CN116262911A - 一种减毒、复制可控的顺向hsv示踪系统及其构建方法和应用 - Google Patents
一种减毒、复制可控的顺向hsv示踪系统及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116262911A CN116262911A CN202111524089.8A CN202111524089A CN116262911A CN 116262911 A CN116262911 A CN 116262911A CN 202111524089 A CN202111524089 A CN 202111524089A CN 116262911 A CN116262911 A CN 116262911A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- gamma
- sequence
- recombinant
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title abstract description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 78
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims abstract description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 31
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 29
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000009447 viral pathogenesis Effects 0.000 claims abstract description 6
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 22
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 22
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 20
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 18
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 18
- 230000003363 transsynaptic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 claims description 8
- 230000007281 self degradation Effects 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 claims description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims description 5
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 claims description 5
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091005944 Cerulean Proteins 0.000 claims description 4
- 241000579895 Chlorostilbon Species 0.000 claims description 4
- 108091005960 Citrine Proteins 0.000 claims description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 4
- 241000545067 Venus Species 0.000 claims description 4
- 239000011035 citrine Substances 0.000 claims description 4
- 239000010976 emerald Substances 0.000 claims description 4
- 229910052876 emerald Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 108091005962 small ultra red fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 3
- JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N Gln-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 abstract description 11
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 abstract 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 87
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 101100508081 Human herpesvirus 1 (strain 17) ICP34.5 gene Proteins 0.000 description 16
- 101150027249 RL1 gene Proteins 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 15
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101150076998 ICP34.5 gene Proteins 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 102400001103 Neurotensin Human genes 0.000 description 1
- 101800001814 Neurotensin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005569 Protein Phosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010059000 Protein Phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 241000288754 Scandentia Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036540 impulse transmission Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000012623 in vivo measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000337 motor cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N neurotensin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000000976 primary motor cortex Anatomy 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了减毒、复制可控的顺向HSV示踪系统及其构建方法和应用。具体公开了跨神经突触的重组1型单纯疱疹病毒，其通过将H129株基因组中神经毒力因子编码基因γ34.5两个拷贝基因敲除；然后将表达可控的γ34.5自降解重组基因回补进γ34.5原来基因位点得到；表达可控的γ34.5自降解重组基因中包含敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST。本发明提供的单纯疱疹病毒可作为目的基因长效高表达的基因转导载体、神经环路长时程、顺行跨多级突触结构示踪、功能神经环路解析等；并在神经系统靶向基因治疗、溶瘤病毒治疗、病毒复制与致病机理分析、动物感染模型建立等方面具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及神经生物学及分子病毒学，具体涉及单纯疱疹病毒示踪系统的减毒改造，利用本发明提供的减毒型重组单纯疱疹病毒可用于神经环路标记、基因转导、溶瘤治疗、动物感染模型建立、病毒复制与致病机理的分析、抗病毒药物筛选等方面。
背景技术
病毒跨突触示踪技术在近年来神经回路解析中得到了越来越广泛的应用。传统的神经网络示踪方法，如染料、化合物示踪剂、蛋白肽类等，能沿轴突转运但因不能跨突触，只能标记局部神经元形态。相对嗜神经病毒作为示踪工具有明显优势：1)高效感染神经细胞；2)能跨突触传播；3)跨突触方向可控，可特异逆向或顺向传播；4)病毒跨突触后能自我复制，信号不衰减；5)可携带复杂调控元件和多样标示物等。
目前常用的嗜神经病毒主要有来源于α疱疹病毒科的伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)和单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)以及棒状病毒科的狂犬病毒(Rabies virus,RV)，其它还有水泡性口炎病毒(vesicμLar stomatitis virus,VSV)等，其中PRV Bartha株和RV是逆向跨突触感染，VSV两个方向都可以传播，相对能特异顺行跨突触传播的是HSV-1H129株，和神经冲动传递的方向一致，非常适于标记输出神经网络。
单纯疱疹病毒1型(HSV 1)是一种普遍分布、条件致病的病原体，是大的具囊膜的病毒，直径约200nm，核心为双链DNA基因组，约153kb，由共价连接的长片段(UL)和短片段(US)组成，每一片段末端均含反转重复序列，因此可以形成4种同分异构体。
HSV野生型病毒毒性较大，中枢感染小鼠一般1周内会全部死亡。HSV最主要的神经毒力因子基因已被鉴定为γ34.5基因，编码参与病毒复制调控、组装、细胞自噬等重要过程的多功能ICP34.5蛋白。γ34.5基因在HSV基因组中有两个拷贝，分别位于UL长片段的末端重复序列TRL和IRL中，基因全长1007bp，编码具有多功能的ICP34.5蛋白(编码框如SEQ IDNO.1所示)：机体细胞被病原体或病毒感染后很快会激活固有免疫应答，包括诱导干扰素及其它重要抗病毒蛋白的产生。病毒感染使真核细胞翻译起始因子eIF2α磷酸化，会导致细胞蛋白合成终止，从而起到阻抑病毒复制的效果。而HSV为复制自身进化出多样策略逃避宿主防御机制，ICP34.5通过与宿主蛋白磷酸酶1(PP1)结合形成复合物，调控介导eIF2α的去磷酸化，从而保持宿主细胞蛋白的合成代谢，服务于病毒复制过程。ICP34.5另外还具有拮抗干扰素诱导产生抗病毒蛋白、拮抗宿主细胞自噬清除病毒等功能。
如上所述，HSV病毒自身性质，目前HSV工具病毒普遍存在毒性大、携带外源基因表达丰度低的缺陷。脑图谱绘制技术中顺行跨突触示踪研究应用最多的是HSV-1H129株，不过目前HSV工具病毒普遍存在毒性大、灵敏度低的缺陷，H129是从一个脑炎死亡患者脑部分离的毒株，野生株具有很大的毒性，感染的细胞一般两天内很快凋亡；小鼠经脑感染H129后一般只能存活3-5天，无法开展长时程神经环路结构示踪，更谈不上用于功能环路解析。因此，HSV H129病毒的自身毒性是目前其作为神经系统示踪工具面临的最大问题之一。
本发明人前期研究结果证实ICP34.5对HSV病毒自身的复制和组装等都具有重要的调控功能，把双拷贝ICP34.5基因完全敲除后，病毒的毒力显著降低。但是γ34.5双拷贝基因敲除后HSVΔγ34.5感染小鼠脑部神经元后为复制缺陷型，跨突触传播能力缺失，不再适于输出环路的跨突触、特别是跨多级突触示踪。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种低毒单纯疱疹病毒跨多级突触示踪系统，所述的低毒HSV通过将HSV-1H129基因组中两个拷贝的神经毒力因子γ34.5基因完全敲除，将完整的荧光基因表达盒插入敲除的γ34.5基因座位；然后将和蛋白降解序列PEST嵌合构建的表达可控的γ34.5重组基因回补进原来基因位点，实现ICP34.5蛋白的自降解可控微量表达，从而获得复制变慢、毒性降低的重组HSV病毒。
双拷贝ICP34.5基因完全敲除后(HSVΔγ34.5)，病毒的毒力显著降低，但是HSVΔγ34.5感染小鼠脑部神经元后为复制缺陷型，跨突触传播能力缺失，不再适于输出环路的跨突触示踪。因此设计回补表达可控的γ34.5基因到原先基因组座位，通过引入真核细胞降解序列PEST使表达的ICP34.5蛋白自降解，从而保持ICP34.5始终处于一个低表达水平，限制病毒的复制速率、而又保证病毒的毒性显著降低，实现构建减毒的顺行HSV示踪新系统。
本发明还有一个目的在于提供了低毒单纯疱疹病毒示踪系统的应用，所述的应用包括：神经环路标记示踪、大容量基因转导载体、神经系统靶向基因治疗、病毒复制与致病机理分析、动物感染模型建立、抗病毒药物筛选、溶瘤治疗等。
减弱毒性的单纯疱疹病毒顺行跨突触病毒示踪系统，通过下述系列构建方法得到：将HSV-1H129基因组中神经毒力因子γ34.5两个拷贝基因完全敲除，将完整的荧光基因表达盒插入敲除的γ34.5基因座位中，所述的荧光基因表达盒包括hUbC启动子、荧光基因和WPRE片段；然后构建表达可控的γ34.5自降解嵌合基因，敲除γ34.5基因编码框中和自噬相关的功能域以及终止密码子获得γ34.5d20；接着将γ34.5d20通过TEVsite(来源于烟草花叶病毒的7氨基酸剪切序列，可特异的被TEV蛋白酶识别并切割融合蛋白)和真核细胞蛋白降解序列PEST嵌合串联，获得重组嵌合基因γ34.5d20-TEVsite-PEST；最后将新的γ34.5d20-TEVsite-PEST嵌合基因回补进HSV重组病毒的γ34.5原来基因位点，实现ICP34.5蛋白的微量可控表达，从而获得复制变慢、毒性降低的重组HSV病毒。
具体地，本发明病毒重组过程中，为便于HSV病毒重组挑斑，首先构建表达红色荧光蛋白的重组HSV H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE，并挑斑纯化；第二步构建绿色荧光蛋白基因通过IRES序列和γ34.5重组嵌合基因(γ34.5d20-TEVsite-PEST)相连的长编码框(EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST)；通过同源重组方法，长编码框(EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST)替换掉上一步的红色荧光蛋白基因表达框(hUbC-tdTomato-WPRE)，这样在红色荧光细胞背景中挑斑绿色荧光的病毒斑，通过5轮挑斑获得纯化的携带表达可控γ34.5嵌合基因和绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒。
本发明一个方面提供了一种跨突触的重组1型单纯疱疹病毒，所述1型单纯疱疹病毒为H129株基因组中神经毒力因子编码基因γ34.5两个拷贝基因被完全敲除；然后将表达可控的γ34.5自降解重组基因回补进γ34.5原来基因位点得到；
所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中包含敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST；
进一步地，敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，降解序列PEST的序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST之间以柔性链连接，优选地，柔性链选自如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，在柔性链和降解序列PEST之间还包括烟草花叶病毒特异的剪切位点TEV site，其序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，表达可控的γ34.5自降解重组基因编码框的3’端还有γ34.5基因3’端非编码序列，其序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因(γ34.5d20-6GGGGS-TEVsite-PEST-3’UTR)的序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，为了便于重组时的筛选，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还包含编码报告蛋白的基因。
进一步地，所述报告蛋白选自荧光蛋白、发光蛋白等。
进一步地，所述荧光蛋白选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。发光蛋白如荧光素酶。
进一步地，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还进一步包含内部核糖体进入位点。
进一步地，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因串联荧光蛋白报告基因的序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，完整的含回补γ34.5自降解嵌合基因在内的外源基因表达盒(EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST)插入敲除的γ34.5基因座位，并且转录方向保持一致，这样可以利用γ34.5上游原有的启动子序列，不用额外引入新的启动子，这样可减少插入的外源基因长度及对病毒的潜在影响。
本发明另一个方面提供了上述重组1型单纯疱疹病毒在制备神经环路顺行跨多级突触标记示踪试剂中的用途。
本发明另一个方面提供了上述重组1型单纯疱疹病毒在制备大容量基因转导载体中的用途。
本发明另一个方面提供了上述重组1型单纯疱疹病毒在制备神经系统靶向基因治疗的药物载体中的用途。
本发明另一个方面提供了上述重组1型单纯疱疹病毒在制备病毒复制与致病机理分析的试剂中的用途。
本发明另一个方面提供了上述重组1型单纯疱疹病毒在制备动物感染模型建立的试剂中的用途。
本发明另一个方面提供了上述重组1型单纯疱疹病毒在制备抗病毒药物筛选的试剂中的用途。
本发明另一个方面提供了上述重组1型单纯疱疹病毒在制备作为溶瘤治疗的溶瘤病毒药物中的用途。
本发明再一个方面提供了一种神经环路顺行跨多级突触标记示踪的方法，所述方法包括将上述重组1型单纯疱疹病毒注射到目标区域。
进一步地，所述目标区域选自受试者脑区。所述受试者选自各种实验动物，例如大鼠、小鼠、兔、树鼩、豚鼠、非人灵长类动物猴等的任意目标脑区。
本发明另一个方面提供了上述跨突触的重组1型单纯疱疹病毒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1)制备敲除神经毒力因子编码基因γ34.5的两个拷贝基因的1型单纯疱疹病毒；
S2)制备用于重组γ34.5基因回补HSV基因的外源基因表达盒的靶向载体；
S3)步骤S2)获得的靶向载体以及步骤S1)制备获得的敲除神经毒力因子编码基因γ34.5两个拷贝基因的1型单纯疱疹病毒同转染细胞后进行重组，通过挑斑纯化后获得上述跨突触的重组1型单纯疱疹病毒；
其中，步骤S2)中，靶向载体中外源基因表达盒中包含表达可控的γ34.5自降解重组基因，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中包含敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST；
进一步地，敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，降解序列PEST的序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST之间以柔性链连接，优选地，柔性链选自如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，在柔性链和降解序列PEST之间还包括烟草花叶病毒特异的剪切位点TEV site，其序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，表达可控的γ34.5基因的3’端还有γ34.5基因3’端非编码序列，其序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因的序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，为了便于重组时的筛选，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还包含编码报告蛋白的基因。
进一步地，所述报告蛋白选自荧光蛋白、发光蛋白。
进一步地，所述荧光蛋白选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP。发光蛋白如荧光素酶。
进一步地，所述外源基因表达盒中还包含内部核糖体进入位点。
进一步地，所述完整的含回补γ34.5自降解嵌合基因在内的外源基因表达盒(EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST)序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明再一个方面提供了一种跨突触的神经示踪试剂，所述试剂中包含跨突触的重组1型单纯疱疹病毒。
如上所述，设计回补表达可控的γ34.5自降解嵌合基因到原先基因组座位，通过引入真核细胞降解序列PEST使表达的ICP34.5蛋白自降解，从而保持ICP34.5始终处于一个低表达水平，限制病毒的复制速率、而又保证病毒的毒性显著降低，实现构建减毒的顺行HSV示踪新系统。
有益效果
本发明公开了单纯疱疹病毒1型(HSV-1)H129临床毒株衍生的重组低毒、复制可控的单纯疱疹病毒系统及其构建方法和应用。利用本发明的靶向载体构建的重组病毒，是显著减毒的H129重组病毒，外源基因表达丰度非常高，不论是在体外或是动物活体测试中新型减毒单纯疱疹病毒都展现出低毒性、长时程高表达的特性，中枢感染动物不会致病，存活时间长。本发明提供的低毒单纯疱疹病毒非常适于做目的基因长效高表达的基因转导载体，神经环路长时程、顺行跨多级突触结构示踪，因其低毒性也适用于功能神经环路解析；另外低毒HSV在神经系统靶向基因治疗、病毒复制与致病机理分析、动物感染模型建立、抗病毒药物筛选、溶瘤治疗等方面具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为HSVγ34.5双拷贝基因敲除的H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE病毒重组及纯化；
图2为H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE基因组分子鉴定图；
图3为γ34.5d20-6GGGGS-TEVsite-PEST-3’UTR可控表达编码框设计示意图；
图4为减毒型H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST-3’UTR重组病毒的基因组结构示意图；
图5为减毒型H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST病毒的重组及纯化图；
图6为减毒型H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST病毒在体跨多级突触示踪验证结果图。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明本发明公开了单纯疱疹病毒1型(HSV-1)H129临床毒株衍生的重组低毒单纯疱疹病毒系统及其构建方法和应用。具体是通过下述方法得到：
(1)同源臂克隆构建
敲除双拷贝γ34.5基因，以HSV-1H129基因组序列为模板，设计引物克隆γ34.5基因上游同源臂(UHA，长527bp，GC含量80％)，下游同源臂(DHA，长547bp，GC含量66％)；克隆的上下游同源臂片段分别通过Hind III及BamH I、BamH I和XbaI酶切后连入pcDNA3.1+载体，命名为pH129Δγ34.5，该载体在克隆的上下游同源臂中间引入一个多克隆位点接头，引入的6种内切酶分别是-AgeI-ClaI-HpaI-BamHI-EcoRI-SwaI-PacI-SbfI-，便于后续克隆外源基因或表达控制元件插入靶向载体。
(2)外源基因表达盒质粒构建
以FUGW质粒为模板，分别克隆hUbC启动子、WPRE片段，经酶切连入pcDNA3.1(+)载体获得pcDNA3.1-hUbC-WPRE载体；克隆红色荧光基因(tdTomato)，通过KpnI、XbaI酶切位点连到pcDNA3.1-hUbC-WPRE载体的hUbC和WPRE中间，获得外源基因表达盒质粒。
(3)携载荧光基因表达盒的重组靶向载体构建
设计引物从荧光基因表达盒质粒上PCR克隆获得hUbC-tdTomato-WPRE-PA或hUbC-EGFP-WPRE-PA整个表达盒DNA，经EcoR I和Sbf I双酶切后连入pH129Δγ34.5，构建得到重组靶向载体pH129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE-PA。
(4)表达弱化可控的γ34.5自降解嵌合基因回补HSV基因组
HSV病毒基因组双拷贝ICP34.5基因完全敲除后，病毒的毒力显著降低，但是HSVΔγ34.5感染小鼠脑部神经元后为复制缺陷型，跨突触传播能力缺失，不再适于输出环路的跨突触示踪。因此设计回补表达可控的γ34.5基因到原先基因组座位，通过引入真核细胞降解序列PEST使表达的ICP34.5蛋白自降解，从而保持ICP34.5始终处于一个低表达水平，限制病毒的复制速率、而又保证病毒的毒性显著降低，实现构建减毒的顺行HSV示踪新系统。
具体构建过程如下：首先将γ34.5基因中参与细胞自噬过程的功能域敲除(γ34.5d20，序列如SEQ ID NO.2所示)，然后在γ34.5d20基因后通过柔性链(6GGGGS，序列如SEQ ID NO.3所示)连接引入真核细胞专一的高效降解序列PEST(序列如SEQ ID NO.4所示)；为可控地将降解PEST基因序列敲除，设计在柔性链和PEST间引入烟草花叶病毒特异的剪切位点TEV site(序列如SEQ ID NO.5所示)，同时为稳定基因表达设计在3’端插入γ34.5基因3’端非编码序列(γ34.5-3’UTR，序列如SEQ ID NO.6所示)，这样整体的回补的表达可控弱化的γ34.5基因为γ34.5d20-6GGGGS-TEVsite-PEST-3’UTR，完整序列如SEQ IDNO.7所示。
本发明病毒重组过程中，为便于HSV病毒重组挑斑，首先构建表达红色荧光蛋白的重组HSV H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE，并挑斑纯化；第二步构建绿色荧光蛋白基因通过IRES序列和γ34.5重组嵌合基因(γ34.5d20-TEVsite-PEST)相连的长编码框(EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST，序列如SEQ ID NO.8所示)；通过同源重组方法，长编码框(EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST)替换掉上一步的红色荧光蛋白基因表达框(hUbC-tdTomato-WPRE)，这样在红色荧光细胞背景中挑斑绿色荧光的病毒斑，通过5轮挑斑获得纯化的携带表达可控γ34.5嵌合基因和绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒。
减毒单纯疱疹病毒示踪系统的应用，所述的应用包括：神经环路顺行跨多级突触标记示踪、大容量基因转导载体、神经系统靶向基因治疗、病毒复制与致病机理分析、动物感染模型建立、抗病毒药物筛选、溶瘤治疗等。
实施例1：分子构建过程包括：
(1)同源臂克隆
在NCBI GenBank数据库中查询HSV-1H129全基因组序列(GenBank:GU734772.1)，分析神经毒力基因γ34.5及其侧翼DNA序列。γ34.5基因在HSV基因组中有两个拷贝，分别位于ΜL长片段的末端重复序列TRL和IRL中，基因全长1007bp，编码框ORF长747bp,序列为SEQ ID NO.1所示，GC含量高达80％；双拷贝γ34.5基因转录方向相反，见图1中箭头标示；本发明设计敲除γ34.5全长基因(1007bp)，抽提纯化HSV-1H129病毒基因组DNA，以其为模板，设计引物克隆γ34.5基因上游同源臂(UHA，长527bp，GC含量80％)，所用引物序列为UHA-F：5'CCCAAGCTTAGCCCGGGCCCCCCGCGGGC 3'(SEQ ID NO.9)；UHA-R：5'CGGGATCCGTTAACCCATCGATGGACCGGTGGAGACAGAGAGCGTGCCGG 3'(SEQ ID NO.10)；下游同源臂(DHA，长547bp，GC含量66％)，PCR所用引物序列为DHA-F：5'CCGGAATTCATTTAAATCCTTAATTAAGGCCTGCAGGAACTTGCAAGAGGCCTTGTTC 3'(SEQ ID NO.11)；DHA-R：5'GCTCTAGAACCCCACGCCTTTCCCCTCC 3'(SEQ ID NO.12)。
PCR反应体系为50μL，其中模板DNA一般用50-100ng，5×PrimeStar HS buffer 10μL，20μM/μL引物1、引物2各0.7μL，dNTPs 5μL，Prime star HS高保真酶0.6μL，补灭菌水到50μL。PCR扩增条件为：98℃5min，(98℃30s，60℃30s，72℃1min/kb)循环32次，72℃延伸10min，16℃30min。克隆的上下游同源臂片段分别通过Hind III及BamH I、BamH I和XbaI酶切后连入pcDNA3.1+载体，命名为pH129Δγ34.5。
(2)外源基因表达盒质粒构建
以FUGW质粒为模板，分别克隆hUbC启动子、WPRE片段；将克隆带有NheI、KpnI酶切位点的泛素启动子片段和带有XbaI、ApaI酶切位点的转录增强元件WPRE，经酶切连入pcDNA3.1(+)载体获得pcDNA3.1-hUbC-WPRE载体；克隆红色荧光基因(tdTomato)片段，通过KpnI、XbaI酶切位点连到pcDNA3.1-hUbC-WPRE载体的hUbC和WPRE中间，获得外源基因表达盒质粒，经酶切、测序证明构建正确。该构建中设计使用的引物及序列见下表。
(3)携载荧光基因表达盒重组靶向载体构建
设计引物从荧光基因表达盒质粒上PCR克隆获得hUbC-tdTomato-WPRE-PA整个表达框，所用引物为UT/GWPA-F：5'AGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTC 3'(SEQ IDNO.21)和UT/GWPA-R：5'CTCTTGCAAGTTCCTGCAGGCCATAGAGCCCACCGCATCC 3'(SEQ IDNO.22)。切胶回收纯化荧光基因表达框大片段经EcoR I和Sbf I双酶切后连入前期构建好的敲除γ34.5全长基因的靶向载体pH129Δγ34.5，经酶切、测序证明荷载荧光基因的靶向载体构建成功，得到重组靶向载体pH129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE-PA。
(4)表达弱化可控的γ34.5自降解嵌合基因回补HSV基因组
HSV病毒基因组双拷贝ICP34.5基因完全敲除后，病毒的毒力显著降低，但是HSVΔγ34.5感染小鼠脑部神经元后为复制缺陷型，跨突触传播能力缺失，不再适于输出环路的跨突触示踪。因此设计回补表达可控的γ34.5基因到原先基因组座位，通过引入真核细胞降解序列PEST使表达的ICP34.5蛋白自降解，从而保持ICP34.5始终处于一个低表达水平，限制病毒的复制速率、而又保证病毒的毒性显著降低，实现构建减毒的顺行HSV示踪新系统。
具体构建过程如下：首先将γ34.5基因中参与细胞自噬过程的功能域敲除(γ34.5d20，序列如SEQ ID NO.2所示)，然后在γ34.5d20基因后通过柔性链(6GGGGS，序列如SEQ ID NO.3所示)连接引入真核细胞专一的高效降解序列PEST(序列如SEQ ID NO.4所示)；为可控地将降解PEST基因序列敲除，设计在柔性链和PEST间引入烟草花叶病毒特异的剪切位点TEV site(来源于烟草花叶病毒的7氨基酸剪切序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly，可特异的被TEV蛋白酶识别并切割融合蛋白(Gln-Gly间为切割位点)，序列如SEQ IDNO.5所示)，同时为稳定基因表达设计在3’端插入γ34.5基因3’端非编码序列(γ34.5-3’UTR，序列如SEQ ID NO.6所示)，这样整体的回补的表达可控弱化的γ34.5基因为γ34.5d20-6GGGGS-TEVsite-PEST-3’UTR，完整序列如SEQ ID NO.7所示。
为了实现示踪和筛选的目的，回补基因组中还包含了荧光蛋白和内部核糖体进入位点。本发明中，为便于HSV病毒重组挑斑，首先构建表达红色荧光蛋白的重组HSV H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE，并挑斑纯化；第二步构建绿色荧光蛋白基因通过IRES序列和γ34.5重组嵌合基因(γ34.5d20-TEVsite-PEST)相连的长编码框(EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST，序列如SEQ ID NO.8所示)；通过同源重组方法，长编码框(EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST)替换掉上一步的红色荧光蛋白基因表达框(hUbC-tdTomato-WPRE)，这样在红色荧光细胞背景中挑斑绿色荧光的病毒斑，通过5轮挑斑获得纯化的携带表达可控γ34.5嵌合基因和绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒。加入荧光蛋白后的基因为EGFP-IRES-34.5d20-6GGGGS-TEVsite-PEST-3’UTR，序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例2：低毒单纯疱疹病毒重组、挑斑纯化及扩增制备
①病毒的重组：抽提靶向载体pH129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE，采用脂质体转染的方法转染293T细胞，6小时后更换含2％FBS的维持培养基并加入单纯疱疹病毒H129株进行感染；在不同时间观察荧光的表达和细胞病变情况，待细胞全部病变后收集细胞培养基上清置于-80℃冰箱。
②病毒的纯化：将收集的病毒上清经三次反复冻融、6500g离心10分钟去净细胞碎片，吸取10μL病毒上清感染Vero细胞，1天后观察感染细胞有无荧光表达来确定新型病毒是否重组成功；后期取重组成功的病毒上清连续10倍梯度稀释后感染Vero细胞，吸附1小时后铺琼脂(含5％胎牛血清的DMEM培养基和2％琼脂1：1混合)。48-72hr后待病毒斑形成后，在倒置荧光显微镜下进行挑斑；新型重组病毒经过6轮左右的挑斑纯化将野生型病毒去除，获得纯化的新型重组病毒H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE。低毒单纯疱疹病毒重组、挑斑纯化及感染细胞荧光表达情况见图1，可见低毒HSVLT感染的细胞荧光表达很亮。
实施例3：减毒单纯疱疹病毒基因组分子鉴定
取浓缩纯化的野生型H129以及低毒HSV(H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE)病毒在100℃灭活10分钟，后续用于γ34.5基因的分子鉴定。选择γ34.5 747bp ORF片段设计引物，鉴定所用引物及序列为γ34.5-F：5'ATGGCCCGCCGCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGG 3'(SEQ ID NO.23)；γ34.5-R：5'TTAGACCGAGTTCGCCGGGCCGGCTCCGCGGGCCAGGGCCCGGGC 3'(SEQ ID NO.24)。由于γ34.5基因GC含量高达82％，选用高GC buffer体系扩增γ34.5ORF：PCR反应体系为50μL，其中灭活HSV病毒样用量为1-5μL，2×PrimeStar high-GCbuffer 25μL，20μM/μL引物1、引物2各0.7μL，dNTPs 5μL，Prime star HS高保真酶0.6μL，补灭菌水到50μL。PCR扩增条件为：98℃5min，(98℃30s，60℃30s，72℃1min)循环32次，72℃延伸10min，16℃30min。分子鉴定结果如图3所示，阴性对照无条带；浓缩的野生型H129病毒经PCR扩增出一条长700bp左右的目的条带；而低毒HSV(H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE)多次重复实验无论选用1μL、3μL、5μL浓缩病毒进行PCR均未扩增出700bp左右的目的条带，结果说明低毒H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE基因组中双拷贝γ34.5基因已被完全敲除。
但是基于发明人前期的研究结果，双拷贝γ34.5基因敲除后的减毒单纯疱疹病毒为复制缺陷型，跨突触传播能力缺失，不能用于输出环路的跨突触示踪。
实施例4：γ34.5自降解嵌合基因回补的减毒单纯疱疹病毒重组、挑斑纯化
①病毒的重组：抽提靶向载体pH129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST-3’UTR质粒，采用脂质体转染的方法转染293T细胞，6小时后更换含2％FBS的维持培养基并加入单纯疱疹病毒H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE病毒进行感染；在不同时间观察荧光的表达和细胞病变情况，待细胞全部病变后收集细胞培养基上清置于-80℃冰箱。
②病毒的纯化：将收集的病毒上清经三次反复冻融、6500g离心10分钟去净细胞碎片，吸取10μL病毒上清感染Vero细胞，1天后观察感染细胞红色荧光背景中有无绿色荧光表达来确定新型病毒是否重组成功；后期取重组成功的病毒上清连续10倍梯度稀释后感染Vero细胞，吸附1小时后铺琼脂(含5％胎牛血清的DMEM培养基和2％琼脂1：1混合)。48-72hr后待病毒斑形成后，在倒置荧光显微镜下进行挑斑；新型重组病毒经过5轮挑斑纯化将母本病毒去除，获得纯化的新型重组病毒H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST-3’UTR。
实施例5：新型减毒、复制型HSV重组病毒的扩增制备
纯化后的H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST-3’UTR重组溶瘤病毒通过感染生长在10cm平皿上的Vero细胞进行批量生产及纯化。将重组病毒按照MOI＝0.01感染Vero细胞，待细胞出现明显的变圆病变之后(大约3天)，将含重组病毒的上清液收集到50mL离心管中，通过离心去除细胞碎片(6400rpm，10分钟)，上清液使用0.22μm的滤膜过滤，最后使用贝克曼高速离心机进行浓缩(30000rpm，3小时)；将浓缩后的重组病毒沉淀使用少量PBS(pH＝7.4)重悬，在4℃条件下过夜，并不断摇动；第2天混匀病毒液，接着将重悬的重组病毒溶液加到20％的蔗糖溶液上层进行超速离心(30000rpm，3小时)、浓缩纯化；最后将溶解后的病毒进行分装，冻存在-80℃冰箱中。使用Vero细胞进行标准噬斑实验来测定浓缩后HSV重组病毒的滴度，滴度以每毫升的噬斑形成单位(PFU/mL)表示。浓缩后的重组病毒H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST-3’UTR滴度经测定约为2×109PFU/mL。
实施例6：减毒、复制型单纯疱疹病毒有效示踪运动皮层(M1)输出神经网络
将制备的表达绿色荧光的低毒、复制型HSV工具病毒H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST-3’UTR进行动物活体测试。精确量取200nl制备的H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST-3’UTR(病毒滴度是2×109PFU/mL)，立体定位注射C57BL/6小鼠初级运动皮层(M1)脑区。每天观测小鼠未表现感染症状，待感染14天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛灌流；取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，接着置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；切片前将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1小时后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。
野生型H129感染小鼠第二天就出现感染症状，一般5天内死亡；而减毒、复制型单纯疱疹病毒感染小鼠无明显感染症状、一直状态良好，待14天后灌流小鼠切片、玻片扫描仪成像。结果如图6所示，减毒、复制型HSV H129工具病毒标记效果良好，在皮层注射位点、对侧M1脑区和下游输出的多个脑区(同侧丘脑VPM、对侧丘脑VPM脑区等)均观察到绿色荧光标记的神经元，而且标记的神经元胞体和纤维清晰可见。上述实验结果与前期采用H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE病毒的实验结果不同，我们前期研究发现γ34.5双拷贝基因完全敲除的减毒株(H129Δγ34.5-hUbC-tdTomato-WPRE)感染小鼠脑区神经元为复制缺陷型，不会跨突触传播，仅通过轴突末梢吸收感染并逆标上游脑区，而下游输出脑区未见荧光标记。本发明中减毒、复制可控的H129Δγ34.5-EGFP-IRES-γ34.5d20-TEVsite-PEST-3’UTR标记到不同的脑区，而且M1投射的下游脑区被有效荧光标记，所以本发明构建的重组HSV病毒为复制可控、减毒型病毒，适用于长时程、顺行跨多级突触的神经环路示踪；同时可作为目的基因长效高表达的基因转导载体，在神经系统靶向基因治疗、溶瘤病毒载体、病毒复制与致病机理分析、动物感染模型建立等方面具有广泛的应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种减毒、复制可控的顺向HSV示踪系统及其构建方法和应用
<130> CP121011354C
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcccgcc gccgccgcca tcgcggcccc cgccgccccc ggccgcccgg gcccacgggc 60
gccgtcccaa ccgcacagtc ccaggtaacc tccacgccca actcggaacc cgcggtcagg 120
agcgcgcccg cggccgcccc gccgccgccc cccgccggtg ggcccccgcc ttcttgttcg 180
ctgctgctgc gccagtggct ccacgttccc gagtccgcgt ccgacgacga cgatgacgac 240
gactggccgg acagcccccc gcccgagccg gcgccagagg cccggcccac cgccgccgcc 300
ccccggcccc ggcccccacc gcccggcgtg ggcccggggg gcggggctga cccctcccac 360
cccccctcgc gccccttccg ccttccgccg cgcctcgccc tccgcctgcg cgtcaccgcg 420
gagcacctgg cgcgcctgcg cctgcgacgc gcgggcgggg agggggcgcc ggagcccccc 480
gcgacccccg cgacccccgc gacccccgcg acccccgcga cccccgcgcg ggtgcgcttc 540
tcgccccacg tccgggtgcg ccacctggtg gtctgggcct cggccgcccg cctggcgcgc 600
cgcggctcgt gggcccgcga gcgggccgac cgggctcggt tccggcgccg ggtggcggag 660
gccgaggcgg tcatcgggcc gtgcctgggg cccgaggccc gtgcccgggc cctggcccgc 720
ggagccggcc cggcgaactc ggtctaa 747
<210> 2
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggcccgcc gccgccgccg ccatcgcggc ccccgccgcc cccggccgcc cgggcccacg 60
ggcgcggtcc caaccgcaca gtcccaggta acctccacgc ccaactcgga acccgtggtc 120
aggagcgcgc ccgcggccgc cccgccgccg ccccccgccg gtgggccccc gccttcttgt 180
tcgctgctgc tgcgccagtg gctccccgag ccggcgccag acgcccggcc caccgccgcc 240
gccccccgcc cccggtcccc accgcccggc gcgggcccgg ggggcggggc taacccctcc 300
caccccccct cacgcccctt ccgccttccg ccgcgcctcg ccctccgcct gcgcgtcacc 360
gcagagcacc tggcgcgcct gcgacgcgcg ggcggggagg gggcgccgga gccccccgcg 420
acccccgcga cccccgcgac ccccgcgcgg gtgcgcttct cgccccacgt ccgggtgcgc 480
cacctggtgg tctgggcctc ggccgcccgc ctggcgcgcc gcggctcgtg ggcccgcgag 540
cgggccgacc gggctcggtt ccggcgccgg gtggcggagg ccgaggcggt catcgggccg 600
tgcctggggc ccgaggcccg tgcccgggcc ctggcccgcg gagccggccc ggcgaactcg 660
gtc 663
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 4
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggatccggta gccatggctt cccgccggag gtggaggagc aggatgatgg cacgctgccc 60
atgtcttgtg cccaggagag cgggatggac cgtcaccctg cagcctgtgc ttctgctagg 120
atcaatgtgt aa 132
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagaacctct acttccaatc g 21
<210> 6
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgttacaccc gaggcggcct gggtcttccg cggagctccc gggagctccg caccaagccg 60
ctctccggag agacgatggc aggagccgcg catatatacg ctgggagccg gcccgccccc 120
aaggcgggcc cgccctcgga gggcgggact ggccaatcgg cggccgccag cgcggcgggg 180
cccggccaac cagcgtttgc cgagtcttcg gggcccggcc cactgggcgg taactcccgc 240
ccagtgggcc gggccgccca cttcccggta tggtaattaa acctgcagg 289
<210> 7
<211> 1168
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggccacaa ccatggcccg ccgccgccgc cgccatcgcg gcccccgccg cccccggccg 60
cccgggccca cgggcgcggt cccaaccgca cagtcccagg taacctccac gcccaactcg 120
gaacccgtgg tcaggagcgc gcccgcggcc gccccgccgc cgccccccgc cggtgggccc 180
ccgccttctt gttcgctgct gctgcgccag tggctccccg agccggcgcc agacgcccgg 240
cccaccgccg ccgccccccg cccccggtcc ccaccgcccg gcgcgggccc ggggggcggg 300
gctaacccct cccacccccc ctcacgcccc ttccgccttc cgccgcgcct cgccctccgc 360
ctgcgcgtca ccgcagagca cctggcgcgc ctgcgacgcg cgggcgggga gggggcgccg 420
gagccccccg cgacccccgc gacccccgcg acccccgcgc gggtgcgctt ctcgccccac 480
gtccgggtgc gccacctggt ggtctgggcc tcggccgccc gcctggcgcg ccgcggctcg 540
tgggcccgcg agcgggccga ccgggctcgg ttccggcgcc gggtggcgga ggccgaggcg 600
gtcatcgggc cgtgcctggg gcccgaggcc cgtgcccggg ccctggcccg cggagccggc 660
ccggcgaact cggtcggtgg cggtggctcg ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct 720
gaattcgaga acctctactt ccaatcggga tccggtagcc atggcttccc gccggaggtg 780
gaggagcagg atgatggcac gctgcccatg tcttgtgccc aggagagcgg gatggaccgt 840
caccctgcag cctgtgcttc tgctaggatc aatgtgtaac gttacacccg aggcggcctg 900
ggtcttccgc ggagctcccg ggagctccgc accaagccgc tctccggaga gacgatggca 960
ggagccgcgc atatatacgc tgggagccgg cccgccccca aggcgggccc gccctcggag 1020
ggcgggactg gccaatcggc ggccgccagc gcggcggggc ccggccaacc agcgtttgcc 1080
gagtcttcgg ggcccggccc actgggcggt aactcccgcc cagtgggccg ggccgcccac 1140
ttcccggtat ggtaattaaa cctgcagg 1168
<210> 8
<211> 2446
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
atcgatacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt 780
tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct 840
tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga 900
atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga 960
ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac 1020
gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag 1080
ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc 1140
agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg 1200
tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt 1260
gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc atggcccgcc gccgccgccg ccatcgcggc 1320
ccccgccgcc cccggccgcc cgggcccacg ggcgcggtcc caaccgcaca gtcccaggta 1380
acctccacgc ccaactcgga acccgtggtc aggagcgcgc ccgcggccgc cccgccgccg 1440
ccccccgccg gtgggccccc gccttcttgt tcgctgctgc tgcgccagtg gctccccgag 1500
ccggcgccag acgcccggcc caccgccgcc gccccccgcc cccggtcccc accgcccggc 1560
gcgggcccgg ggggcggggc taacccctcc caccccccct cacgcccctt ccgccttccg 1620
ccgcgcctcg ccctccgcct gcgcgtcacc gcagagcacc tggcgcgcct gcgacgcgcg 1680
ggcggggagg gggcgccgga gccccccgcg acccccgcga cccccgcgac ccccgcgcgg 1740
gtgcgcttct cgccccacgt ccgggtgcgc cacctggtgg tctgggcctc ggccgcccgc 1800
ctggcgcgcc gcggctcgtg ggcccgcgag cgggccgacc gggctcggtt ccggcgccgg 1860
gtggcggagg ccgaggcggt catcgggccg tgcctggggc ccgaggcccg tgcccgggcc 1920
ctggcccgcg gagccggccc ggcgaactcg gtcggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 1980
tcgggtggcg gcggatctga attcgagaac ctctacttcc aatcgggatc cggtagccat 2040
ggcttcccgc cggaggtgga ggagcaggat gatggcacgc tgcccatgtc ttgtgcccag 2100
gagagcggga tggaccgtca ccctgcagcc tgtgcttctg ctaggatcaa tgtgtaacgt 2160
tacacccgag gcggcctggg tcttccgcgg agctcccggg agctccgcac caagccgctc 2220
tccggagaga cgatggcagg agccgcgcat atatacgctg ggagccggcc cgcccccaag 2280
gcgggcccgc cctcggaggg cgggactggc caatcggcgg ccgccagcgc ggcggggccc 2340
ggccaaccag cgtttgccga gtcttcgggg cccggcccac tgggcggtaa ctcccgccca 2400
gtgggccggg ccgcccactt cccggtatgg taattaaacc tgcagg 2446
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccaagctta gcccgggccc cccgcgggc 29
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgggatccgt taacccatcg atggaccggt ggagacagag agcgtgccgg 50
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccggaattca tttaaatcct taattaaggc ctgcaggaac ttgcaagagg ccttgttc 58
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gctctagaac cccacgcctt tcccctcc 28
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctagctagcg cgccgggttt tggcgcctcc cgcg 34
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cggggtaccg tctaacaaaa aagccaaaaa cggc 34
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgctctagaa atcaacctct ggattacaaa atttg 35
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aaagggccct gcggggaggc ggcccaaagg gagatc 36
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ataggtacca tggtgagcaa gggcgaggag g 31
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgctctagat tacttgtaca gctcgtccat gccg 34
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agtccagtgt ggtggaattc gcgccgggtt ttggcgcctc 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctcttgcaag ttcctgcagg ccatagagcc caccgcatcc 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agtccagtgt ggtggaattc gcgccgggtt ttggcgcctc 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctcttgcaag ttcctgcagg ccatagagcc caccgcatcc 40
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atggcccgcc gccgccgccg ccatcgcggc ccccgccgcc cccgg 45
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttagaccgag ttcgccgggc cggctccgcg ggccagggcc cgggc 45
Claims (10)
1.一种跨突触的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组1型单纯疱疹病毒通过H129株基因组中神经毒力因子编码基因γ34.5两个拷贝基因被完全敲除；然后将表达可控的γ34.5自降解重组基因回补进γ34.5原来基因位点得到；
所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中包含敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST；
优选地，敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，降解序列PEST的序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST之间以柔性链连接，优选地，柔性链选自如SEQ ID NO.3所示。
3.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，在柔性链和降解序列PEST之间还包括TEVsite；TEVsite来源于烟草花叶病毒的7氨基酸剪切序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly，可特异的被TEV蛋白酶识别并切割融合蛋白(Gln-Gly间为切割位点)，TEVsite序列如SEQ ID NO.5所示。
4.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，表达可控的γ34.5自降解重组基因编码框的3’端还有γ34.5基因3’端非编码序列，其序列如SEQ ID NO.6所示。
5.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因的序列如SEQ ID NO.7所示。
6.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还包含编码报告蛋白的基因；
优选地，所述报告蛋白选自荧光蛋白、发光蛋白等。
更优选地，所述荧光蛋白选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP；发光蛋白选自荧光素酶等。
7.权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒，其特征在于，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还进一步包含内部核糖体进入位点；
优选地，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因串联荧光蛋白报告基因的完整序列如SEQ ID NO.8所示。
8.权利要求1-7任一项所述的重组1型单纯疱疹病毒在制备神经环路顺行跨多级突触示踪剂、制备大容量基因转导载体、制备神经系统靶向基因治疗的药物载体、制备病毒复制与致病机理分析的试剂、制备动物感染模型建立的试剂、制备抗病毒药物筛选的试剂、制备作为溶瘤治疗的溶瘤病毒药物中的用途。
9.一种神经环路顺行跨多级突触标记示踪的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-7任一项所述的重组1型单纯疱疹病毒注射到目标区域；
优选地，所述目标区域选自受试者脑区或其他目标组织或器官；
更优选地，所述受试者选自各种实验动物。
10.权利要求1-7任一项所述的跨突触的重组1型单纯疱疹病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1)制备敲除神经毒力因子编码基因γ34.5的两个拷贝基因的1型单纯疱疹病毒；
S2)制备用于重组γ34.5基因回补HSV基因的外源基因表达盒的靶向载体；
S3)步骤S2)获得的靶向载体以及步骤S1)制备获得的敲除神经毒力因子编码基因γ34.5的两个拷贝基因的1型单纯疱疹病毒同转染细胞后进行重组，通过挑斑纯化后获得上述跨突触的重组1型单纯疱疹病毒；
其中，步骤S2)中，靶向载体中外源基因表达盒中包含表达可控的γ34.5自降解重组基因，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中包含敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST；
优选地，敲除了参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，降解序列PEST的序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，参与细胞自噬过程的功能域的γ34.5基因以及降解序列PEST之间以柔性链连接，优选地，柔性链选自如SEQ ID NO.3所示；
优选地，在柔性链和降解序列PEST之间还包括烟草花叶病毒特异的剪切位点TEVsite，其序列如SEQ ID NO.5所示；
优选地，表达可控的γ34.5基因的3’端还有γ34.5基因3’端非编码序列，其序列如SEQID NO.6所示；
优选地，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因的序列如SEQ ID NO.7所示；
优选地，为了便于重组时的筛选，所述表达可控的γ34.5自降解重组基因中还包含编码报告蛋白的基因；
优选地，所述报告蛋白选自荧光蛋白、发光蛋白；更优选地，所述荧光蛋白选自GFP、EGFP、Emerald、Citrine、Venus、mOrange、mCherry、TagBFP、mTurquoise、Cerulean、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、RFP、TagRFP、TdTomato、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、iRFP和smURFP；发光蛋白如荧光素酶等；
优选地，所述靶向载体中外源基因表达盒中还包含内部核糖体进入位点；
优选地，所述完整的含回补γ34.5自降解嵌合基因在内的外源基因表达盒序列如SEQID NO.8所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111524089.8A CN116262911A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种减毒、复制可控的顺向hsv示踪系统及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111524089.8A CN116262911A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种减毒、复制可控的顺向hsv示踪系统及其构建方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116262911A true CN116262911A (zh) | 2023-06-16 |
Family
ID=86722260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111524089.8A Pending CN116262911A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种减毒、复制可控的顺向hsv示踪系统及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116262911A (zh) |
-
2021
- 2021-12-14 CN CN202111524089.8A patent/CN116262911A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019261783C1 (en) | MND promoter chimeric antigen receptors | |
| KR20220032050A (ko) | 조작된 casx 시스템 | |
| KR20200127152A (ko) | 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도 | |
| CA3099497A1 (en) | Fusosome compositions and uses thereof | |
| AU2019380517A1 (en) | Fusosome compositions for hematopoietic stem cell delivery | |
| TW202223088A (zh) | 新型ｃｒｉｓｐｒ酶以及系統 | |
| CN108359640B (zh) | 一种标记全脑区神经网络结构的狂犬病毒、其制备和应用 | |
| Bilal et al. | Optimization of methods for the genetic modification of human T cells | |
| Wu et al. | Glycoprotein gene relocation in rabies virus | |
| CN112210565B (zh) | 一种g基因及其在高效逆向跨单突触中的应用 | |
| CA3156199A1 (en) | Type i-b crispr-associated transposase systems | |
| CN108048483B (zh) | 复制型重组腺病毒HAdV-5载体系统及其应用 | |
| CN114164184A (zh) | 一种新城疫病毒基因ⅵ型疫苗株及其应用 | |
| EP1681346A1 (en) | Recombinant virus vector originating in hhv-6 or hhv-7, method of producing the same, method of transforming host cell using the same, host cell transformed thereby and gene therapy method using the same | |
| US4687737A (en) | Mammalian suppressor genes | |
| US20230366877A1 (en) | Ebiv nucleic acid composition and application thereof | |
| CN116262911A (zh) | 一种减毒、复制可控的顺向hsv示踪系统及其构建方法和应用 | |
| CN112746059A (zh) | 基于病毒结构蛋白遗传互补的冠状病毒细胞模型 | |
| WO2023030340A1 (en) | Novel design of guide rna and uses thereof | |
| CN113444746B (zh) | 白藜芦醇调控转基因表达的控制系统及其构建和应用 | |
| CN104762322A (zh) | 一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统 | |
| WO2022006745A1 (en) | Guide rna for hsv-1 gene editing and method thereof | |
| CN108384763B (zh) | 一种传染性脾肾坏死病毒orf074基因缺失株及其制备方法和应用 | |
| KR20100121823A (ko) | 소 엔테로바이러스를 이용한 재조합 바이러스 벡터 및 그 제조방법 | |
| CN108220252B (zh) | 一种传染性脾肾坏死病毒orf022基因缺失株及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |