Obtención de las secuencias abundantes en adenina artificiales no naturales, que contienen contenidos de base de piridina y guanina diferentes. El objetivo principal de éste ejemplo es para ensayar la posibilidad de la obtención de los elementos IRES artificiales no naturales que contienen las secuencias abundantes en adenina, con lo cual los contenidos de adenina varían entre 100 y 25% y los contenidos del nucleótido de pirimidina son hasta el 20%. Estrategia de clonación; Las secuencias del iniciador del nucleótido y de las etapas de clonación de IRESes artificiales que contienen 16 copias del fragmento AAAC y AAAÜ, con lo cual el contenido del nucleótido de pirimidina es de 25% los cuales están representados en las Figuras 12 y 13 respectivamen e. Las secuencias del iniciador del nucleótido y las secuencias de clonación de los IRESes artificiales que contienen 16 copias del fragmento GAAAC y del fragmento GAAU, con lo cual el contenido de guanina es de 25%, el contenido de adenosina es de 50% y el contenido del nucleótido de pirimidina es de 25% los cuales están representados en las Figuras 14 y 15 respectivamente. Los siguientes 2 ejemplos de los elementos de IRES tienen múltiples copias del AAAAC y del fragmento AAAAÜ demuestra que el contenido del nucleótido de pirimidina del 20% no elimina la actividad de IRES. La estrategia de clonación de estas construcciones se menciona en las Figuras 16 y 17 respectivamente. Otros dos IRESes artificiales contienen copias múltiples del AAGG (Figura 18) y del fragmento AGGG (Figura 19) que serán estructurados con la ayuda para determinar el contenido del nucleótido de adenina mínimo en un conjunto del nucleótido que proporciona la actividad del IRES artificial. RESULTADOS .

Se ha obtenido una serie de secuencias sintéticas (Figuras 5-9) las cuales se usan como espaciadores inter-cis rónicos en el vector H-GFP-GUS bi-cistrónico y se examina en RRL, protoplastos del tabaco y células HeLa. Dos secuencias sintéticas que representan 4 copias enlazadas de una repetición directa de 19-nt (Ecpx4) y 16 copias de la secuencia GAAA (GAAA)i6 (Figuras 5 y 6) que se comparan con otros dos tipos de secuencias artificiales: (i) secuencias abundantes de GUUÜ (GUüü) i6 (Figura 7) y en Empx4 (Figura 8) y (ii) un tetrámero abundante de GC (GCRT) que contiene 4 copias de la secuencia abundante de GC de 8-nt CGCGGGCG enlazada mediante la secuencia 6-nt ÜÜUGUÜÜ (Figura 9) . La traducción de RRL de H-GFP-GUS bi-cistrónico contiene las secuencias artificiales como los espaciadores inter-cistrónicos mostrados (Figura 20) tal que las secuencias artificiales Ecpx4 y (GAAA) i6 dirige eficientemente la traducción del gen GUS bajo condiciones cuándo la traducción del gen GFP se bloquea mediante la estructura (H estable) . Además la eficiencia in vitro de estas dos secuencias son aún más elevadas que el IRESCp,i48CR natural, con lo cual el alargamiento del Ecpx4 a 8 copias (Ecpx8) no incrementa la expresión del gen GUS. Las secuencias abundantes de GÜUU de Empx4 y (GUÜU)16 se eliminan para obtener un efecto despreciable en la síntesis de GÜS (Figura 20) . La secuencia GCRT no tiene ninguna actividad de IRES (datos no mostrados) . Los experimentos in vivo sobre los protoplastos del tabaco (Figura 21) y las células HeLa (Figura 22) t ransfectados con las construcciones H-GFP-GUS que contienen las secuencias artificiales como se han descrito antes, que se confirman los resultados in vitro: la secuencia artificial (GAAA) ig es adecuada para la función como un elemento IRES aún más eficientemente que el IRESEMCB (en las células HeLa) y comparable a IRESCp,i48CR (protoplastos y células HeLa ) . Los resultados con las secuencias artificiales que contienen las secuencias poli (A) y poli (G) demuestran que en contraste a las secuencia poli (G) , el IRES artificial basado en 100% del contenido de adenina funciona eficientemente como un IRES (Tabla 1) . Tabla 1 : expresión GÜS en RRL directa mediante las secuencias poli (A) y poli (G) usadas como espaciadores inter-cistrónicos de las transcriptasas H-GFP-GUS. Las muestras se incuban a 30°C por 60 min. La actividad GUS se mide en alícuotas de 2 µ? usando MUG .

Claims (38)

REIVINDICACIONES

1. -Un método para la obtención de una secuencia de ácido nucleico que tiene un conjunto de ácido nucleico abundante de al menos 25 nucleótidos en longitud, en dónde la secuencia de ácido nucleico es capaz de originar la traducción mediante los elementos IRES de la entrada de ribosoma internos; y el bloque de ácido nucleico abundante en adenina comprende al menos 80mol-% de adenina.

2. -ün método para la obtención de una secuencia de ácido nucleico que tiene un conjunto de ácido nucleico abundante en adenina de al menos 25 nucleótidos en longitud, con lo cual la secuencia de ácido nucleico es capaz de originar la traducción mediante el elemento IRES de entrada de ribosoma interno; el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende de 40 a 100mol-% de adenina; y el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende de hasta 20mol-% de guanina.

3. -Un método para la obtención de la secuencia de ácido nucleico que tiene un conjunto de ácido nucleico abundante de adenina de al menos 40 nucleótidos en longitud, con lo cual la secuencia del ácido nucleico es capaz de originar la traducción mediante el elemento IRES de entrada de ribosoma interno; y el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende al menos 60mol-% de adenina .

4. -Un método para la obtención de una secuencia de ácido nucleico que tiene un conjunto de ácido nucleico abundante en adenina de al menos 50 nucleótidos en longitud, con lo cual la secuencia del ácido nucleico es capaz de originar la traducción mediante el elemento IRES de entrada de ribosoma interno; el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende de 40 a 100mol-% de adenina y un sub-conjunto de las bases sin adenina que separan dos bases de adenina dentro del conjunto de ácido nucleico abundante en adenina que tiene una longitud a lo sumo de cinco bases.

5. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 4r en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende al menos 60mol-% de adenina .

6. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 4, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende al menos 80mol-%.

7. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es de al menos 30 nucleótidos en longitud.

8. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es al menos 40 nucleótidos en longitud.

9. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es al menos 50 nucleótidos en longitud.

10. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es de hasta 200 nucleótidos en longitud.

11. -El método de conformidad a la reivindicación 10, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es de hasta 100 nucleótidos en longitud.

12. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende menos de 30mol-% de nucleótidos de pirimidina.

13. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende menos que 20mol-% de nucleótidos de pirimidina.

14. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones l a 13, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende al menos 90mol-% de adenina .

15. -El método de conformidad a la reivindicación 14, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende 100mol-% de adenina.

16. -El método de conformidad a la reivindicación 3 ó 4, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende hasta 30mol-% de guanina.

17. -El método de conformidad a la reivindicación 16, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina comprende hasta 20mol-% de guanina.

18. -El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 ó 16 y 17, en dónde cualquier sub-conjunto de pirimidina dentro de lo conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es de a lo sumo 3 nucleótidos en longitud.

19. -El método de conformidad a la reivindicación 18, en dónde cualquier sub-conjunto de pirimidina dentro del conjunto de ácido nucleico abundante en adenina es de a lo sumo dos nucleótidos en longitud.

20. -El método de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 3, en dónde cualquier sub-conjunto de las bases sin adenina separan dos bases de adenina dentro del conjunto de ácido nucleico abundante en adenina que tiene una longitud de a lo sumo 10 bases.

21. -El método de conformidad a la reivindicación 20, en dónde cualquier sub-con unto de bases sin adenina separan dos bases de adenina dentro del conjunto de ácido nucleico abundante en adenina tiene una longitud de a lo sumo cinco bases .

22. -El método de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 21, en dónde la secuencia de ácido nucleico capaz de originar la traducción mediante el elemento IRES de entrada de ribosoma interno se selecciona para proporcionar la elevación a un nivel de expresión deseado de un gen informador bajo la regulación de traducción de la secuencia de ácido nucleico.

23. -El método de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 22, en dónde el elemento IRES se prueba para la actividad IRES mediante insertar el elemento IRES en una construcción di-cistrónica lineal entre un gen en dirección y un gen informador GUS en dirección, en dónde el elemento IRES se coloca para la traducción dependiente-IRES del gen GUS en dirección y con lo cual el gen en dirección es precedido por una estructura de gancho estable para prevenir la traducción independiente-IRES de los genes; la determinación de la traducción dependiente-IRES del gen GUS en un lisado del reticulocito de conejo ó en un ensayo de traducción in vitro del extracto de germen de trigo con lo cual la expresión del gen GUS se cuantifica de preferencia en relación a una construcción que tiene un elemento IRES de referencia ó de un elemento sin-IRES entre el gen en dirección y el gen GUS; y la selección de un elemento IRES el cual proporciona la elevación para la expresión GUS en al menos uno de los ensayos de traducción in vi tro.

24. -El elemento IRES que se obtiene u obtenible de conformidad al método de una de las reivindicaciones 1 a 23.

25. -Un vector que tiene un elemento IRES de conformidad a la reivindicación 24.

26. -Un cartucho de ácido nucleico para la construcción de un vector de conformidad a la reivindicación 25.

27. -Un método para la identificación de los elementos de ácido nucleico que tiene actividad IRES mediante la investigación de las secuencias de nucleótido, secuencias de nucleótido notablemente de las bases de datos del genoma, aplicando el criterio como se define en una de las reivindicaciones 1 a 23.

28. -El método de conformidad a la reivindicación 27, en dónde las regiones 5' -sin traducir de los marcos de lectura abierta son investigados.

29. -Un programa de computadora para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 27 ó 28 y que comprende un algoritmo basado en el criterio como se define en una de las reivindicaciones 1 a 21.

30. -Una computadora que tiene el programa de la computadora de conformidad a la reivindicación 29.

31. -Un procedimiento de expresión de una secuencia de nucleótido de interés en células eucarióticas mediante la introducción en las células de un vector que comprende la secuencia del nucleótido de interés enlazado funcionalmente a una secuencia de ácido nucleico en dirección que se obtiene de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 23 ó 27 a 28, con lo cual la secuencia del nucleótido de interés se traduce independientemente-cubierta mediante la secuencia del ácido nucleico en dirección.

32. -El procedimiento de conformidad a la reivindicación 31, en dónde la secuencia del nucleótido de interés se expresa a partir de un mARN bi-cistrónico ó poli-cistrónico .

33. -El procedimiento de conformidad a la reivindicación 31 ó 32, en dónde la célula eucariótica es una célula de planta ó una célula de una planta.

34. -El procedimiento de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, en dónde la célula eucariótica es una célula animal.

35. -El procedimiento de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, en dónde la célula eucariótica es una célula de levadura.

36. -El procedimiento de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, en dónde el conjunto de ácido nucleico abundante en adenina de la secuencia de ácido nucleico es un elemento poli (A) .

37. -las células eucarióticas modificadas temporalmente ó transgénicas que contienen un elemento IRES como se define en la reivindicación 24 enlazadas funcionalmente a una secuencia de un nucleótido de interés.

38. -La planta modificada temporalmente ó transgénica que contiene un elemento IRES como se definió en la reivindicación 24 enlazada funcionalmente a una secuencia del nucleótido de interés.