KR102549746B1 - 안정한 동결된 단순 포진 바이러스 제제 - Google Patents

안정한 동결된 단순 포진 바이러스 제제 Download PDF

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Abstract

하나 이상의 동결/해동 사이클 동안 및/또는 동결 온도 바로 초과로부터 주변 온도에 걸친 온도에서의 액체 상태의 장기간 저장 동안 감염력을 유지시키고 개선된 바이러스 안정성을 제공하는 생 바이러스 조성물.

Description

안정한 동결된 단순 포진 바이러스 제제{STABLE FROZEN HERPES SIMPLEX VIRUS FORMULATION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2014년 12월 18일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/093,663호의 이익을 주장한다.
생 바이러스, 예컨대 단순 포진 바이러스는 -80℃ 초과의 저장 온도에서 연장된 기간 동안 통상적으로 불안정하다. 열 안정성의 부족은 액체 제제에서 이러한 바이러스, 특히 치료학적 바이러스에 요구사항을 부여한다. 이러한 치료학적 바이러스 조성물은 저장되고 수송되고 동결되고, 치료학적으로 효과적인 감염력을 유지시키기 위해 해동 후 즉시 사용되어야 한다.
열 안정성의 부족은 제조, 저장 및 수송의 비용을 증가시키는 조작적인 요구사항을 부여한다. 제조 조작 동안, 예를 들어 동결/해동 사이클은 준최적 공정 수율 및 공급 사슬에서의 필요한 융통성의 결여를 발생시킬 수 있다. 저장 및 수송은 또한 도전적이어서, 복잡한 취급 및 복잡한 공급 사슬을 발생시킨다.
열 안정성의 부족은 또한 상업적인 요구사항을 부여한다. 안정한 반감기를 보장하도록 -80℃ 저장을 요하는 생 바이러스 조성물은 건강 관리 제공자에 대해 복잡한 저장 및 취급 프로토콜을 발생시킨다. 이러한 제한은 부정확하게 저장되는 경우 또는 전체 제품이 사용되지 않는 경우 제품 반품의 위험을 증가시킨다. 이것은 고객에 대한 비용을 증가시킬 가능성을 가진다.
본 발명은 다수의 동결/해동 사이클 동안 및 차가운 및 주변 온도에서의 장기간 저장 동안 감염력을 안정화시키고 보존하기 위해 사용될 수 있는 생 바이러스 제제를 제공한다. 이 제제는 안정성 및/또는 감염력의 소실 없이 융통성을 제공함으로써 바이러스의 제조, 수송, 저장 및 사용 동안 제한을 감소시킨다.
성장하는 암살상 면역치료 분야는 암살상 바이러스 조성물의 치료학적 사용을 증가시킨다. 하나 이상의 동결/해동 사이클 동안 및/또는 동결 온도 바로 초과로부터 주변 온도에 걸친 온도에서의 액체 상태의 장기간 저장 동안 감염력을 유지시키고 개선된 바이러스 안정성을 제공하는 생 바이러스 조성물에 대한 임의의 개선은 조작적으로 유리할 뿐만 아니라, 건강 관리 제공자 및 환자에 대해 편의성 및 융통성을 매우 증가시킨다. 본 발명은 이러한 조성물을 제공함으로써 이 수요를 충족한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 단순 포진 바이러스, 단백질, 적어도 1종의 당, 염화나트륨 및 인산나트륨(pH 7.4)을 포함하는 생 바이러스 조성물을 제공하고, 이 조성물은 동결된다.
일 실시형태에서, 이 조성물은 2℃ 내지 적어도 25℃에서 해동되고 저장될 수 있다. 관련 실시형태에서, 2℃ 내지 적어도 25℃에서 해동 후, 생 바이러스 조성물은 적어도 -30℃의 온도에서 다시 동결되고 저장된다.
또 다른 실시형태에서, 이 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 해동되고 저장될 수 있다. 관련 실시형태에서, 2℃ 내지 8℃에서 해동 후, 생 바이러스 조성물은 적어도 -30℃의 온도에서 다시 동결되고 저장된다.
또 다른 실시형태에서, 단백질은 부분적으로 가수분해된 젤라틴 또는 인간 혈청 알부민이다.
또 다른 실시형태에서, 부분적으로 가수분해된 젤라틴의 농도는 0.01% 내지 1%(w/v)이다.
또 다른 실시형태에서, 인간 혈청 알부민의 농도는 0.25% 내지 1%이다.
또 다른 실시형태에서, 적어도 1종의 당은 소르비톨, 미오-이노시톨 또는 수크로스이다. 관련 실시형태에서, 소르비톨의 농도는 2%(w/v)이다. 관련 실시형태에서, 미오-이노시톨의 농도는 4%(w/v)이다. 관련 실시형태에서, 수크로스의 농도는 9%(w/v) 내지 15%(w/v)이다.
또 다른 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 145mM이다.
또 다른 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 145mM이다.
또 다른 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 100mM이다.
또 다른 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 약 100mM이다.
또 다른 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 102mM이다.
또 다른 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 약 102mM이다.
또 다른 실시형태에서, 부분적으로 가수분해된 젤라틴은 돼지 유래(porcine)이다.
또 다른 실시형태에서, 이 바이러스는 단순 포진 바이러스 1이다.
또 다른 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 임상 단리물이다.
또 다른 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 재발성 구순포진으로부터의 임상 단리물이다.
또 다른 실시형태에서, 단순 포진 바이러스 1 균주는 균주 JS1, 균주 17+, 균주 F 및 균주 KOS로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 하나 이상의 기능성 유전자가 결여된다. 관련 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 기능성 ICP34.5-코딩 유전자가 결여된다. 관련 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 기능성 ICP47-코딩 유전자가 결여된다. 관련 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 기능성 ICP6-코딩 유전자, 기능성 당단백질 H-코딩 유전자 또는 기능성 타이미딘 키나제-코딩 유전자가 추가로 결여된다. 관련 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 기능성 vhs-코딩 유전자가 결여된다. 또 다른 관련 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 기능성 UL43-코딩 유전자가 결여된다. 관련 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 기능성 VMW-코딩 유전자, 기능성 ICPO-코딩 유전자, 기능성 ICP4-코딩 유전자, 기능성 ICP22-코딩 유전자 또는 기능성 ICP27-코딩 유전자가 결여된다. 관련 실시형태에서, 단순 포진 바이러스에 대한 변형은 Us11 유전자가 조기 유전자로서 발현되도록 이루어진다. 관련 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 하나 이상의 비상동성 유전자 및/또는 바이러스 유전자를 포함한다. 관련 실시형태에서, 비상동성 유전자 및/또는 바이러스 유전자는 세포독소, 면역조절 단백질, 종양 항원, 프로드럭 활성자, 종양 억제제, 프로드럭 전환 효소, 세포가 세포 융합하게 할 수 있는 단백질, TAP 저해제, 바이러스 단백질 Us11, 안티센스 RNA 분자 또는 리보자임을 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시형태에서, 비상동성 유전자 및/또는 바이러스 유전자는 IL-12, 과립구 대식구 집락 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor; GM-CSF), 사이토신 데아미나제, 긴팔원숭이 백혈병 융합생성 당단백질, 소 헤르페스 바이러스(bovine herpesvirus; BHV) UL49.5 폴리펩타이드 또는 바이러스 단백질 Us11을 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec), 세프레흐버(Seprehvir)(상표명) (HSV-1716), G207, OrienX010, NV1020, M032, ImmunoVEX, NSC-733972, HF-10, BV-2711, JX-594, Myb34.5, AE-618, 브레인웰(Brainwel)(상표명), 헤압웰(Heapwel)(상표명) 및 OncoVEXGALV /CD로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 환자에서 종양 세포를 사멸하기에 효과적인 조건 하에 상기 기재된 생 바이러스 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 종양 세포를 사멸하는 방법. 관련 실시형태에서, 생 바이러스 조성물은 관문 저해제와 함께 투여된다. 관련 실시형태에서, 생 바이러스 조성물은 관문 저해제 전에, 이것과 동시에 또는 이것 후에 투여된다. 관련 실시형태에서, 종양 세포는 성상세포종, 핍지교종, 뇌수막종, 신경섬유종,교모세포종, 상의세포종, 신경초종, 신경섬유육종, 수모세포종, 흑색종 세포, 췌장암 세포, 전립선 암종 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 간종양 세포, 중피종, 방광암 세포 및 표피 암종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 관련 실시형태에서, 환자는 인간이다. 관련 실시형태에서, 투여는 주사에 의해 수행된다.
또 다른 실시형태에서, 감염력은 단백질이 결여된 동일한 생 바이러스 조성물과 비교하여 증가한다.
도 1. 동결/해동 안정성에 대한 완충제 및 염 함량의 효과. 채워진 마름모, 실선: 10mM Naphos, 빈 원, 파선, 10mM Kphos, 채워진 원, 실선: 100mM Kphos; 채워진 사각형, 실선: 73mM NaCl; 빈 사각형, 파선: 0mM NaCl 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 2a. 동결/해동 안정성에 대한 당 농도의 효과. 채워진 사각형, 실선: 9% 소르비톨, 빈 사각형, 파선: 15% 소르비톨 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 2b. 동결/해동 안정성에 대한 당 농도의 효과. 채워진 사각형, 실선, 9% 소르비톨, 채워진 삼각형, 실선: 15% 수크로스, 빈 사각형, 파선: 9% 트레할로스 및 빈 삼각형, 파선: 15% 트레할로스.
도 3. 동결/해동 동안 안정성에 대한 단백질/당 조합의 효과. 채워진 사각형, 실선: 9% 수크로스, 2% 항스트렙타비딘 mAb, 빈 사각형, 파선: 9% 수크로스, 2% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 4% rHSA, 빈 원, 파선: 4% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 4a. 2 내지 8℃에서 액체 안정성에 대한 당 및 단백질 부형제의 효과. 채워진 사각형, 실선: 2% rHSA, 빈 사각형, 파선: 2% ph젤라틴; 채워진 원, 실선: 15% 트레할로스, 빈 원, 파선: 15% 수크로스, 채워진 삼각형, 실선: 9% 수크로스, 2% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 4b. 25℃에서 액체 안정성에 대한 당 및 단백질 부형제의 효과. 채워진 사각형, 실선: 2% rHSA, 빈 사각형, 파선: 2% ph젤라틴, 빈 원, 파선: 15% 수크로스, 채워진 삼각형, 실선: 9% 수크로스 및 2% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 5. 동결/해동 사이클 동안 안정성에 대한 rHSA 및 ph젤라틴 농도의 효과. 채워진 사각형, 실선: 1% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 2% rHSA, 채워진 원, 실선: 4% rHSA, 빈 사각형, 파선: 1% ph젤라틴, 빈 삼각형, 파선: 2% ph젤라틴, 빈 원, 파선: 4% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 6a. 25℃에서 액체 저장 동안 안정성에 대한 rHSA 및 ph젤라틴 농도의 효과. 채워진 사각형, 실선: 1% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 2% rHSA, 채워진 원, 실선: 4% rHSA, 빈 사각형, 파선: 1% ph젤라틴, 빈 삼각형, 파선: 2% ph젤라틴, 빈 원, 파선: 4% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 6b. 2 내지 8℃에서 액체 저장 동안 안정성에 대한 rHSA 및 ph젤라틴 농도의 효과. 채워진 사각형, 실선: 1% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 2% rHSA, 채워진 원, 실선: 4% rHSA, 빈 사각형, 파선: 1% ph젤라틴, 빈 삼각형, 파선: 2% ph젤라틴 및 빈 원, 파선: 4% ph젤라틴, 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 7a. 25℃에서 액체 안정성에 대한 rHSA의 상이한 등급 및 소소의 효과. 채워진 사각형, 실선: 2% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 2% 시그마(Sigma), 빈 삼각형, 파선: 2% 노보자임 알파(Novozyme Alpha), 빈 원, 파선: 2% 노보자임 알빅스(Novozyme Albix) 및 빈 마름모, 파선: 2% 노보자임 프라임(Novozyme Prime).
도 7b. 25℃에서 액체 안정성에 대한 rHSA의 상이한 등급 및 소소의 효과. 채워진 사각형, 실선: 2% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 2% 시그마, 빈 삼각형, 파선: 1% 노보자임 알파, 빈 원, 파선: 2% 노보자임 알파 및 빈 마름모, 파선: 4% 노보자임 알파.
도 7c. 25℃에서 액체 안정성에 대한 rHSA의 상이한 등급 및 소소의 효과. 채워진 사각형, 실선: 2% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 2% 시그마, 빈 삼각형, 파선: 1% 노보자임 알빅스, 빈 원, 파선: 2% 노보자임 알빅스 및 빈 마름모, 파선: 4% 노보자임 알빅스.
도 7d. 25℃에서 액체 안정성에 대한 rHSA의 상이한 등급 및 소소의 효과. 채워진 사각형, 실선: 2% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 2% 시그마, 빈 삼각형, 파선: 1% 노보자임 프라임, 빈 원, 파선: 2% 노보자임 프라임 및 빈 마름모, 파선: 4% 노보자임 프라임.
도 8a. 106 PFU/㎖에서 동결/해동 사이클 동안 안정성에 대한 0.25 내지 1.0% ph젤라틴의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 0.5% ph젤라틴, 채워진 삼각형, 실선: 1.0% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 8b. 108 PFU/㎖에서 동결/해동 사이클 동안 안정성에 대한 0.25 내지 1.0% ph젤라틴의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 0.5% ph젤라틴, 채워진 삼각형, 실선: 1.0% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 8c. 106 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 액체 안정성에 대한 0.25 내지 1.0% ph젤라틴의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 0.5% ph젤라틴, 채워진 삼각형, 실선: 1.0% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 8d. 108 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 액체 안정성에 대한 0.25 내지 1.0% ph젤라틴의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 0.5% ph젤라틴, 채워진 삼각형, 실선: 1.0% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 8e. 106 PFU/㎖에서 25℃에서 액체 안정성에 대한 0.25 내지 1.0% ph젤라틴의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 0.5% ph젤라틴, 채워진 삼각형, 실선: 1.0% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 8f. 108 PFU/㎖에서 25℃에서 액체 안정성에 대한 0.25 내지 1.0% ph젤라틴의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 0.5% ph젤라틴, 채워진 삼각형, 실선: 1.0% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 8g. 106 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 액체 안정성에 대한 0.01% 내지 0.5% ph젤라틴의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.01% ph젤라틴, 채워진 삼각형, 실선: 0.05% ph젤라틴, 빈 원, 실선: 0.1% ph젤라틴, 별, 파선: 0.25% ph젤라틴. 채워진 원, 실선: 0.5% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 8h. 106 PFU/㎖에서 25℃에서 액체 안정성에 대한 0.01% 내지 0.5% ph젤라틴의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.01% ph젤라틴, 채워진 삼각형, 실선: 0.05% ph젤라틴, 빈 원, 실선: 0.1% ph젤라틴, 별, 파선: 0.25% ph젤라틴. 채워진 원, 실선: 0.5% ph젤라틴 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 9a. 106 PFU/㎖에서 동결/해동 사이클 동안 안정성에 대한 0.25 내지 2.0%의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 0.5% rHSA, 빈 삼각형, 실선: 1.0% rHSA, 별, 실선: 2.0% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 9b. 108 PFU/㎖에서 동결/해동 사이클 동안 안정성에 대한 0.25 내지 2.0%의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 0.5% rHSA, 빈 삼각형, 실선: 1.0% rHSA, 별, 실선: 2.0% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 9c. 주 단위의, 시간에 따른, 106 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 액체 안정성에 대한 0.25 내지 2.0% rHSA의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 0.5% rHSA, 빈 삼각형, 실선: 1.0% rHSA, 별, 실선: 2.0% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 9d. 주 단위의, 시간에 따른, 108 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 액체 안정성에 대한 0.25 내지 2.0% rHSA의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 0.5% rHSA, 빈 삼각형, 실선: 1.0% rHSA, 별, 실선: 2.0% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 9e. 일 단위의, 시간에 따른, 106 PFU/㎖에서 25℃에서 액체 안정성에 대한 0.25 내지 2.0% rHSA의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 0.5% rHSA, 빈 삼각형, 실선: 1.0% rHSA, 별, 실선: 2.0% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 9f. 주 단위의, 시간에 따른, 108 PFU/㎖에서 25℃에서 액체 안정성에 대한 0.25 내지 2.0% rHSA의 효과. 채워진 사각형, 실선: 0.25% rHSA, 채워진 삼각형, 실선: 0.5% rHSA, 빈 삼각형, 실선: 1.0% rHSA, 별, 실선: 2.0% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10a. 주의 시간의, 106 PFU/㎖에서 -30℃에서 장기간 동결된 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10b. 주의 시간의, 108 PFU/㎖에서 -30℃에서 장기간 동결된 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10c. 주의 시간의, 106 PFU/㎖에서 -70℃에서 장기간 동결된 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10d. 주의 시간의, B) 108 PFU/㎖에서 -70℃에서 장기간 동결된 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10e. 106 PFU/㎖에서 동결/해동 사이클 동안 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10f. 108 PFU/㎖에서 동결/해동 사이클 동안 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10g. 주의 시간의, 106 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 장기간 액체 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10h. 주의 시간의, 108 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 장기간 액체 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10i. 주의 시간의, 106 PFU/㎖에서 25℃에서 장기간 액체 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 10j. 주의 시간의, 108 PFU/㎖에서 25℃에서 장기간 액체 안정성. 채워진 사각형: 0.5% ph젤라틴, 채워진 원: 0.5% rHSA 및 채워진 마름모, 파선: 대조군.
도 11a. 주의 시간의, 106 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 정적 저장. 채워진 사각형, 파선: 완충제 + 0.5% ph젤라틴, 채워진 원, 파선: 완충제 + 0.5% rHSA, 채워진 마름모, 파선: 완충제 대조군. 채워진 사각형, 실선: 제제 + 0.5% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 제제 + 0.5% rHSA, 및 채워진 마름모, 실선: 제제 대조군.
도 11b. -70℃에서 동결되고, 이후 주의 시간의, 106 PFU/㎖의 2 내지 8℃(1 동결-해동 사이클)에서 저장됨. 채워진 사각형, 파선: 완충제 + 0.5% ph젤라틴, 채워진 원, 파선: 완충제 + 0.5% rHSA, 채워진 마름모, 파선: 완충제 대조군. 채워진 사각형, 실선: 제제 + 0.5% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 제제 + 0.5% rHSA, 및 채워진 마름모, 실선: 제제 대조군.
도 12a. 주의 시간의, 108 PFU/㎖에서 2 내지 8℃에서 정적 저장. 채워진 사각형, 파선: 완충제 + 0.5% ph젤라틴, 채워진 원, 파선: 완충제 + 0.5% rHSA, 채워진 마름모, 파선: 완충제 대조군. 채워진 사각형, 실선: 제제 + 0.5% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 제제 + 0.5% rHSA, 및 채워진 마름모, 실선: 제제 대조군.
도 12b. -70℃에서 동결되고, 이후 주의 시간의, 108 PFU/㎖의 2 내지 8℃(1 동결-해동 사이클)에서 저장됨. 채워진 사각형, 파선: 완충제 + 0.5% ph젤라틴, 채워진 원, 파선: 완충제 + 0.5% rHSA, 채워진 마름모, 파선: 완충제 대조군. 채워진 사각형, 실선: 제제 + 0.5% ph젤라틴, 채워진 원, 실선: 제제 + 0.5% rHSA, 및 채워진 마름모, 실선: 제제 대조군.
본 명세서에 기재된 발명은 다수의 동결/해동 사이클 동안 및 거의 동결 및 주변 온도에서의 장기간 저장 동안 감염력을 안정화시키고 보존하도록 사용될 수 있는 생 바이러스 조성물을 제공한다. 이 조성물은 동결 해동의 융통성을 제공함으로써 제조, 수송, 저장 및 사용 동안 요구사항을 감소시킨다. 본 발명의 생 바이러스 조성물은 동결/해동 사이클 동안 통상적으로 발생하는 손상으로부터 생 바이러스를 보호하고, 액체 상태에서, 이것은 -30℃ 이하의 온도에서 동결된 저장 동안 우수한 안정성을 유지하면서 2 내지 8℃ 또는 주변 온도에서 안정성을 제공한다.
헤르페스 바이러스 입자는 세포 유래 막 이중층에서 엔벨로핑된 20면체 단백질 캡시드 내에 패키징된 이중 가닥 DNA 게놈으로 이루어진 복잡한 구조이다. 피막(tegument)으로 공지된 바이러스 단백질의 층은 캡시드와 지질 엔벨로프 사이에 샌드위칭된다[1,2]. 막 엔벨로프의 존재는 많은 상이한 유형의 동물 바이러스의 구별되는 특징이다. 생 바이러스를 안정화시키기 위한 조성물의 제제화 시, 지질 엔벨로프는 바이러스 입자에 상당한 물리적 불안정성을 부여하는 것으로 보이고, 이것은, 특히 비엔벨로핑된 포유류 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 레오바이러스 및 폴리오바이러스와 비교할 때, 이 유형의 바이러스를 안정화시키는 것이 어렵게 만든다. 예를 들어, 2 내지 8℃ 저장에서, 아데노바이러스 타입 5는 2년 동안 안정하고, 폴리오바이러스 및 레오바이러스는 적어도 1년 동안 안정한 것으로 밝혀졌다[3-5]. 폭스바이러스는 유사한 온도에서 유사한 정도의 저장 안정성을 나타내는 유일한 엔벨로핑된 동물 바이러스인 것으로 보인다. 그러나, 폭스바이러스는 다른 엔벨로핑된 동물 바이러스와 구조적으로 구별되는데, 왜냐하면 이것이 이중 엔벨로프 및 다른 구조 차이를 함유하기 때문이다[6,7]. 실제로, 폭스바이러스는 60년 초과 동안 2 내지 8℃에서 건조된 샘플의 보관된 조직, 환경 샘플 및 실험실 저장에서 관찰된 장기간 저장에 의해 입증된 바대로 현저히 안정하다[8-12].
미국에서 허가된 엔벨로핑된 생 바이러스 제품[13] 중, 하나(폭스바이러스 백신; ACAM2000)를 제외한 모두가 PHG를 함유한다(표 1)(비록, 상기 기재된 바와 같지만, 폭스바이러스는 다양한 환경에서 특히 안정한 것으로 공지되어 있다). 표 1에 예시된 바대로, 심지어 PHG를 사용하는 생 바이러스 제제가 동결건조를 요하고, 이것은 PHG의 사용이 예를 들어 2 내지 8℃에서 액체 조성물의 적절한 저장 안정성을 부여하기에 충분하지 않다는 것을 나타낸다. FluMist(등록상표)는, 동결건조되지 않더라고, 대략 18주의 비교적 짧은 기간에도 불구하고 액체 조성물로서 2 내지 8℃에서 저장될 수 있다. 반대로, 본 발명의 조성물은, 이전의 생 바이러스 액체 제제에 비해 상당한 증가인, 2 내지 8℃에 적어도 9개월(39주)의 저장 안정성을 나타내는 생 바이러스 액체 제제를 허용한다.
[표 1]
Figure 112017063879780-pct00001
본 발명의 조성물은 동결 해동 손상 동안 바이러스의 불활화를 또한 방지한다. 효력(또는 활성)의 소실 없이 약물 제품 또는 중간체 생성물을 동결하고 해동하는 능력은 최종 제품의 제조 공정 설계, 라벨링, 포장 조작, 공급 사슬 배포 및 건강 관리 제공자 취급의 융통성을 허용하므로 매우 중요하다. 예를 들어, 동결-해동 손상에 대해 보호하는 생 바이러스 제제는 실수로 해동되거나 사용되지 않는 경우 재동결될 수 있어서, 약물 소실의 양을 감소시킨다. 그러나, 생물학은 통상적으로 동결 해동 조작으로 인해 약간의 손상을 경험하고, 따라서 효력의 소실을 감소시키기 위해 일반적으로 단일 동결-해동 사이클로 제한된다[14,15]. 표 1에 기재된 생 바이러스 제품 중에, 동결건조 제품 중 어느 것도 재구성 후 재동결될 수 있다. 또한, FluMist(등록상표)는 후의 해동 및 사용을 위해 동결되지 않을 수 있다. 도 10e 및 도 10f에 도시된 바대로, 본 발명의 조성물은 10회의 동결-해동 사이클에 걸쳐 효력을 유지하였지만, 대조군은 각각 2 로그 초과 및 1 로그 초과를 소실하였다. 이 이익은 도 9a 및 도 9b에 도시된 바대로 PGH 농도의 비교적 넓은 범위에 걸쳐 실현된다.
더구나, 본 명세서에 기재된 조성물에 대한 PHG의 첨가는 가시적인 및 준가시적인 입자의 형성을 방지한다. 제품 외관은 중요한 제품 속성이다; 특정한 외관 기준을 만족시키지 않는 제품은 관련 바이러스 롯트의 폐기 또는 회수를 발생시킬 수 있다. 미립자의 형성은, 제조 동안 또는 더 후의 시간에(예를 들어, 저장 동안), 모든 생물학과 상당히 상관된다. 이 조성물에 대한 PHG의 첨가는 제조 후(도 11a 및 도 12a) 또는 동결 해동 후(도 11b 및 도 12b) 최종 제품에 존재하는 미립자의 양을 상당히 감소시킨다. PHG의 부재 하에, 이 조성물이 높은 수준의 미립자를 나타내는 것에 주목한다. 이것은 이러한 상당한 정도로 미립자 형성을 방지하는 PHG의 처음의 보고인 것으로 보인다.
따라서, 본 발명은 단순 포진 바이러스, 단백질, 적어도 1종의 당, 염화나트륨 및 인산나트륨(pH 7-8)을 포함하는 생 바이러스 조성물을 제공하고, 이 조성물은 동결된다. 본 발명은 또한 단순 포진 바이러스, 단백질, 적어도 1종의 당, 염화나트륨 및 인산나트륨(pH 7.4)을 포함하는 생 바이러스 조성물을 제공하고, 이 조성물은 동결된다. 일 실시형태에서, 생 바이러스 조성물은 2℃ 내지 적어도 25℃에서 해동되고 저장된다. 또 다른 실시형태에서, 생 바이러스 조성물은 2℃ 내지 25℃에서 해동되고 저장된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 해동되고 저장된다. 또 다른 실시형태에서, 해동 후, 생 바이러스 조성물은 재동결된다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 해동 후, 생 바이러스 조성물은 -30℃ 이하의 온도에서 재동결되고 저장된다.
몇몇 실시형태에서, 바이러스 조성물은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회 또는 20회 해동되고 저장되고 재동결된다(즉, 동결/해동 사이클을 겪음). 몇몇 실시형태에서, 바이러스 조성물은 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회 또는 20회 해동되고 저장되고 재동결된다(즉, 동결/해동 사이클을 겪음).
또 다른 실시형태에서, 단백질은 부분적으로 가수분해된 젤라틴(PHG) 또는 인간 혈청 알부민이다. 몇몇 실시형태에서, PHG의 농도는 0.01% 내지 1%(w/v)이다. 일 실시형태에서, 부분적으로 가수분해된 젤라틴은 돼지 유래이다. 몇몇 실시형태에서, PHG의 농도는 0.01% 내지 4%, 0.1% 내지 4%, 0.1% 내지 3.5%, 0.1% 내지 3%, 0.1% 내지 2.5%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 1.5%, 0.01% 내지 1%, 0.1% 내지 1%, 0.2% 내지 1%, 0.3% 내지 1%, 0.4% 내지 1%, 0.3% 내지 0.9%, 0.3% 내지 0.8%, 0.3% 내지 0.7%, 0.3% 내지 0.6%, 또는 0.4% 내지 0.6%(w/v)이다. 몇몇 실시형태에서, PHG의 농도는 약 0.01% 내지 약 4%, 약 0.1% 내지 약 4%, 약 0.1% 내지 약 3.5%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 2.5%, 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 1.5%, 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.2% 내지 약 1%, 약 0.3% 내지 약 1%, 약 0.4% 내지 약 1%, 약 0.3% 내지 약 0.9%, 약 0.3% 내지 약 0.8%, 약 0.3% 내지 약 0.7%, 약 0.3% 내지 약 0.6%, 또는 약 0.4% 내지 약 0.6%(w/v)이다. 다른 실시형태에서, PHG의 농도는 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5%, 또는 약 4%(w/v)이다. 다른 실시형태에서, PHG의 농도는 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 또는 4%(w/v)이다. 특정한 실시형태에서, PHG의 농도는 약 0.5%(w/v)이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, PHG의 농도는 0.5%(w/v)이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 돼지 유래 PHG의 농도는 약 0.5%(w/v)이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 돼지 유래 PHG의 농도는 0.5%(w/v)이다. 단백질이 인간 혈청 알부민인 실시형태에서, 인간 혈청 알부민의 농도는 약 0.25% 내지 약 4%, 약 0.25% 내지 약 3.5%, 약 0.25% 내지 약 3%, 약 0.25% 내지 약 2.5%, 약 0.25% 내지 약 2%, 약 0.25% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.25% 내지 약 1%(w/v)이다. 단백질이 인간 혈청 알부민인 다른 실시형태에서, 인간 혈청 알부민의 농도는 0.25% 내지 4%, 0.25% 내지 3.5%, 0.25% 내지 3%, 0.25% 내지 2.5%, 0.25% 내지 2%, 0.25% 내지 1.5%, 또는 0.25% 내지 1%(w/v)이다.
또 다른 실시형태에서, 적어도 1종의 당은 소르비톨, 미오-이노시톨 또는 수크로스이다. 몇몇 실시형태에서, 소르비톨의 농도는 2%(w/v)이다. 다른 실시형태에서, 소르비톨의 농도는 약 2%(w/v)이다. 다른 실시형태에서, 소르비톨의 농도는 약 0.5%, 약 1%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2%, 약 2.1%, 약 2.2%, 약 2.3%, 약 2.4%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5%, 약 4%, 약 4.5%, 또는 약 5%(w/v)이다. 다른 실시형태에서, 소르비톨의 농도는 0.5%, 1%, 1.5%, 1.65, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 3% 3.5%, 4%, 4.5%, 또는 5%(w/v)이다. 다른 실시형태에서, 소르비톨의 농도는 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 1% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 약 2.5%, 약 1.6% 내지 약 2.4%, 약 1.7% 내지 약 2.3%, 약 1.8% 내지 약 2.2%, 또는 약 1.9% 내지 약 2.1%(w/v)이다. 다른 실시형태에서, 소르비톨의 농도는 0.01% 내지 5%, 0.1% 내지 5%, 0.5% 내지 5%, 0.5% 내지 4%, 0.5% 내지 3%, 1% 내지 3%, 1.5% 내지 2.5%, 1.6% 내지 2.4%, 1.7% 내지 2.3%, 1.8% 내지 2.2%, 또는 1.9% 내지 2.1%(w/v)이다. 적어도 1종의 당이 미오-이노시톨인 실시형태에서, 미오-이노시톨의 농도는 4%(w/v)이다. 또 다른 실시형태에서, 미오-이노시톨의 농도는 약 4%(w/v)이다. 적어도 1종의 당이 수크로스인 실시형태에서, 수크로스의 농도는 9%(w/v) 내지 15%(w/v)이다. 또 다른 실시형태에서, 수크로스의 농도는 약 9%(w/v) 내지 약 15%(w/v)이다.
일 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 145mM이다. 또 다른 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 145mM이다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 10 내지 500mM, 10 내지 300mM, 50 내지 300mM, 50 내지 250mM, 100 내지 250mM, 100 내지 200mM, 100 내지 190mM, 100 내지 180mM, 110 내지 180mM, 120 내지 180mM, 120 내지 170mM, 130 내지 170mM, 130 내지 160mM, 140 내지 160mM, 또는 140 내지 150mM이다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 10 내지 약 500mM, 약 10 내지 약 300mM, 약 50 내지 약 300mM, 약 50 내지 약 250mM, 약 100 내지 약 250mM, 약 100 내지 약 200mM, 약 100 내지 약 190mM, 약 100 내지 약 180mM, 약 110 내지 약 180mM, 약 120 내지 약 180mM, 약 120 내지 약 170mM, 약 130 내지 약 170mM, 약 130 내지 약 160mM, 약 140 내지 약 160mM, 또는 약 140 내지 약 150mM이다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 135mM, 136mM, 137mM, 138mM, 139mM, 140mM, 141mM, 142mM, 143mM, 144mM, 145mM, 146mM, 147mM, 148mM, 149mM, 150mM, 151mM, 152mM, 153mM, 154mM, 또는 155mM이다. 몇몇 실시형태에서, 염화나트륨의 농도는 약 135mM, 약 136mM, 약 137mM, 약 138mM, 약 139mM, 약 140mM, 약 141mM, 약 142mM, 약 143mM, 약 144mM, 약 145mM, 약 146mM, 약 147mM, 약 148mM, 약 149mM, 약 150mM, 약 151mM, 약 152mM, 약 153mM, 약 154mM, 또는 약 155mM이다.
일 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 100mM이다. 또 다른 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 약 100mM이다. 또 다른 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 102mM이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 약 102mM이다. 몇몇 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 10 내지 500mM, 10 내지 300mM, 50 내지 300mM, 50 내지 250mM, 50　to 150mM, 60 내지 140mM, 70 내지 130mM, 80 내지 120mM, 90 내지 110mM, 91 내지 109mM, 92 내지 108mM, 93 내지 107mM, 94 내지 106mM, 95 내지 105mM, 96 내지 104mM, 97 내지 103mM, 98 내지 102mM, 또는 99 내지 101mM이다. 몇몇 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 약 10 내지 약 500mM, 약 10 내지 약 300mM, 약 50 내지 약 300mM, 약 50 내지 약 250mM, 약 50　to 약 150mM, 약 60 내지 약 140mM, 약 70 내지 약 130mM, 약 80 내지 약 120mM, 약 90 내지 약 110mM, 약 91 내지 약 109mM, 약 92 내지 약 108mM, 약 93 내지 약 107mM, 약 94 내지 약 106mM, 약 95 내지 약 105mM, 약 96 내지 약 104mM, 약 97 내지 약 103mM, 약 98 내지 약 102mM, 또는 약 99 내지 약 101mM이다. 몇몇 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 90mM, 91mM, 92mM, 93mM, 94mM, 95mM, 96mM, 97mM, 98mM, 99mM, 100mM, 101mM, 102mM, 103mM, 104mM, 105mM, 106mM, 107mM, 108mM, 109mM, 또는 110mM이다. 몇몇 실시형태에서, 인산나트륨의 농도는 약 90mM, 약 91mM, 약 92mM, 약 93mM, 약 94mM, 약 95mM, 약 96mM, 약 97mM, 약 98mM, 약 99mM, 약 100mM, 약 101mM, 약 102mM, 약 103mM, 약 104mM, 약 105mM, 약 106mM, 약 107mM, 약 108mM, 약 109mM, 또는 약 110mM이다.
특정한 실시형태에서, 본 발명은 단순 포진 바이러스, 부분적으로 가수분해된 젤라틴, 소르비톨, 염화나트륨 및 인산나트륨(pH 7-8 또는 pH 7.4)을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 이 조성물은 단순 포진 바이러스 1, 부분적으로 가수분해된 돼지 유래 젤라틴, 소르비톨, 염화나트륨 및 인산나트륨(pH 7-8 또는 pH 7.4)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이 조성물은 단순 포진 바이러스 1, 약 0.5%(w/v)의 농도의 부분적으로 가수분해된 돼지 유래 젤라틴, 약 2%(w/v)의 농도의 소르비톨, 약 145mM의 농도의 염화나트륨, 및 약 100mM의 농도의 인산나트륨(pH 7-8)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이 조성물은 단순 포진 바이러스 1, 약 0.5%(w/v)의 농도의 부분적으로 가수분해된 돼지 유래 젤라틴, 약 2%(w/v)의 농도의 소르비톨, 약 145mM의 농도의 염화나트륨, 및 약 102mM의 농도의 인산나트륨(pH 7-8)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이 조성물은 단순 포진 바이러스 1, 약 0.5%(w/v)의 농도의 부분적으로 가수분해된 돼지 유래 젤라틴, 약 2%(w/v)의 농도의 소르비톨, 약 145mM의 농도의 염화나트륨, 및 약 100mM의 농도의 인산나트륨(약 pH 7.4)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이 조성물은 단순 포진 바이러스 1, 약 0.5%(w/v)의 농도의 부분적으로 가수분해된 돼지 유래 젤라틴, 약 2%(w/v)의 농도의 소르비톨, 약 145mM의 농도의 염화나트륨, 및 약 102mM의 농도의 인산나트륨(약 pH 7.4)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이 조성물은 단순 포진 바이러스 1, 약 0.5%(w/v)의 농도의 부분적으로 가수분해된 돼지 유래 젤라틴, 2%(w/v)의 농도의 소르비톨, 145mM의 농도의 염화나트륨, 및 100mM의 농도의 인산나트륨(pH 7.4)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이 조성물은 단순 포진 바이러스 1, 0.5%(w/v)의 농도의 부분적으로 가수분해된 돼지 유래 젤라틴, 2%(w/v)의 농도의 소르비톨, 145mM의 농도의 염화나트륨, 및 102mM의 농도의 인산나트륨(pH 7.4)을 포함한다. 상기 실시형태에서, 단순 포진 바이러스 1은 탈리모겐 라허파렙벡일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "약"은 표시된 값으로부터의 5%의 변동을 의미하거나, 값의 범위의 경우, 이러한 범위의 하한 및 상한 둘 다로부터의 5% 변동을 의미한다.
일 실시형태에서, 생 바이러스 조성물의 감염력은 단백질이 결여된 동일한 생 바이러스 조성물과 비교하여 증가한다. 바이러스 감염력(역가)은 플라크 검정, 예컨대 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 바이러스는 단순 포진 바이러스 1(HSV1) 또는 단순 포진 2(HSV2) 균주, 또는 이의 유도체, 바람직하게는 HSV1로부터 유래할 수 있다. 유도체는 HSV1 및 HSV2 균주로부터의 DNA를 함유하는 내부 타입 재조합을 포함한다. 이러한 내부 타입 재조합은 예를 들어 문헌[Thompson et al., (1998) Virus Genes 1(3); 275 286, and Meignier et al., (1998) J. Infect. Dis. 159; 602 614]에 당해 분야에 기재되어 있다.
단순 포진 바이러스 균주는 임상 단리물로부터 유래할 수 있다. 이러한 균주는 감염된 개체, 예컨대 재발성 구순포진을 가지는 사람으로부터 단리된다. 임상 단리물은 원하는 능력 또는 특징, 예컨대 미국 특허 제7,063,835호 및 미국 특허 제7,223,593호(이의 각각은 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 바대로 표준 실험실 균주와 비교하여 시험관내 및/또는 생체내 종양 및/또는 다른 세포에서 증대된 복제에 대해 스크리닝될 수 있다. 일 실시형태에서, 단순 포진 바이러스는 재발성 구순포진으로부터의 임상 단리물이다.
단순 포진 바이러스 1 바이러스 균주는 균주 JS1, 균주 17+, 균주 F 및 균주 KOS, 균주 파톤(Patton)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
단순 포진 바이러스는 예를 들어 이의 전구체 균주와 비교하여 변형될 수 있어서, 변형된 바이러스는 하나 이상의 기능성 바이러스 유전자가 결여된다. 본 명세서에 사용된 바대로, "기능성" 바이러스 유전자가 "결여"는 유전자(들)가 단순 포진 게놈에서 부분적으로 또는 완전히 결실되거나 대체되거나 재배열되거나 그렇지 않으면 변경되어서 기능성 바이러스 단백질이 단순 포진 바이러스에 의해 그 유전자로부터 더 이상 발현될 수 없다는 것을 의미한다.
변형될 수 있는 유전자의 예는 ICP34.5(γ34.5)와 같은 단백질을 코딩하는 병독성 유전자를 포함한다. ICP34.5는 HSV 감염 동안 병독성 인자로서 작용하고, 비분열 세포에서 복제를 제한하고, 바이러스가 비병원성이 되게 한다. 변형될 수 있는 또 다른 바이러스 유전자는 감염된 숙주 세포의 표면 상의 주조직 적합성 복합체 I형(major histocompatibility complex class I) 발현을 하향조절하는 ICP47를 코딩하는 유전자이고, 항원 제시와 연관된 운반체(transporter associated with antigen presentation; TAP)에 대한 결합은 소포체에서의 항원성 펩타이드 수송 및 MHC I형 분자의 로딩을 차단한다. 또 다른 것은 분할 세포가 아니라 비분할 세포에서의 뉴클레오타이드 대사 및 바이러스 DNA 합성에 관여한 리보뉴클레오타이드 환원효소의 큰 아단위인 ICP6이다. 아시클로버를 아시클로버-모노포스페이트로 인산화하는 것을 담당하는 타이미딘 키나제, 비리온 트랜스-활성자 단백질 vmw65, 당단백질 H, vhs, ICP43, 및 ICP4, ICP27, ICP22 및/또는 ICP0을 코딩하는 극초기 유전자는 또한 변형될 수 있다.
변형은 단순 포진 바이러스 유전자의 발현의 시기를 변경하도록 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, Us11은 Us11 유전자를 Us12 프로모터 하에 놓음으로써 조기 유전자로서 발현될 수 있다, Mulvey et al. (1999) J Virology, 73:4, 3375-3385, 미국 특허 제US5824318호, Mohr & Gluzman(1996) EMBO 15: 4759-4766.
변형된 단순 포진 바이러스의 예는 'a' 서열의 18bp DR~ 구성요소의 하나의 완전한 카피를 제거하는, HSV 게놈의 긴 반복 영역의 BamHI s 단편(0 내지 0-02 및 0-81 내지 0.83 맵 단위)의 각각의 카피 내에 위치한 759bp의 결실을 가지고, 전초기(1E) 유전자 1의 5' 말단의 상류의 ll05bp에 종료하는, 단순 포진 바이러스 1형의 세프레흐버(상표명)(HSV1716) 균주 17+을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 문헌[MacLean et al., (1991) Journal of General Virology 79:631-639)]을 참조한다.
ICP 34.5 유전자인, HSV 신경병독성의 주요 결정인자의 카피 둘 다의 결실, 및 감염된 세포 단백질 6(ICP6)을 코딩하는, UL39에서의 이. 콜라이 lacZ 유전자의 불활화 삽입을 가지는, 야생형 HSV-1 균주로부터 유래한 암살상 HSV-1인, G207, 문헌[Mineta et al. (1995) Nat Med. 1:938-943]을 참조한다.
γ34.5 및 ICP47 유전자의 카피 둘 다의 결실, 및 ICP6 유전자의 차단 및 인간 GM-CSF 유전자의 삽입을 가지는 단순 포진 바이러스인 OrienX010, 문헌[Liu et al., (2013) World Journal of Gastroenterology 19(31):5138-5143]을 참조한다.
ICP34.5, UL24 및 UL56.34,35의 하나의 카피를 포함하는, 긴(L) 및 짧은(S) 영역의 연결 영역을 가지는 단순 포진 바이러스인 NV1020은 결실된다. 결실된 영역은 HSV-2 US DNA의 단편(US2, US3(PK), gJ 및 gG)에 의해 대체되고, 문헌[Todo, et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA. 98:6396-6401]을 참조한다.
ICP34.5 유전자의 카피 둘 다의 결실 및 인터류킨 12의 삽입을 가지는 단순 포진 바이러스인 M032, 문헌[Cassady and Ness Parker, (2010) The Open Virology Journal 4:103-108]을 참조한다.
수탁 번호 01010209 하에 유럽 세포 배양 수집(European collection of cell cultures; ECAAC)에 기탁된 HSV-1 균주 JS1인 임상 균주로부터 유래한 탈리모겐 라허파렙벡. 탈리모겐 라허파렙벡에서, ICP34.5 및 ICP47을 코딩하는 HSV-1 바이러스 유전자는 기능성으로 결실된다. ICP47의 기능성 결실은 종양 선택도를 감소시키지 않으면서 종양 세포에서의 바이러스 성장을 촉진하는 유전자인 US11의 조기 발현을 발생시킨다. 인간 GM-CSF에 대한 코딩 서열은 바이러스 게놈으로 삽입되고, 문헌[Liu et al., Gene Ther 10: 292-303, 2003]을 참조한다.
ImmunoVEX HSV2는 vhs, ICP47, ICP34.5, UL43 및 US5를 포함하는 유전자의 기능성 결실을 가지는 단순 포진 바이러스(HSV-2)이다.
OncoVEXGALV /CD는 기능성으로 결실된 ICP34.5 및 ICP47을 코딩하는 유전자 및 ICP34.5 유전자 대신에 바이러스 게놈으로 삽입된 긴팔원숭이 백혈병 융합생성 당단백질 및 사이토신 데아미나제를 코딩하는 유전자를 가지는 HSV-1 균주 JS1로부터 또한 유래한다.
변형된 단순 포진 바이러스의 추가적인 예는 NSC-733972, HF-10, BV-2711, JX-594, Myb34.5, AE-618, 브레인웰(상표명) 및 헤압웰(상표명)을 포함한다.
헤르페스 바이러스 균주 및 이러한 균주를 만드는 방법은 또한 미국 특허 제US5824318호; 제US6764675호; 제US6,770,274호; 제US7,063,835호; 제US7,223,593호; 제US7749745호; 제US7744899호; 제US8273568호; 제US8420071호; 제US8470577호; WIPO 공보 제WO199600007호; 제WO199639841호; 제WO199907394호; 제WO200054795호; 제WO2006002394호; 제WO201306795호; 중국 특허 제CN128303호, 제CN10230334호 및 제CN10230335호; 문헌[Varghese and Rabkin, (2002) Cancer Gene Therapy 9:967-97 및 Cassady and Ness Parker, (2010) The Open Virology Journal 4:103-108]에 기재되어 있다.
본 발명의 단순 포진 바이러스는 하나 이상의 비상동성 유전자를 또한 포함할 수 있다. 비상동성 유전자는 바이러스의 게놈으로 도입되는 유전자를 의미하고, 이 유전자는 바이러스의 게놈에서 보통 발견되지 않거나, 상이한 핵산 서열을 가지고 상이한 생화학 기전을 통해 작용하는 상이한 종으로부터의 바이러스에서 발현된 유전자의 동족체이다. 비상동성 유전자는 하나 이상의 단백질, 예를 들어 세포독소, 면역조절 단백질(즉, 항원에 대한 숙주 면역 반응을 증대시키거나 억제하는 단백질), 종양 항원, 프로드럭 활성자, 종양 억제제, 프로드럭 전환 효소, 세포가 세포 융합하게 할 수 있는 단백질, TAP 저해제 안티센스 RNA 분자 또는 리보자임을 코딩할 수 있다. 면역조절 단백질의 예는 예를 들어 사이토카인을 포함한다. 사이토카인은 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-20; α, β 또는 γ-인터페론, 종양 괴사 인자 알파(TNFα), CD40L, 과립구 대식구 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식구 집락 자극 인자(macrophage colony stimulating factor; M-CSF), 및 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor; G-CSF), 케모카인(예컨대, 호중구 활성화 단백질(neutrophil activating protein; NAP), 대식구 화학주성 및 활성화 인자(macrophage chemoattractant and activating factor; MCAF), RANTES, 및 대식구 염증성 펩타이드 MIP-1a 및 MIP-1b), 보체 성분 및 이의 수용체, 면역계 보조 분자(예를 들어, B7.1 및 B7.2), 부착 분자(예를 들어, ICAM-1, 2, 및 3), 및 부착 수용체 분자를 포함한다. 종양 항원은 인간 파필로마바이러스의 E6 및 E7 항원, EBV 유래 단백질, 뮤신, 예컨대 MUC1, 흑색종 타이로시나제 및 MZ2-E이다. 프로드럭 활성자는 나이트로리덕타제 및 사이토크롬 p450을 포함하고, 종양 억제제는 p53을 포함한다. 프로드럭 전환 효소는 사이토신 데아미나제를 포함한다. 세포가 세포 융합하게 할 수 있는 단백질은 긴팔원숭이 백혈병 융합생성 당단백질을 포함한다. TAP 저해제는 소 헤르페스 바이러스(BHV) UL49.5 폴리펩타이드를 포함한다. 세포 또는 병원균 mRNA의 발현을 차단하도록 사용될 수 있는 안티센스 RNA 분자. 결함 있는 세포 RNA를 복구하거나, 원치 않는 세포 또는 병원균-코딩된 RNA를 파괴하도록 설계된 리보자임(예를 들어, 해머헤드 또는 헤어핀 기반 리보자임)일 수 있는 RNA 분자.
단순 포진 게놈으로의 다수의 바이러스 유전자의 삽입, 예컨대 바이러스 단백질 Us11을 코딩하는 유전자의 하나 이상의 카피의 삽입이 또한 포함된다.
본 발명의 생 바이러스 조성물은 인간 또는 동물을 치료하는 방법에 포함될 수 있다. 특히, 본 발명의 생 바이러스 조성물은 암 치료의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 생 바이러스 조성물은 다양한 종양 및 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 유효량의 생 바이러스 조성물을 상기 개체에게 투여함으로써 이를 필요로 하는 환자에서 종양을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 상호 교환되어 사용되고, 인간 또는 비인간 포유류, 예컨대 소과, 말과, 개과, 양과 또는 고양이과(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 포유류를 의미한다. 바람직하게는, 환자는 인간이다.
본 발명의 생 바이러스 조성물은 환자에서 임의의 고형 종양의 치료학적 치료에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생 바이러스 조성물은 전립선, 유방, 폐, 간, 신장 세포, 자궁내막, 방광, 결장 또는 자궁경부 암종; 선암; 흑색종; 림프종; 신경교종; 육종, 예컨대 연조직 및 골 육종; 또는 두경부의 암, 및 바람직하게는, 방광암을 가지는 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 생 바이러스 조성물은 환자에서의 암, 예컨대 모든 종류의 암, 신생물 또는 악성 종양, 예컨대 백혈병, 암종 및 육종을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 암은 유방, 뇌, 자궁경부, 결장, 두경부, 간, 신장, 폐, 비소세포 폐, 흑색종, 중피종, 난소, 육종, 위, 자궁 및 수모세포종의 암을 포함한다. 또한, 호지킨 질환, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 거대글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 악성 췌장 인슐린종(insulanoma), 악성 유암종, 방광암, 악성전 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경아세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신 피질 암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 및 전립선암.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 본 발명의 생 바이러스 조성물은 성상세포종, 핍지교종, 뇌수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 상의세포종, 신경초종, 신경섬유육종, 수모세포종, 흑색종 세포, 췌장암 세포, 전립선 암종 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 간종양 세포, 중피종 및 표피 암종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포를 사멸하기 위해 사용된다.
본 발명의 생 바이러스 조성물은 방사선, 화학요법, 온열요법, 치료학적 단백질 및 수술(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다른 치료 양상과 조합되어 또한 사용될 수 있다. 생 바이러스 조성물은 다른 치료 양상 전에, 이것과 동시에 또는 이것 후에 투여될 수 있다.
치료학적 단백질은 면역 관문 저해제를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "면역 관문 저해제"는 하나 이상의 관문 단백질을 완전히 또는 부분적으로 감소시키거나 저해하거나 방해하거나 조절하는 분자를 의미한다.
관문 단백질은 T 세포 활성화 또는 기능을 조절한다. CTLA-4 및 이의 리간드 CD80 및 CD86; 및 PD1 및 이의 리간드 PDL1 및 PDL2와 같은 다양한 관문 단백질이 공지되어 있다. 이 단백질은 T 세포 반응의 동시자극 또는 저해 상호작용을 담당한다. 면역 관문 단백질은 생리학적 면역 반응의 자가 관용 및 기간 및 폭을 조절하고 유지시킨다. 면역 관문 저해제는 항체를 포함하거나 항체로부터 유래한다.
관문 저해제는 세포독성 T 림프구 연관 항원 4(CTLA-4) 저해제를 포함한다. CTLA-4의 저해제는 트레멜리무맙, 이플리무맙(10D1, MDX-D010으로 또한 공지됨), 및 미국 특허 제5,811,097호; 제5,811,097호; 제5,855,887호; 제6,051,227호; 제6,207,157호; 제6,682,736호; 제6,984,720호; 및 제7,605,238호에 기재된 항-CTLA-4 항체 및 명칭 Yervoy(상표명) 하에 판매되는 것을 포함한다.
다른 면역 관문 단백질은 프로그래밍된 세포사 1(PD-1) 및 프로그래밍된 세포사 리간드 1 및 2(PDL1)(PDL2)를 포함한다. PD1 및 PDL1 및 PDL2를 저해하는 분자의 예는 니볼루맙(MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538), PD-1에 결합하고 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 의해 이의 활성화를 차단하는 완전 인간 IgG4 항체; Keytruda(상표명)로 판매되는 펨브롤리주맙(람브롤리주맙, MK-3475 또는 SCH 900475); MPDL3280A, 조작된 항-PDL1 항체(아테졸리주맙); CT-011; AMP-224; BMS-936559(MDX-1105-01) 및 미국 특허 제7,488,802호; 제7,943,743호; 제8,008,449호; 제8,168,757호; 8,217,149호, 및 PCT 공개 특허 출원 제W003042402호, 제WO2008156712호, 제W02010089411호, 제W02010036959호, 제WO2011066342호, 제WO2011159877호, 제WO2011082400호, 및 제WO2011161699호에 기재된 것을 포함한다.
다른 면역 관문 저해제는 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) 저해제, 예컨대 IMP321, 가용성 Ig 융합 단백질; B7 저해제, 예컨대 항-B7-H3 항체 MGA271을 포함한다. TIM3(T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3) 저해제가 또한 포함된다.
의사는 원하는 효과를 달성하는 투약량이 도달할 때까지 생 바이러스 조성물을 투여할 수 있다. 이 조성물은 직접 주사 또는 다른 적합한 투여 방법에 의해 시간에 따라 단일 용량으로, 또는 2개 이상의 용량(동일한 양의 원하는 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있음)으로 따라서 투여될 수 있다. 본 발명의 생 백신 조성물은 일정 기간에 걸쳐 예를 들어 1회 또는 1회 초과, 예를 들어 규칙적인 간격으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 생 바이러스 조성물은 환자가 선택된 표시자 또는 표시자들에 대해 기준에 비해 의학 관련 개선 정도를 나타낼 때까지 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 생 백신 조성물은 탈리모겐 라허파렙벡을 포함한다. 이 조성물은 1주의 1일에 106 플라크 형성 단위/㎖(PFU/㎖)의 4.0㎖ 이하의 용량, 이어서 4주의 1일에 108 PFU/㎖의 4.0㎖ 이하의 용량에서, 및 이후 2주(±3일)마다 주사용 피부, 경피 및 결절 종양으로 종양내 주사에 의해 투여된다. 종양(들)에 주사하고자 하는 탈리모겐 라허파렙벡의 추천 용적은 종양(들)의 크기에 따라 달라진다. 모든 합당하게 주사 가능한 병변(초음파 지도에 따라 또는 이것 없이 주사 가능한 피부, 경피 및 결절 질환)은 개별 투약 경우에 이용 가능한 최대 투약 용적에 의해 주사되어야 한다. 각각의 치료 일에, 주사의 우선순위가 하기와 같이 추천된다: 마지막 주사 이후에 나타난 임의의 현재 주사 가능한 종양; 가장 큰 종양에 의해 시작하여 종양 크기에 의해; 현재 주사 가능한 임의의 이전에 주사 불가능한 종양(들).
본 명세서에 달리 정의되지 않은 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당해 분야의 당업자가 보통 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않은 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 연결되어 사용된 명명법 및 이의 기법은 당해 분야에 널리 공지되고 흔히 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기법은, 달리 표시되지 않은 한, 본 명세서에 걸쳐 인용되고 기재된 다양한 일반적인 및 더 구체적인 참고문헌에 기재된 바대로 당해 분야에 널리 공지된 종래의 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 확인된 모든 특허 및 다른 공보는 그 전문이 참고문헌으로 본 명세서에 명확히 포함된다.
실시예
실시예 1
암살상 바이러스와 사용하기 위해 돼지 유래 부분적으로 가수분해된 젤라틴(ph젤라틴)을 함유하는 제제를 개발하였다. 이 제제는 동결된 조건 하의 장기간 저장, 다수의 동결/해동 사이클 및 2 내지 8℃ 및 25℃에서의 액체 저장 동안 감염력의 소실에 대해 암살상 바이러스를 보호한다. 또한, 제제는 ph젤라틴이 없는 제제와 비교하여 가시적인 입자 및 준가시적인 입자 둘 다의 형성을 감소시켰다. 이 제제는 제조, 포장 및 라벨링 동안 ph젤라틴이 없는 제제에 비해 이점을 제공하고, 건강 관리 제공자에게 편의성 및 융통성을 크게 증가시킨다.
샘플 제제
이 실시예에서, 암살상 단순 포진 바이러스(HSV-1) 탈리모겐 라허파렙벡(Lui et al., (2003) Gene Therapy, 10:292-303)을 106 PFU/㎖ 및 108 PFU/㎖의 농도로 사용하였다. 108 PFU/㎖의 바이러스 농도에 대해, 원하는 최종 부형제 농도를 달성하는 용적에서 농축 부형제 스톡 용액(즉, 10-20% w/v ph젤라틴 또는 재조합 HSA)의 첨가에 의해 샘플을 제조하였다. 106 PFU/㎖의 암살상 HSV-1 농도에 대해, 원하는 완충제로 108 PFU/㎖ 재료의 간단한 희석에 의해 샘플을 제조하였다. 108 PFU/㎖의 암살상 HSV-1 농도에 대해, 농축 암살상 HSV-1 용액에 대한 농축 부형제 스톡 용액 및 완충제의 첨가에 의해 샘플을 제조하였다. Flip-off(등록상표) TruEdge(등록상표) 시일(West)로 실링된 FluoroTec(등록상표) 코팅된 클로로뷰틸 엘라스토머 스토퍼(West)를 가지는 사용 준비 된 2cc 결정 제니쓰(zenith) 수지 바이알(West Pharmaceuticals Inc.(펜실베이니아주 엑스톤))에 샘플을 저장하였다.
플라크 검정
감수성 표시자 세포로 시험 샘플을 적정하고, 세포변성 효과(cytopathic effect; CPE)를 관찰하고, 후속하는 플라크 형성 단위(PFU)(검출 한계 ≥2.08 Log10 PFU/㎖)를 계수함으로써 감염성 암살상 HSV-1의 양을 정량화하였다.
간단히 말하면, BHK(베이비 햄스터 신장; ATCC(버지니아주 매너서스)) 세포를 L-글루타민(Life Technologies(캘리포니아주 칼스바드)), 10% 소 태아 혈청(Thermo-Fisher(매사추세츠주 월섬)) 및 항생제 스트렙토마이신 및 페니실린(Life Technologies(캘리포니아주 칼스바드))이 보충된 DMEM(Life Technologies(캘리포니아주 칼스바드))에서 전파시켰다. BHK 세포를 시험 하루 전에 12웰 플레이트에서 시딩하였다. 시험 샘플을 연속하여 희석하고 단층의 감염에 사용하였다. 바이러스 흡착을 허용하는 초기 항온처리 기간 후, 세포를 카복시메틸셀룰로스(CMC)를 함유하는 오버레이 배지 및 성장 배지에 의해 커버하고, 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 항온처리하였다. 접종원을 흡인시키고 PBS에 의해 세척한 후 0.01% 글루타르알데하이드 용액(시그마-알드리치(미조리주 세인트 루이스))을 사용하여 세포를 후속하여 고정하였다. 이후, 세포를 2% 결정 바이올렛 용액(시그마-알드리치)을 사용하여 염색하여 플라크를 가시화하였다. 바이러스 역가를 결정하기 위해, 시험 샘플의 각각의 희석에 대해 형성된 플라크를 계수하고, 시험된 2회 반복의 평균으로부터 최종 역가를 결정하였다(Log10 PFU/㎖).
준가시적인 입자 분석
광 엄폐(light obscuration; HIAC) 및 미세흐름 영상화(micro-flow imaging; MFI)의 2개의 기법에 의해 준가시적인 입자를 모니터링하였다.
HIAC
Ryco HIAC 입자 계수기(Beckman Coulter(캘리포니아주 브레아))를 사용하여 광 엄폐에 의해 준가시적인 입자를 모니터링하였다. 15 마이크론 표준 입자 계수 조절(Duke Scientific, Thermo Fisher Scientific(매사추세츠주 월섬))을 샘플 시험 전에 분석하였다. 4개의 0.2㎖ 주사를 사용하여 준가시적인 입자 계수를 수행하였다. 마지막 3개의 판독을 평균하고, ㎖마다 누적 계수로서 보고하였다.
MFI
100㎛ 실란 코팅된 유세포가 장착된 미세흐름 영상화(MFI) 장치(4200 Protein Simple(캘리포니아주 산타 클라라))에서 준가시적인 입자 분석을 수행하였다. 각각의 측정 전에, 물을 시스템을 통해 플러시 처리하여 조명을 최적화하고 깨끗한 기준을 제공하였다. 각각의 샘플에 대해, 전체 1㎖를 0.2㎖/분의 유속으로 세포를 통해 펌프질하였다. 처음 0.35㎖를 사용하여 유세포를 퍼징하고, 남은 0.65㎖를 분석하였다. 2㎛ 이상의 입자의 전체 수를 보고하였다.
동결 해동 안정성
1회 및 5회 동결/해동 사이클 후 바이러스 감염력에 대해 시험함으로써 다수의 인자를 스크리닝하였다.
완충제 및 염
인산나트륨은 동결된 상태에서 결정화하여서, 동결된 상태에서의 pH를 상당히 하강시키는 것으로 공지되어 있다. 다른 한편, 인산칼륨은 결정화하지 않는다.
제제: 2%(w/v) 소르비톨, 4%(w/v) 미오-이노시톨, 145mM NaCl 및 100mM 인산나트륨(pH 7.4)은 대조군으로서 작용하였다. 대조군 제제는 인산나트륨의 농도가 100mM 내지 10mM으로 감소하거나, 10 또는 100mM 인산칼륨에 의해 치환되도록 변형되었다. NaCl 농도가 73mM으로 감소하거나 완전히 제거된 제제를 또한 시험하였고, 표 1을 참조한다.
Figure 112017063879780-pct00002
샘플을 106 PFU/㎖에서 제조하였다. 상기 기재된 바와 같은 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다. 샘플을 적어도 1일 동안 -70℃에서의 동결로 처리하고, 이후 2시간 이하 동안 실온으로 해동하였다. 해동된 샘플을 각각의 후속하는 동결/해동 사이클(전체 1 또는 5 사이클) 동안 적어도 1일 동안 -70℃에서 다시 동결하고, 이후 2시간 이하 동안 실온으로 해동하였다.
인산나트륨의 감소 또는 인산칼륨의 치환에 의해, 감염력의 소실이 동결/해동 사이클 후 여전히 보였고, 이것 중 어느 것도 대조군에 비해 어떠한 이익을 제공하는 것으로 생각되지 않았다. 유사하게, NaCl의 농도의 감소는 대조군과 비교하여 동결/해동 사이클 동안 바이러스의 안정성에 영향을 가지지 않았다(도 1).
당
당은 저온보호성 부형제로서 흔히 사용되고, 그래서 일련의 농도의 상이한 당이 동결/해동 사이클 동안 암살상 HSV-1 안정성에 대한 이의 효과에 대해 시험되었다.
미오-이노시톨이 제거되고 소르비톨이 9% 또는 15%(w/v)로 증가하도록 대조군 제제를 변형하였다. 샘플의 제2 그룹에서, 미오-이노시톨 및 소르비톨 둘 다가 제거되고 9% 또는 15% 트레할로스(w/v) 또는 9 또는 15% 수크로스(w/v)에 의해 대체되도록 대조군 제제를 변형하고, 표 2를 참조한다.
Figure 112017063879780-pct00003
샘플을 106 PFU/㎖에서 제조하였다. 샘플을 상기 기재된 바대로 1 또는 5 동결-해동 사이클로 처리하였다. 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다.
9% 및 15% 소르비톨을 가지는 제제는 5회 동결/해동 사이클 후 감염력의 변화 없이 암살상 HSV-1 안정성의 상당한 증가를 생성시켰다. 유사하게, 15%의 수크로스 및 9% 및 15%의 트레할로스를 가지는 제제는 동결/해동 스트레스에 대해 보호를 제공하였다. 9%의 수크로스를 가지는 제제는 동결/해동 스트레스에 대해 보호를 제공하지 않았다(도 2a 및 도 2b).
당 및 단백질
동결/해동 동안 암살상 HSV-1 안정성에 대한 효과에 대해 높은 당 함량 및 안정화 단백질의 조합을 이후 시험하였다. 미오-이노시톨 및 소르비톨이 제거되고 9% 수크로스(w/v) 및 2%(w/v) 항스트렙타비딘 mAb(내부로 생성됨) 또는 2% 돼지 유래 부분적으로 가수분해된 젤라틴(ph젤라틴)(w/v)(Gelita(아이오와주 서전트 블러프))에 의해 제거되도록 대조군 제제를 변형하였다. 실험의 제2 세트에서, 대조군 제제를 4% ph젤라틴(w/v) 또는 4% 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA)(노보자임(노스 캐롤라이나주 프랭클린턴))(w/v)의 첨가에 의해 유지시키고, 표 3을 참조한다.
샘플을 106 PFU/㎖에서 제조하였다. 샘플을 1회 또는 5회 동결-해동 사이클로 처리하였다. 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다.
Figure 112017063879780-pct00004
안정화 단백질 rHSA, ph젤라틴, 또는 항스트렙타비딘 mAb의 첨가는 5회 동결/해동 사이클 후 감염력의 소실 없이 동결/해동 스트레스에 대해 보호하였다. ph젤라틴은 9%(w/v) 수크로스 또는 2%(w/v) 소르비톨 및 4%(w/v) 미오-이노시톨의 대조군 조합의 존재 하에 동결/해동 스트레스에 대해 보호하는 데 있어서 동등하게 효과적이었다. 도 3을 참조한다.
당 함량을 증가시키거나 안정화 단백질의 첨가에 의해 동결/해동 안정성은 개선하였다. 암살상 HSV-1은 모든 시험된 제제에서 감염력의 소실 없이 5회 동결/해동 사이클을 견뎌서, 3개의 매우 상이한 단백질이 동결/해동 스트레스에 대해 보호를 제공할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 단백질 중에서, rHSA 및 ph젤라틴은 최고의 안정성을 제공하고, 이들이 치료학적 제제에서 사용에 허가되었으므로, 이들은 추가의 연구에 선택되었다.
액체 저장
2 내지 8℃ 및 25℃에서 암살상 HSV-1 액체 안정성에 대한 효과에 대해 동결/해동 스트레스에 대해 보호한 이 당 및 단백질을 시험하였다. 실험의 일 세트에서, 소르비톨 및 미오-이노시톨이 15% 트레할로스, 15% 수크로스 또는 9% 소르비톨 및 2% rHSA에 의해 대체되도록 대조군 제제를 변형시켰다. 실험의 또 다른 세트에서, 대조군 제제를 2% rHSA 또는 2% ph젤라틴의 첨가에 의해 유지시키고, 표 4를 참조한다.
Figure 112017063879780-pct00005
샘플을 시험 제제 중의 106 PFU/㎖로 희석에 의해 제조하고, 적어도 1일 동안 -70℃에서 동결시키고, 이후 2 내지 8℃ 또는 25℃에서 저장하였다. 암살상 HSV-1이 더 높은 온도에서 감소한 안정성을 나타내면서, 샘플을 14일 동안 2 내지 8℃에서 및 3일 동안 25℃에서 유지시켜 제제 사이의 차이를 검출하였다. 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다.
15% 트레할로스에 의한 소르비톨 및 미오-이노시톨의 대체는 2 내지 8℃ 또는 25℃에서 액체 저장 동안 암살상 HSV-1을 안정화시키지 않았다. 15% 수크로스에 의한 대체는 일관되지 않은 결과를 생성하면서, 약간의 안정화가 2 내지 8℃가 아닌 25℃에서 관찰되었다. 반대로, 2% rHSA 또는 2% ph젤라틴의 첨가는 2% 소르비톨 + 4% 미오-이노시톨 또는 9% 수크로스의 존재 하에 온도 둘 다에서 액체 저장 동안 우수한 안정성을 제공하고, 도 4a 및 도 4b를 참조한다.
결론으로, 안정화 단백질(ph젤라틴 또는 rHSA)의 첨가는 동결/해동 및 액체 저장 동안 개선된 안정성으르 제공하였다. 당 함량의 변형은 동결/해동 동안 추가적인 안정성을 제공하지만, 액체 저장 동안 비교적 적은 효과를 가진다. 따라서, 추가의 노력은 안정화 단백질의 상이한 수준 및 유형의 효과에 초점을 두었다.
실시예 2
단백질 농도
개선된 동결/해동 및 액체 안정성의 조합은 제조, 패키징 및 라벨링에 대한 실질적인 이익을 제공할 것이다. 2 내지 8℃에서 저장하는 능력은 건강 관리 제공자에게 크게 개선된 융통성 및 편의성을 제공할 것이다.
대조군 제제를 1%, 2% 또는 4% ph젤라틴 또는 1%, 2% 또는 4% rHSA의 첨가에 의해 유지시켰다. 샘플을 106 PFU/㎖에서 제조하였다. 상기 기재된 바와 같은 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다. 샘플을 상기 기재된 바대로 5회 동결/해동 사이클로 처리하였다.
암살상 HSV-1 안정성에 대한 단백질 농도의 효과를 결정하도록 rHSA 및 ph젤라틴의 농도는 변했다. ph젤라틴 및 rHSA 둘 다는 시험된 전체 범위에 걸쳐 동결/해동 사이클 동안 보호를 제공하였고, 도 5를 참조한다.
2 내지 8℃ 및 25℃에서의 암살상 HSV-1 액체 안정성에 대한 변하는 단백질 농도의 효과를 이후 시험하였다. 1%, 2% 또는 4% ph젤라틴 또는 1%, 2% 또는 4% rhHSA의 첨가에 의해 대조군 제제를 유지시켰다. 샘플을 106 PFU/㎖에서 제조하고, 적어도 1일 동안 -70℃에서 동결하고(예비동결), 이후 2 내지 8℃ 및 25℃에서 저장하였다. 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다.
ph젤라틴 제제는 25℃에서 3일 후 활성의 소실 없이 액체 저장 동안 훨씬 훌륭히 수행되었다. 반대로, rHSA 함유 제제의 모두는 동일한 기간에 걸쳐 감염력의 소실을 나타냈다. 또한, rHSA 함유 제제는 rHSA 농도가 증가하면서 25℃에서 실제로 나쁘게 수행되었다. 감염력의 적은 변화가 이 시간 기간 동안 2 내지 8℃에서 관찰되었다; 도 6a 및 도 6b 참조.
rHSA 등급
증가한 양의 rHSA를 가지는 제제가 유사한 양의 ph젤라틴보다 안 좋은 안정성을 생성하는지를 결정하기 위해, rHSA 자체를 실험하였다. 결과는 rHSA 내의 성분, 예컨대 rHSA를 안정화시키기 위해 첨가되는 화합물 또는 오염물질로 인한 것으로 가정되었다. 대안적으로, 결과는 자체의 효과로 인할 수 있다.
25℃에서의 액체 저장 동안 암살상 HSV-1을 안정화시키는 능력에 대해 rHSA의 4개의 상이한 등급을 시험하였다. 대조군 제제를 2% 시그마, 1%, 2% 또는 4% 노보자임 알파, 1%, 2% 또는 4% 노보자임 알빅스, 또는 1%, 2% 또는 4% 노보자임 프라임 rHSA의 첨가에 의해 유지시켰다. 또한, 대조군 제제를 2% ph젤라틴의 첨가에 의해 또한 제조하고, 표 5를 참조한다. 이 제제를 상기 기재된 바대로 2주 동안 25℃에서 액체 안정성에 대해 시험하였다.
Figure 112017063879780-pct00006
각각의 rHSA 등급은 다른 순도의 수준 및 rHSA를 안정화시키도록 의도된 다른 성분을 가졌다. 시그마 재료는 연구 등급이고, 가장 낮은 안정화 효과를 가졌다. 노보자임으로부터의 3개의 등급(알파, 알빅스 및 프라임)은 상당히 더 높은 순도를 가졌지만, 각각은 다른 수준의 다른 성분을 가졌다. 노보자임 rHSA 등급은 시그마 등급보다 높은 안정성을 제공하였지만, 노보자임 rHSA 사이에 차이가 없었다. 또한, 모든 3개의 노보자임 rHSA는 증가하는 농도로 첨가될 때 나쁜 안정성을 나타냈다. 마지막으로, rHSA 등급, 및 ph젤라틴은 수행되지 않았고, 도 7a 내지 도 7d를 참조한다.
단백질의 하한
106 및 108 PFU/㎖ 암살상 HSV-1 농도를 안정화시키는 데 필요한 rHSA 및 ph젤라틴의 최소 양을 결정하기 위해 추가의 스크린을 수행하였다.
대조군 제제를 0.25%, 0.5% 및 1% w/v ph젤라틴 및 0.25%, 0.5% 및 1% w/v rHSA(노보자임 프라임)의 첨가에 의해 유지시켰다. 샘플을 106 및 108 PFU/㎖의 암살상 HSV-1 농도에 의해 제조하였다. 샘플의 일 세트를 상기 기재된 바대로 5회 동결/해동 사이클로 처리하였다. 상기 기재된 바대로 1개는 4주 동안 2 내지 8℃에서 및 1개는 2주 동안 25℃에서, 샘플의 2개의 세트를 액체 안정성에 대해 시험하였다. 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다.
ph젤라틴은 106 및 108 PFU/㎖ 바이러스 농도 둘 다에서 동결/해동 사이클 및 2 내지 8℃ 및 25℃에서의 액체 저장(도 8a 내지 도 8f) 동안 0.25%-1% w/v인 시험된 전체 범위에 걸쳐 보호를 제공하였다. rHSA 함유 제제는 모두 106 및 108 PFU/㎖ 바이러스 농도 둘 다에서 시험된 단백질 농도의 전체 범위에 걸쳐 2 내지 8℃ 및 25℃에서의 액체 저장 동안 감염력의 소실을 나타냈지만, 감염력이 소실이 동결 해동 사이클 동안 보이지 않았다(도 9a 내지 도 9f).
ph젤라틴이 더 낮은 수준에서 시험된 추가적인 스크린을 수행하였다. 대조군 제제를 0.01% 내지 0.5%(w/v)의 ph젤라틴의 첨가에 의해 유지시켰다. 샘플을 106 및 108 PFU/㎖의 암살상 HSV-1 농도에 의해 제조하고, 상기 기재된 바대로 2 내지 8℃ 및 25℃에서의 액체 안정성에 대해 시험하였다. 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다. ph젤라틴은 시험된 단백질 농도의 전체 범위(0.01% 내지 0.5%)에 걸쳐 액체 저장 동안 보호를 제공하였고, 도 8g 및 도 8h를 참조한다.
장기간 안정성
대조군 제제와 비교하여 단백질 함유 제제의 안정성을 결정하도록 장기간 연구를 수행하였다. 대조군 제제 또는 0.5%(w/v)의 rHSA 또는 ph젤라틴을 함유하는 대조군 제제에서 106 PFU/㎖ 및 108 PFU/㎖에서 암살상 HSV-1을 제제화하였다. 상기 기재된 바대로 2 내지 8℃ 및 25℃에서의 액체 저장; -30℃ 및 -70℃에서의 동결된 저장 동안 및 10회 동결 해동 사이클 동안 샘플을 평가하였다. 상기 기재된 바와 같은 플라크 검정에 의해 감염력(역가)을 결정하였다.
ph젤라틴 함유 제제는 다시 평가된 모든 저장 조건에 대해 탁월한 안정성을 제공하였다. rHSA 함유 제제는 오직 -30℃(도 10a 및 도 10b) 및 -70℃(도 10c 및 도 10d)에서 동결된 상태에서 저장된 제제에 대해 및 동결 해동의 10회 사이클로 처리될 때(도 10e 및 도 10f) (검정의 오차 내에) 유사한 안정성을 제공하였다. 그러나, 액체 상태에서의 저장 동안, ph젤라틴 제제는 더 높은 안정화 효과를 나타냈고, 이것은 106 PFU/㎖ 암살상 HSV-1 농도가 2 내지 8℃(도 10g 및 도 10h) 및 25℃(도 10i 및 도 10j)에서 저장될 때 가장 명확하다. 2 내지 8℃에서의 39주의 저장 후, ph젤라틴 함유 제제는 1.7 log 손실을 나타냈지만, rHSA 함유 제제는 2.9 log 손실을 나타냈다. 대조군 제제는 2 내지 8℃에서의 12주의 저장 후 모든 활성을 소실하였다. 25℃에서의 4주의 저장 동안, ph젤라틴 함유 제제는 2.3 log 손실을 나타냈지만, rHSA 함유 제제는 3.6 log 손실을 나타냈다. 대조군 제제는 25℃에서의 2주의 저장 후 모든 활성을 소실하였다.
제제의 입자 연구
108 PFU/㎖ 바이러스의 최종 농도로의 20%(w/v) rHSA 또는 ph젤라틴(또는 대조군 제제 완충제의 동등한 용적) 및 0.5% 안정화 단백질의 첨가에 의해 암살상 HSV-1을 제제화하였다. 이후, 용액을 입자 비함유 출발 물질을 생성하기 위해 실리콘 오일 프리 1회용 주사기(NORM-JECT(등록상표) Luer Slip Centric Ti(펜실베니아주 벨러폰테))를 사용하여 0.22㎛ 필터(Sterivex(상표명) EMD Millipore(매사추세츠주 빌레리카))를 통해 통과시켰다.
샘플의 일 세트를 상기 기재된 바대로(정적) 2 내지 8℃에서 저장하고, 샘플의 제2 세트를 -70℃에서 동결시키고 이후 2 내지 8℃에서 저장하였다(1 동결 해동 사이클).
준가시적인 분석 또는 가시적인 관찰에 의해 입자를 측정하였다.
0.5%(w/v) rHSA 또는 ph젤라틴을 함유하는 제제는 준가시적인 분석 기법(도 11a-11B 및 12A-12B)에 의해 측정된 바대로 대조군 제제와 비교하여 감소한 입자 형성을 나타냈다. 또한, 108 PFU/㎖의 농도의 암살상 HSV-1은 0.5% ph젤라틴 또는 rHSA를 함유하는 제제에서가 아니라 대조군 제제에서 가시적인 입자를 형성하였다.
참고문헌
Figure 112017063879780-pct00007

Claims (38)

  1. 단순 포진 바이러스 1;
    0.1% 내지 3% (w/v) 농도의 부분적으로 가수분해된 젤라틴 및 0.25% 내지 2.5% (w/v) 농도의 인간 혈청 알부민으로부터 선택된 단백질;
    0.5% 내지 4% (w/v) 농도의 소르비톨 및 9% 내지 15% (w/v) 농도의 수크로스로부터 선택된 당;
    50 내지 250 mM 농도의 염화나트륨; 및
    인산나트륨 또는 인산칼륨
    을 포함하는, pH 7-8인 동결 생 바이러스 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    단순 포진 바이러스 1;
    0.25% 내지 2.5% (w/v) 농도의 인간 혈청 알부민;
    0.5% 내지 3% (w/v) 농도의 소르비톨;
    50 내지 250 mM 농도의 염화나트륨; 및
    인산나트륨 또는 인산칼륨
    을 포함하는, pH 7-8인 생 바이러스 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    단순 포진 바이러스 1;
    0.25% 내지 2% (w/v) 농도의 인간 혈청 알부민;
    3% (w/v) 농도의 소르비톨;
    50 내지 250 mM 농도의 염화나트륨; 및
    인산나트륨 또는 인산칼륨
    을 포함하는, pH 7-8인 생 바이러스 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    단순 포진 바이러스 1;
    0.1% 내지 3% (w/v) 농도의 부분적으로 가수분해된 젤라틴;
    0.5% 내지 3% (w/v) 농도의 소르비톨;
    50 내지 250 mM 농도의 염화나트륨; 및
    인산나트륨 또는 인산칼륨
    을 포함하는, pH 7-8인 생 바이러스 조성물.
  5. 단순 포진 바이러스 1;
    0.1 내지 3% (w/v) 농도의 부분적으로 가수분해된 젤라틴;
    0.5 내지 3% (w/v) 농도의 소르비톨;
    50 내지 250 mM 농도의 염화나트륨;
    10-500 mM 농도의 인산나트륨
    을 포함하는, pH 7.4인 생 바이러스 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 4% (w/v)의 농도의 미오-이노시톨을 추가로 포함하는 생 바이러스 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    단순 포진 바이러스 1;
    0.5% (w/v) 농도의 부분적으로 가수분해된 젤라틴;
    2% (w/v) 농도의 소르비톨;
    145 mM 농도의 염화나트륨; 및
    102 mM 농도의 인산나트륨
    을 포함하는 생 바이러스 조성물로서,
    여기서 조성물은 4% (w/v) 농도의 미오-이노시톨을 추가로 포함하는,
    pH 7.4인 생 바이러스 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민이 재조합 인간 혈청 알부민인 생 바이러스 조성물.
  9. 제1항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 부분적으로 가수분해된 젤라틴이 돼지 유래(porcine)인 생 바이러스 조성물.
  10. 제1항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 0.1% 내지 1% (w/v) 농도의 부분적으로 가수분해된 젤라틴을 포함하는 생 바이러스 조성물.
  11. 제1항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 3% (w/v) 농도의 부분적으로 가수분해된 젤라틴을 포함하는 생 바이러스 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 0.25% 내지 2% (w/v) 농도의 인간 혈청 알부민을 포함하는 생 바이러스 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 0.5% 내지 4% (w/v) 농도의 소르비톨 및 9% 내지 15% (w/v) 농도의 수크로스를 포함하는 생 바이러스 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 0.5% 내지 3% (w/v) 농도의 소르비톨을 포함하는 생 바이러스 조성물.
  15. 제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 3% (w/v) 또는 2% (w/v) 농도의 소르비톨을 포함하는 생 바이러스 조성물.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 130 내지 160 mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 생 바이러스 조성물.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 137 mM 또는 145 mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 생 바이러스 조성물.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 10 내지 300 mM 농도의 인산나트륨을 포함하는 생 바이러스 조성물.
  19. 제1항 내지 제7항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단순 포진 바이러스 1이 탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec)TM, HSV1716, G207, OrienX010, NV1020 및 M032로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생 바이러스 조성물.
  20. 제1항 내지 제7항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단순 포진 바이러스 1이 탈리모겐 라허파렙벡TM인 생 바이러스 조성물.
  21. 제1항 내지 제7항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포를 사멸시키는데 사용하기 위한 생 바이러스 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 종양 세포를 사멸시키는데 사용하기 위한 생 바이러스 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 관문 저해제(check point inhibitor)와 조합하여 투여되는 것인 생 바이러스 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 관문 저해제와 조합하여 투여되는 것인 생 바이러스 조성물.
  25. 제21항에 있어서, 종양 세포가 성상세포종, 핍지교종, 뇌수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 상의세포종, 신경초종, 신경섬유육종, 수모세포종, 흑색종 세포, 췌장암 세포, 전립선 암종 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 간종양 세포, 중피종, 방광암 세포, 및 표피 암종 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생 바이러스 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 종양 세포가 흑색종 세포인 생 바이러스 조성물.
  27. 제22항에 있어서, 종양 세포가 성상세포종, 핍지교종, 뇌수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 상의세포종, 신경초종, 신경섬유육종, 수모세포종, 흑색종 세포, 췌장암 세포, 전립선 암종 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 간종양 세포, 중피종, 방광암 세포, 및 표피 암종 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생 바이러스 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 종양 세포가 흑색종 세포인 생 바이러스 조성물.
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