CN114829608B - 融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫dna疫苗及其构建方法和应用 - Google Patents

融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫dna疫苗及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗及其构建方法和应用，其中提供的免疫DNA疫苗ZD‑nCor19以新型冠状病毒RBD蛋白、S2亚基的301‑538aa区段和N蛋白的138‑369aa区段作为靶抗原，并在适当位置引入特定的免疫增效类分子，可以同时高效诱导体液免疫和细胞免疫，并且可以避免由全长S蛋白和全长N蛋白可能产生的ADE相关的安全性问题，兼具有预防和治疗的双重效果。

Description

融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗及其构 建方法和应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年11月20日提交的中国专利申请号为202011310160.8的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗(ipDNA vaccine)(命名为ZD-nCor19)及其构建方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，人感染新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
目前，全球累计确诊的新型冠状病毒感染病例已经达到数千万例，累计死亡病例已超过百万人，给全人类的生命健康安全造成巨大的威胁。然而COVID-19疫情仍在全球多个地区迅速蔓延，已经明确该病毒的传播性和致病性强、危害性大，全球有78亿人面临感染以及发病和死亡的风险，国际公认接种安全有效的疫苗是保护人类安全健康的重要措施和有效手段，因此迫切需要开发出有效且安全的疫苗来遏制这场新型冠状病毒大流行。
目前在全球范围内，已有近200项新型冠状病毒疫苗处于不同的开发阶段，其中10种新型冠状病毒疫苗正在进行Ⅲ期临床试验(截止至2020年10月13日)，主要包括新型冠状病毒灭活疫苗、重组亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗、核酸疫苗等，进行新型冠状病毒疫苗的研发，虽已经取得了阶段性的成果，但对开发出防治兼用型的新型冠状病毒疫苗品种仍有迫切需求。
发明内容
本发明旨在提供一种融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗及其构建方法和应用。
本发明的第一方面提供一种融合基因，其包含以下(1)至(4)中的至少两种：
(1)表达新型冠状病毒COVID-19的RBD氨基酸片段的基因；
(2)表达新型冠状病毒COVID-19的S2亚基或其部分氨基酸片段的基因；
(3)表达新型冠状病毒COVID-19的N蛋白或其部分氨基酸片段的基因；
(4)表达选自以下中的任一种或其组合的氨基酸片段的基因：CTB、TT、PADRE、Foldon、CPPCP、Furin2A、ERISS、IRES和OX40L。
在一个实施方案中，所述融合基因包含以下(1)至(4)中的至少三种：
(1)表达新型冠状病毒COVID-19的RBD氨基酸片段的基因；
(2)表达新型冠状病毒COVID-19的S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因；
(3)表达新型冠状病毒COVID-19的N蛋白的138-369位氨基酸片段的基因；
(4)表达以下的氨基酸片段的基因：CTB、TT、PADRE、Foldon、CPPCP、Furin2A、ERISS、IRES和OX40L。
在一个实施方案中，所述融合基因中表达所述RBD氨基酸片段的基因与表达所述S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因连接成融合片段；在一个优选的实施方案中，所述融合片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO:6所示的序列；表达所述N蛋白的138-369位氨基酸片段的基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:10所示的序列。
在另一个实施方案中，所述融合基因中：
表达所述CTB氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
表达所述TT氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
表达所述PADRE氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
表达所述Foldon氨基酸片段的基因与表达所述CPPCP氨基酸片段的基因连接成一合成片段，该合成片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
表达所述Furin2A氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
表达所述ERISS氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
表达所述IRES氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；和/或
表达所述OX40L氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在一个实施方案中，所述融合基因中：表达所述RBD氨基酸片段的基因与表达所述S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因连接成融合片段，在所述的融合片段的上游依次连接有表达所述CTB、TT和PADRE氨基酸片段的基因，在所述的融合片段的下游依次连接有表达所述Foldon、CPPCP和Furin2A氨基酸片段的基因；和/或在表达所述N蛋白的138-369位氨基酸片段的基因的上游连接有表达所述ERISS氨基酸片段的基因，下游依次连接有表达所述IRES和OX40L氨基酸片段的基因。
在一个优选的实施方案中，表达所述RBD氨基酸片段的基因与表达所述S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因通过表达(G4S)2连接臂的基因连接，所述融合片段的上游与表达所述PADRE氨基酸片段的基因通过核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的表达连接臂linker G6的基因连接。
在进一步优选的实施方案中，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
本发明的第二方面提供一种融合蛋白，其由上述的融合基因表达获得。
本发明的第三方面提供一种重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗，命名为ZD-nCor19，其包含上述的融合基因和载体。
在一个实施方案中，所述载体为pZDVac载体。
本发明的第四方面还提供了上述的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗的构建方法，其包括以下步骤：
1)合成上述的融合基因；
2)将所述融合基因插入pZDVac载体中，获得所述重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗。
在本发明的第五方面中，上述的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用也属于本发明的内容。
在本发明提供的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗中，融合基因精准锁定表达新型冠状病毒S1亚基的RBD蛋白、S2亚基的301-538aa区段和N蛋白的138-369aa区段的基因作为表达靶抗原的基因，另外结合其它特别设计，如在靶抗原基因的上下游分别连接有表达免疫增效类分子的基因，在表达靶抗原的基因之间设置Furin2A蛋白酶切割位点，可以使得本发明构建获得的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗(重组质粒pZDVac-CRSNPO)既可以有效避免由全长S蛋白和全长N蛋白可能产生的ADE相关的安全性问题，还可以保证由其表达的融合蛋白相对于仅使用S1蛋白或仅使用RBD或者仅使用S1蛋白(RBD)与N蛋白作为靶抗原时能够覆盖新型冠状病毒更多的抗原表位，达到较为全面的保护。该疫苗在靶抗原的设计中仅使用RBD、S2亚基的301-538aa区段和N蛋白的138-369aa区段，其相对于全长S蛋白和N蛋白具有较小的片段，这不仅有利于疫苗的构建，还使其更容易进入细胞中，且具有高效的表达效率和高效的免疫效果。另外，Furin2A蛋白酶切割位点的存在使得来源于S蛋白的两个抗原区段(RBD和S2亚基的301-538aa区段)可分泌表达，进而诱导更好的体液免疫反应，而来源于N蛋白的一个抗原区段(N蛋白的138-369aa区段)可细胞内表达，进而诱导T细胞免疫反应，因此本发明构建获得的疫苗可以同时高效诱导体液免疫反应和T细胞免疫反应，两者协同增强疫苗的免疫保护效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)安全性强：本发明疫苗属于DNA形式的RNA疫苗，不整合到染色体，所以不会引起细胞的恶性转化。而且该疫苗进入细胞后，会大规模进行RNA的转录，导致细胞的快速凋亡，进一步避免了恶性转化的可能性。另外，该疫苗为裸质粒产品，没有额外添加脂质体、铝佐剂等，基本不引起额外的非特异性炎症反应。所以安全性方面，在各类疫苗中是最具优势最有保障的。
2)高效免疫：本发明疫苗属于一类融合了DNA疫苗和RNA疫苗双重优势的高效免疫DNA疫苗((ipDNA vaccine)ZD-nCor19)，经验证结果表明，其通过采用皮内注射接种加电脉冲辅助导入(两针接种，间隔28天，紧急情况可间隔1-4周不等)，可高效诱导类粘膜表层免疫保护效应，并诱导全身系统性的高效细胞免疫应答，既能形成强大的表浅免疫保护效力，又具备强大的深层保护作用。这种免疫应答，属于身体高等级的免疫响应，具备快速免疫决策动员的、集团军运动歼灭战式的、深度纵深主动防御清除的特点，为人体提供高效持久的免疫保护。一旦遇到病毒袭击，可以快速高效进行系统性的免疫动员，包括表层类粘膜层面的免疫应答以及全身系统性的天然免疫、体液免疫和细胞免疫，快速杀灭清除侵入体内的新型冠状病毒，防止病毒致病和病情重症化，保护生命，避免出现各类后遗症，在身体不产生症状或仅仅产生轻微症状的情况下，完成对病毒的高效杀灭清除，快速恢复健康。
另外，该疫苗的高效免疫还体现在能够提升人体全身免疫力方面。对于免疫力比较弱的老年人群体和有严重基础性疾病的人群，该疫苗是一款极为优秀的生命保护疫苗，帮助守护老年人和免疫弱势群体的生命和健康。
3)长效，抗变异：本发明疫苗除了具备高效免疫保护的特点，该疫苗诱导的抗原特异性细胞免疫，多年都会保留免疫记忆能力，所以该疫苗也是一款可以提供长效免疫保护的疫苗。而且在疫苗设计中，使用了病毒内部N蛋白部分片段作为靶抗原，极其稳定，很少产生明确变异，所以本发明疫苗也是可以有效抗病毒变异的疫苗。在病毒表面抗原产生显著变异使某些疫苗失去免疫保护效力之后，本发明疫苗仍然能够提供高效的免疫保护功能。
4)防治兼用：本发明疫苗不但可以作为预防疫苗来用，同时对于病毒检测阳性的人群，也可以进行紧急免疫治疗使用，该疫苗可以快速诱导高效细胞免疫应答，及时高效清理体内病毒，防止病情重症化，帮助挽救生命，降低病毒致死率。因此，本发明疫苗将是是一款可以真正保护生命、救助生命的疫苗。
5)产能巨大，成本低廉：本发明疫苗可以利用大肠杆菌原核系统进行生物发酵生产，因此可以借助已有的生物发酵工业体系，并建立新的工业体系，因此该疫苗的生产可以形成巨大产能，成本相对低廉，可望满足国内和国际对该疫苗品种的需求。
6)稳定性好：DNA疫苗一般具有稳定性较强，可以常温储存和运输的特点，而RNA疫苗、蛋白质亚基和病毒载体疫苗、灭活疫苗等则需要冷链运输，这是DNA疫苗相较于其他类型疫苗品种的一个特别优势。本发明提供的疫苗是一款疫苗，因此在稳定性方面具有非常大的优势，可以成为国家新型冠状病毒疫苗援外品种中的上乘之选。
7)市场广阔：目前还没有任何一种新型冠状病毒疫苗上市，因此目前临床或在研的疫苗的效果无法判断，这就不得不需要运用多款研发中的疫苗打出一套“组合拳”，形成疫苗互补，不但可以单独使用本申请疫苗以提供高效保护，对于其他类型的疫苗，也可以将本申请疫苗用于加强免疫，与其他类型的疫苗协同应用，提供更加卓越的免疫保护能力。另外，本发明提供的疫苗甚至可以帮助某些可能有ADE效应(antibody-dependentenhancement抗体依赖增强)隐患的疫苗，克服可能的ADE效应，避免ADE效应加重病情的严重问题。
综上所述，本发明提供的疫苗(ipDNA vaccine)ZD-nCor19，有望具备安全、高效、长效、抗变异、稳定性好、产能巨大的特点和优点，是一款具有高效免疫效果的DNA疫苗，可用于常规群体预防、老年人等免疫弱势群体特异性免疫保护、特定人群免疫加强、病毒暴露后紧急接种免疫治疗、不同类型疫苗免疫协同强化以及作为国家对外援助疫苗等，可望作为一种防治兼用的优秀疫苗，进行深度开发和应用。
附图说明
图1为本发明一个实施例提供的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗中靶抗原和免疫增效类分子的连接结构示意图；
图2为pZDVac-CCCPO质粒双酶切的凝胶电泳照片；
图3为pUC57-CRSNP质粒双酶切的凝胶电泳照片；
图4为重组质粒pZDVac-CRSNPO的目的基因片段及骨架载体的回收鉴定凝胶电泳照片；
图5为重组质粒pZDVac-CRSNPO的构建示意图；
图6为菌落PCR鉴定阳性克隆的凝胶电泳照片；
图7为阳性克隆小提质粒酶切鉴定的凝胶电泳照片；
图8为重组质粒pZDVac-CRSNPO免疫小鼠后以N蛋白为刺激物的小鼠脾脏细胞中细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌频率柱状图；
图9为重组质粒pZDVac-CRSNPO免疫小鼠后以RBD蛋白为刺激物的小鼠脾脏细胞中细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌频率柱状图；
图10为重组质粒pZDVac-CRSNPO诱导小鼠模型T细胞反应类型偏向分析散点图；
图11为重组质粒pZDVac-CRSNPO对人受试者免疫前和免疫后以N蛋白和RBD蛋白为刺激物的人PBMC中细胞因子IFN-γ的分泌散点图；
图12为重组质粒pZDVac-CRSNPO以不同剂量对人受试者免疫前和免疫后以N蛋白和RBD蛋白为刺激物的人PBMC中细胞因子IFN-γ的分泌散点图；
图13为不同免疫途径及不同电导入条件下使用重组质粒pZDVac-CRSNPO对小鼠进行免疫后诱导的抗体检测结果散点图；
图14为不同免疫途径及不同电导入条件下使用重组质粒pZDVac-CRSNPO对小鼠进行免疫后诱导的N抗原、RBD抗原和S2抗原的Elispot检测结果柱状图。
具体实施方式
本发明旨在提供一种防治兼具的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗(ipDNAvaccine)ZD-nCor19及其构建方法和应用，主要基于以下技术手段实现。
本发明在构建重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗中使用基于甲病毒改造的复制子DNA疫苗载体pZDVac，该载体是在现有的pSFV1质粒基础上，用人巨细胞病毒CMV启动子替换原SP6启动子、添加多聚腺苷酸尾SV40poly(A)，并将pSFV1质粒的抗性基因替换为临床上安全性更好的卡那霉素抗性基因，最终将改造成功后的复制子真核表达载体，命名为pZDVac载体(即专利文献CN105343874A中公开的pSVK1)，该载体可以避免体外制备RNA的繁琐过程，可以以DNA质粒形式直接转染人和动物细胞进行外源蛋白的高水平表达，并承袭了甲病毒载体可诱导产生I型IFN，为表达的抗原提供佐剂效果的功能，具有增强免疫原性的功效。
本发明在抗原设计方面充分考虑了以下因素并提出优化的设计方案：
(1)由于目前对新型冠状病毒的基础研究还较少，而且还没有任何一种新型冠状病毒疫苗上市，因此针对新型冠状病毒疫苗用靶抗原的选择没有确切标准，即没有任何依据可以确定关于新型冠状病毒的哪一段抗原作为疫苗靶抗原时更加有效。因此研究者们普遍以SARS病毒疫苗的开发工作为选择新型冠状病毒的抗原依据，在靶抗原选择上一般采用新型冠状病毒的全长刺突糖蛋白(Spike Protein，S蛋白，其由S1和S2两个亚基组成)或截短型S蛋白(S1亚基及其受体结合区RBD)形式，以及新型冠状病毒中保守性较高的核衣壳蛋白N(SARS-CoV-2Nucleocapsid)。普遍认为选择全长的S蛋白比较保险，其包含了大部分的抗原表位，覆盖面较广；选择RBD，则是因为其含有关键中和区(CND)，CND可以诱发强效的中和抗体反应以及可能产生对变异株的交叉保护；选择N蛋白则是因为其是冠状病毒中具有高度免疫原性和保守性的磷蛋白，不仅能诱导特异的抗体，还能诱导特异的细胞毒细胞活性，且保守性更好，在多种冠状病毒中保守性极高，相对不易产生变异，能够避免因为病毒变异(S蛋白是病毒中更容易产生变异的抗原，如果病毒发生了变异，很可能会影响到疫苗的免疫效果)而造成疫苗失效的风险。其中，根据新型冠状病毒的结构和感染患者的机制，普遍认为新型冠状病毒的S1亚基和N蛋白是引发强免疫反应的主要病毒抗原，是研发疫苗的最佳病毒抗原。
(2)发明人则考虑到新型冠状病毒的全长S蛋白和全长N蛋白可能会产生ADE相关的安全性问题，因此本发明人通过优化设计并最终确定选择S蛋白的S1亚基的RBD、S2亚基的301-538aa区段和N蛋白的138-369aa区段进行靶抗原设计。其中S1亚基的RBD含有关键中和区，是疫苗研发的关键；S2亚基的301-538aa区段中则含有大部分的T细胞抗原表位，N蛋白的138-369aa区段中也含有多个T细胞抗原表位，这样的靶抗原设计既可以有效避免由全长S蛋白和全长N蛋白可能产生的ADE相关的安全性问题，还可以保证设计得到的融合蛋白相对于仅使用S1蛋白或仅使用RBD或者仅使用S1蛋白(RBD)与N蛋白的融合蛋白能够覆盖新型冠状病毒更多的抗原表位，达到较为全面的保护，同时本发明的靶抗原的设计中仅使用RBD、S2亚基的301-538aa区段和N蛋白的138-369aa区段，其相对于全长S蛋白和N蛋白具有较小的片段，这不仅有利于疫苗的构建，还更容易进入细胞中，且具有高效的表达效率和高效的免疫效果。另外，在靶抗原设计中，将来源于S蛋白的两个抗原区段(RBD和S2亚基的301-538aa区段)设计成可分泌表达，其可诱导更好的体液免疫反应；将来源于N蛋白的一个抗原区段(N蛋白的138-369aa区段)设计成可细胞内表达，其可以进一步增强诱导的T细胞免疫反应，因此基于该设计构建获得的疫苗可以同时高效诱导体液免疫反应和T细胞免疫反应，两者协同增强疫苗的免疫保护效果。
(3)发明人还考虑到单纯用抗原做DNA疫苗或者病毒载体类疫苗，其免疫原性可能不足，因此为了使构建获得的重组新型冠状病毒DNA疫苗的免疫原性进一步提高，进而提高其免疫保护效力，还筛选并确定了适用于本发明构建的疫苗中靶抗原的免疫增效类分子，其包括：
(i)霍乱毒素B亚基(CTB)：其能够启动天然免疫、活化DC，增强免疫反应，有助于将抗原转入细胞内，诱导产生TH1和TH2免疫通路，起粘膜免疫佐剂的功效；
(ii)破伤风毒素辅助性T细胞表位(TT)和泛DR辅助T细胞表位(pan-DR helper Tcell epitopes，PARDE)：其能够增强CD4+T细胞反应；
(iii)Foldon-CPPCP：Foldon是一种可以使目标蛋白发生非共价寡聚的结构域，它来源于T4噬菌体纤维蛋白C端，由27个氨基酸组成，非共价作用力所形成寡聚化结构稳定性较高，在温度高于75℃或常温下在2％以上的SDS中才会解聚，解聚后在适宜环境中仍可重新形成三聚体。CPPCP(半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-脯氨酸)类似于抗体铰链区，适用于双特异性抗体和融合蛋白，易于三聚体蛋白形成颗粒化。该类免疫增效分子可以使疫苗表达的抗原形成多聚体和颗粒化，可进一步增强其免疫原性；
(iv)ERISS序列：其为腺病毒E3引导序列(adenovirus E3 leader sequence)，是内质网插入信号序列，即ER insertion signal sequence(ERISS)，ERISS可结合内织网信号识别粒(SRP)。通过SRP能够结合ER膜表面的SRP受体的特性，将融合的目的抗原有效地转运到ER内，加强APC对抗原的加工与MHCI类分子的提呈，从而增强诱导有效的保护性CTL产生；
(v)OX40L：其能够为T细胞活化提供共刺激信号。
将表达这些免疫增效类分子的部分或全部的基因整合至表达RBD、S2亚基的301-538aa区段和N蛋白的138-369aa区段的基因中的任一种或其组合组成的基因片段中，能获得系列融合基因。将这些融合基因插入所确定的pZDVac载体中，构建获得本发明的重组新型冠状病毒DNA疫苗。
融合基因包括多种组合形式(以下基于融合基因表达后的蛋白结构进行描述)，例如：
组合1：将RBD蛋白和S2亚基301-538aa区段通过(G4S)2连接臂进行连接，然后在RBD蛋白的氨基端(N端)依次引入霍乱毒素B亚基、破伤风毒素辅助性T细胞表位、泛DR辅助T细胞表位(其中将泛DR辅助T细胞表位与RBD蛋白以G6柔性linker(连接头)连接)，本发明人惊讶发现，这三种免疫增效类分子的连接顺序相对于其他连接顺序(例如依次为破伤风毒素辅助性T细胞表位、泛DR辅助T细胞表位和霍乱毒素B亚基，或破伤风毒素辅助性T细胞表位、霍乱毒素B亚基和泛DR辅助T细胞表位等)更有利于展示靶抗原，并增强靶抗原诱导的免疫反应。
组合2：在S2亚基的301-538aa区段的羧基端(C端)引入Foldon-CPPCP，其中Foldon的作用是易于让抗原三聚体化，CPPCP则是让三聚体的抗原进一步颗粒化，两者的联用协同使靶抗原表达后更容易进行多聚体化和颗粒化，相对于可溶性的抗原更容易被APC吞噬，能同时活化Th细胞、CTL细胞、B细胞，既能激发细胞免疫，又可激发体液免疫，因此可产生全面的免疫反应，大大增强疫苗的免疫保护效果。在该组合中，本发明人意外发现，将该两种佐剂分子Foldon和CPPCP联用，并以Foldon-CPPCP的连接顺序放置于RBD蛋白和S2亚基301-538aa区段的融合片段之后相对于其他连接顺序(例如CPPCP-Foldon)和其他位置更有利于Foldon和CPPCP在表达后展示出来；而如果将佐剂分子Foldon-CPPCP放置在融合片段的其他位置，很可能会导致这两种佐剂分子在表达后，由于其分子量太小容易被包裹在抗原蛋白中间，因此两者的空间结构就展示不出来，发挥不了使靶抗原表达后进行多聚体化和颗粒化的作用。组合2与组合1联合能发挥叠加效果或协同增效。
组合3：基于组合2在CPPCP的羧基端或基于组合1在S2亚基的301-538aa区段的羧基端依次连入Furin2A，ERISS和N蛋白的138-369aa区段。其中ERISS可加强APC对抗原的加工与MHCI类分子的提呈，从而增强细胞内表达的N蛋白区段的T细胞免疫反应，Furin2A是蛋白酶切割位点，可以使N蛋白138-369aa区段独立在细胞内表达，诱导T细胞免疫反应。
组合4：基于组合3在N蛋白138-369aa区段的C端连接了内部核糖体进入位点(IRES)序列，在IRES序列的下游，连接了OX40L分子，其能为T细胞活化传递第二信号，可以进一步刺激免疫应答，并诱导免疫反应向TH1类型高级别免疫响应偏移。
另外，可在上述各组合融合基因的上游依次引入Kozak序列和信号肽序列(也可事先添加在骨架载体中)，信号肽可以选用适合于真核表达的信号肽。
图1给出了重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗中靶抗原和免疫增效类分子的一种连接结构示例，包含了整合了以上组合1-组合4的融合基因以及该融合基因上游的Kozak序列和信号肽序列。
本发明的一个优选实施例提供的重组新型冠状病毒DNA疫苗的结构的设计可以使得各靶抗原之间、各免疫增效分子之间、靶抗原与各免疫增效类分子之间产生协同增效作用，从而提高DNA疫苗的免疫保护效果；同时该DNA疫苗设计成S蛋白的区段(RBD和S2亚基的301-538aa区段)和N蛋白的区段(138-369aa区段)分别表达，其中S蛋白的区段分泌表达，N蛋白的区段细胞内表达，因此其可以同时诱导良好的体液免疫反应和T细胞免疫反应，可进一步提高该DNA疫苗的免疫保护效果。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物和序列用已有技术合成。
实施例1：重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗ZD-nCor19的构建
在该实施例中使用pZDVac载体作为DNA疫苗的载体，使用新型冠状病毒的RBD、S2亚基的301-538aa区段和N蛋白的138-369aa区段作为靶抗原，并使用霍乱毒素B、破伤风毒素辅助性T细胞表位、泛DR辅助T细胞表位、Foldon-CPPCP、Furin2A、ERISS、IRES和OX40L(各自所对应的核苷酸序列如下表1所示，其中RBD和S2亚基的301-538aa区段由(G4S)2连接给出(RBD-(G4S)2-S2)，表1中Linker G6表示为RBD和PARDE之间的连接头序列，N蛋白的138-369aa区段的核苷酸序列在表1中以NP给出)作为免疫增效分子来构建重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗，具体包括以下步骤。
1.1、表达载体骨架的制备和鉴定
将pZDVac-CCCPO质粒(其为将合成基因序列CTB-TT-CTLA-4+PD-L1胞外区-PADRE-IRES-OX40L克隆至pZDVac载体中，结构为pZDVac-CTB-TT-CTLA-4+PD-L1胞外区-PADRE-IRES-OX40L，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:1)用AclI和XbaI进行双酶切，经0.45％凝胶电泳的照片如图2所示，其中泳道1和2均为pZDVac-CCCPO质粒经过AclI和XbaI双酶切之后的结果，纯化回收12kb左右大片段即为pZDVac-IRES-OX40L，对回收片段经再次凝胶电泳鉴定的结果如图4中泳道2所示，其可以作为构建新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗的表达载体骨架。
1.2、基因片段的合成和鉴定
如图1所示，按照CTB-TT-PARDE-G6-RBD-(G4S)2-S2-Foldon-CPPCP-Furin2A-ERISS-NP(命名为第一目的基因，简称CRSNP)的基因连接顺序进行全基因合成，并在目的基因的上游引入酶切位点XbaI、NruI、PmeI，下游引入AclI单酶切位点，获得了携带有目的基因片段CRSNP的重组质粒，命名为pUC57-CRSNP重组质粒，该步骤由北京博迈德基因有限公司(Biomed)完成；
将pUC57-CRSNP重组质粒用AclI与XbaI双酶切(购自New England Biolabs(NEB)公司)，经0.45％琼脂糖DNA凝胶电泳(Regular Agarose G-10来自Biowest公司)的照片如图3所示，其中泳道1表示pUC57-CRSNP重组质粒的电泳结果，泳道2表示pUC57-CRSNP重组质粒经AclI与XbaI双酶切之后的电泳结果，回收3.6kb目的片段(大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)来自TIANGEN公司)即可获得目的基因片段CRSNP(如图3中箭头所示，命名为第一目的基因片段)，回收的第一目的基因片段经再次凝胶电泳鉴定的结果如图4中泳道1所示。
在该实施例中，本发明人还合成了另外两条目的基因片段：RBD-(G4S)2-S2-NP(命名为第二目的基因片段，其与第一目的基因片段的区别仅在于没有连接免疫增效类分子)以及Foldon-CPPCP-TT-PARDE-G6-RBD-(G4S)2-S2-CTB-Furin2A-ERISS-NP(命名为第三目的基因片段，其与第一目的基因片段的区别在于免疫佐剂分子Foldon-CPPCP和CTB的位置不同)。
表1：重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗中各结构的核苷酸序列信息
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1.3、重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗的构建
如图5所示，将上述步骤1.1获得的表达载体骨架pZDVac-IRES-OX40L与步骤1.2获得的第一目的基因CRSNP通过T4连接酶连接，随后经阳性克隆和菌落PCR鉴定后即可获得携带有第一目的基因片段CRSNP的重组表达载体：pZDVac-CTB-TT-PARDE-G6-RBD-(G4S)2-S2-Foldon-CPPCP-Furin2A-ERISS-NP-IRES-OX40L(命名为pZDVac-CRSNPO重组质粒，其中融合基因CTB-TT-PARDE-G6-RBD-(G4S)2-S2-Foldon-CPPCP-Furin2A-ERISS-NP-IRES-OX40L对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，其中除包含有上表1所示的核苷酸序列外，还包含有酶切位点)，即为重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗ZD-nCor19，具体构建步骤包括：
1.3.1、T4连接
将上述步骤1.1胶回收获得的表达载体骨架pZDVac-IRES-OX40L(约12kb)与步骤1.2胶回收获得的第一目的基因片段CRSNP(约3.6kb)连接，16℃过夜获得连接产物，体系如下表2所示：
表2：T4连接体系
1.3.2、阳性克隆筛选
取100μL stable感受态细胞置于冰浴中，待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入10μL上述步骤1.3.1获得的连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，立即转移到42℃水浴锅中热击90s，迅速转移到冰浴中2min。向感受态细胞中加入500μL无菌的不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37℃中，150rpm震荡培养60min。12000rpm离心1min，弃去500μL上清。取100μL已转化的感受态细胞均匀涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的固体培养基上，37℃倒置培养48小时。
挑取上述转化的单克隆菌体，进行菌落PCR，鉴定阳性克隆。设计上游引物F与下游引物R进行PCR扩增(引物序列由北京博迈德基因有限公司(Biomed)合成)：
上游引物F：CCCAGGAGACCCGGTTCTAGAGACGGACATT(SEQ ID NO:14)；
下游引物R：AAGCGGCTTCGGCCAGTAACGTTAGGGGGGG(SEQ ID NO:15)；
PCR体系(25μL)为：12.5μL的2×PCR mix(购自北京博迈德基因有限公司(Biomed))；11.5μL的ddH2O；0.5μL的F(10μM)和0.5μL的R(10μM)，对连接产物转化菌落进行PCR扩增。PCR反应条件为95℃5min 1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃50s，扩增35个循环；72℃7min。PCR产物用0.45％琼脂糖DNA凝胶电泳分析，结果如图6所示，其中泳道1-5为不同单菌落的PCR结果。
1.3.3、阳性克隆提取质粒和酶切鉴定
菌落PCR鉴定为阳性的克隆，在含有卡那霉素(50μg/mL)的固体培养基上划线，37℃，倒置过夜培养。而后挑取单克隆，接种于1.5mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养后，按1:50的比例接种于20mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基，37℃，200rpm过夜培养。无菌环境下，取其中12mL菌液，按1.2mL菌液+0.6mL60％甘油菌的比例，制备成甘油菌。剩余菌液离心后提取质粒，分别用AclI和XbaI进行单酶切及双酶切鉴定，单酶切和双酶切体系如下表3和表4所示。
表3：单酶切体系
表4：双酶切体系
按照上表3或4的酶切体系混匀样品，并短暂离心，使样品及酶沉于管底。将离心管放置于37℃水浴锅中，孵育2h。用0.45％琼脂糖DNA凝胶电泳对酶切结果进行鉴定，鉴定结果如图7所示，其中泳道1-3分别为图6中经PCR鉴定的阳性克隆1、2、4；泳道4-6分别为阳性克隆菌落1、2、4质粒的AclI单酶切结果；泳道7-9分别为阳性克隆菌落1、2、4质粒的XbaI单酶切结果；泳道10-12分别为阳性克隆菌落1、2、4质粒的AclI和XbaI双酶切结果，其中包括大小约12kb的条带和大小约为3.6kb的条带，证明最终构建成功重组质粒pZDVac-CRSNPO，即为重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗。
该实施例中还利用与上述步骤1.3类似的方法构建获得了携带有第二目的基因(RBD-(G4S)2-S2-NP)的重组质粒pZDVac-RBD-(G4S)2-S2-NP(其中利用空载体pZDVac作为骨架载体，命名为对照质粒1)，和携带有第三目的基因(Foldon-CPPCP-TT-PARDE-G6-RBD-(G4S)2-S2-CTB-Furin2A-ERISS-NP)的重组质粒pZDVac-Foldon-CPPCP-TT-PARDE-G6-RBD-(G4S)2-S2-CTB-Furin2A-ERISS-NP-IRES-OX40L(命名为对照质粒2)。
实施例2：pZDVac-CRSNPO重组质粒在小鼠模型中诱导的免疫原性
该实施例利用上述实施例1构建获得的pZDVac-CRSNPO重组质粒，验证其在小鼠模型中诱导的免疫原性效果，具体包括以下步骤。
2.1、将20只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)随机分为4组，每组5只，分别通过肌肉注射+电脉冲刺激的方式进行3次免疫，免疫间隔为7天。实验分组情况及剂量情况如表5所示。
表5：pZDVac-CRSNPO重组质粒在小鼠模型细胞免疫反应检测实验中的分组情况
2.2、末次免疫后2周，处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞，分别使用新型冠状病毒N蛋白和RBD蛋白刺激培养20小时后，按MabTech公司Mouse IFN-γ与IL-4ELISPOT板说明书进行免疫学检测。不同蛋白刺激物下细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌频率检测统计结果分别如图8和图9所示(其中p＜0.05为统计学差异具有显著性)，抗原特异性T细胞免疫反应偏向性统计结果如图10所示。
图8至图10的结果显示，不同剂量的pZDVac-CRSNPO重组质粒免疫小鼠后均能诱导N抗原与RBD抗原特异性T细胞免疫反应，且既分泌代表Th1型反应的IFN-γ，也能分泌代表Th2型反应的IL-4；而Th1型细胞因子IFN-γ的分泌频率要明显高于Th2型细胞因子IL-4。表明该pZDVac-CRSNPO重组质粒诱导的T细胞免疫反应偏向Th1，且相对0.3μg组和10μg组而言，1μg为最佳免疫剂量。
按照上述步骤2.1和2.2同样的方法，分别对6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠免疫对照质粒1和对照质粒2后所诱导的免疫原性进行检测，结果表明：对照质粒1和对照质粒2所诱导的免疫原性效果均不及pZDVac-CRSNPO重组质粒所诱导的免疫原性效果。
实施例3：pZDVac-CRSNPO重组质粒在人体中的免疫原性检测
该实施例利用实施例1构建获得的pZDVac-CRSNPO重组质粒对人受试者进行免疫，验证其在人体内诱导的免疫原性效果，具体包括以下步骤。
3.1、将经过筛选的志愿者15人(申请单位内部人员，已签署志愿参与试验)，随机分为3组，每组5人，免疫间隔为28天，进行三次免疫。分别在第一次免疫前、第二次免疫后14天及第三次免疫后21天，取志愿者PBMC进行ELISPOT检测。前两次免疫方式为肌肉注射+电脉冲刺激，第三次免疫为皮内注射+电脉冲刺激。实验分组及剂量情况如下表6所示。
表6：pZDVac-CRSNPO重组质粒在人受试者细胞免疫反应检测实验中的分组情况
3.2、取从志愿者体内获得的新鲜的PBMC，分别使用新型冠状病毒N蛋白和RBD蛋白刺激培养20小时后，按MabTech公司Human IFN-γELISPOT板说明书进行免疫学检测。三次免疫后不同蛋白刺激物下细胞因子IFN-γ的分泌频率检测统计结果如图11所示(其中p＜0.05为统计学差异具有显著性；p＜0.01为统计学差异具有非常显著性)，三次免疫不同剂量反应统计结果如图12所示(其中p＜0.05为统计学差异具有显著性；p＜0.01为统计学差异具有非常显著性)。
图11结果显示，与免疫前相比，进行二免和三免后均能够诱导强烈的细胞免疫反应，分别使用N蛋白和RBD蛋白作为刺激物时，PBMC中细胞因子IFN-γ的分泌频率具有非常显著的提高；并且当使用N蛋白作为刺激物时，三免后细胞因子IFN-γ的分泌频率高于二免后，而当使用RBD蛋白作为刺激物时，二免后细胞因子IFN-γ的分泌频率高于三免。图12结果显示，不同剂量组免疫后与免疫前相比，斑点数均有显著增加，说明各剂量下均能有效诱导特异性细胞免疫；而使用N蛋白和RBD蛋白作为刺激物时，二免后各剂量组之间斑点数的统计学差异具有显著性(p＝0.0343，为低中高三个剂量组之间的方差分析结果)。可见，相对于高剂量组和低剂量组，中剂量组免疫效果更佳，且三免后斑点数并未增加太多，因此该pZDVac-CRSNPO重组质粒作为新型冠状病毒DNA疫苗时，采用中剂量免疫2针(2针之间例如间隔28天)即可。
另外，对该实施例筛选的15名志愿者在疫苗注射后进行定期随访和体检(至少3个月)，所有志愿者均没有表现出任何不适状况，初步表明本发明提供的pZDVac-CRSNPO重组质粒作为疫苗使用时具有良好的安全性。
实施例4：pZDVac-CRSNPO重组质粒的免疫途径及电导入条件
该实施例利用实施例1构建获得的pZDVac-CRSNPO重组质粒通过不同的免疫途径(肌肉注射或皮内注射)以及不同的电导入条件对小鼠进行免疫，以评价不同的免疫途径和不同的电导入条件下诱导产生的免疫反应强弱，具体包括以下步骤。
4.1、按照下表7所示的组别将40只健康的6-8周雌性Balb/c小鼠(购自维通利华)随机分为5组，每组8只，分别通过肌肉注射或皮内注射&电导入(1Hz×6次，电极针间距0.5cm)的方式对各组小鼠左后肢单点给药进行免疫。设置空白对照组不做处理，其他各组小鼠给予pSVK1-CRSNPO重组质粒1μg/只。给药日计为0d，分别于0d、21d对5组小鼠进行两次免疫。
表7：pZDVac-CRSNPO重组质粒不同免疫途径及电导入条件下的小鼠分组情况
4.2、于末次免疫后2周取血清进行抗体检测，具体为使用ACRO Biosystems抗体检测试剂盒进行血清抗体(RBD IgG)检测，小鼠血清按1:100稀释，阳性判定为OD450nm处吸光值＞0.1。并于末次免疫2周后，处死各组小鼠，按MabTech公司IFN-γELISPOT板说明书进行ELISPOT检测(IFN-γ)，其中ELISPOT实验的斑点计数表达方式为：spot-forming units(SFU)/106splenocytes；实验孔阳性的判断标准为：实验孔斑点数＞阴性对照孔斑点均值+2SD；每只小鼠阳性斑点数计算方法为：1只小鼠的脾细胞做5个复孔，至少3个孔为阳性，则该小鼠的数据有效，该小鼠斑点数＝实验孔平均斑点数-阴性对照孔斑点数；每组小鼠的斑点数计算方法为：将该组每只有效小鼠数据求平均值，以平均值±标准差表示。数据的统计学分析用GraphPad Prism 8软件进行，其中两组间差异用Student's t test检验进行分析，多组间差异比较用单因素方差分析。p<0.05为统计学上差异具有显著性，P<0.01为统计学上差异具有非常显著性。
抗体检测的结果如图13所示，可见pSVK1-CRSNPO重组质粒经不同途径(肌肉注射和皮内注射)或不同电导入条件免疫小鼠后，均能诱导抗体反应。肌肉注射组(60V，50ms，1Hz×6次，电极针间距0.5cm，场强120V/cm)诱导产生的抗体水平与空白对照组相比，统计学上差异具有显著性；皮内注射组a(60V，50ms，1Hz×6次，电极针间距0.5cm，场强120V/cm)诱导产生的抗体水平与空白对照组相比，统计学上差异也具有显著性；而皮内注射组b(36V，50ms)和c(36V，10ms)诱导产生的抗体水平与空白对照组相比，统计学上差异不显著；表明在肌肉注射和皮下注射条件下当电导入条件为电压60V，脉宽50ms时，相对于电压36V，脉宽50ms的电导入条件具有相对更好的免疫效果。另外，在相同的电导入条件下，皮内注射组a诱导产生的抗体水平与肌肉注射组相比，统计学上差异虽不显著，但总体上经肌肉注射途径免疫pSVK1-CRSNPO重组质粒会有相对更好的体液免疫效果。
ELISPOT检测检测结果如图14所示，可见pSVK1-CRSNPO重组质粒经不同途径(肌肉注射和皮内注射)和不同电导入条件下免疫小鼠后均能诱导N抗原、RBD抗原和S2抗原特异性T细胞免疫反应，实验组(肌肉注射组、皮下注射组a、b、c)与空白对照组相比，在统计学上差异均具有显著性，其中各电导入条件下经皮内注射途径免疫后诱导的N抗原、RBD抗原和S2抗原特异性T细胞免疫反应与经肌肉注射途径免疫后诱导的N抗原、RBD抗原和S2抗原特异性T细胞免疫反应均无明显差异。
综上结果表明，本发明提供的pSVK1-CRSNPO重组质粒疫苗经不同免疫途径及不同电导入条件刺激小鼠，均能够诱导较强的特异性T细胞免疫反应，并且肌肉注射组与皮内注射组诱导的细胞免疫反应无明显差异；本发明提供的pSVK1-CRSNPO重组质粒疫苗在诱导体液免疫反应方面，电压60V，脉宽50ms的电导入条件具有相对更好的诱导效果，且总体上疫苗经肌肉注射能产生相对更好的体液免疫反应。因此本发明提供的pSVK1-CRSNPO重组质粒在作为疫苗使用时能够诱导良好的细胞免疫反应和体液免疫反应，可以发挥良好的疫苗接种保护效果，这与上述实施例2和实施例3的结果一致。
实施例5：免疫攻毒试验
该实施例按照上述实施例4中的疫苗免疫接种方式(肌肉注射或皮下注射&电导入(60V，50ms，1Hz×6次，电极针间距0.5cm，场强120V/cm))，将pSVK1-CRSNPO重组质粒免疫hACE2转基因小鼠或恒河猴，设置阴性对照组，给予生理盐水。给药日计为0d，分别于0d、21d对各组动物进行两次免疫，于末次免疫后2周分别对各组动物进行攻毒(新型冠状病毒液)，攻毒后观察各组动物，并考察各组动物肺部病毒载量下降和肺部的病理情况，以肺部病毒载量下降(≥2个log)和肺部病理改善为有效性评价的基本要求。结果表明：阴性对照组动物在攻毒后均表现出感染新型冠状病毒的典型临床症状(例如发热、精神萎靡、体重下降、甚至死亡等)，而免疫组至少4/5的动物获得保护，未表现出感染新型冠状病毒的典型临床症状，且肺部病毒载量下降(≥2个log)和肺部病理明显改善。表明本发明提供的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗ZD-nCor19具有有效性和安全性。
综上实施例结果显示，本发明构建获得的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗(即pZDVac-CRSNPO重组质粒)在动物水平的免疫学功能测试中能够有效诱导高效免疫应答，包括天然免疫反应和抗原特异性细胞免疫应答，证实是一款有较大发展潜力的新型冠状病毒DNA疫苗品种。使用该疫苗对人受试者进行免疫后，发现3个剂量组(100μg、300μg、500μg)均可以诱导出较高水平的天然免疫应答和抗原特异性细胞免疫应答，其中300μg剂量组诱导的免疫应答水平最高。所有参与测试的人受试者，在定期的随访和体检期间均没有出现发热、过敏、头痛、全身无力等明显不良反应。通过比较不同的免疫途径及不同电导入条件诱导产生的免疫反应强弱，表明本发明提供的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗可以通过肌肉注射和皮下注射的方式接种，均可以诱导良好的特异性T细胞免疫反应和体液免疫反应。免疫攻毒试验结果也表明本发明的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗具有良好的安全性和免疫保护效果。以上结果均初步证实是本发明构建的疫苗是一款既能诱导高级别免疫响应同时又非常温和安全的疫苗品种。
此处描述的实施例只用于说明(作为例证)，技术人员所做的各种修改或变更也应包括在专利申请的实质范围内。
工业应用性
本发明提供了融合基因及基于该融合基因的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗及其构建方法和应用，其中该重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗兼具有预防和治疗新型冠状病毒感染的双重效果，适于工业应用。
序列表
<110> 北京震旦鼎泰生物科技有限公司
<120> 融合基因及一种重组新型冠状病毒高效免疫鼎分子DNA疫苗及其构建方法和应用
<150> 202011310160.8
<151> 2020-11-20
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcttactggc ttatcgaaat taatacgact cactataggg agaccggaag cttgaattca 60
tggcggatgt gtgacataca cgacgccaaa agattttgtt ccagctcctg ccacctccgc 120
tacgcgagag attaaccacc cacgatggcc gccaaagtgc atgttgatat tgaggctgac 180
agcccattca tcaagtcttt gcagaaggca tttccgtcgt tcgaggtgga gtcattgcag 240
gtcacaccaa atgaccatgc aaatgccaga gcattttcgc acctggctac caaattgatc 300
gagcaggaga ctgacaaaga cacactcatc ttggatatcg gcagtgcgcc ttccaggaga 360
atgatgtcta cgcacaaata ccactgcgta tgccctatgc gcagcgcaga agaccccgaa 420
aggctcgtat gctacgcaaa gaaactggca gcggcctccg ggaaggtgct ggatagagag 480
atcgcaggaa aaatcaccga cctgcagacc gtcatggcta cgccagacgc tgaatctcct 540
accttttgcc tgcatacaga cgtcacgtgt cgtacggcag ccgaagtggc cgtataccag 600
gacgtgtatg ctgtacatgc accaacatcg ctgtaccatc aggcgatgaa aggtgtcaga 660
acggcgtatt ggattgggtt tgacaccacc ccgtttatgt ttgacgcgct agcaggcgcg 720
tatccaacct acgccacaaa ctgggccgac gagcaggtgt tacaggccag gaacatagga 780
ctgtgtgcag catccttgac tgagggaaga ctcggcaaac tgtccattct ccgcaagaag 840
caattgaaac cttgcgacac agtcatgttc tcggtaggat ctacattgta cactgagagc 900
agaaagctac tgaggagctg gcacttaccc tccgtattcc acctgaaagg taaacaatcc 960
tttacctgta ggtgcgatac catcgtatca tgtgaagggt acgtagttaa gaaaatcact 1020
atgtgccccg gcctgtacgg taaaacggta gggtacgccg tgacgtatca cgcggaggga 1080
ttcctagtgt gcaagaccac agacactgtc aaaggagaaa gagtctcatt ccctgtatgc 1140
acctacgtcc cctcaaccat ctgtgatcaa atgactggca tactagcgac cgacgtcaca 1200
ccggaggacg cacagaagtt gttagtggga ttgaatcaga ggatagttgt gaacggaaga 1260
acacagcgaa acactaacac gatgaagaac tatctgcttc cgattgtggc cgtcgcattt 1320
agcaagtggg cgagggaata caaggcagac cttgatgatg aaaaacctct gggtgtccga 1380
gagaggtcac ttacttgctg ctgcttgtgg gcatttaaaa cgaggaagat gcacaccatg 1440
tacaagaaac cagacaccca gacaatagtg aaggtgcctt cagagtttaa ctcgttcgtc 1500
atcccgagcc tatggtctac aggcctcgca atcccagtca gatcacgcat taagatgctt 1560
ttggccaaga agaccaagcg agagttaata cctgttctcg acgcgtcgtc agccagggat 1620
gctgaacaag aggagaagga gaggttggag gccgagctga ctagagaagc cttaccaccc 1680
ctcgtcccca tcgcgccggc ggagacggga gtcgtcgacg tcgacgttga agaactagag 1740
tatcacgcag gtgcaggggt cgtggaaaca cctcgcagcg cgttgaaagt caccgcacag 1800
ccgaacgacg tactactagg aaattacgta gttctgtccc cgcagaccgt gctcaagagc 1860
tccaagttgg cccccgtgca ccctctagca gagcaggtga aaataataac acataacggg 1920
agggccggcc gttaccaggt cgacggatat gacggcaggg tcctactacc atgtggatcg 1980
gccattccgg tccctgagtt tcaagctttg agcgagagcg ccactatggt gtacaacgaa 2040
agggagttcg tcaacaggaa actataccat attgccgttc acggaccgtc gctgaacacc 2100
gacgaggaga actacgagaa agtcagagct gaaagaactg acgccgagta cgtgttcgac 2160
gtagataaaa aatgctgcgt caagagagag gaagcgtcgg gtttggtgtt ggtgggagag 2220
ctaaccaacc ccccgttcca tgaattcgcc tacgaagggc tgaagatcag gccgtcggca 2280
ccatataaga ctacagtagt aggagtcttt ggggttccgg gatcaggcaa gtctgctatt 2340
attaagagcc tcgtgaccaa acacgatctg gtcaccagcg gcaagaagga gaactgccag 2400
gaaatagtca acgacgtgaa gaagcaccgc ggactggaca tccaggcaaa aacagtggac 2460
tccatcctgc taaacgggtg tcgtcgtgcc gtggacatcc tatatgtgga cgaggctttc 2520
gcttgccatt ccggtactct gctagcccta attgctcttg ttaaacctcg gagcaaagtg 2580
gtgttatgcg gagaccccaa gcaatgcgga ttcttcaata tgatgcagct taaggtgaac 2640
ttcaaccaca acatctgcac tgaagtatgt cataaaagta tatccagacg ttgcacgcgt 2700
ccagtcacgg ccatcgtgtc tacgttgcac tacggaggca agatgcgcac gaccaacccg 2760
tgcaacaaac ccataatcat agacaccaca ggacagacca agcccaagcc aggagacatc 2820
gtgttaacat gcttccgagg ctgggtaaag cagctgcagt tggactaccg tggacacgaa 2880
gtcatgacag cagcagcatc tcagggcctc acccgcaaag gggtatacgc cgtaaggcag 2940
aaggtgaatg aaaatccctt gtatgcccct gcgtcggagc acgtgaatgt actgctgacg 3000
cgcactgagg ataggctggt gtggaaaacg ctggccggcg atccctggat taaggtccta 3060
tcaaacattc cacagggtaa ctttacggcc acattggaag aatggcaaga agaacacgac 3120
aaaataatga aggtgattga aggaccggct gcgcctgtgg acgcgttcca gaacaaagcg 3180
aacgtgtgtt gggcgaaaag cctggtgcct gtcctggaca ctgccggaat cagattgaca 3240
gcagaggagt ggagcaccat aattacagca tttaaggagg acagagctta ctctccagtg 3300
gtggccttga atgaaatttg caccaagtac tatggagttg acctggacag tggcctgttt 3360
tctgccccga aggtgtccct gtattacgag aacaaccact gggataacag acctggtgga 3420
aggatgtatg gattcaatgc cgcaacagct gccaggctgg aagctagaca taccttcctg 3480
aaggggcagt ggcatacggg caagcaggca gttatcgcag aaagaaaaat ccaaccgctt 3540
tctgtgctgg acaatgtaat tcctatcaac cgcaggctgc cgcacgccct ggtggctgag 3600
tacaagacgg ttaaaggcag tagggttgag tggctggtca ataaagtaag agggtaccac 3660
gtcctgctgg tgagtgagta caacctggct ttgcctcgac gcagggtcac ttggttgtca 3720
ccgctgaatg tcacaggcgc cgataggtgc tacgacctaa gtttaggact gccggctgac 3780
gccggcaggt tcgacttggt ctttgtgaac attcacacgg aattcagaat ccaccactac 3840
cagcagtgtg tcgaccacgc catgaagctg cagatgcttg ggggagatgc gctacgactg 3900
ctaaaacccg gcggcagcct cttgatgaga gcttacggat acgccgataa aatcagcgaa 3960
gccgttgttt cctccttaag cagaaagttc tcgtctgcaa gagtgttgcg cccggattgt 4020
gtcaccagca atacagaagt gttcttgctg ttctccaact ttgacaacgg aaagagaccc 4080
tctacgctac accagatgaa taccaagctg agtgccgtgt atgccggaga agccatgcac 4140
acggccgggt gtgcaccatc ctacagagtt aagagagcag acatagccac gtgcacagaa 4200
gcggctgtgg ttaacgcagc taacgcccgt ggaactgtag gggatggcgt atgcagggcc 4260
gtggcgaaga aatggccgtc agcctttaag ggagaagcaa caccagtggg cacaattaaa 4320
acagtcatgt gcggctcgta ccccgtcatc cacgctgtag cgcctaattt ctctgccacg 4380
actgaagcgg aaggggaccg cgaattggcc gctgtctacc gggcagtggc cgccgaagta 4440
aacagactgt cactgagcag cgtagccatc ccgctgctgt ccacaggagt gttcagcggc 4500
ggaagagata ggctgcagca atccctcaac catctattca cagcaatgga cgccacggac 4560
gctgacgtga ccatctactg cagagacaaa agttgggaga agaaaatcca ggaagccata 4620
gacatgagga cggctgtgga gttgctcaat gatgacgtgg agctgaccac agacttggtg 4680
agagtgcacc cggacagcag cctggtgggt cgtaagggct acagtaccac tgacgggtcg 4740
ctgtactcgt actttgaagg tacgaaattc aaccaggctg ctattgatat ggcagagata 4800
ctgacgttgt ggcccagact gcaagaggca aacgaacaga tatgcctata cgcgctgggc 4860
gaaacaatgg acaacatcag atccaaatgt ccggtgaacg attccgattc atcaacacct 4920
cccaggacag tgccctgcct gtgccgctac gcaatgacag cagaacggat cgcccgcctt 4980
aggtcacacc aagttaaaag catggtggtt tgctcatctt ttcccctccc gaaataccat 5040
gtagatgggg tgcagaaggt aaagtgcgag aaggttctcc tgttcgaccc gacggtacct 5100
tcagtggtta gtccgcggaa gtatgccgca tctacgacgg accactcaga tcggtcgtta 5160
cgagggtttg acttggactg gaccaccgac tcgtcttcca ctgccagcga taccatgtcg 5220
ctacccagtt tgcagtcgtg tgacatcgac tcgatctacg agccaatggc tcccatagta 5280
gtgacggctg acgtacaccc tgaacccgca ggcatcgcgg acctggcggc agatgtgcat 5340
cctgaacccg cagaccatgt ggacctcgag aacccgattc ctccaccgcg cccgaagaga 5400
gctgcatacc ttgcctcccg cgcggcggag cgaccggtgc cggcgccgag aaagccgacg 5460
cctgccccaa ggactgcgtt taggaacaag ctgcctttga cgttcggcga ctttgacgag 5520
cacgaggtcg atgcgttggc ctccgggatt actttcggag acttcgacga cgtcctgcga 5580
ctaggccgcg cgggtgcata tattttctcc tcggacactg gcagcggaca tttacaacaa 5640
aaatccgtta ggcagcacaa tctccagtgc gcacaactgg atgcggtcga ggaggagaaa 5700
atgtacccgc caaaattgga tactgagagg gagaagctgt tgctgctgaa aatgcagatg 5760
cacccatcgg aggctaataa gagtcgatac cagtctcgca aagtggagaa catgaaagcc 5820
acggtggtgg acaggctcac atcgggggcc agattgtaca cgggagcgga cgtaggccgc 5880
ataccaacat acgcggttcg gtacccccgc cccgtgtact cccctaccgt gatcgaaaga 5940
ttctcaagcc ccgatgtagc aatcgcagcg tgcaacgaat acctatccag aaattaccca 6000
acagtggcgt cgtaccagat aacagatgaa tacgacgcat acttggacat ggttgacggg 6060
tcggatagtt gcttggacag agcgacattc tgcccggcga agctccggtg ctacccgaaa 6120
catcatgcgt accaccagcc gactgtacgc agtgccgtcc cgtcaccctt tcagaacaca 6180
ctacagaacg tgctagcggc cgccaccaag agaaactgca acgtcacgca aatgcgagaa 6240
ctacccacca tggactcggc agtgttcaac gtggagtgct tcaagcgcta tgcctgctcc 6300
ggagaatatt gggaagaata tgctaaacaa cctatccgga taaccactga gaacatcact 6360
acctatgtga ccaaattgaa aggcccgaaa gctgctgcct tgttcgctaa gacccacaac 6420
ttggttccgc tgcaggaggt tcccatggac agattcacgg tcgacatgaa acgagatgtc 6480
aaagtcactc cagggacgaa acacacagag gaaagaccca aagtccaggt aattcaagca 6540
gcggagccat tggcgaccgc ttacctgtgc ggcatccaca gggaattagt aaggagacta 6600
aatgctgtgt tacgccctaa cgtgcacaca ttgtttgata tgtcggccga agactttgac 6660
gcgatcatcg cctctcactt ccacccagga gacccggttc tagagacgga cattgcatca 6720
ttcgacaaaa gccaggacga ctccttggct cttacaggtt taatgatcct cgaagatcta 6780
ggggtggatc agtacctgct ggacttgatc gaggcagcct ttggggaaat atccagctgt 6840
cacctaccaa ctggcacgcg cttcaagttc ggagctatga tgaaatcggg catgtttctg 6900
actttgttta ttaacactgt tttgaacatc accatagcaa gcagggtact ggagcagaga 6960
ctcactgact ccgcctgtgc ggccttcatc ggcgacgaca acatcgttca cggagtgatc 7020
tccgacaagc tgatggcgga gaggtgcgcg tcgtgggtca acatggaggt gaagatcatt 7080
gacgctgtca tgggcgaaaa acccccatat ttttgtgggg gattcatagt ttttgacagc 7140
gtcacacaga ccgcctgccg tgtttcagac ccacttaagc gcctgttcaa gttgggtaag 7200
ccgctaacag ctgaagacaa gcaggacgaa gacaggcgac gagcactgag tgacgaggtt 7260
agcaagtggt tccggacagg cttgggggcc gaactggagg tggcactaac atctaggtat 7320
gaggtagagg gctgcaaaag tatcctcata gccatggcca ccttggcgag ggacattaag 7380
gcgtttaaga aattgagagg acctgttata cacctctacg gcggtcctag attggtgcgt 7440
taatacacag aattctgatt ggatcccgcc accatgatca agctgaagtt cggggtgttc 7500
ttcaccgtgc tgctgagcag cgcctacgcc cacgggaccc ctcagaacat caccgacctg 7560
tgcgccgagt accacaacac ccagatctac accctgaacg acaagatttt cagctacacc 7620
gaaagcctgg caggaaaaag agagatggcc atcatcacct tcaaaaacgg cgccatcttc 7680
caggtggagg tgcccggcag ccagcacatc gatagccaga agaaggccat cgaaagaatg 7740
aaggacacac tgagaatcgc ctacctgacc gaggccaagg tggaaaagct gtgcgtgtgg 7800
aataataaga ccccccacgc catcgccgcc atcagcatgg ccaaccagta catcaaggca 7860
aacagcaaat tcatcggaat caccgaaaaa gccatgcacg tggcacagcc cgccgtggtg 7920
ctggcaagct ccagaggaat cgcctccttc gtgtgcgagt acgccagccc cggaaaggcc 7980
acagaggtga gagtgaccgt gctgagacag gccgactccc aggtgaccga agtgtgtgct 8040
gccacataca tgatgggcaa cgagctgacc ttcctggacg attccatctg caccggaacc 8100
agcagtggaa accaggtgaa cctgaccatt cagggcctga gggccatgga caccggactg 8160
tacatctgca aggtggagct gatgtacccc cccccctact acctgggcat cggaaacgga 8220
acccagatct atgtgatcga ccccgagcca tgtcccgaca gcgactttac cgtgaccgtg 8280
cccaaggacc tgtacgtggt ggagtacggc tctaacatga ccatcgagtg taaatttccc 8340
gtggagaagc agctggacct ggcagccctg atcgtgtact gggagatgga ggacaagaac 8400
atcatccagt ttgtgcacgg cgaggaagac ctgaaggtgc agcactcctc atacagacag 8460
agagccagac tgctgaaaga ccagctgagc ctgggcaacg cagccctgca gatcaccgac 8520
gtgaagctgc aggacgccgg agtgtacaga tgcatgatca gctacggagg ggcagactac 8580
aagagaatca ccgtgaaagt gaacgcaccc tacaacaaaa tcaaccagag aatcctggtg 8640
gtggaccccg tgaccagcga gcacgagctg acctgccagg ccgagggcta ccccaaggca 8700
gaggtgatct ggaccagcag cgaccaccag gtgctgagcg gcaagaccac caccaccaat 8760
agcaaaagag aggaaaagct gttcaacgtg accagcacac tgagaattaa tacaaccacc 8820
aacgagatct tctactgcac attcagaaga ctggaccccg aagaaaacca caccgccgag 8880
ctggtgatcc ccgaactgcc cctggcccac ccccctaacg aaagaaccca cctggtgatc 8940
ctgggcgcca tcctgctgtg cctgggagtg gccctgacct tcatcttccg cctgagaaag 9000
ggcaggatga tggacgtgaa aaagtgcggc atccaggaca caaacagcaa aaagcagagc 9060
gatacccacc tggaggagac cgccaaattt gtggccgcct ggaccctgaa ggcagccgct 9120
tgagaattcg gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa 9180
taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat 9240
gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct 9300
ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct 9360
tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc 9420
gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa 9480
ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc 9540
gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 9600
gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc 9660
ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataagcttg ccacaacccg 9720
cgcgcttaat taacccgggg ccaccatgga gcgggtgcag cccctggagg agaacgtggg 9780
caacgccgcc agacccaggt tcgagagaaa caagctgctg ctggtggcca gcgtgatcca 9840
gggactgggc ctgctgctgt gcttcaccta tatttgcctg cactttagtg ccctgcaggt 9900
gagtcataga tacccccgca ttcagtccat caaagtgcag ttcaccgagt ataagaagga 9960
gaagggattc attctgacct cccagaagga ggacgagatc atgaaggtgc agaacaatag 10020
cgtgatcatc aactgtgacg gcttttacct gatttcactg aaaggatact tcagccagga 10080
ggtgaatatc agcctgcact accagaaaga cgaggagccc ctgttccagc tgaagaaggt 10140
gaggagcgtg aacagcctga tggtggccag cctgacctac aaggacaaag tgtacctgaa 10200
cgtgaccacc gacaacacca gcctggatga ttttcacgtg aacggaggcg agctgatcct 10260
gatccatcag aaccccggcg agttctaagg gtaattaatt gacgttttac ggccgccggt 10320
ggcgcccgcg cccggcggcc cgtccctggc cgttgcaggc cactccggtg gctcccgtcg 10380
tccccgactt ccaggcccag cagatgcagc aactcatcag cgccgtaaat gcgctgacaa 10440
tgagacagaa cgcaattgct cctgctaggc ctcccaaacc aaagaagaag aagacaacca 10500
aaccaaagcc gaaaacgcag cccaagaaga tcaacggaaa aacgcagcag caaaagaaga 10560
aagacaagca agccgacaag aagaagaaga aacccggaaa aagagaaaga atgtgcatga 10620
agattgaaaa tgactgtatc ttcgtatgcg gctagccaca gtaacgtagt gtttccagac 10680
atgtcgggca ccgcactatc atgggtgcag aaaatctcgg gtggtctggg ggccttcgca 10740
atcggcgcta tcctggtgct ggttgtggtc acttgcattg ggctccgcag ataagttagg 10800
gtaggcaatg gcattgatat agcaagaaaa ttgaaaacag aaaaagttag ggtaagcaat 10860
ggcatataac cataactgta taacttgtaa caaagcgcaa caagacctgc gcaattggcc 10920
ccgtggtccg cctcacggaa actcggggca actcatattg acacattaat tggcaataat 10980
tggaagctta cataagctta attcgacgaa taattggatt tttattttat tttgcaattg 11040
gtttttaata tttccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 11100
aaaaaaaaaa aaactagaga tcataatcag ccatatcaca tctgtagagg ttttacttgc 11160
tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 11220
tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 11280
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 11340
atcttatcat gtctggatct agtctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 11400
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 11460
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 11520
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 11580
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 11640
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 11700
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 11760
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 11820
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 11880
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 11940
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 12000
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 12060
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 12120
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 12180
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 12240
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 12300
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagac 12360
tagtatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct 12420
attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 12480
gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 12540
actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 12600
tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 12660
gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 12720
aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 12780
tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 12840
cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagtatgcc 12900
cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 12960
aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca 13020
ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 13080
cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 13140
tcttgacgag ttcttctgac tcgaggcatg caccatgatt acgaattcac gcgtgcatgc 13200
tcgggggacg atcgtcgggg ggctcggggg acgatcgtcg gggggctcgg gggacgatcg 13260
tcggggggct cgggggacga tcgtcggggg gctcgggcat gcacgcgtaa gcttggcact 13320
ggccgaccat gattacgaat tcacgcgtgc atgctcgggg gacgatcgtc ggggggctcg 13380
ggggacgatc gtcggggggc tcgggggacg atcgtcgggg ggctcggggg acgatcgtcg 13440
gggggctcgg gcatgcacgc gtaagcttgg cactggccgg catgcaagct gcaggcatgc 13500
accatgatta cgaattcacg cgtgcatgct cgggggacga tcgtcggggg gctcggggga 13560
cgatcgtcgg ggggctcggg ggacgatcgt cggggggctc gggggacgat cgtcgggggg 13620
ctcgggcatg cacgcgtaag cttggcactg gccgaccatg attacgaatt cacgcgtgca 13680
tgctcggggg acgatcgtcg gggggctcgg gggacgatcg tcggggggct cgggggacga 13740
tcgtcggggg gctcggggga cgatcgtcgg ggggctcggg catgcacgcg taagcttggc 13800
actggccggc atgcaagctc ggatccaccg gtcgccacca tggtgagcaa catgcaagct 13860
cgtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 13920
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 13980
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 14040
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 14100
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 14160
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 14220
ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 14280
tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 14340
aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 14400
tctatataag cagagctctc tggctaacta gagaacccac t 14441
<210> 2
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatcaagc tgaagttcgg ggtgttcttc accgtgctgc tgagcagcgc ctacgcccac 60
gggacccctc agaacatcac cgacctgtgc gccgagtacc acaacaccca gatctacacc 120
ctgaacgaca agattttcag ctacaccgaa agcctggcag gaaaaagaga gatggccatc 180
atcaccttca aaaacggcgc catcttccag gtggaggtgc ccggcagcca gcacatcgat 240
agccagaaga aggccatcga aagaatgaag gacacactga gaatcgccta cctgaccgag 300
gccaaggtgg aaaagctgtg cgtgtggaat aataagaccc cccacgccat cgccgccatc 360
agcatggcca ac 372
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtacatca aggcaaacag caaattcatc ggaatcaccg aa 42
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccaaatttg tggccgcctg gaccctgaag gcagccgct 39
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcggcggcg gcggcggc 18
<210> 6
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcgtgcagc ccaccgagag catcgtgcgc ttccccaaca tcaccaacct gtgccccttc 60
ggcgaggtgt tcaacgccac ccgcttcgcc agcgtgtacg cctggaaccg caagcgcatc 120
agcaactgcg tggccgacta cagcgtgctg tacaacagcg ccagcttcag caccttcaag 180
tgctacggcg tgagccccac caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac 240
agcttcgtga tccgcggcga cgaggtgcgc cagatcgccc ccggccagac cggcaagatc 300
gccgactaca actacaagct gcccgacgac ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaacagc 360
aacaacctgg acagcaaggt gggcggcaac tacaactacc tgtaccgcct gttccgcaag 420
agcaacctga agcccttcga gcgcgacatc agcaccgaga tctaccaggc cggcagcacc 480
ccctgcaacg gcgtggaggg cttcaactgc tacttccccc tgcagagcta cggcttccag 540
cccaccaacg gcgtgggcta ccagccctac cgcgtggtgg tgctgagctt cgagctgctg 600
cacgcccccg ccaccgtgtg cggccccaag aagagcacca acctggtgaa gaacaagtgc 660
gtgaacttcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg tgctgaacga catcctgagc 720
cgcctggaca aggtggaggc cgaggtgcag atcgaccgcc tgatcaccgg ccgcctgcag 780
agcctgcaga cctacgtgac ccagcagctg atccgcgccg ccgagatccg cgccagcgcc 840
aacctggccg ccaccaagat gagcgagtgc gtgctgggcc agagcaagcg cgtggacttc 900
tgcggcaagg gctaccacct gatgagcttc ccccagagcg ccccccacgg cgtggtgttc 960
ctgcacgtga cctacgtgcc cgcccaggag aagaacttca ccaccgcccc cgccatctgc 1020
cacgacggca aggcccactt cccccgcgag ggcgtgttcg tgagcaacgg cacccactgg 1080
ttcgtgaccc agcgcaactt ctacgagccc cagatcatca ccaccgacaa caccttcgtg 1140
agcggcaact gcgacgtggt gatcggcatc gtgaacaaca ccgtgtacga ccccctgcag 1200
cccgagctgg acagcttcaa ggaggagctg gacaagtact tcaagaacca caccagcccc 1260
gacgtggacc tgggcgacat cagcggcatc aacgccagcg tggtgaacat ccagaaggag 1320
atcgaccgcc tgaacgaggt ggccaagaac ctgaacgaga gcctgatcga cctgcaggag 1380
ctgggcaagt acgagcagta catcaagtgg ccc 1413
<210> 7
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggctacatcc ccgaggcccc ccgcgacggc caggcctacg tgcgcaagga cggcgagtgg 60
gtgctgctga gcaccttcct gtgccccccc tgcccc 96
<210> 8
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcgccaagc gcgcccccgt gaagcagacc ctgaacttcg acctgctgaa gctggccggc 60
gacgtggaga gcaaccccgg cccc 84
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcgctaca tgatcctggg cctgctggcc ctggccgccg tgtgcagcgc c 51
<210> 10
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccctgaaca cccccaagga ccacatcggc acccgcaacc ccgccaacaa cgccgccatc 60
gtgctgcagc tgccccaggg caccaccctg cccaagggct tctacgccga gggcagccgc 120
ggcggcagcc aggccagcag ccgcagcagc agccgcagcc gcaacagcag ccgcaacagc 180
acccccggca gcagccgcgg caccagcccc gcccgcatgg ccggcaacgg cggcgacgcc 240
gccctggccc tgctgctgct ggaccgcctg aaccagctgg agagcaagat gagcggcaag 300
ggccagcagc agcagggcca gaccgtgacc aagaagagcg ccgccgaggc cagcaagaag 360
ccccgccaga agcgcaccgc caccaaggcc tacaacgtga cccaggcctt cggccgccgc 420
ggccccgagc agacccaggg caacttcggc gaccaggagc tgatccgcca gggcaccgac 480
tacaagcact ggccccagat cgcccagttc gcccccagcg ccagcgcctt cttcggcatg 540
agccgcatcg gcatggaggt gacccccagc ggcacctggc tgacctacac cggcgccatc 600
aagctggacg acaaggaccc caacttcaag gaccaggtga tcctgctgaa caagcacatc 660
gacgcctaca agaccttccc ccccaccgag cccaagtga 699
<210> 11
<211> 569
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacga 569
<210> 12
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggagcggg tgcagcccct ggaggagaac gtgggcaacg ccgccagacc caggttcgag 60
agaaacaagc tgctgctggt ggccagcgtg atccagggac tgggcctgct gctgtgcttc 120
acctatattt gcctgcactt tagtgccctg caggtgagtc atagataccc ccgcattcag 180
tccatcaaag tgcagttcac cgagtataag aaggagaagg gattcattct gacctcccag 240
aaggaggacg agatcatgaa ggtgcagaac aatagcgtga tcatcaactg tgacggcttt 300
tacctgattt cactgaaagg atacttcagc caggaggtga atatcagcct gcactaccag 360
aaagacgagg agcccctgtt ccagctgaag aaggtgagga gcgtgaacag cctgatggtg 420
gccagcctga cctacaagga caaagtgtac ctgaacgtga ccaccgacaa caccagcctg 480
gatgattttc acgtgaacgg aggcgagctg atcctgatcc atcagaaccc cggcgagttc 540
taa 543
<210> 13
<211> 4159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgatcaagc tgaagttcgg ggtgttcttc accgtgctgc tgagcagcgc ctacgcccac 60
gggacccctc agaacatcac cgacctgtgc gccgagtacc acaacaccca gatctacacc 120
ctgaacgaca agattttcag ctacaccgaa agcctggcag gaaaaagaga gatggccatc 180
atcaccttca aaaacggcgc catcttccag gtggaggtgc ccggcagcca gcacatcgat 240
agccagaaga aggccatcga aagaatgaag gacacactga gaatcgccta cctgaccgag 300
gccaaggtgg aaaagctgtg cgtgtggaat aataagaccc cccacgccat cgccgccatc 360
agcatggcca accagtacat caaggcaaac agcaaattca tcggaatcac cgaagccaaa 420
tttgtggccg cctggaccct gaaggcagcc gctggcggcg gcggcggcgg ccgcgtgcag 480
cccaccgaga gcatcgtgcg cttccccaac atcaccaacc tgtgcccctt cggcgaggtg 540
ttcaacgcca cccgcttcgc cagcgtgtac gcctggaacc gcaagcgcat cagcaactgc 600
gtggccgact acagcgtgct gtacaacagc gccagcttca gcaccttcaa gtgctacggc 660
gtgagcccca ccaagctgaa cgacctgtgc ttcaccaacg tgtacgccga cagcttcgtg 720
atccgcggcg acgaggtgcg ccagatcgcc cccggccaga ccggcaagat cgccgactac 780
aactacaagc tgcccgacga cttcaccggc tgcgtgatcg cctggaacag caacaacctg 840
gacagcaagg tgggcggcaa ctacaactac ctgtaccgcc tgttccgcaa gagcaacctg 900
aagcccttcg agcgcgacat cagcaccgag atctaccagg ccggcagcac cccctgcaac 960
ggcgtggagg gcttcaactg ctacttcccc ctgcagagct acggcttcca gcccaccaac 1020
ggcgtgggct accagcccta ccgcgtggtg gtgctgagct tcgagctgct gcacgccccc 1080
gccaccgtgt gcggccccaa gaagagcacc aacctggtga agaacaagtg cgtgaacttc 1140
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gtgctgaacg acatcctgag ccgcctggac 1200
aaggtggagg ccgaggtgca gatcgaccgc ctgatcaccg gccgcctgca gagcctgcag 1260
acctacgtga cccagcagct gatccgcgcc gccgagatcc gcgccagcgc caacctggcc 1320
gccaccaaga tgagcgagtg cgtgctgggc cagagcaagc gcgtggactt ctgcggcaag 1380
ggctaccacc tgatgagctt cccccagagc gccccccacg gcgtggtgtt cctgcacgtg 1440
acctacgtgc ccgcccagga gaagaacttc accaccgccc ccgccatctg ccacgacggc 1500
aaggcccact tcccccgcga gggcgtgttc gtgagcaacg gcacccactg gttcgtgacc 1560
cagcgcaact tctacgagcc ccagatcatc accaccgaca acaccttcgt gagcggcaac 1620
tgcgacgtgg tgatcggcat cgtgaacaac accgtgtacg accccctgca gcccgagctg 1680
gacagcttca aggaggagct ggacaagtac ttcaagaacc acaccagccc cgacgtggac 1740
ctgggcgaca tcagcggcat caacgccagc gtggtgaaca tccagaagga gatcgaccgc 1800
ctgaacgagg tggccaagaa cctgaacgag agcctgatcg acctgcagga gctgggcaag 1860
tacgagcagt acatcaagtg gccctggtac atctggctgg gcttcatcgc cggcctgatc 1920
gccatcgtga tggtgaccat catgctgtgc tgcatgacca gctgctgcag ctgcctgaag 1980
ggctgctgca gctgcggcag ctgctgcaag ttcgacgagg acgacagcga gcccgtgctg 2040
aagggcgtga agctgcacta caccggctac atccccgagg ccccccgcga cggccaggcc 2100
tacgtgcgca aggacggcga gtgggtgctg ctgagcacct tcctgtgccc cccctgcccc 2160
cgcgccaagc gcgcccccgt gaagcagacc ctgaacttcg acctgctgaa gctggccggc 2220
gacgtggaga gcaaccccgg ccccatgcgc tacatgatcc tgggcctgct ggccctggcc 2280
gccgtgtgca gcgccgccct gaacaccccc aaggaccaca tcggcacccg caaccccgcc 2340
aacaacgccg ccatcgtgct gcagctgccc cagggcacca ccctgcccaa gggcttctac 2400
gccgagggca gccgcggcgg cagccaggcc agcagccgca gcagcagccg cagccgcaac 2460
agcagccgca acagcacccc cggcagcagc cgcggcacca gccccgcccg catggccggc 2520
aacggcggcg acgccgccct ggccctgctg ctgctggacc gcctgaacca gctggagagc 2580
aagatgagcg gcaagggcca gcagcagcag ggccagaccg tgaccaagaa gagcgccgcc 2640
gaggccagca agaagccccg ccagaagcgc accgccacca aggcctacaa cgtgacccag 2700
gccttcggcc gccgcggccc cgagcagacc cagggcaact tcggcgacca ggagctgatc 2760
cgccagggca ccgactacaa gcactggccc cagatcgccc agttcgcccc cagcgccagc 2820
gccttcttcg gcatgagccg catcggcatg gaggtgaccc ccagcggcac ctggctgacc 2880
tacaccggcg ccatcaagct ggacgacaag gaccccaact tcaaggacca ggtgatcctg 2940
ctgaacaagc acatcgacgc ctacaagacc ttccccccca ccgagcccaa gtgagaattc 3000
ggcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 3060
tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 3120
cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 3180
ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 3240
caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 3300
ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 3360
cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 3420
aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3480
tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3540
ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc gcgcgcttaa 3600
ttaacccggg gccaccatgg agcgggtgca gcccctggag gagaacgtgg gcaacgccgc 3660
cagacccagg ttcgagagaa acaagctgct gctggtggcc agcgtgatcc agggactggg 3720
cctgctgctg tgcttcacct atatttgcct gcactttagt gccctgcagg tgagtcatag 3780
atacccccgc attcagtcca tcaaagtgca gttcaccgag tataagaagg agaagggatt 3840
cattctgacc tcccagaagg aggacgagat catgaaggtg cagaacaata gcgtgatcat 3900
caactgtgac ggcttttacc tgatttcact gaaaggatac ttcagccagg aggtgaatat 3960
cagcctgcac taccagaaag acgaggagcc cctgttccag ctgaagaagg tgaggagcgt 4020
gaacagcctg atggtggcca gcctgaccta caaggacaaa gtgtacctga acgtgaccac 4080
cgacaacacc agcctggatg attttcacgt gaacggaggc gagctgatcc tgatccatca 4140
gaaccccggc gagttctaa 4159
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccaggagac ccggttctag agacggacat t 31
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagcggcttc ggccagtaac gttagggggg g 31

Claims (13)

1.一种融合基因，其由以下（1）至（3）融合而成：
（1）表达新型冠状病毒COVID-19的RBD氨基酸片段的基因；
（2）表达新型冠状病毒COVID-19的S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因；
（3）表达新型冠状病毒COVID-19的N蛋白的138-369位氨基酸片段的基因。
2.一种融合基因，其由以下（1）至（4）融合而成：
（1）表达新型冠状病毒COVID-19的RBD氨基酸片段的基因；
（2）表达新型冠状病毒COVID-19的S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因；
（3）表达新型冠状病毒COVID-19的N蛋白的138-369位氨基酸片段的基因；
（4）表达以下的氨基酸片段的基因：霍乱毒素B亚基（CTB）、破伤风毒素辅助性T细胞表位（TT）、泛DR辅助T细胞表位(PADRE)、Foldon-CPPCP、Furin2A、ERISS、IRES和OX40L。
3.根据权利要求1或2所述的融合基因，其中表达所述RBD氨基酸片段的基因与表达所述S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因连接成融合片段。
4.根据权利要求3所述的融合基因，所述融合片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；表达所述N蛋白的138-369位氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
5.根据权利要求2所述的融合基因，其中：
表达所述CTB氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
表达所述TT氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
表达所述PADRE氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
表达所述Foldon氨基酸片段的基因与表达所述CPPCP氨基酸片段的基因连接成一合成片段，该合成片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
表达所述Furin2A氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
表达所述ERISS氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
表达所述IRES氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；和/或
表达所述OX40L氨基酸片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
6.根据权利要求2所述的融合基因，其中：
表达所述RBD氨基酸片段的基因与表达所述S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因连接成融合片段，在所述的融合片段的上游依次连接有表达所述CTB、TT和PADRE氨基酸片段的基因，在所述的融合片段的下游依次连接有表达所述Foldon、CPPCP和Furin2A氨基酸片段的基因；和/或
在表达所述N蛋白的138-369位氨基酸片段的基因的上游连接有表达所述ERISS氨基酸片段的基因，下游依次连接有表达所述IRES和OX40L氨基酸片段的基因。
7.根据权利要求6所述的融合基因，其中表达所述RBD氨基酸片段的基因与表达所述S2亚基的301-538位氨基酸片段的基因通过表达(G4S)2连接臂的基因连接，所述融合片段的上游与表达所述PADRE氨基酸片段的基因通过核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的表达连接臂linker G6的基因连接。
8.根据权利要求7所述的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
9.一种融合蛋白，其由权利要求1-8中任一项所述的融合基因表达获得。
10.一种重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗，命名为ZD-nCor19，其包含权利要求1-8中任一项所述的融合基因和载体。
11.根据权利要求10所述的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗，其中所述载体命名为pZDVac载体，其为在pSFV1质粒基础上经以下改造获得：用人巨细胞病毒CMV启动子替换原SP6启动子、添加多聚腺苷酸尾SV40 poly(A)，并将pSFV1质粒的抗性基因替换为卡那霉素抗性基因。
12.权利要求11所述的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗的构建方法，其包括以下步骤：
1）合成权利要求1-8中任一项所述的融合基因；
2）将所述融合基因插入pZDVac载体中，获得所述重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗。
13.权利要求10或11所述的重组新型冠状病毒高效免疫DNA疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
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