CN116209751A - 用于hsv-1基因编辑的指导rna及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了指导RNA(gRNA)，其包含能够将Cas9蛋白靶向1型单纯疱疹病毒(HSV‑1)的ICP6基因中的靶序列以提供特异性切割事件的指导序列，其中与野生型HSV‑1相比，所述靶序列包含GATC插入。还提供了通过使用所述gRNA产生所需重组HSV‑1的HSV‑1基因编辑系统和基因编辑方法。

Description

用于HSV-1基因编辑的指导RNA及其方法
技术领域
本文公开的实施方案涉及基因编辑领域，特别是涉及用于1型单纯疱疹病毒(HSV-1)的Cas9介导的基因编辑的人工指导RNA(gRNA)。还公开了通过使用所述gRNA进行的Cas9介导的基因编辑方法。
背景技术
1型单纯疱疹病毒(HSV-1；按分类学名称也被称为人类单纯疱疹病毒1型)是疱疹病毒科单纯疱疹病毒属中的双链DNA病毒。HSV-1含有152,000个核苷酸。在过去的几十年中，HSV-1已经被修饰以产生用于治疗癌症的各种溶瘤病毒。其中，重组HSV-1病毒株OrienX010(ICP34.5-/-，ICP47-，ICP6-)是正在进行的临床试验中的溶瘤病毒，其包括在原始ICP34.5基因处插入两个拷贝的人GM-CSF基因和未公开的在ICP6基因内的失活修饰。
CRISPR/Cas9介导的同源重组被用于改进HSV-1的基因编辑，特别是用于基因插入(Dong Wang et al.(2018),Cancer Gene Ther.,25(5-6):93-105)。然而，由于各种HSV-1突变体之间的差异，现有的基因编辑方法不能应用于所有种类的HSV-1突变体。特别地，使用CRISPR/Cas9系统编辑所述HSV-1突变体OrienX010的经修饰ICP6基因区域是不容易实现的。
目前还需要开发用于上述HSV-1突变体类型的高效的基因编辑方法。
发明内容
本文公开的实施方案涉及包含指导序列的指导RNA(gRNA)，所述指导序列能够将Cas9蛋白靶向1型单纯疱疹病毒(HSV-1)的ICP6基因中的靶序列以提供特异性切割事件，其中与野生型HSV-1相比，所述靶序列包含GATC插入。
一些实施方案涉及编码如上所述的gRNA的第一多核苷酸。
一些实施方案还涉及载体，所述载体包含可操作地连接至合适的启动子的如上所述的第一多核苷酸，并且任选地还包含编码Cas9蛋白的第二多核苷酸。
一些实施方案还涉及包含如上所述的一种载体和含有编码Cas9蛋白的第二多核苷酸的第二载体的载体系统。
一些实施方案还涉及用如上所述的载体或载体系统转化的转化体细胞，其能够表达gRNA和Cas9蛋白。
一些实施方案还涉及包含如上所述的gRNA和Cas9蛋白的Cas9/gRNA复合物。
一些实施方案还涉及用于HSV-1的基因编辑系统，其包括：
(a)包含ICP6基因中的靶序列的HSV-1病毒株，其中所述靶序列与野生型HSV-1相比包含GATC插入；
(b)如上所述的载体或载体系统，其能够表达gRNA和Cas9蛋白；以及
(c)靶向多核苷酸，其按顺序包含上游同源臂、外源基因和下游同源臂，其中所述上游同源臂和下游同源臂分别与所述HSV-1的靶结构域的5’区和3’区同源，其中所述靶序列位于所述HSV-1的靶结构域内。
本发明还涉及用于产生重组HSV-1的基因编辑方法，其包括以下步骤：
(a)提供HSV-1病毒株，其中所述HSV-1病毒株包含ICP6基因中的靶序列，并且所述靶序列与野生型HSV-1相比包含GATC插入；
(b)构建如上所述的载体或载体系统，其能够表达gRNA和Cas9蛋白；
(c)制备包含靶向多核苷酸的线性DNA，所述靶向多核苷酸能够通过同源重组将外源基因插入所述HSV-1的靶结构域中；
(d)将所述载体或载体系统转化到细胞中以获得第一转化体细胞；
(e)将线性DNA转化到第一转化体细胞中以获得第二转化体细胞；
(f)用HSV-1病毒株感染第二转化体细胞，以在第二转化体细胞中引起CRISPR/Cas9介导的同源重组的发生，其中gRNA将Cas9蛋白靶向靶序列以提供特异性切割事件，然后通过同源重组将外源基因插入靶结构域。
本发明还涉及通过上述基因编辑方法产生的重组HSV-1。
附图说明
图1显示HSV-1靶病毒株的部分ICP6序列(SEQ ID No.17)和HSV-1病毒株17的序列比对。
图2显示gRNA切割效率测定的凝胶电泳结果。泳道1含有DNA标记，泳道2-7显示gRNA 1-6的结果，泳道8含有在Cas9体外切割试剂盒(Inovogen Tech.Co.,目录号PC1400)中提供的阳性对照。
图3显示质粒“pCas9-ICP6gRNA-Neo R”的基因图。
图4是显示本发明的Cas9/gRNA介导的同源重组的将EGFP插入HSV-1的ICP6基因座的概念的图。
图5显示获得的重组HSV-1的两阶段PCR鉴定的凝胶电泳结果。泳道2-6是第一阶段PCR的结果(使用引物对HSV1-GFP-KI-F1和HSV1-GFP-KI-R1)，其中泳道2-5分别含有来自重组HSV-1样品1-4的PCR产物，泳道6含有来自HSV-1靶病毒株的PCR产物。泳道8-12是第二阶段PCR的结果(使用引物对HSV1-GFP-KI-F2和HSV1-GFP-KI-R2)，其中泳道8-11分别含有来自重组HSV-1样品1-4的PCR产物，泳道12含有来自HSV-1靶病毒株的PCR产物。泳道1，7和13含有DNA标记。
图6显示噬斑纯化的结果。绿色荧光噬斑用灰色箭头指示，没有绿色荧光的噬斑用黑色箭头指示。上图显示荧光显微镜观察到的结果；下图显示通过非荧光光学显微镜观察到的结果。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。此外，列出以下定义以说明和定义用于描述本发明的多个术语的含义和范围。
定义
如本文所用，术语“指导RNA”、“gRNA”、“单指导RNA”和“sgRNA”在本文中可互换使用，并且是指能够结合Cas蛋白并有助于将Cas蛋白靶向靶序列(例如，DNA序列)内的特定位置的RNA分子(或统称为一组RNA分子)。具有“gRNA功能性”的非天然存在的(人工)gRNA是具有天然存在的指导RNA的一种或多种功能(例如与Cas蛋白结合)，或是具有由与Cas蛋白结合的指导RNA执行的功能以提供特异性切割事件的gRNA。
术语“CRISPR相关蛋白”或“Cas蛋白”是指野生型Cas蛋白、其片段或其变体。术语“Cas9”或“Cas9蛋白”或“Cas9核酸酶”或“CRISPR相关蛋白9”是指RNA指导的DNA核酸酶、其片段、或其突变体或变体，能够与gRNA结合并切割靶DNA序列。通常，Cas9蛋白包含gRNA结合结构域和DNA切割结构域。
在一些实施方案中，Cas9蛋白是识别PAM序列(即NGG)的RNA指导的DNA核酸酶。在一些实施方案中，Cas9蛋白是源自酿脓链球菌的RNA指导的DNA核酸酶。
术语“Cas9/gRNA复合物”是指包含Cas9蛋白和指导RNA的复合物，其可以协同地在靶DNA处提供特异性切割事件。
术语“指导序列”是指指导RNA的与靶DNA的靶序列互补的序列。通常，指导序列是由A、U、C和G组成的约20个核苷酸的RNA分子。
术语“靶序列”是指被Cas9/gRNA复合物靶向和切割的DNA序列。靶序列与gRNA的指导序列互补，并且位于原型间隔区-邻近基序(PAM)序列的5’端。靶序列是约15-25个核苷酸的序列。在一些实施方案中，靶序列是20个核苷酸的序列。
术语“原型间隔区-邻近基序(PAM)”是指紧跟由Cas9蛋白靶向的靶序列的2-6个碱基对的DNA序列，并帮助Cas9蛋白提供特异性切割事件。例如，PAM序列是NGG，如CGG、AGG、TGG和GGG。
术语“特异性切割事件”是指由Cas9/gRNA复合物引起的特异性DNA切割，并且在切割过程中不发生脱靶效应。
术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指环状双链DNA环，其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段。
术语“转化体细胞”是指已经用细胞外DNA(外源的、人工的或修饰的)转化或转染，并且能够表达其中包含的基因的细胞。
术语“同源定向修复(HDR)”是指细胞中使用同源模板来指导修复以准确和精确地修复双链DNA断裂的机制。HDR最常见的形式是同源重组(HR)，这是其中核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间交换的一种遗传重组。
术语“同源重组(HR)”是指发生在两个同源DNA分子之间的DNA交叉。同源重组是在细胞中插入外源基因或缺失希望的基因的常用方法。
术语“靶向多核苷酸”是指用于通过同源重组使DNA交叉的合成序列，其通常包括上游同源臂、下游同源臂和任选的外源基因(取决于插入或缺失的目的)。术语“靶向载体”是指包含靶向多核苷酸的载体。
术语“靶结构域”指HSV-1的被选择用于同源重组的序列。靶结构域通常包含与靶向多核苷酸的上游同源臂同源的5’区和与靶向多核苷酸的下游同源臂同源的3’区。靶序列位于HSV-1的靶结构域内，其中靶序列中发生的特异性切割事件将增强靶结构域中的同源重组。
详细描述
详细地，本发明涉及包含指导序列的人工指导RNA(gRNA)，所述指导序列能够将Cas蛋白靶向1型单纯疱疹病毒(HSV-1)的ICP6基因中的靶序列以提供特异性切割事件，其中与野生型HSV-1相比，所述靶序列包含GATC插入。特别地，本文使用的Cas蛋白是Cas9蛋白。
在一个方面，本发明涉及如上所述的gRNA，其中所述ICP6基因表达通过插入GATC序列引起的失活的ICP6蛋白。另一方面，ICP6基因是失活的ICP6基因。
在一个实施方案中，ICP6基因包含对应于SEQ ID NO.17的核苷酸25-64的序列。在另一个实施方案中，ICP6基因包含SEQ ID NO.17。
本文应用的HSV-1可以是具有如上所述的ICP6基因特征的任何HSV-1突变体，即具有GATC插入。在一个实施方案中，本文应用的HSV-1包含对应于SEQ ID NO.17的核苷酸25-64的序列。在一个实施方案中，本文应用的HSV-1包含SEQ ID NO.17。例如，所用的HSV-1可以是野生型HSV-1或HSV-1病毒株CL-1(CGMCC1736)或HSV-1病毒株17，其将GTAC序列插入其ICP6基因以产生SEQ ID NO.17。
在另一个方面，所用的HSV-1可以是任何现有的经修饰的HSV-1，其中在其ICP6基因中插入GTAC序列以产生SEQ ID NO.17。例如，所用的HSV-1可以是病毒株OrienX010，其包括插入到其ICP6基因中的GATC序列，以产生SEQ ID NO.17。
在另一个方面，本发明涉及如上所述的gRNA，其中靶序列是SEQ ID NO.17的核苷酸25-64的20个核苷酸区段的序列。在一个实施方案中，靶序列包含SEQ ID NO.17的20个核苷酸区段的序列。
在另一个实施方案中，靶序列包含选自SEQ ID No.18、19、20、21、22和23的序列。在特定的实施方案中，靶序列选自SEQ ID No.18、19、20、21、22和23。例如，靶序列是SEQ IDNo.21。
在另一个方面，本发明涉及上述gRNA，其中所述指导序列包含选自SEQ ID No.24、25、26、27、28和29的序列。在一个实施方案中，指导序列是选自SEQ ID No.24、25、26、27、28和29的序列。例如，指导序列是SEQ ID No.27。
通常，人工gRNA包含与靶基因中的靶序列互补的指导序列，和与Cas9蛋白结合并形成用于引起靶序列切割的Cas9/gRNA复合物的Cas9相关序列。在一些实施方案中，指导序列与HSV-1的ICP6基因中的靶序列互补。编码gRNA的Cas9相关序列的DNA序列是例如gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggt gctttt。
在一个具体方面，本发明涉及编码gRNA的第一多核苷酸，其中所述gRNA包含如上所述的指导序列和Cas9相关序列。
在一个具体方面，本发明涉及一种载体，该载体包含编码如上所述的gRNA的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至适合的启动子，并且任选地进一步包含编码Cas9蛋白的第二多核苷酸。
具体地，本发明涉及包含编码如上所述的gRNA的第一多核苷酸和编码Cas9蛋白的第二多核苷酸的载体，所述第一多核苷酸可操作地连接至合适的启动子。例如，本发明的载体可以是实施例3中构建的质粒pCas9-ICP6gRNA-Neo R。另一方面，用于表达gRNA的合适启动子可以是U6启动子。
在一个具体方面，本发明涉及包含第一载体和第二载体的载体系统，其中该第一载体包含编码如上所述的gRNA的第一多核苷酸，并且该第二载体包含编码Cas9蛋白的第二多核苷酸。
在另一个方面，本发明涉及用如上所述的载体或载体系统转化的转化体细胞，其能够表达gRNA和Cas9蛋白。特别地，本文所用的转化体细胞包括但不限于Vero细胞、BHK细胞或HEK293细胞。在一个实施方案中，转化体细胞是Vero细胞。
在一个具体方面，本发明涉及包含如上所述的gRNA和Cas9蛋白的Cas9/gRNA复合物。
在一个具体方面，本发明涉及用于HSV-1的基因编辑系统，其包括：
(a)包含ICP6基因中的靶序列的HSV-1病毒株，其中所述靶序列与野生型HSV-1相比包含GATC插入；
(b)如上所述的载体或载体系统，其能够表达如上所述的gRNA和Cas9蛋白；以及
(c)靶向多核苷酸，其按顺序包含上游同源臂、外源基因和下游同源臂，其中所述上游同源臂和下游同源臂分别与所述HSV-1的靶结构域的5’区和3’区同源，其中所述靶序列位于所述HSV-1的靶结构域内。
在一个具体方面，本发明涉及用于产生重组HSV-1的基因编辑方法，其包括以下步骤：
(a)提供HSV-1病毒株，其中所述HSV-1病毒株包含ICP6基因中的靶序列，并且与野生型HSV-1相比，所述靶序列包含GATC插入；
(b)构建如上所述的载体或载体系统，其能够表达如上所述的gRNA和Cas9蛋白；
(c)制备包含靶向多核苷酸的线性DNA，所述靶向多核苷酸能够通过同源重组将外源基因插入所述HSV-1的靶结构域中；
(d)将所述载体或载体系统转化到转化体细胞中以获得第一转化体；
(e)将线性DNA转化到第一转化体中以获得第二转化体；
(f)用HSV-1病毒株感染第二转化体以在转化体中引起CRISPR/Cas9介导的同源重组的发生，其中gRNA将Cas9蛋白靶向靶序列以提供特异性切割事件，然后通过同源重组将外源基因插入靶结构域。
在本发明的基因编辑方法中，ICP6基因是通过插入GATC序列引起的失活ICP6基因。在另一个实施方案中，ICP6基因被部分缺失。在特定的实施方案中，ICP6基因包含对应于SEQ ID NO.17的核苷酸25-64的序列。特别地，ICP6基因包含SEQ ID NO.17。
在本发明的基因编辑方法中，靶序列包含选自SEQ ID No.18、19、20、21、22和23的序列。在一个实施方案中，靶序列选自SEQ ID No.18、19、20、21、22和23。在特定的实施方案中，靶序列是SEQ ID No.21。
特别地，步骤(c)中的线性DNA通过用限制性内切酶消化包含靶向多核苷酸的同源重组(HR)靶向载体而获得。用于插入希望的靶向多核苷酸的HR靶向载体可以是商业载体，例如pEASY-Blunt克隆载体。
具体地，步骤(c)中的靶向多核苷酸按顺序包含上游同源臂、外源基因和下游同源臂；其中所述上游同源臂和所述下游同源臂分别与所述HSV-1的靶结构域的5’区和3’区同源，其中所述靶序列位于所述HSV-1的靶结构域内。
特别地，所述HSV-1的靶结构域包含位于5’区的上游同源臂和位于3’区的下游同源臂，其中有待被Cas9/gRNA系统切割的靶序列位于靶结构域内。在一个实施方案中，所述HSV-1的靶结构域包含部分ICP6基因区段和UL40基因，其中上游同源臂与部分ICP6基因区段的上游序列同源，下游同源臂与部分ICP6基因区段和UL40基因的下游序列同源，且有待由Cas9/gRNA系统切割的靶序列位于部分ICP6基因区段内(如图4中所示)。
上游同源臂与所述HSV-1的靶结构域的5’区同源。在一个实施方案中，上游同源臂包含SEQ ID No.12的序列。下游同源臂与所述HSV-1的靶结构域的3’区同源。在一个实施方案中，下游同源臂包含SEQ ID No.13的序列。
本文所用的外源基因包括但不限于可编码以下的基因：(1)报告子，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、mCherry、DsRed、tdTomato或Zsgreen；(2)免疫调节细胞因子，如GM-CSF、白介素(即IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9和IL-10)、干扰素(IFN)和肿瘤坏死因子(即TNF-α和TNF-β)；(3)治疗性抗体或其功能片段，如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG3抗体和抗TIM3抗体；(4)用于调节免疫应答的融合蛋白；(5)趋化因子，如CCL5、CCL20和CCL21；(6)肿瘤凋亡相关因子，如肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)和P53基因；(7)抗血管生成因子，例如内皮抑素和血管内皮生长抑制因子(VEGI)；(8)抑制肿瘤相关基因表达的小RNA，如miRNA、siRNA、shRNA和lncRNA；或(9)肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)，例如甲胎蛋白(AFP)、黑素瘤相关抗原(MAGE)、HER2、EGFR、PSA、TRP-2、EpCAM、GPC3、间皮素(MSLN)、CD20、CD40和PD-L1。
在一个具体方面，本发明涉及通过上述基因编辑方法产生的重组HSV-1。
实施例
本发明通过以下举例说明本发明的gRNA和HSV-1基因编辑方法的实施例进一步说明，但不限于此。
材料
HSV-1病毒株CL-1于2006年6月14日保藏在中国普通微生物培养物保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 1736，与HSV-1病毒株17(NCBI登录号：NC_001806)具有99.5％的序列相似性。
使用CN 1283803C或CN 101376893B中描述的同源重组方法修饰HSV-1病毒株CL-1(151180bp)的基因组以获得HSV-1病毒株OrienX010(ICP34.5-/-，ICP47-，ICP6-)(下文称为“HSV-1靶病毒株”)。简而言之，这种遗传修饰包括ICP34.5基因(在513-1259核苷酸和123999-124745核苷酸处的两个拷贝)和ICP47基因(在144230-144496核苷酸处)的缺失，以及将人GM-CSF基因插入ICP34.5基因的原始位置。此外，GATC序列被插入到88251-88252核苷酸之间的位点(其中原始ICP6基因位于85327-88740核苷酸处)以导致所述ICP6基因的移码突变以及失活。因此，获得的HSV-1靶病毒株具有如SEQ ID No.17所示的部分ICP6序列，其中SEQ ID No.17含有所述GATC插入。
如图1所示，对HSV-1靶病毒株的部分ICP6序列(SEQ ID No.17)和HSV-1病毒株17(NCBI登录号：NC_001806)进行序列比对比较。除GATC插入外，HSV-1靶病毒株的部分ICP6序列(SEQ ID No.17)与HSV-1病毒株17基因组DNA的89324-89390核苷酸相同。将获得的HSV-1靶病毒株及其基因组DNA纯化并储存在适合于以下实验的条件下。
在表1中总结了本文使用的序列，用于快速检查。
表1
Figure BDA0004091016120000111
Figure BDA0004091016120000121
实施例1
gRNA的指导序列的设计
选择含有GATC插入的HSV-1ICP6部分序列(SEQ ID No.17)作为靶标并用于设计gRNA的指导序列，其与涵盖GATC插入的20个核苷酸的ICP6靶序列互补。
在产生的DNA序列库中，选择涵盖GATC插入的6个ICP6靶序列作为候选。表1中显示了6个ICP6靶序列及其相应的PAM序列。
表1
Figure BDA0004091016120000131
(注：“+”表示DNA的有义链；“-”表示DNA的反义链。PAM是指原型间隔区邻近基序。下划线表示插入的GTAC或其部分。)
表2中示出了各自靶向来自表1的ICP6靶序列1-6之一的gRNA 1-6的六个指导序列。进一步分析含有这些指导序列的gRNA 1-6以评价它们的切割效率。
表2
Figure BDA0004091016120000132
实施例2
设计的gRNA的体外切割效率测定
使用Cas9体外切割试剂盒(Inovogen Tech.Co.,目录号PC1400)并遵循制造商的说明进行切割效率分析。简言之，在37℃的温度下，在Cas9反应缓冲液(来自试剂盒)中共孵育Cas9蛋白(来自试剂盒)、来自表2的设计的gRNA、及ICP6靶DNA片段30分钟来进行Cas9切割反应，然后通过在85℃的温度下孵育10分钟来停止反应。通过DNA凝胶电泳观察结果。
使用商品化的sgRNA体外转录试剂盒(Inovogen Tech.Co.,目录号PC1380)从合成的多核苷酸模板(如下所示)转录和获得gRNA，然后进行纯化过程。
N20-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttt，其中N20是表1中所示的所选的ICP6靶序列。
使用材料部分公开的HSV-1靶病毒株基因组DNA作为DNA模板，以及引物对ICP6-F和ICP6-R(SEQ ID No.30和31)，进行聚合酶链式反应(PCR)以合成ICP6靶DNA片段(594bp)，其中变性、引物退火和引物延伸的温度分别为98℃、61℃、72℃，反应循环为35次。
切割效率测定的结果示于图2中。凝胶电泳显示gRNA 4(泳道5)显示出高切割活性，产生两条带的DNA切割产物，其小于594bp。594bp条带表明ICP6靶DNA片段未切割。gRNA1、2、3、5和6(即泳道2、3、4、6和7)都表现出弱的切割活性，仅产生少量的DNA切割产物。
根据上述结果，gRNA 4具有成为HDR增强gRNA的最大潜力。因此，选择ICP6靶序列4(SEQ ID No.21)用于以下表达质粒构建和CRISPR/Cas9介导的同源重组。
实施例3
Cas9/gRNA表达质粒pCas9-ICP6gRNA-Neo R的构建
为了将ICP6靶序列4(SEQ ID No.21)克隆到质粒pX330-U6-chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene，目录号42230)中，如下合成具有4个核苷酸突出端的两个部分互补的寡核苷酸ICP6gRNA4-F和ICP6gRNA4-R(SEQ ID No.1和2)。
5’-CACC GGCCTCGGCGCAGATCGATCT-3’(SEQ ID No.1)
3’-CCGGAGCCGCGTCTAGCTAGA CAAA-5’(SEQ ID No.2，反向)
通过退火程序将部分互补的寡核苷酸退火以形成具有4个核苷酸突出端的双链DNA。将具有粘性末端的双链DNA(包含希望的ICP6靶序列4)克隆到BbsI预消化的质粒pX330-U6-chimeric_BB-CBh-hSpCas9中以获得称为pX330-ICP6gRNA的质粒。通过使用引物对U6-seq-F2和ICP6gRNA4-R(SEQ ID No.16和2)的PCR和琼脂糖凝胶电泳(PCR产物为243bp)证实ICP6靶序列4的成功克隆。
然后，使用质粒pX330-ICP6gRNA作为DNA模板，通过使用引物对MluI-gRNA-F和SpeI-sgRNA-R(SEQ ID No.3和4)进行PCR来扩增U6-ICP6gRNA片段(SEQ ID No.5)，其中变性、引物退火和引物延伸的温度分别为98℃、58℃、72℃，反应循环为35次。通过1％琼脂糖凝胶电泳(474bp)分析和确认PCR产物。将扩增的U6-ICP6gRNA片段再循环并通过限制性内切酶MluI和SpeI消化以进一步使用。
将Cas9基因克隆到质粒pcDNA3.1(Invitrogen，目录号V79020)中以获得称为pcDNA3.1-Cas9的质粒。然后，用限制性内切酶MluI和SpeI消化获得的质粒pcDNA3.1-Cas9。
然后，通过T4 DNA连接酶连接MluI/SpeI预切割的U6-ICP6gRNA片段和质粒pcDNA3.1-Cas9，得到称为“pCas9-ICP6gRNA-NeoR”的质粒(如图3和SEQ ID NO.36所示)。
然后将质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR转染到抗Trans1-T1噬菌体的化学感受态细胞(TransGen Biotech，目录号CD501)中。将转染的细胞在选择性培养基中在37℃孵育过夜。挑选转染的细胞的单个克隆，通过使用引物对MluI-gRNA-F和SpeI-sgRNA-R(SEQ ID No.3和4)的PCR和1％琼脂糖凝胶电泳(PCR产物为474bp)证实这种转染。将获得的含有质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR的转染的细胞储存备用。
实施例4
用质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR转染的Vero细胞的制备
将实施例3中获得的含有质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR的转染的细胞在LB培养基中在37℃下培养过夜，然后使用
Figure BDA0004091016120000161
HiPure Plasmid MaxiPrep试剂盒(TransGenBiotech，目录号EM121)并遵循制造商方案进行质粒DNA提取。在
Figure BDA0004091016120000162
缓冲液(NewEngland Biolabs，目录号B7204S)中使用限制性内切酶MluI-HF(NEB)将提取的质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR加工成线性的，然后纯化。
通过使用商业试剂LipofectamineTM 3000(InvitrogenTM，目录号L3000008)并遵循制造商的方案将获得的线性质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR转染到Vero细胞(
Figure BDA0004091016120000163
CCL-81TM)中。简言之，通过混合5μg线性质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR、5μl P3000TM试剂(InvitrogenTM，目录号L3000008)和250μl Opti-MEMTM培养基(GibcoTM，目录号31985088)制备稀释的质粒DNA。通过混合5μl LipofectamineTM 3000试剂和250μl Opti-MEMTM培养基获得稀释的LipofectamineTM 3000试剂。通过将上述稀释的质粒DNA和稀释的LipofectamineTM 3000试剂混合，然后在室温下孵育5分钟来制备DNA-脂质复合物。
为了转染，然后将DNA-脂质复合物(含有线性质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR)与Vero细胞共孵育，将Vero细胞以4×105个细胞/孔的细胞密度接种在包含2mL完全生长培养基的6孔板中。孵育24小时后，根据细胞生长条件，每2天或每3天更新包含最终浓度为800μg/ml的选择性抗生素G418(GeneticinTM，GibcoTM，目录号10131027)的5-10mL生长培养基。孵育约15天后，用质粒pCas9-ICP6gRNA-NeoR转染的Vero细胞(下文称为“Vero-ICP6细胞”)稳定生长并储存用于后续实验。
实施例5
同源重组靶向载体的构建
为了构建同源重组(HR)靶向载体，如下制备包含上游/下游同源臂(SEQ ID No.12和13)和外源EGFP基因(SEQ ID No.14)的靶向多核苷酸(SEQ ID No.15)。
上游同源臂(UHA；SEQ ID No.12)通过PCR合成，其中将材料部分公开的HSV-1靶病毒株的基因组DNA用作DNA模板，引物对为ICP6-SOE-F1和ICP6-SOE-R1(SEQ ID No.6和7)，变性、引物退火和引物延伸的温度分别为98℃、63℃、72℃，反应循环为35次。通过1％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物(1534bp)，然后回收用于进一步使用。
下游同源臂(DHA；SEQ ID No.13)通过PCR合成，其中将材料部分中公开的HSV-1靶病毒株的基因组DNA用作DNA模板，引物对为ICP6-SOE-F3和ML40-SOE-R3(SEQ ID No.8和9)，变性、引物退火和引物延伸的温度分别为98℃、62℃、72℃，反应循环为35次。通过1％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物(1194bp)，然后回收用于进一步使用。
外源EGFP基因(SEQ ID No.14)通过PCR合成，其中以pEGFPN1(Clontech)为DNA模板，引物对为EGFP-SOE-F2和EGFP-SOE-R2(SEQ ID No.10和11)，变性、引物退火和引物延伸的温度分别为98℃、60℃、72℃，反应循环为35次。通过1％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物(1628bp)，然后回收用于进一步使用。
然后，上游同源臂(UHA；SEQ ID No.12)和外源EGFP基因(SEQ ID No.14)通过重叠延伸PCR连接在一起，产生UHA-EGFP片段(3133bp)。UHA-EGFP片段和下游同源臂(DHA；SEQID No.13)通过另外的重叠延伸PCR连接在一起以产生UHA-EGFP-DHA片段(下文称为“靶向多核苷酸”；SEQ ID No.15)。通过1％琼脂糖凝胶电泳确认最终重叠PCR产物(4300bp)，然后回收用于进一步使用。
通过将靶向多核苷酸(SEQ ID No.15)克隆到商业pEASY-Blunt克隆载体(TransGen Biotech，目录号CB101-01)中获得HR靶向载体，然后将其转染到抗Trans1-T1噬菌体的化学感受态细胞(TransGen Biotech，目录号CD501)中。将转染的细胞在选择性LB培养基中在37℃孵育过夜。挑取转染的细胞的单个克隆，并通过使用引物对ICP6-SOE-F1和ML40-SOE-R3(SEQ ID No.6和9)的PCR，随后使用1％琼脂糖凝胶电泳(PCR产物为4300bp)来证实这种转染。将由此获得的含有HR靶向载体的转染的细胞储存备用。
实施例6
HSV-1中CRISPR/Cas9介导的同源重组
通过使用
Figure BDA0004091016120000181
HiPure Plasmid MaxiPrep Kit(TransGen Biotech，目录号EM121)从实施例5中获得的转染的细胞收获HR靶向载体，然后通过使用限制性内切酶EcoRV-HF(New England Biolabs，目录号R3195S)将其在
Figure BDA0004091016120000182
缓冲液(NewEngland Biolabs，目录号B7204S)中加工成线性的。由此获得的线性HR靶向载体通过使用一般纯化方法纯化。
通过使用市售试剂Lipofectamine TM 3000(Invitrogen TM，目录号L3000008)并按照制造商的方案将线性HR靶向载体转染到实施例4中获得的Vero-ICP6细胞中。简言之，通过混合5μg线性HR靶向载体，5μl P3000 TM试剂和125μl Opti-MEM TM培养基制备稀释的质粒DNA。通过混合5μl Lipofectamine TM 3000试剂和125μl Opti-MEM TM培养基获得稀释的Lipofectamine TM 3000试剂。通过将上述稀释的质粒DNA和稀释的Lipofectamine TM3000试剂混合，然后在室温下孵育15分钟来制备DNA-脂质复合物。
然后，为了转染，将DNA-脂质复合物(含有线性HR靶向载体)与Vero-ICP6细胞(含有线性质粒pCas9-ICP6gRNA-Neo R)在37℃的温度下共孵育8小时，所述Vero-ICP6细胞以4×105个细胞/孔的细胞密度接种在包含2mL完全生长培养基的6孔板中。孵育8小时后，向上述培养基中加入2mL含有材料部分中公开的HSV-1靶病毒株的基础培养基(MOI＝1)以引起病毒感染。在培养期间观察到病毒诱导的致细胞病变效应。当致细胞病变效应增加至80％(约48小时)时，收获含有病毒感染的Vero细胞的培养基并储存在-80℃下用于进一步使用。
实施例7
重组HSV-1的鉴定
为了鉴定，将实施例6中收获的上述病毒感染的Vero细胞进行三个冷冻/解冻循环(-80℃/30℃)，然后以3000rpm离心(ThermoFisher，离心机参考号75005297；转子目录号75003331)处理10分钟以获得含有重组HSV-1的上清液。将蛋白酶K(20mg/ml)和10％SDS加入上清液中，然后将其在58℃孵育2小时，在98℃孵育10分钟，在4℃孵育5分钟。孵育后，以15000g离心5分钟，收获上清液用作以下PCR实验中的DNA模板。
使用两个PCR确认HSV-1的正确同源重组。如图4所示，通过正确的同源重组插入外源基因(EGFP)，并设计两个引物对，每个引物对用于扩增EGFP基因的一部分和下游HR臂的片段，如图4所示。
在第一阶段PCR中，使用材料部分获得的HSV-1靶病毒株的基因组DNA作为DNA模板，引物对为HSV1-GFP-KI-F1和HSV1-GFP-KI-R1(SEQ ID No.32和33)，变性、引物退火和引物延伸的温度分别为98℃、60℃、72℃，反应循环为35次。通过1％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物(2214bp)，然后回收用作下一次PCR的DNA模板。
在第二阶段PCR中，获得的第一PCR产物(2214bp)用作DNA模板，引物对为HSV1-GFP-KI-F2和HSV1-GFP-KI-R2(SEQ ID No.34和35)，变性、引物退火和引物延伸的温度分别为98℃、60℃、72℃，反应循环为35次。通过1％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物(2063bp)。
图5的泳道2-5分别显示了重组HSV-1的第一次PCR的样品1-4的结果，泳道8-11分别显示了第二阶段PCR的结果。对于重组HSV-1样品3和4(泳道4-5用于第一阶段PCR，泳道10-11也用于第二阶段PCR)，观察到对应于预期扩增子的条带，开始于EGFP基因并延伸到下游HR臂中，表明在这些样品中成功完成了同源重组。
实施例8
重组HSV-1的纯化
通过使用噬斑纯化方法纯化重组HSV-1。简而言之，将Vero细胞以8x105个细胞/孔的细胞密度接种在包含完全生长培养基的6孔板中，并在37℃下培养过夜。然后，除去原始培养基，向每个孔中加入1mL稀释的重组病毒溶液，在37℃共孵育2小时。共孵育后，弃去剩余的病毒溶液，加入2mL含有1.8％低熔点琼脂糖(Sigma，目录号A9045)的完全生长培养基以形成覆盖层。将板倒置并在37℃孵育。每天检查平板的致细胞病变效应。
观察到明显的细胞损伤后(约48小时)，加入2mL含有1.8％低熔点琼脂糖和稀释的中性红(Sigma，目录号N2889)的完全生长培养基以形成另一覆盖层。将板再次倒置并在37℃下孵育24小时。使用荧光显微镜观察绿色荧光板。
如图6中所示，收获绿色荧光噬斑。随后，选择并纯化绿色荧光噬斑，并进行噬斑纯化至少三次，直到噬斑全部变成绿色荧光噬斑。绿色荧光噬斑表明，利用所公开的gRNA成功地完成了CRISPR/Cas9介导的HVS-1靶病毒株的同源重组。
Figure IDA0004091016180000011
Figure IDA0004091016180000021
Figure IDA0004091016180000031
Figure IDA0004091016180000041
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Figure IDA0004091016180000061
Figure IDA0004091016180000071
Figure IDA0004091016180000081
Figure IDA0004091016180000091
Figure IDA0004091016180000101
Figure IDA0004091016180000111
Figure IDA0004091016180000121
Figure IDA0004091016180000131
Figure IDA0004091016180000141
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Figure IDA0004091016180000161
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Figure IDA0004091016180000201
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Figure IDA0004091016180000221
Figure IDA0004091016180000231
Figure IDA0004091016180000241
Figure IDA0004091016180000251

Claims (30)

1.一种指导RNA(gRNA)，其包含能够将Cas9蛋白靶向1型单纯疱疹病毒(HSV-1)的ICP6基因中的靶序列以提供切割事件的指导序列，其中与野生型HSV-1相比，所述靶序列包含GATC插入。
2.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述ICP6基因表达通过插入GATC序列引起的失活的ICP6蛋白。
3.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述ICP6基因是失活的ICP6基因。
4.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述ICP6基因包含对应于SEQ ID NO.17的核苷酸25-64的序列。
5.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述ICP6基因包含SEQ IDNO.17。
6.根据权利要求5所述的gRNA，其中所述靶序列是选自对应于SEQ ID NO.17的核苷酸25-64的序列范围的20个核苷酸的序列。
7.根据权利要求5所述的gRNA，其中所述靶序列包含选自SEQID NO.17的20个核苷酸的序列。
8.根据权利要求5所述的gRNA，其中所述靶序列包含选自SEQID No.18、19、20、21、22和23的序列。
9.根据权利要求5所述的gRNA，其中所述靶序列选自SEQ IDNo.18、19、20、21、22和23。
10.根据权利要求5所述的gRNA，其中所述靶序列是SEQ IDNo.21。
11.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述指导序列包含选自SEQ ID NO.24、25、26、27、28和29的序列。
12.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述指导序列是选自SEQID NO.24、25、26、27、28和29的序列。
13.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述指导序列是SEQ IDNo.27。
14.一种第一多核苷酸，其编码根据权利要求1-13中任一项所述的gRNA。
15.一种载体，其包含与合适的启动子可操作地连接的根据权利要求14所述的第一多核苷酸。
16.根据权利要求15所述的载体，其进一步包含编码Cas9蛋白的第二多核苷酸。
17.一种载体系统，其包含根据权利要求15所述的一种载体和包含编码Cas9蛋白的第二多核苷酸的第二载体。
18.一种用根据权利要求16所述的载体或根据权利要求17所述的载体系统转化的转化体细胞，其能够表达gRNA和Cas9蛋白。
19.根据权利要求18所述的转化体细胞，其是Vero细胞。
20.一种Cas9/gRNA复合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的gRNA、和Cas9蛋白。
21.一种用于HSV-1的基因编辑系统，其包括：
(a)包含在ICP6基因中的靶序列的HSV-1病毒株，其中所述靶序列与野生型HSV-1相比包含GATC插入；
(b)根据权利要求16所述的载体或根据权利要求17所述的载体系统，其能够表达gRNA和Cas9蛋白；和
(c)靶向多核苷酸，其按顺序包含上游同源臂、外源基因和下游同源臂，其中所述上游同源臂和所述下游同源臂分别与所述HSV-1的靶结构域的5’区和3’区同源，其中所述靶序列位于所述HSV-1的靶结构域内。
22.一种用于产生重组HSV-1的基因编辑方法，其包括以下步骤：
(a)提供HSV-1病毒株，其中所述HSV-1病毒株包含ICP6基因中的靶序列，并且与野生型HSV-1相比，所述靶序列包含GATC插入；
(b)构建根据权利要求16所述的载体或根据权利要求17所述的载体系统，其能够表达gRNA和Cas9蛋白；
(c)制备包含靶向多核苷酸的线性DNA，所述靶向多核苷酸能够通过同源重组将外源基因插入所述HSV-1的靶结构域中；
(d)将所述载体或所述载体系统转化到转化体细胞中以获得第一转化体；
(e)将所述线性DNA转化到所述第一转化体中以获得第二转化体；和
(f)用所述HSV-1病毒株感染所述第二转化体以在所述第二转化体中引起CRISPR/Cas9介导的同源重组的发生，其中所述gRNA将所述Cas9蛋白靶向所述靶序列以提供特异性切割事件，然后通过同源重组将所述外源基因插入所述靶结构域中。
23.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中所述ICP6基因包含SEQ ID NO.17。
24.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中所述靶序列包含选自SEQ ID No.18、19、20、21、22和23的序列。
25.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中所述靶序列选自SEQ ID No.18、19、20、21、22和23。
26.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中所述靶序列是SEQ ID No.21。
27.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中步骤(c)中的所述靶向多核苷酸按顺序包含上游同源臂、所述外源基因和下游同源臂；其中所述上游同源臂和所述下游同源臂分别与所述HSV-1的靶结构域的5’区和3’区同源，其中所述靶序列位于所述HSV-1的靶结构域内。
28.根据权利要求27所述的基因编辑方法，其中所述上游同源臂包含SEQ ID No.12。
29.根据权利要求27所述的基因编辑方法，其中所述下游同源臂包含SEQ ID No.13。
30.一种重组HSV-1，其通过根据权利要求22所述的基因编辑方法产生。
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