CN113862229A - 一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法 - Google Patents

一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113862229A
CN113862229A CN202010618707.4A CN202010618707A CN113862229A CN 113862229 A CN113862229 A CN 113862229A CN 202010618707 A CN202010618707 A CN 202010618707A CN 113862229 A CN113862229 A CN 113862229A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gamma
gene
ifn
herpes simplex
simplex virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010618707.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张旭辉
罗显麟
唐锐华
陈小锋
李文佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co ltd
Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Guangdong HEC Pharmaceutical
Original Assignee
Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co ltd
Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co ltd, Sunshine Lake Pharma Co Ltd filed Critical Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co ltd
Priority to CN202010618707.4A priority Critical patent/CN113862229A/zh
Priority to PCT/CN2021/070373 priority patent/WO2022001080A1/zh
Publication of CN113862229A publication Critical patent/CN113862229A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/763—Herpes virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/869—Herpesviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16632—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法和应用。本发明通过将I型单纯疱疹病毒的ICP34.5基因、ICP47基因敲除，并在UL23基因上插入IFN‑γ表达序列，构建得到的重组病毒，可有效降低其神经毒性及选择性在肿瘤细胞中感染复制增殖，并且对肿瘤细胞的敏感性提高。

Description

一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体地，本发明涉及一种重组单纯疱疹病毒、构建重组单纯疱疹病毒的方法以及制药用途。
背景技术
溶瘤病毒疗法是一种利用病毒特异性地在肿瘤细胞中复制继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应的新型肿瘤治疗方法。相比其他肿瘤治疗方法，溶瘤病毒疗法具有复制高效、杀伤效果好和毒副作用小等特点，已经成为肿瘤治疗研究领域的新热点。
IFN-γ即干扰素γ，各种癌症类型影响的早期研究揭示了其广泛的抗肿瘤潜力。其中，最广为人知的作用是增强NK细胞和CTL细胞潜在抗肿瘤效应，IFN-γ可诱导CXC趋化因子如MIG和IP-10的表达，这已被证明对T细胞浸润肿瘤至关重要。由于肿瘤细胞表达的抗原与其未转化的细胞不同，例如，由基因突变引起的新抗原，过表达的细胞抗原或病毒抗原，IFN-γ刺激肿瘤抗原呈递MHC分子的表达以增加肿瘤细胞的免疫原性，使它们更容易受到免疫识别和破坏。IFN-γ还通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡显示出直接的抗癌活性。
IFN-γ刺激肿瘤抗原呈递MHC分子的表达以增加肿瘤细胞的免疫原性，使它们更容易受到免疫识别和破坏。IFN-γ还通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡显示出直接的抗癌活性，目前没有携带IFN-γ的HSV1的报道，将IFN-γ运用在抗肿瘤领域，构建的新型溶瘤病毒HSV-1IFN-γ(+)，具有高效、特异性强等优点，还可引起特异的抗肿瘤免疫反应，提升在肿瘤细胞的敏感性。
发明内容
本申请旨在至少在一定程度上解决上述背景技术中的技术问题之一。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组单纯疱疹病毒。所述重组单纯疱疹病毒的ICP47和双拷贝的ICP34.5基因被敲除，并将IFN-γ基因编码框设置于UL23基因位置，所述IFN-γ选自hIFN-γ或mIFN-γ。
敲除HSV基因组中的复制非必需基因ICP47，可提高被病毒感染的肿瘤细胞表面MHC-I的表达和细胞抗原呈递的能力；敲除双拷贝ICP34.5，可使单纯疱疹病毒(HSV)在正常细胞内复制受限，选择性地在肿瘤细胞中复制，进而提高HSV病毒地用药安全性。
经试验验证，当IFN-γ基因编码框设置于HSV载体的UL23基因位置时，上述重组单纯疱疹病毒可持续高表达IFN-γ，不仅高选择地在肿瘤细胞内繁殖感染，而且还具有免疫调节作用，确保肿瘤细胞被机体自身的免疫反应彻底清除。
根据本发明的实施例，IFN-γ可以是hIFN-γ或mIFN-γ。
根据本发明的实施例，上述重组单纯疱疹病毒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，IFN-γ基因编码框设置于UL23基因序列的第387-521 位核苷酸之间。需要说明的是，本申请描述的UL23基因序列编码是以UL23基因起始密码子的第一位核苷酸为第1位进行顺序编码的，UL23基因的序列可参考：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001806.2？report＝genbank&from ＝46609&to＝47803&strand＝true。
根据本发明的具体实施例，hIFN-γ基因编码框设置于UL23基因序列的第 387-521位核苷酸之间是通过将UL23基因序列的第388-520位核苷酸敲除，之后将hIFN-γ基因编码框插入UL23基因序列的第387-521位核苷酸之间获得的。
根据本发明的实施例，所述启动子包括选自CMV、CAG、EF1α、劳斯肉瘤氏病毒长末端重复序列(RSV LTR)、金属硫蛋白I(MTI)的至少之一。
根据本发明的实施例，所述启动子为CMV。
根据本发明的实施例，所述HSV为HSV1。发明人发现，HSV2可能引起生殖器感染，进而选择HSV1，安全性进一步提高。
根据本发明的实施例，hIFN-γ基因编码框具有如下所示的核苷酸序列，1) SEQID NO:1所示的核苷酸序列；2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。
ATGAAGTACACCAGCTATATCCTGGCCTTCCAGCTGTGCATCGTGCTGG GCTCCCTGGGCTGCTACTGTCAGGACCCCTATGTGAAGGAGGCCGAGAAC CTGAAGAAGTACTTCAATGCAGGACACTCCGACGTGGCAGATAACGGCAC CCTGTTTCTGGGCATCCTGAAGAATTGGAAGGAGGAGTCTGATCGGAAGAT CATGCAGAGCCAGATCGTGAGCTTCTACTTCAAGCTGTTCAAGAACTTTAA GGACGATCAGTCTATCCAGAAGAGCGTGGAGACAATCAAGGAGGACATGA ATGTGAAGTTCTTTAACTCTAACAAGAAGAAGAGGGACGATTTCGAGAAG CTGACCAACTACAGCGTGACAGATCTGAATGTGCAGAGAAAGGCCATCCA CGAGCTGATCCAGGTCATGGCAGAGCTGAGCCCTGCAGCAAAGACAGGCA AGCGGAAGAGGAGCCAGATGCTGTTTCGCGGCAGGAGAGCCTCTCAGTGA (SEQ ID NO:1)。
根据本发明的实施例，所述重组单纯疱疹病毒具有如下所示的核苷酸序列， a)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；b)与a)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。
TCGATGTGTCTGTCCTCCGGAAGGGCCCCCAACACGATGTTTGTGCCG GGCAAGGTCGGCGGGATGAGGGCCACGAACGCCAGCACGGCCTGGGGGG TCATGCTGCCCATAAGGTATCGCGCGTCttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaact gcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggc attatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcgg ttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggag tttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgt gtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgac tcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggATG AAGTACACCAGCTATATCCTGGCCTTCCAGCTGTGCATCGTGCTGGGCTCCC TGGGCTGCTACTGTCAGGACCCCTATGTGAAGGAGGCCGAGAACCTGAAG AAGTACTTCAATGCAGGACACTCCGACGTGGCAGATAACGGCACCCTGTTT CTGGGCATCCTGAAGAATTGGAAGGAGGAGTCTGATCGGAAGATCATGCA GAGCCAGATCGTGAGCTTCTACTTCAAGCTGTTCAAGAACTTTAAGGACGA TCAGTCTATCCAGAAGAGCGTGGAGACAATCAAGGAGGACATGAATGTGAAGTTCTTTAACTCTAACAAGAAGAAGAGGGACGATTTCGAGAAGCTGACC AACTACAGCGTGACAGATCTGAATGTGCAGAGAAAGGCCATCCACGAGCT GATCCAGGTCATGGCAGAGCTGAGCCCTGCAGCAAAGACAGGCAAGCGGAAGAGGAGCCAGATGCTGTTTCGCGGCAGGAGAGCCTCTCAGTGAcagatatc cagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagc catctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaat tgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaag acaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggta tccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagc gccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtGGATCCCCGGGT ACCGAGCTCCCCATTGTTATCTGGGCGCTTGTCATTACCACCGCCGCGTCCC CGGCCGATATCTCACCCTGGTCGAGGCGGTGTTGTGTGGTGTAGATGTTCG CGATTGTCTCGG(SEQ ID NO:2)。
根据本发明的实施例，mIFN-γ基因编码框具有如下所示的核苷酸序列，1) SEQID NO:3所示的核苷酸序列；2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。
ATGAACGCCACCCACTGCATCCTGGCCCTGCAGCTGTTCCTGATGGCC GTGTCCGGCTGCTACTGTCACGGCACAGTGATCGAGAGCCTGGAGTCCCTG AACAATTATTTCAACAGCTCCGGCATCGACGTGGAGGAGAAGTCTCTGTTT CTGGATATCTGGCGGAATTGGCAGAAGGACGGCGATATGAAGATCCTGCAG TCTCAGATCATCAGCTTCTACCTGCGCCTGTTTGAGGTGCTGAAGGACAAC CAGGCCATCTCCAACAATATCTCTGTGATCGAGAGCCACCTGATCACCACAT TCTTTTCCAATTCTAAGGCCAAGAAGGATGCCTTCATGTCCATCGCCAAGTT TGAGGTGAACAATCCCCAGGTGCAGAGGCAGGCCTTTAATGAGCTGATCA GAGTGGTGCACCAGCTGCTGCCTGAGTCTAGCCTGAGGAAGAGAAAGCGG AGCCGCTGTTGA(SEQ ID NO:3)。
根据本发明的实施例，所述重组单纯疱疹病毒具有如下所示的核苷酸序列， a)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；b)与a)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。
TCGATGTGTCTGTCCTCCGGAAGGGCCCCCAACACGATGTTTGTGCCG GGCAAGGTCGGCGGGATGAGGGCCACGAACGCCAGCACGGCCTGGGGGG TCATGCTGCCCATAAGGTATCGCGCGTCttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaact gcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggc attatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcgg ttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggag tttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgt gtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgac tcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggATG AACGCCACCCACTGCATCCTGGCCCTGCAGCTGTTCCTGATGGCCGTGTCC GGCTGCTACTGTCACGGCACAGTGATCGAGAGCCTGGAGTCCCTGAACAA TTATTTCAACAGCTCCGGCATCGACGTGGAGGAGAAGTCTCTGTTTCTGGA TATCTGGCGGAATTGGCAGAAGGACGGCGATATGAAGATCCTGCAGTCTCA GATCATCAGCTTCTACCTGCGCCTGTTTGAGGTGCTGAAGGACAACCAGGC CATCTCCAACAATATCTCTGTGATCGAGAGCCACCTGATCACCACATTCTTTTCCAATTCTAAGGCCAAGAAGGATGCCTTCATGTCCATCGCCAAGTTTGAG GTGAACAATCCCCAGGTGCAGAGGCAGGCCTTTAATGAGCTGATCAGAGT GGTGCACCAGCTGCTGCCTGAGTCTAGCCTGAGGAAGAGAAAGCGGAGCCGCTGTTGAcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcc tttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagc aagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaacc agctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcg tgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccg tGGATCCCCGGGTACCGAGCTCCCCATTGTTATCTGGGCGCTTGTCATTACC ACCGCCGCGTCCCCGGCCGATATCTCACCCTGGTCGAGGCGGTGTTGTGTGGTGTAGATGTTCGCGATTGTCTCGG(SEQ ID NO:4)
在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组单纯疱疹病毒的构建方法。
根据本发明的实施例，所述构建方法包括如下步骤：
步骤一、构建PCDNA3.1(+)-CMV-IFN-γ-poly(A)质粒：用NheI/NotI同时酶切PUC57 simple-IFN-γ质粒，将片段回收，与用NheI/NotI酶切的PCDNA3.1(+) 载体连接，创建CMV启动IFN-γ基因表达、poly(A)信号终止的质粒 PCDNA3.1(+)-CMV-IFN-γ-poly(A)；
步骤二、构建pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2：PCR扩增病毒UL23基因上游的同源臂UL23-HOM1片段，利用同源重组的方式与线性化的pMD18-T载体连接，构建成功的质粒命名为pMD18-T-UL23-HOM1；PCR扩增病毒UL23基因下游的同源臂UL23-HOM2片段，用EcoRI酶酶切质粒pMD18-T-UL23-HOM1，使用同源重组的方式将UL23-HOM2片段与线性化的pMD18-T-UL23-HOM1载体连接，构建成功的质粒命名为pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2；
步骤三、构建pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-IFN-γ-poly(A)：扩增 CMV-IFN-γ-poly(A)序列，用XbaI酶酶切质粒pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2，使用同源重组的方式将CMV-IFN-γ-poly(A)片段与线性化的 pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2载体连接，构建成功的质粒命名为 pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-IFN-γ-poly(A)；
步骤四、构建靶向LacZ基因的打靶质粒：将靶向LacZ的引物退火互搭，用BbsI酶酶切质粒CRISPR/Cas9-sgRNA质粒，将互搭的打靶引物与线性化的 CRISPR/Cas9-sgRNA载体通过粘性互补的方式连接，成功构建出打靶质粒 CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-12或CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-11；
步骤五、293FT细胞内CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的同源重组I型单纯疱疹病毒KOS株：将步骤三中表达hIFN-γ的同源质粒 pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-hIFN-γ-poly(A)、步骤四中靶向LacZ基因的打靶质粒与ICP34.5基因、ICP47基因被敲除，UL23基因失活的KOS基因组共同转染293FT细胞，获得表达IFN-γ的重组病毒HSV-1IFN-γ(+)。
本领域的技术人员可以理解，所述步骤一、二的顺序可互换。
根据本发明的实施例，上述方法中，所述IFN-γ选自hIFN-γ或mIFN-γ。
根据本发明实施例的方法可构建表达hIFN-γ的重组病毒HSV-1hIFN-γ(+)，或表达mIFN-γ的重组病毒HSV-1mIFN-γ(+)。
根据本发明实施例的方法构建的重组单纯疱疹病毒，可选择性杀伤肿瘤细胞，提升对肿瘤细胞的敏感性。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例，步骤二中的上下游同源臂中，
上游侧翼序列的引物对包括：上游序列hrR3UL23HOM1-F1为 CCTGCAGGTCGACGAGATGCCGTAGTCAGGTTTAGTTCGTCCGGC；
下游序列hrR3UL23HOM1-R1为 GGGATCCTCTAGAGACGCGCGATACCTTATGGGCAGCATGAC；
下游侧翼序列的引物对包括：上游序列hrR3UL23HOM2-F1为 CCGGGTACCGAGCTCCCCATTGTTATCTGGGCGCTTGTCATTACCAC；
下游序列hrR3UL23HOM2-R1为 TATGACCATGATTACTCTGGAGCATCCGCACGACTGCGGTGATATTA。
根据本发明的实施例，步骤三中的IFN-γ基因中，
上游序列hrR3 UL23 HOM-F1为 AAGGTATCGCGCGTCTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTA；
下游序列hrR3UL23HOM1-R1-2为 GGTACCCGGGGATCCACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAA。
根据本发明的实施例，步骤四中的LacZ基因打靶序列中，
Figure RE-GDA0002622064790000071
根据本发明的实施例，步骤五中重组病毒HSV-1IFN-γ(+)通过1轮或多轮挑取病毒斑的方法进行纯化。
根据本发明的实施例，步骤五中重组病毒HSV-1IFN-γ(+)通过3轮挑取病毒斑的方法进行纯化。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述转基因细胞携带有前面所述的重组单纯疱疹病毒或前面所述的构建方法构建得到的重组单纯疱疹病毒。根据本发明实施例的重组细胞是通过将前面所述的重组单纯疱疹病毒导入受体细胞中获得的，前面所述的重组单纯疱疹病毒导入受体细胞后，溶瘤病毒可在受体细胞中包装并大量复制，并持续高表达IFN-γ。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的重组单纯疱疹病毒、前面所述的构建方法构建的重组单纯疱疹病毒或前面所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。
根据本发明的实施例，所述药物用于选择性杀伤肿瘤细胞。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的 pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-hIFN-γ-poly(A)质粒图谱；
图2是根据本发明实施例的构建的重组病毒的PCR凝胶电泳检测图；
图3是根据本发明实施例的构建的重组病毒HSV-1-UL23-mIFN-γ的测序结构图；
图4是根据本发明实施例的构建的重组病毒HSV-1-UL23-hIFN-γ的测序结构图；
图5是根据本发明实施例的构建的重组病毒的打靶位点的PCR凝胶电泳检测图；
图6是根据本发明实施例的24h时mIFN-γ、hIFN-γ、2K对Skmel-28肿瘤细胞的抑制曲线；
图7是根据本发明实施例的48h时mIFN-γ、hIFN-γ、2K对Skmel-28肿瘤细胞的抑制曲线；
图8是根据本发明实施例的24h时mIFN-γ、hIFN-γ、2K对Skov3肿瘤细胞的抑制曲线；
图9是根据本发明实施例的48h时mIFN-γ、hIFN-γ、2K对Skov3肿瘤细胞的抑制曲线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明中，限制性核酸内切酶NheI/NotI：购自Takara公司；hIFN-γ基因：金斯瑞合成；PCDNA3.1(+)：购自(Takara公司)；pMD18-T：购自Takara公司；EcoRI：购自Takara公司；XbaI：购自Takara公司；CRISPR/Cas9-sgRNA：购自(Takara公司)；
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
需要说明的是，本申请所述的“IFN-γ”又称γ-hIFN或免疫干扰素或γ干扰素，是一种具有免疫调节作用的淋巴因子。各种癌症类型影响的早期研究揭示了其广泛的抗肿瘤潜力。其中，最广为人知的作用是增强NK细胞和CTL细胞潜在抗肿瘤效应，IFN-γ可诱导CXC趋化因子如MIG和IP-10的表达，这已被证明对 T细胞浸润肿瘤至关重要。此外，IFN-γ是Th1介导的免疫应答的主要产物，并协调Th1效应机制，作为正反馈环中先天免疫(巨噬细胞和NK细胞)的进一步激活。其中“hIFN-γ”是人γ干扰素，“mIFN-γ”是鼠γ干扰素。
本申请所述的“hIFN-γ基因编码框”是指能够表达功能性hIFN-γ的核酸序列，也就说，该核酸序列所编码的hIFN-γ区段是能够实现该hIFN-γ功能的区段，或者说，该核酸序列所编码的hIFN-γ区段是hIFN-γ必要功能区。
本申请所述的“ICP47和ICP34.5被敲除”是指ICP47和ICP34.5基因被沉默，这两种基因的表达量相比于未被敲除ICP47和ICP34.5的HSV-1，显著降低。
本申请所述的“UL23基因失活”是指插入失活，也就是说在UL23基因位置插入外源基因后，UL23基因的原有功能丧失。
本申请所述的“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如启动子序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。
以下实施例利用CRISPR/Cas9系统构建重组HSV-1病毒，具体包括质粒构建，重组筛选，及病毒鉴定等。重组HSV-1病毒的生物学活性，具体包括hIFN-γ或mIFN-γ的表达情况，病毒在肿瘤细胞上感染杀伤能力等。
实施例1构建重组单纯疱疹病毒
1、单纯疱疹病毒重组靶向载体的构建
步骤一、构建PCDNA3.1(+)-CMV-hIFN-γ-poly(A)质粒：用NheI/NotI同时酶切PUC57 simple-hIFN-γ质粒，将片段回收，与用NheI/NotI酶切的PCDNA3.1(+) 载体连接，创建CMV启动hIFN-γ基因表达、poly(A)信号终止的质粒 PCDNA3.1(+)-CMV-hIFN-γ-poly(A)；
步骤二、构建pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2：PCR扩增病毒UL23基因上游的同源臂UL23-HOM1片段，利用同源重组的方式与线性化的pMD18-T载体连接，构建成功的质粒命名为pMD18-T-UL23-HOM1；PCR扩增病毒UL23基因下游的同源臂UL23-HOM2片段，用EcoRI酶酶切质粒pMD18-T-UL23-HOM1，使用同源重组的方式将UL23-HOM2片段与线性化的pMD18-T-UL23-HOM1载体连接，构建成功的质粒命名为pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2；
步骤三、构建pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-hIFN-γ-poly(A)：扩增 CMV-hIFN-γ-poly(A)序列，用XbaI酶酶切质粒pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2，使用同源重组的方式将CMV-hIFN-γ-poly(A)片段与线性化的 pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2载体连接，构建成功的质粒命名为 pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-hIFN-γ-poly(A)；
步骤四、构建CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-12打靶质粒：将靶向LacZ的引物退火互搭，用BbsI酶酶切质粒CRISPR/Cas9-sgRNA质粒，将互搭的打靶引物与线性化的CRISPR/Cas9-sgRNA载体通过粘性互补的方式连接，构建成功的质粒命名为CRISPR/Cas9-s gRNA-LacZ-12，简写为gRNA-LacZ-12，代号为S12。
在本实施例中，除了CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-12，我们还筛选到另一个效果较好的打靶质粒CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-11(简写为gRNA-LacZ-11，代号为S11)，CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-12和CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-11的区别在于sgRNA不同。
2、单纯疱疹病毒的重组
293FT细胞内CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的同源重组I型单纯疱疹病毒 KOS株：将实施例1步骤三中表达hIFN-γ的同源质粒 pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-hIFN-γ-poly(A)、步骤四中靶向LacZ基因的 CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-12质粒与ICP34.5基因、UL23基因、ICP47基因敲除的KOS基因组共同转染293FT细胞，获得表达hIFN-γ的重组病毒2k-HSV-1-UL23-hIFN-γ(+)。
具体来说，操作如下：
步骤一、293FT细胞铺12孔板
取293FT细胞悬浮液接种于十二孔板，每孔1ml，接种密度分别为10^4，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养，期间需要观察细胞生长密度，待细胞融合度达70％，进行转染。
步骤二、使用
Figure RE-GDA0002622064790000111
3000转染试剂进行转染
(1)使用
Figure RE-GDA0002622064790000112
培养基稀释
Figure RE-GDA0002622064790000113
3000试剂，然后充分混匀：
Figure RE-GDA0002622064790000114
(2)使用
Figure RE-GDA0002622064790000115
培养基稀释质粒，制备质粒预混液，然后添加P3000TM试剂，然后充分混匀：
Figure RE-GDA0002622064790000116
(3)在每管已稀释的
Figure RE-GDA0002622064790000117
3000试剂中加入稀释的DNA(体积比1:1)，充分混匀后室温孵育15min。
Figure RE-GDA0002622064790000118
(4)加入120μL DNA-脂质体复合物至293FT细胞中，37℃、5％CO2培养箱中孵育，4h后换一次液，放回培养箱继续培养。
(5)转染72h，将细胞和病毒一起收集。冻融三次。保存于-20℃。
依照本实施例同样的方法构建携带mIFN-γ的单纯疱疹重组病毒。
本次实验用两个打靶质粒(gRNA-LacZ-11和gRNA-LacZ-12)构建了以下4 个重组病毒：
质粒 sgRNA-LacZ-11 sgRNA-LacZ-12
pMD18-T-UL23HOM-mIFN-γ + +
pMD18-T-UL23HOM-hIFN-γ + +
实施例2 HSV-1-UL23-h/mIFN-γ重组病毒的筛选纯化
(1)实验材料：
P2代重组病毒2k-HSV-1-UL23-mIFN-γ(S11-5-1#、S11-7-2#)、2k-HSV-1-UL23-hIFN-γ(S11-2-1#、S12-8-2#)(其中，2k表示敲除ICP47和ICP34.5， S11或S12表示打靶质粒的代号，5-1、7-2、2-1和8-2是病毒斑的代号，p2表示病毒代数)。
(2)重组病毒的第三轮筛选纯化
1、Vero细胞铺板(6孔板)
2、病毒感染(6孔板，病毒原液稀释度为5×107)
3、中性红/x-gal染色
4、挑白斑，每孔有1-3个斑
5、vero细胞扩增病毒(24孔板)
6、收取病毒
Figure RE-GDA0002622064790000121
实施例3 HSV-1-UL23-h/mIFN-γ重组病毒的PCR验证
对三轮纯化后单一病毒斑HSV-1-UL23-mIFN-γ、HSV-1-UL23-hIFN-γ(进行 PCR验证。
实验材料：
P3代重组病毒2k-HSV-1-UL23-mIFN-γ(S11-5-1#、S11-7-2#)、 2k-HSV-1-UL23-hIFN-γ(S11-2-1#、S12-8-2#)(其中，2k表示敲除ICP47和ICP34.5， S11或S12表示打靶质粒的代号，5-1、7-2、2-1和8-2是病毒斑的代号，p3表示病毒代数)。(备注：5-1/5-2为同一个孔，且该孔中仅有两个病毒斑)
1、PCR同源臂外臂
引物为UL23HOM1 left-F2/B48431UL24R；
PCR产物大小：HSV-1-UL23-hIFN-γ(4585bp)、HSV-1-UL23-mIFN-γ(4552 bp)。
引物序列：
UL23HOM1 left-F2 ACCGGAGGGCTGTCGTGCATGGATATCA
B 48431UL24 R ACGAGAACTGCGGTCGTTGTCCTAA
PCR体系：
组成 体积(μL)
5×PS GXL缓冲液 10.0
模板[HSV-1-UL23-hIFN-γ/mIFN-γ] 1.0
正向引物(UL23HOM1 left-F2) 1.0
反向因为u(B 48431UL24R) 1.0
primeSTAR GXL 1.0
dNTP混合物 4.0
ddH<sub>2</sub>O 32.0
总体积 50.0
PCR程序：
98℃，3min；(98℃，10s；60℃，15s；68℃，3min)×35cycles；72℃， 5min；12℃，forever。
测序结果与分析：PCR产物进行凝胶电泳检测，如图2所示，两个p3代重组病毒HSV-1-UL23-mIFN-γ(S11-5-1-1#、S11-7-2-1#)、两个p3代重组病毒 HSV-1-UL23-hIFN-γ(S11-2-1-1#、S12-8-2-1#)作为最终筛选出的病毒(在本申请中命名为2k-HSV-1-UL23-mIFN-γ-S11-5-1-1-P3或2k-HSV-1-UL23-mIFN-γ- S11-7-2-1-P3或2k-HSV-1-UL23-hIFN-γ-S11-2-1-1-P3或2k-HSV-1-UL23- hIFN-γ-S11-8-2-1-P3)。分别对HSV-1-UL23-mIFN-γ(S11-5-1-1#、S11-7-2-1#) 进行测序，如图3所示，测序验证UL23HOM1以左618bp到UL23HOM2以右 500bp序列完整无突变，表明mIFN-γ已成功插入HSV-1-病毒基因组。分别对HSV-1-UL23-hIFN-γ(S11-5-1-1#、S11-7-2-1#)进行测序，如图4所示，测序验证UL23HOM1以左618bp到UL23HOM2以右500bp序列完整无突变，表明hIFN-γ已成功插入HSV-1-病毒基因组。
2、PCR打靶位点的LacZ基因
PCR体系：
Figure RE-GDA0002622064790000141
PCR程序：
98℃，3min；(98℃，10s；60℃，15s；68℃，1min)×35cycles；72℃， 5min；12℃，forever。
测序结果与分析：PCR产物进行凝胶电泳检测，如图5所示，表明病毒较纯，未混有含有LacZ基因的病毒。
实施例4 IFN-γ病毒细胞毒性实验
(1)实验材料：mIFN-γ指代P3代2k-HSV-1-UL23-mIFN-γ；hIFN-γ指代 P3代2k-HSV-1-UL23-hIFN-γ；2k指代HSV-1/2K；细胞为Skmel-28(人恶性黑色素瘤细胞)、Skov3(人卵巢癌细胞)。
(2)细胞杀伤验证：以合适的细胞密度接种于96孔培养板，培养过夜后，分别加入7个梯度浓度(MOI＝10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01)的三种病毒，再分别培养24，48或72小时，依照CCK8试剂盒说明书进行细胞活力的检测。
(3)细胞杀伤结果：
hIFN-γ、mIFN-γ及2k三种病毒对Skmel-28肿瘤细胞、Skov3肿瘤细胞均具有良好的杀伤作用，24h及48h时hIFN-γ病毒的杀伤能力强于其他两种病毒，结果如表1和图6-9所示。
表1：
Figure RE-GDA0002622064790000142
Figure RE-GDA0002622064790000151
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市东阳光生物药研发有限公司
广东东阳光药业有限公司
<120> 一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法
<130> 2020-06-28
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIFN-γ基因编码框序列
<400> 1
atgaagtaca ccagctatat cctggccttc cagctgtgca tcgtgctggg ctccctgggc 60
tgctactgtc aggaccccta tgtgaaggag gccgagaacc tgaagaagta cttcaatgca 120
ggacactccg acgtggcaga taacggcacc ctgtttctgg gcatcctgaa gaattggaag 180
gaggagtctg atcggaagat catgcagagc cagatcgtga gcttctactt caagctgttc 240
aagaacttta aggacgatca gtctatccag aagagcgtgg agacaatcaa ggaggacatg 300
aatgtgaagt tctttaactc taacaagaag aagagggacg atttcgagaa gctgaccaac 360
tacagcgtga cagatctgaa tgtgcagaga aaggccatcc acgagctgat ccaggtcatg 420
gcagagctga gccctgcagc aaagacaggc aagcggaaga ggagccagat gctgtttcgc 480
ggcaggagag cctctcagtg a 501
<210> 2
<211> 1764
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重组单纯疱疹病毒的核苷酸序列
<400> 2
tcgatgtgtc tgtcctccgg aagggccccc aacacgatgt ttgtgccggg caaggtcggc 60
gggatgaggg ccacgaacgc cagcacggcc tggggggtca tgctgcccat aaggtatcgc 120
gcgtcttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 180
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 240
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 300
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 360
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 420
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 480
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 540
gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 600
ctggctagcg tttaaactta agcttggtac cgagctcgga tccactagtc cagtgtggat 660
gaagtacacc agctatatcc tggccttcca gctgtgcatc gtgctgggct ccctgggctg 720
ctactgtcag gacccctatg tgaaggaggc cgagaacctg aagaagtact tcaatgcagg 780
acactccgac gtggcagata acggcaccct gtttctgggc atcctgaaga attggaagga 840
ggagtctgat cggaagatca tgcagagcca gatcgtgagc ttctacttca agctgttcaa 900
gaactttaag gacgatcagt ctatccagaa gagcgtggag acaatcaagg aggacatgaa 960
tgtgaagttc tttaactcta acaagaagaa gagggacgat ttcgagaagc tgaccaacta 1020
cagcgtgaca gatctgaatg tgcagagaaa ggccatccac gagctgatcc aggtcatggc 1080
agagctgagc cctgcagcaa agacaggcaa gcggaagagg agccagatgc tgtttcgcgg 1140
caggagagcc tctcagtgac agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc 1200
ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1260
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1320
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1380
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 1440
tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg 1500
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 1560
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 1620
tcgccggctt tccccgtgga tccccgggta ccgagctccc cattgttatc tgggcgcttg 1680
tcattaccac cgccgcgtcc ccggccgata tctcaccctg gtcgaggcgg tgttgtgtgg 1740
tgtagatgtt cgcgattgtc tcgg 1764
<210> 3
<211> 468
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIFN-γ基因编码框序列
<400> 3
atgaacgcca cccactgcat cctggccctg cagctgttcc tgatggccgt gtccggctgc 60
tactgtcacg gcacagtgat cgagagcctg gagtccctga acaattattt caacagctcc 120
ggcatcgacg tggaggagaa gtctctgttt ctggatatct ggcggaattg gcagaaggac 180
ggcgatatga agatcctgca gtctcagatc atcagcttct acctgcgcct gtttgaggtg 240
ctgaaggaca accaggccat ctccaacaat atctctgtga tcgagagcca cctgatcacc 300
acattctttt ccaattctaa ggccaagaag gatgccttca tgtccatcgc caagtttgag 360
gtgaacaatc cccaggtgca gaggcaggcc tttaatgagc tgatcagagt ggtgcaccag 420
ctgctgcctg agtctagcct gaggaagaga aagcggagcc gctgttga 468
<210> 4
<211> 1731
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重组单纯疱疹病毒的核苷酸序列
<400> 4
tcgatgtgtc tgtcctccgg aagggccccc aacacgatgt ttgtgccggg caaggtcggc 60
gggatgaggg ccacgaacgc cagcacggcc tggggggtca tgctgcccat aaggtatcgc 120
gcgtcttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 180
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 240
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 300
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 360
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 420
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 480
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 540
gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 600
ctggctagcg tttaaactta agcttggtac cgagctcgga tccactagtc cagtgtggat 660
gaacgccacc cactgcatcc tggccctgca gctgttcctg atggccgtgt ccggctgcta 720
ctgtcacggc acagtgatcg agagcctgga gtccctgaac aattatttca acagctccgg 780
catcgacgtg gaggagaagt ctctgtttct ggatatctgg cggaattggc agaaggacgg 840
cgatatgaag atcctgcagt ctcagatcat cagcttctac ctgcgcctgt ttgaggtgct 900
gaaggacaac caggccatct ccaacaatat ctctgtgatc gagagccacc tgatcaccac 960
attcttttcc aattctaagg ccaagaagga tgccttcatg tccatcgcca agtttgaggt 1020
gaacaatccc caggtgcaga ggcaggcctt taatgagctg atcagagtgg tgcaccagct 1080
gctgcctgag tctagcctga ggaagagaaa gcggagccgc tgttgacaga tatccagcac 1140
agtggcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc 1200
cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 1260
gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta 1320
ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 1380
acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca 1440
gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg 1500
tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg 1560
ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtggatcc ccgggtaccg 1620
agctccccat tgttatctgg gcgcttgtca ttaccaccgc cgcgtccccg gccgatatct 1680
caccctggtc gaggcggtgt tgtgtggtgt agatgttcgc gattgtctcg g 1731

Claims (12)

1.一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒的ICP47和双拷贝的ICP34.5基因被敲除，并将IFN-γ编码框设置于UL23基因位置,所述IFN-γ选自hIFN-γ或mIFN-γ。
2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于，IFN-γ基因编码框设置于UL23基因序列的第387-521位核苷酸之间位置。
3.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述IFN-γ基因编码框与启动子可操作地连接，所述启动子包括选自CMV、CAG、EF1α、RSV LTR、MTI的至少之一。
4.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于，hIFN-γ基因编码框具有如下所示的核苷酸序列，
1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核苷酸序列；
任选地，所述重组单纯疱疹病毒具有如下所示的核苷酸序列，
a)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
b)与a)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于，mIFN-γ基因编码框具有如下所示的核苷酸序列，
1)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核苷酸序列；
任选地，所述重组单纯疱疹病毒具有如下所示的核苷酸序列，
a)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
b)与a)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同源性的核苷酸。
6.一种重组单纯疱疹病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、构建PCDNA3.1(+)-CMV-IFN-γ-poly(A)质粒：用NheI/NotI同时酶切PUC57simple-IFN-γ质粒，将片段回收，与用NheI/NotI酶切的PCDNA3.1(+)载体连接，创建CMV启动IFN-γ基因表达、poly(A)信号终止的质粒PCDNA3.1(+)-CMV-IFN-γ-poly(A)；
步骤二、构建pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2：PCR扩增病毒UL23基因上游的同源臂UL23-HOM1片段，利用同源重组的方式与线性化的pMD18-T载体连接，构建成功的质粒命名为pMD18-T-UL23-HOM1；PCR扩增病毒UL23基因下游的同源臂UL23-HOM2片段，用EcoRI酶酶切质粒pMD18-T-UL23-HOM1，使用同源重组的方式将UL23-HOM2片段与线性化的pMD18-T-UL23-HOM1载体连接，构建成功的质粒命名为pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2；
步骤三、构建pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-IFN-γ-poly(A)：扩增CMV-IFN-γ-poly(A)序列，用XbaI酶酶切质粒pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2，使用同源重组的方式将CMV-IFN-γ-poly(A)片段与线性化的pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2载体连接，构建成功的质粒命名为pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-IFN-γ-poly(A)；
步骤四、构建靶向LacZ基因的打靶质粒：将靶向LacZ的引物退火互搭，用BbsI酶酶切质粒CRISPR/Cas9-sgRNA质粒，将互搭的打靶引物与线性化的CRISPR/Cas9-sgRNA载体通过粘性互补的方式连接，成功构建出打靶质粒CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-12或CRISPR/Cas9-sgRNA-LacZ-11；
步骤五、293FT细胞内CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的同源重组I型单纯疱疹病毒KOS株：将步骤三中表达IFN-γ的同源质粒pMD18-T-UL23-HOM1-HOM2-CMV-IFN-γ-poly(A)、步骤四中靶向LacZ基因的打靶质粒与ICP34.5基因、ICP47基因被敲除，UL23基因失活的KOS基因组共同转染293FT细胞，获得表达IFN-γ的重组病毒HSV-1IFN-γ(+)；
其中步骤一、二顺序可互换；所述IFN-γ选自hIFN-γ或mIFN-γ。
7.根据权利要求6所述的一种重组单纯疱疹病毒的构建方法，其特征在于，步骤二中的上下游同源臂中，
上游侧翼序列的引物对包括：上游序列hrR3UL23HOM1-F1为CCTGCAGGTCGACGAGATGCCGTAGTCAGGTTTAGTTCGTCCGGC；
下游序列hrR3UL23HOM1-R1为GGGATCCTCTAGAGACGCGCGATACCTTATGGGCAGCATGAC；
下游侧翼序列的引物对包括：上游序列hrR3UL23HOM2-F1为CCGGGTACCGAGCTCCCCATTGTTATCTGGGCGCTTGTCATTACCAC；
下游序列hrR3UL23HOM2-R1为TATGACCATGATTACTCTGGAGCATCCGCACGACTGCGGTGATATTA。
8.根据权利要求6所述的一种重组单纯疱疹病毒的构建方法，其特征在于，步骤三中的IFN-γ基因中，
上游序列hrR3 UL23 HOM-F1为AAGGTATCGCGCGTCTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTA；
下游序列hrR3UL23HOM1-R1-2为GGTACCCGGGGATCCACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAA。
9.根据权利要求6所述的一种重组单纯疱疹病毒的构建方法，其特征在于，步骤四中的LacZ基因打靶序列中，
上游序列sgRNA-Lac Z-12-F为CACCGGCCGGGGGCGGGGCATGTGC；
下游序列sgRNA-Lac Z-12-R为AAACGCACATGCCCCGCCCCCGGCC；
或上游序列sgRNA-Lac Z-11-F为CACCGGGTCTGCTTTCTGACAAACT；
下游序列sgRNA-Lac Z-11-R为AAACAGTTTGTCAGAAAGCAGACCC。
10.根据权利要求6所述的一种重组单纯疱疹病毒的构建方法，其特征在于，步骤五中重组病毒HSV-1IFN-γ(+)通过1轮或多轮挑取病毒斑的方法进行纯化。
11.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带有权利要求1-5任一项所述的重组单纯疱疹病毒或权利要求6-10任一项所述的重组单纯疱疹病毒的构建方法构建的重组单纯疱疹病毒。
12.权利要求1-5任一项所述的重组单纯疱疹病毒、权利要求6-10任一项所述的重组单纯疱疹病毒的构建方法构建的重组单纯疱疹病毒、权利要求11所述的重组细胞在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途，任选地，所述药物用于选择性杀伤肿瘤细胞。
CN202010618707.4A 2020-06-30 2020-06-30 一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法 Pending CN113862229A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010618707.4A CN113862229A (zh) 2020-06-30 2020-06-30 一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法
PCT/CN2021/070373 WO2022001080A1 (zh) 2020-06-30 2021-01-05 一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010618707.4A CN113862229A (zh) 2020-06-30 2020-06-30 一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113862229A true CN113862229A (zh) 2021-12-31

Family

ID=78981659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010618707.4A Pending CN113862229A (zh) 2020-06-30 2020-06-30 一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113862229A (zh)
WO (1) WO2022001080A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116334010A (zh) * 2023-05-30 2023-06-27 中义(北京)健康研究院 一种重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110982794A (zh) * 2020-03-05 2020-04-10 北京唯源立康生物科技有限公司 一种修饰的单纯疱疹病毒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107354136A (zh) * 2017-06-15 2017-11-17 杭州睿可特生物科技有限公司 重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用
WO2019152868A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus (hsv) related keratitis
EP3801583A1 (en) * 2018-06-08 2021-04-14 The Board of Trustees of the University of Illinois Recombinant herpes simplex virus for cancer immunotherapy

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110982794A (zh) * 2020-03-05 2020-04-10 北京唯源立康生物科技有限公司 一种修饰的单纯疱疹病毒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
未知: "interferon gamma precursor [Homo sapiens]", 《GENBANK》 *
未知: "interferon gamma precursor [Mus musculus]", 《GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116334010A (zh) * 2023-05-30 2023-06-27 中义(北京)健康研究院 一种重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用
CN116334010B (zh) * 2023-05-30 2023-08-29 中义(北京)健康研究院 一种重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022001080A1 (zh) 2022-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109312309B (zh) 工程化的病毒
KR102626276B1 (ko) 이-특이적인 항체를 암호화하는 종양붕괴성 아데노바이러스 및 이와 관련된 방법 및 용도
KR20190104055A (ko) 변형된 바이러스
CN111635913B (zh) 构建体及其应用
CN111358953A (zh) 一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体、其制备方法及用途
JP2021527694A (ja) 腫瘍溶解性ウイルスを用いた処置
US20220305118A1 (en) Carbohydrate nanocarrier delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
KR20220078650A (ko) 이중 바이러스 및 이중 종양용해 바이러스 및 치료 방법
KR102370150B1 (ko) 전사 조절 인자 및 이의 외래 단백질 발현 증강에 있어서의 응용
KR20230019450A (ko) 캡슐화된 rna 레플리콘 및 사용 방법
CN114805500B (zh) 非洲猪瘟病毒i73r蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点突变毒株的构建
CN113862229A (zh) 一种重组单纯疱疹病毒及其构建方法
CN102329784A (zh) 一种日本乙型脑炎病毒样颗粒及其制备方法和应用
CN108315351A (zh) 一种用于工业生产的哺乳动物细胞表达载体
CN113943752A (zh) 构建体、敏感性提高的溶瘤病毒及其应用
CN114829608B (zh) 融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫dna疫苗及其构建方法和应用
RU2731293C1 (ru) Способ получения генно-модифицированных линий клеток натуральных киллеров с нокаутированным геном PD-1 и повышенной экспрессией белков семейства Фактора Некроза Опухолей для иммунотерапии онкологических заболеваний
CN110885819A (zh) 基于aav病毒的基因编辑表达盒
KR20210135532A (ko) 암 치료를 위한 종양 용해 바이러스의 용도
WO2020255015A1 (en) Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and dihydropyrimidine derivatives as capsid assembly modulators
WO2020255010A1 (en) Combination of recombinant interleukin 12 construct and hepatitis b virus (hbv) vaccines
CN113462700B (zh) SARS-CoV-2线性DNA疫苗
US20030181405A1 (en) Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
KR20220072758A (ko) 트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 프라임에디팅용 조성물
CN115418356A (zh) 一种表达i型干扰素的hsv-1溶瘤病毒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211231