JP2023538643A - Ｃａｐ２構造を有する新規な５’キャップアナログおよびその調製方法 - Google Patents

Ｃａｐ２構造を有する新規な５’キャップアナログおよびその調製方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023538643A
JP2023538643A JP2023512445A JP2023512445A JP2023538643A JP 2023538643 A JP2023538643 A JP 2023538643A JP 2023512445 A JP2023512445 A JP 2023512445A JP 2023512445 A JP2023512445 A JP 2023512445A JP 2023538643 A JP2023538643 A JP 2023538643A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ppp
methyl
omea
omeg
omeu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2023512445A
Other languages
English (en)
Inventor
勇 胡
苗苗 張
丹 洪
迅 胡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Rhegen Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Rhegen Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Rhegen Biotechnology Co Ltd filed Critical Shenzhen Rhegen Biotechnology Co Ltd
Publication of JP2023538643A publication Critical patent/JP2023538643A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Infusion, Injection, And Reservoir Apparatuses (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

Cap2構造を有する5’キャップアナログおよびその調製方法。Cap2構造を有する5’キャップアナログの分子式は、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)などのいずれか一つから選択される。Cap2構造を有する5’キャップアナログは、高い合成効率、高いキャッピング効率、低い免疫原性、および高いタンパク質翻訳効率を有する。

Description

本出願は、2020年8月20日に中国特許庁に出願した出願番号：202010842263.2、名称「Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログおよびその調製方法」の中国特許出願の優先権を主張する。この全内容は、引用により本出願に包含される。
本発明は一般に、遺伝子工学技術の分野に関し、特に、Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログおよびその調製方法に関する。
翻訳効率と免疫原性は、mRNA薬物がその機能を発揮するための2つの重要な因子である。RIG-IやIFITなどの自己免疫タンパク質は、キャップが異常なmRNAを認識することで、外来性mRNAの細胞内での活性や半減期を低下させ、mRNA薬物がインビボで機能することを困難にする。したがって、mRNAのキャップ構造を最適化することは、mRNAの生物学的活性を改善し、mRNAの免疫原性を低下させるのに不可欠である。
現在、キャップ構造を有するmRNAをインビトロで合成する方法は2つある。第一の方法は、mRNAを転写した後に、それをワクシニアウイルスキャッピング酵素でキャッピングし、Cap0構造またはCap1構造を有するRNAを生成する。この方法は効率的であるが、収量が不安定であり、費用が高くつく。また、この酵素的キャッピング法では、Cap2構造およびm6Am構造を有するキャップを生成できない。第二の方法は、転写中にキャッピングするために過剰量のキャップアナログを添加する。最も一般的に使用されている構造的キャップアナログはARCAであり、ARCAを用いて免疫原性Cap0を生成できるが、キャッピング効率は70％に過ぎない。また、この方法は、転写反応系1mlあたり最大1.5mgのRNAが調製されるように収率が比較的低いが、転写産物は高い免疫原性を有する。また、クリーンキャップ(Cleancap)と称される別の新しい同時転写キャッピング法も広く利用されている。Cleancapは、Cap1に属し、二量体(m7GpppG)を用いてT7転写を開始するARCAとは異なり、三量体(m7GpppAmG)を用いてT7転写を開始する。この方法は、転写反応系1mlあたり4mgのキャッピングされたRNAが調製され、キャップ効率が90%と収率が比較的高いが、その転写産物はARCAよりも免疫原性が低い。
mRNA合成系における既存のキャップアナログの低いキャッピング効率、合成体積あたりの少ないmRNA収量、および高い免疫原性といった欠点に基づき、本発明者らは、これらの応用上の欠点を補うだけでなく、タンパク質の翻訳効率を大幅に改善させた、Cap2構造を有する新規なキャップアナログを開発した。
上記の理由を背景に、本発明は、Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログおよびその調製方法を提供する。また、本発明により提供されるCap2構造を有する新規な5’キャップアナログは、高い合成効率、高いキャッピング効率、低い免疫原性および高いタンパク質翻訳効率を有している。
本発明は、以下の技術的解決手段により実現される。
Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログであって、その新規な5’キャップアナログは、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp (5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、および
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)
から選択されるいずれか一つの分子式を有する。
本発明はさらに、上記の技術的解決手段に記載のCap2構造を有する新規な5’キャップアナログの調製方法であって、
(1) 2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPを得る工程；
(2) 工程1)から得られた2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPをRNase不含水に溶解し、それぞれ7-メチルグアノシン、7-メチル-3’-Oメチルグアノシン、グアノシルトランスフェラーゼ、および2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)を得る工程；および
(3) 工程(2)から得られたm7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)をそれぞれRNase不含水に溶解し、T4 RNAリガーゼ1と混合し、次にそれぞれ2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPと混合し、次いで2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液と混合し、インキュベートすることで、Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログを得る工程、
を含む方法を提供する。
好ましくは、工程1)において2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTP、および2’-O-メチル-UTPの量とRNase不含水の容積との比は、1～30mmol:14μLである。
好ましくは、工程1)においてRNase不含水とリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液との容積比は14:1:15である。
好ましくは、リン酸ヒドロラーゼは、50,000Uの酵素活性を有する。
2×反応緩衝液の構成成分は、50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2、および1mM DTTを含み、pH値が8である。
好ましくは、工程1)～3)のインキュベーション温度はそれぞれ37℃であり、そのインキュベーション時間はそれぞれ1hである。
好ましくは、工程2)において、RNase不含水と7-メチル-グアノシン、7-メチル-3’-O-メチル-グアノシン、グアノシルトランスフェラーゼおよび2×反応緩衝液との容積比は11:10:10:1:22である。
好ましくは、工程3)において、RNase不含水とT4 RNAリガーゼ1および2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液との容積比は11:1:22である。
好ましくは、2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液の構成成分は、60mM Tris-HCl、20mM MgCl2、20mM DTTおよび2mM ATPを含む。
好ましくは、T4 RNAリガーゼ1の酵素活性は10,000Uである。
本発明の有益な効果は、以下の通りである。
本発明におけるCap2構造を有するキャップアナログ32種類は、既存のキャップアナログであるARCAおよびCleancapと比べて、高い合成効率を有し、
本発明におけるCap2構造を有するキャップアナログ32種類は、既存のキャップアナログであるARCAおよびCleancapと比べて、高いキャッピング効率を有し、
本発明におけるCap2構造を有するキャップアナログ32種類は、既存のキャップアナログであるARCAおよびCleancapと比べて、低い免疫原性を示し、そして
本発明におけるCap2構造を有するキャップアナログ32種類は、既存のキャップアナログであるARCAおよびCleancapと比べて、高いタンパク質翻訳効率を有する。
図1は、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を用いて、25℃で各最終製品の構造および均質性を確認したものである。
図2は、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を用いて、25℃で各最終製品の構造および均質性を確認したものである。
図3は、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を用いて、25℃で各最終製品の構造および均質性を確認したものである。
図4は、キャップアナログと結合した生成物の蛍光滴定曲線を示すものである。リガンド濃度が高くなるにつれて、曲線の変化はeIF4Eと対応するCapアナログとの間の結合が弱くなることを示す。リガンド濃度の増加に伴う蛍光シグナルの増加は、溶液中の遊離キャップアナログの増加によるものである。蛍光強度は相対値で示す。
図5は、キャップアナログと結合した生成物の蛍光滴定曲線を示すものである。リガンド濃度が高くなるにつれて、曲線の変化はeIF4Eと対応するCapアナログとの間の結合が弱くなることを示す。リガンド濃度の増加に伴う蛍光シグナルの増加は、溶液中の遊離キャップアナログの増加によるものである。蛍光強度は相対値で示す。
図6は、キャップアナログと結合した生成物の蛍光滴定曲線を示すものである。リガンド濃度が高くなるにつれて、曲線の変化はeIF4Eと対応するCapアナログとの間の結合が弱くなることを示す。リガンド濃度の増加に伴う蛍光シグナルの増加は、溶液中の遊離キャップアナログの増加によるものである。蛍光強度は相対値で示す。
図7は、キャップアナログと結合した生成物の蛍光滴定曲線を示すものである。リガンド濃度が高くなるにつれて、曲線の変化はeIF4Eと対応するCapアナログとの間の結合が弱くなることを示す。リガンド濃度の増加に伴う蛍光シグナルの増加は、溶液中の遊離キャップアナログの増加によるものである。蛍光強度は相対値で示す。
図8は、ウサギ網状赤血球抽出液グロビンmRNA翻訳の阻害に対するキャップアナログの作用を示すものであり、ウサギ網状赤血球抽出液系中で天然ウサギグロビンmRNAを翻訳し、タンパク質に[3 H]Leuを取り込むことによりグロビン合成を検出したものである。
図9は、本発明により提供されるキャップアナログの一般構造式を示すものである。
図10は、本発明により提供されるCap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類をmRNA合成に適用すると、mRNAの合成効率が効果的に向上し、かつCap2構造を有する新規なキャップアナログを用いた合成生成物(4～6mg)は、合成系1mlあたりARCA(1.5mg)およびCleancap(3.8mg)よりも有意に高いことを示している。
図11は、本発明により提供されるCap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類をmRNA合成に適用すると、mRNAのキャッピング効率が効果的に向上し、かつ同じ合成条件でCap2構造を有する新規なキャップアナログを用いた合成生成物の95％がキャッピングされ、これはARCAの70％、Cleancapの90％よりも高いことを示している。
図12は、本発明により提供されるCap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類をmRNA合成に適用すると、免疫原性が効果的に低下し、かつCap2構造を有する新規なキャップアナログを用いた合成生成物の細胞内免疫原性は、ACRA構造を用いた同一のmRNAのそれの9～52％に過ぎないことを示している。
図13は、本発明により提供されるCap2構造を有する新規なキャップアナログをmRNA合成に適用すると、タンパク質の翻訳効率が効果的に改善することを示すものである。ルシフェラーゼ(Luc)をコードするmRNAをARCA、Cleancap、およびCap2構造を有する新規なキャップアナログでそれぞれキャッピングし、マウスにおけるこれら3つのmRNAの発現強度を比較したところ、Cap2構造を有する新規なキャップアナログを用いたLuc mRNAが最も発現強度が高いことが分かった。
発明の詳細な説明
本発明は、Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログであって、Cap2構造を有する該新規な5’キャップアナログは、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp (5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、および
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)
から選択されるいずれか一つの分子式を有する、5’キャップアナログを提供する。
本発明において、記載されているCap2構造を有する新規な5’キャップアナログの共通点は、2’OMeのメトキシ修飾、AGCUおよびm7Gヌクレオシドのメトキシ修飾、すなわち2’OMeAまたは2’OMeGまたは2’OMeCまたは2’OMeU、および3’-O-Me-m7Gに基礎としている。Cap2構造を有する新規なキャップは、酵素反応によって形成される。
本発明はさらに、上記の技術的解決手段に記載のCap2構造を有する新規な5’キャップアナログの調製方法であって、
1) 2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPを得る工程；
2) 工程1)から得られた2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれ7-メチルグアノシン、7-メチル-3’-Oメチルグアノシン、グアノシルトランスフェラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)を得る工程；および
3) 工程2)から得られたm7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)をそれぞれRNase不含水に溶解し、T4 RNAリガーゼ1と混合し、次にそれぞれ2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPと混合し、次いで2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液と混合し、インキュベートすることで、Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログを得る工程、
を含む方法を提供する。
本発明において、2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPを得る。本発明において、2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPは市販品である。
本発明において、2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPの量とRNase不含水の容積との比は、好ましくは全て1～30mmol:14μLであり、より好ましくは、10mmol:14μLである。2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPは、特に供給源が限定されず、市販品として入手されるか常法により調製され得る。本発明において、RNase不含水とリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液との容積比は、好ましくは14:1:15である。本発明において、リン酸ヒドロラーゼの酵素活性は、好ましくは50,000Uであり；2×反応緩衝液の構成成分は、好ましくは、50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2および1mM DTTを含み、pH値が8である。本発明において、インキュベーション温度は、好ましくは37℃であり、インキュベーション時間は、好ましくは1hである。本発明において、2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPは、好ましくは、HPLCにより精製され、次にRNase不含水に溶解される。
本発明において、得られた2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれ7-メチルグアノシン、7-メチル-3’-Oメチルグアノシン、グアノシルトランスフェラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、インキュベートすることで、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)を得る。
本発明において、RNase不含水と7-メチルグアノシン、7-メチル-3’-O-メチルグアノシン、グアノシルトランスフェラーゼおよび2×反応緩衝液との容積比は、好ましくは11:10:10:1:22である。本発明において、グアノシルトランスフェラーゼの酵素活性は、好ましくは50,000Uである。本発明において、2×反応緩衝液の構成成分は、好ましくは、50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2および1mM DTTを含み、pH値が8である。7-メチルグアノシンおよび7-メチル-3’-O-グアノシンの供給源は特に制限されず、従来から市販されているもの、または通常の調製方法により調製することができるものである。本発明において、インキュベーション温度は、好ましくは37℃であり、インキュベーション時間は、好ましくは1hである。
本発明において、得られたm7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)をそれぞれRNase不含水に溶解し、T4 RNAリガーゼ1と混合し、次にそれぞれ2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-ATPおよび2’-O-メチル-UTPと混合し、次いで2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液と混合し、インキュベートすることで、新規なCap2構造5’キャップアナログを得る。
本発明において、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)は、好ましくは、HPLCにより精製され、次にRNase不含水に溶解される。
本発明において、RNase不含水とT4 RNAリガーゼ1および2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液との容積比は、好ましくは11:1:22である。本発明において、T4 RNAリガーゼ1は、好ましくは10,000Uの酵素活性を有する。本発明において、2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液の構成成分は、好ましくは、60mM Tris-HCl、20mM MgCl2、20mM DTTおよび2mM ATPを含む。本発明において、インキュベーション温度は、好ましくは37℃であり、インキュベーション時間は、好ましくは1hである。
以下、本発明により提供される技術的解決手段を実施態様と関連付けて詳細に説明するが、これらは本発明の保護範囲を限定するために使用されるべきではない。
実施例1
1. 10mmolの2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPまたは2’-O-メチル-UTPをそれぞれRNase不含水に溶解して総容積を14μLとした。リン酸ヒドロラーゼ1μL(50,000U)および2×反応緩衝液(50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM DTT、pH値8)15μLを添加した後、混合物を37℃で1hインキュベートして2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPを得た。
2. 上記で得られた2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPをそれぞれHPLCにより精製し、RNase不含水に溶解して、総容積を11μLとした。
3. 工程2で得られた溶液に、7-メチルグアノシン10μL(10mmol)、7-メチル-3’-O-メチルグアノシン10μL(10mmol)およびグアノシルトランスフェラーゼ1μL(50,000 U)を添加した。2×反応緩衝液(50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2および1mM DTT、pH値8)22μLを添加し、混合物を37℃で1hインキュベートすることで、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)または3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)を得た。
4. 工程3で得られた溶液をHPLCにより精製し、RNase不含水に溶解しておき、総容積を11μLとした。
5. 工程4で得られた溶液に、10μL(10mmol)の2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPまたは2’-O-メチル-UTPをそれぞれ1μL(10,000U)のT4 RNAリガーゼ1(ssRNAリガーゼNEB M0437M)ともに添加した。2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液(60mM Tris-HCl(25℃でpH7.8)、20mM MgCl2、20mM DTTおよび2mM ATP)22μLを添加した後、混合物を37℃で1hインキュベートすることで、Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログを得た。
6. 工程5で得られた溶液をHPLCにより精製し、RNase不含水に溶解した:
1) RP HPLC実験パラメータを流速1mL/min(内径が4.6mmであるクロマトグラフカラム)；0.1mL/min(内径が2.1mmであるクロマトグラフカラム)にセットし；
2) 試料(0.1mgL/ml)100μLを注入し(すなわち、測定されたキャップアナログの量はそれそれ10μg、流速lmL/minで1μg=100mAU)；2.1mmのクロマトグラフカラムに0.1mg/mLの濃度の標準タンパク質10μLを添加し、すなわち、測定されたキャップアナログの量はそれぞれ1μg(流速0.1mL/minで1μg=100mAU)；
3) 試料の収集において、キャッピングされたポリプロピレン微小遠心管中で溶出したピックを収集し、蓋をしっかりと閉めて、-20℃で保存した。
分子式は、以下の通りである:
1. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
2. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
3. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
4. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
5. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
6. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
7. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
8. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
9. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
10. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
11. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
12. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
13. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
14. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
15. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、
16. m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)、
17. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
18. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp (5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
19. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
20. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
21. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
22. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
23. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
24. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
25. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
26. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
27. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
28. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
29. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
30. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
31. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、および
32. 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)。
調製したCap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類を、25℃でRP HPLCを用いて同定した。その結果を図1～3に示す。
実施例2
実施例1で調製したCap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類のeIF4Eへの結合能力を試験した結果、結合能力が高いほど翻訳活性が強いと結論付けられた。
キャップアナログのeIF4Eへの結合能力を検討した。真核生物の開始因子である4E(eIF4E)は、mRNAの5’末端にあるキャップ構造を特異的に認識するキャップ結合タンパク質であり、真核生物の翻訳開始において重要な役割を担っている。eIF4Eは、その自身にトリプトファンが存在するため、波長280nmで励起され、波長337nmで蛍光を検出することができる。キャップ構造と結合した後は蛍光が減衰するため、本法はキャップ構造のelF4Eへの結合能力を検出するための標準として役立つ。その結果を図4-7に示す。
実験方法：0.1μM eIF4Eタンパク質(溶媒:50mM HEPES/KOH(pH7.2)、100mM KCl、0.5mM EDTAおよび1mM DTT)1.4 mLに、様々な濃度のキャップ構造溶液1μLを滴下し、波長280nmで励起し、波長337nmで蛍光変化を検出した。
実施例3
実施例1で調製したCap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類の生物活性は、グロビン発現レベルに対するCap2構造を有するキャップアナログの作用を試験することにより決定した。
ウサギ網状赤血球抽出液をマイクロコッカスヌクレアーゼで処理して核酸を除去し、mRNAが発現できるmRNAのインビトロ翻訳系として機能する。該翻訳系に天然ウサギグロブリンmRNAを最終濃度5ug/mLで3H標識ロイシンとともに添加した。Cap2構造を有するキャップアナログ(対照としてARCAおよびCleancap)100μmolを1mLの反応系にそれぞれ添加し、24時間後に反応系中のタンパク質を抽出して、グロブリン3H含有量を測定した。
キャップアナログはeIF4Eへの結合を競合するため、組み込まれたキャップアナログがeIF4Eに強く結合するほど、組み込まれた天然mRNAの翻訳レベルは低下し、グロビンの3H含量は低下する。その結果を図8に示す。
実験方法：ウサギ網状赤血球抽出液をミクロコッカスヌクレアーゼ処理して核酸を除去したものを、mRNAが発現できるインビトロ翻訳系の反応系として使用した。天然ウサギグロブリンmRNAを最終濃度5μg/mlで3H標識ロイシンとともに系に添加した。Cap2構造を有するキャップアナログ(ARCAおよびCleancapを対照として使用)100μmolを反応系の各1mlに添加し、24時間後に反応系中のタンパク質を抽出した。グロブリンの3H含有量を測定した。
実施例4
実施例1で調製したCap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類をmRNA合成に適用したところ、mRNAの合成効率が効果的に向上した(4～6mg/mL)。
実験方法：
1. mRNAを合成する前に、プラスミドをNotIで直鎖化し、4℃で一晩消化し(digested)；
2. DNA鋳型で抽出し；
3. ARCA、Cleancap、および本発明における32種類のCap2をそれぞれCap構造として用い、mRNAをインビトロで転写合成する。反応系は表1に示す。
Figure 2023538643000002
4. LiCl溶液を用いて転写産物を精製し、反応収率を算出する。
その結果を表2および図10に示す。ARCAキャップ構造を用いて転写反応系1mlあたり1.5mgまでのmRNAを、Cleancapを用いて転写反応系1mlあたり3.8mgまでのmRNAを、本発明におけるCap2を用いて転写反応系1mlあたり4～6mgまでのmRNAを調製した。
Figure 2023538643000003
実施例5
実施例1で調製したCap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類をmRNA合成に適用したところ、キャッピング効率が効果的に向上した(95～98％)。
実験方法：
実施例1で得られた種々のキャップ構造を有するmRNA分子を酵素的に切断し、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリー分析実験において、キャッピングされたmRNA分子とキャッピングされていないmRNA分子の比率を決定することができた。
ビーズ前処理：
1. 磁石を用いてビーズを濃縮し、上澄保存溶液を吸引し、等容量の0.1M NaOH＋0.05M NaClを添加；
2. 上澄を吸引し、等容量の0.1M NaClを用いてビーズを再懸濁させ、濃度を一定に保持；
3. mRNAおよび切断タグをアニールし、以下の反応系を設定；
Figure 2023538643000004
4. 切断タグとビーズとを組み合わせ；
ビーズを15,000gで5分間遠心分離し、上清を除去し、次に、120μlのアニールしたmRNAおよびタグを添加し、室温で30分間インキュベートし、その間、軽く振盪して十分に結合するように確保した。
5. RNase Hを用いて酵素切断；
RNase H 10μlを添加し、37℃で3時間インキュベートする。磁石を用いてビーズを沈降させ、上清を捨てる。
洗浄緩衝液100μlを添加し、完全に混合し、磁石を用いて2分間沈降させ、上清を捨てる。これを3回繰り返す。
6. RppHを用いて加水分解；
ネバッファー2に10単位のRppHを使用し、室温で1時間加水分解を行う。
7. 純水で3回洗浄；
8. 溶出；
DI水を吸引し、80℃に予熱した75％エタノール100μlを添加し、3分間インキュベートし、磁気を用いて3分間沈降させた。上清を採取し、次いで蒸発させ、45分間遠心分離して10μlの容量にした。最後に、試料を50μlの100M EDTA/1% MeOHに再懸濁させ、LC-MS分析した。
9. 合成した様々なキャップアナログのmRNAキャッピング率をLC-MSで分析した。
その結果を表4と図11に示す。ARCAキャップ構造を用いた場合、転写産物の最大キャッピング率は70％、Cleancapを用いた場合、転写産物の最大キャッピング率は90％、本発明におけるCap2を用いた場合、転写産物の最大キャッピング率は95％にまで達した。
Figure 2023538643000005
実施例6
実施例1で調製した、Cap2構造を有する新規なキャップアナログ32種類をmRNA合成に適用したところ、免疫原性を効果的に低減した。
実験方法：細胞内免疫タンパク質であるTLR3、TLR7、TLR8およびRIG-1を、RNA免疫沈降によりそれに結合結合しているRNAとともに免疫沈降させ、最後にリアルタイム定量PCRによりこれらのmRNAを同定したところ、その相対的存在量が免疫原性に比例していた。
実験方法：
1. 細胞採取
ヒト由来PBMC細胞を106細胞/ウェルで培養し、Lipofectamine 2000を用いて細胞に、ARCAを有するmRNA、Cleancapを有するmRNA、Cap2構造を有するmRNAをそれぞれ5μgでトランスフェクトした。24時間後にトリプシン消化により細胞を収集し、PBSに再懸濁させ、遠心分離して収集した。
2. 細胞の固定と溶解
細胞に固定剤を添加し、15分後にグリシンを添加して固定を終了させ、次いで、遠心分離して細胞を収集した。溶解液を添加することによって細胞を再懸濁させ、4℃の氷上で30分間インキュベートし、2400gで10分間遠心分離し、上清を収集した。
3. RNA免疫沈降
TLR3、TLR7、TLR8およびRIG-1抗体(2～10μg)を上清(6～10mg)に添加し、次いで、4℃で2時間軽くインキュベートした。次に、それにタンパク質A/Gビーズ(40μL)を添加し、4℃で1時間軽くインキュベートした。
4. 結合していない物質の洗い出し
沈降した磁気ビーズを2500rpmで30秒間遠心分離し、上清を除去する。ビーズを500μLのRIP緩衝液に再懸濁させる。RIP緩衝液で合計3回洗浄し、次いでPBSで1回洗浄する。
5. 免疫沈降した後、RBPに結合したRNAを精製
磁気ビーズをTRIzol RNA抽出試薬(1mL)に再懸濁させ、共沈したRNAを単離し、次にヌクレアーゼ不含水(20μL)を用いてRNAを溶出する。
6. RNAをcDNAに逆転写(RT)し、mRNAの配列に従ってプライマーを設計して定量PCR分析を行う。mRNAの免疫原性は、磁気ビーズにより沈降したmRNAのコピー数に比例する。
その結果を表5および図12に示す。本発明におけるCap2構造を有するキャップを含むmRNAの免疫原性は、ARCA構造を有するキャップおよびCleancap構造を有するキャップの免疫原性と比較して有意に低い。
表5 様々なキャップ構造を用いた場合のmRNAの細胞内免疫原性の結果はすべてARCAに対する相対値である。
Figure 2023538643000006
実施例7
実施例1で調製したCap2構造を有する新規なキャップアナログをmRNA合成に適用した場合の有効なタンパク質翻訳効率。
実験方法：
等量のルシフェラーゼをコードするmRNAをマウスの背中に皮下注射し、24時間後にルシフェラーゼ基質を尾静脈に注射したところ、発光強度は、有効な標的タンパク質翻訳率に比例していた。
その実験結果を図13に示す。本方法におけるCap2構造を有する新規なキャップアナログをmRNA合成に適用した場合の有効なタンパク質翻訳効率は、ARCAおよびCleancapのキャップ構造の場合よりも有意に高い。
上記は本発明の好ましい実施態様にすぎず、当業者であれば、本発明の原理から逸脱することなく他の改良および装飾を行うことができ、これらの改良および装飾も本発明の保護範囲として考慮されるべきであることに留意すべきである。
上記は本発明の好ましい実施態様にすぎず、当業者であれば、本発明の原理から逸脱することなく他の改良および装飾を行うことができ、これらの改良および装飾も本発明の保護範囲として考慮されるべきであることに留意すべきである。
さらに、本願発明は次の態様を含む。
１．Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログであって、Cap2構造を有する該新規な5’キャップアナログは、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、
m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp (5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、および
3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)
から選択されるいずれか一つの分子式を有することを特徴とする、5’キャップアナログ。
２．項1に記載のCap2構造を有する新規な5’キャップアナログの調製方法であって、
1) 2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPを得る工程；
2) 工程1)から得られた2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれ7-メチルグアノシン、7-メチル-3’-O-メチルグアノシン、グアノシルトランスフェラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)を得る工程；および
3) 工程2)から得られたm7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)をそれぞれRNase不含水に溶解し、T4 RNAリガーゼ1と混合し、次にそれぞれ2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPと混合し、次いで2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液と混合し、インキュベートすることで、Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログを得る工程、
を含むことを特徴とする方法。
３．工程1)において、2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPの量とRNase不含水の容積との比が、1～30mmol:14μLであることを特徴とする、項2に記載の調製方法。
４．工程1)において、RNase不含水とリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液との容積比が、14:1:15であることを特徴とする、項2に記載の調製方法。
５．リン酸ヒドロラーゼが、50,000Uの酵素活性を有し、
2×反応緩衝液の構成成分が、50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl 2 および1mM DTTを含み、pH値が8であることを特徴とする、項4に記載の調製方法。
６．工程1)～工程3)のインキュベーション温度がそれぞれ37℃であり、そのインキュベーション時間がそれぞれ1hであることを特徴とする、項2に記載の調製方法。
７．工程2)において、RNase不含水と7-メチル-グアノシン、7-メチル-3’-O-メチル-グアノシン、グアノシルトランスフェラーゼおよび2×反応緩衝液との容積比が、11:10:10:1:22であることを特徴とする、項2に記載の調製方法。
８．RNase不含水とT4 RNAリガーゼ1および2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液との容積比が、11:1:22であることを特徴とする、項3に記載の調製方法。
９．2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液の構成成分が、60mM Tris-HCl、20mM MgCl 2 、20mM DTTおよび2mM ATPを含むことを特徴とする、項2または8に記載の調製方法。
１０．T4 RNAリガーゼ1の酵素活性が、10,000Uであることを特徴とする、項2または8に記載の調製方法。

Claims (10)

  1. Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログであって、Cap2構造を有する該新規な5’キャップアナログは、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、
    m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeG)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp (5’)(2’OMeG)p(2’OMeG)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeG)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeG)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeA)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeA)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeA)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeA)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeC)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeC)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeC)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeC)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)p(2’OMeU)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)p(2’OMeU)、
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeC)p(2’OMeU)、および
    3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeU)p(2’OMeU)
    から選択されるいずれか一つの分子式を有することを特徴とする、5’キャップアナログ。
  2. 請求項1に記載のCap2構造を有する新規な5’キャップアナログの調製方法であって、
    1) 2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPを得る工程；
    2) 工程1)から得られた2’-O-メチル-ADP、2’-O-メチル-GDP、2’-O-メチル-CDPおよび2’-O-メチル-UDPをそれぞれRNase不含水に溶解し、それぞれ7-メチルグアノシン、7-メチル-3’-O-メチルグアノシン、グアノシルトランスフェラーゼおよび2×反応緩衝液と混合し、次いでインキュベートすることで、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)を得る工程；および
    3) 工程2)から得られたm7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)および3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA/G/C/U)をそれぞれRNase不含水に溶解し、T4 RNAリガーゼ1と混合し、次にそれぞれ2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPと混合し、次いで2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液と混合し、インキュベートすることで、Cap2構造を有する新規な5’キャップアナログを得る工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  3. 工程1)において、2’-O-メチル-ATP、2’-O-メチル-GTP、2’-O-メチル-CTPおよび2’-O-メチル-UTPの量とRNase不含水の容積との比が、1～30mmol:14μLであることを特徴とする、請求項2に記載の調製方法。
  4. 工程1)において、RNase不含水とリン酸ヒドロラーゼおよび2×反応緩衝液との容積比が、14:1:15であることを特徴とする、請求項2に記載の調製方法。
  5. リン酸ヒドロラーゼが、50,000Uの酵素活性を有し、
    2×反応緩衝液の構成成分が、50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2および1mM DTTを含み、pH値が8であることを特徴とする、請求項4に記載の調製方法。
  6. 工程1)～工程3)のインキュベーション温度がそれぞれ37℃であり、そのインキュベーション時間がそれぞれ1hであることを特徴とする、請求項2に記載の調製方法。
  7. 工程2)において、RNase不含水と7-メチル-グアノシン、7-メチル-3’-O-メチル-グアノシン、グアノシルトランスフェラーゼおよび2×反応緩衝液との容積比が、11:10:10:1:22であることを特徴とする、請求項2に記載の調製方法。
  8. RNase不含水とT4 RNAリガーゼ1および2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液との容積比が、11:1:22であることを特徴とする、請求項3に記載の調製方法。
  9. 2×T4 RNAリガーゼ反応緩衝液の構成成分が、60mM Tris-HCl、20mM MgCl2、20mM DTTおよび2mM ATPを含むことを特徴とする、請求項2または8に記載の調製方法。
  10. T4 RNAリガーゼ1の酵素活性が、10,000Uであることを特徴とする、請求項2または8に記載の調製方法。
JP2023512445A 2020-08-20 2020-10-29 Ｃａｐ２構造を有する新規な５’キャップアナログおよびその調製方法 Withdrawn JP2023538643A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010842263.2A CN111944864B (zh) 2020-08-20 2020-08-20 一种Cap2结构5＇帽子类似物及其制备方法
CN202010842263.2 2020-08-20
PCT/CN2020/124720 WO2022036858A1 (zh) 2020-08-20 2020-10-29 一种新型Cap2结构5'帽子类似物及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023538643A true JP2023538643A (ja) 2023-09-08

Family

ID=73358694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023512445A Withdrawn JP2023538643A (ja) 2020-08-20 2020-10-29 Ｃａｐ２構造を有する新規な５’キャップアナログおよびその調製方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230304058A1 (ja)
EP (1) EP4202053A1 (ja)
JP (1) JP2023538643A (ja)
KR (1) KR20230050447A (ja)
CN (31) CN113337559A (ja)
AU (1) AU2020464470A1 (ja)
WO (1) WO2022036858A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113603739A (zh) * 2021-08-27 2021-11-05 上海兆维科技发展有限公司 一种加帽类似物及其应用
CN115260264B (zh) * 2022-02-28 2023-06-09 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的化合物及其应用
CN114540444B (zh) * 2022-04-23 2022-08-09 江苏申基生物科技有限公司 一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系
CN117645642A (zh) * 2022-09-05 2024-03-05 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的化合物及其应用
WO2024077351A1 (en) * 2022-10-12 2024-04-18 Pharmorage Pty Limited Modified oligonucleotides
CN118048420A (zh) * 2024-04-16 2024-05-17 楷拓生物科技(苏州)有限公司 一种加帽mRNA的制备方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6312926B1 (en) * 1998-08-14 2001-11-06 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey mRNA capping enzymes and uses thereof
US7074596B2 (en) * 2002-03-25 2006-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues
ES2500515T3 (es) * 2007-06-19 2014-09-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Síntesis y utilización de análogos de fosforotioato antiinversos de la caperuza de ARN mensajero
WO2009135212A2 (en) * 2008-05-02 2009-11-05 Epicentre Technologies Corporation Selective 5' ligation tagging of rna
EP2197901B1 (en) * 2007-10-09 2013-12-11 European Molecular Biology Laboratory (Embl) Soluble fragments of influenza virus pb2 protein capable of binding rna-cap
EP3248618A1 (en) * 2009-04-22 2017-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
JP2016504050A (ja) * 2013-01-17 2016-02-12 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 細胞表現型の改変のためのシグナルセンサーポリヌクレオチド
AU2014239264A1 (en) * 2013-03-14 2015-08-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Quantitative assessment for cap efficiency of messenger RNA
EP3954224A1 (en) * 2015-09-21 2022-02-16 TriLink BioTechnologies, LLC Compositions and methods for synthesizing 5'-capped rnas
PL415967A1 (pl) * 2016-01-29 2017-07-31 Univ Warszawski 5'-tiofosforanowe analogi końca 5' mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanie
WO2018075827A1 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Trinucleotide mrna cap analogs
AU2019355177A1 (en) * 2018-10-04 2021-05-06 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
US11072808B2 (en) * 2018-10-04 2021-07-27 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
CN110218753A (zh) * 2019-05-27 2019-09-10 湖北爱济莱斯生物科技有限公司 一种提高体外合成mRNA稳定性的方法
CN110331147A (zh) * 2019-06-21 2019-10-15 苏州吉玛基因股份有限公司 一种mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
CN110760535A (zh) * 2019-10-23 2020-02-07 青岛宁逸生物科技有限公司 一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法、利用载体转录得到mRNA的方法和应用
CN111041025B (zh) * 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CN111218458B (zh) * 2020-02-27 2020-11-20 珠海丽凡达生物技术有限公司 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113122595A (zh) 2021-07-16
CN113106135A (zh) 2021-07-13
CN113122596A (zh) 2021-07-16
CN113308504A (zh) 2021-08-27
WO2022036858A1 (zh) 2022-02-24
CN113278666A (zh) 2021-08-20
CN113337558A (zh) 2021-09-03
CN113337559A (zh) 2021-09-03
CN111944864A (zh) 2020-11-17
CN113234776A (zh) 2021-08-10
CN113234781A (zh) 2021-08-10
EP4202053A1 (en) 2023-06-28
CN113416762A (zh) 2021-09-21
CN113337560A (zh) 2021-09-03
KR20230050447A (ko) 2023-04-14
AU2020464470A9 (en) 2024-06-13
CN113234782A (zh) 2021-08-10
CN113278667A (zh) 2021-08-20
AU2020464470A1 (en) 2023-05-04
CN113234780A (zh) 2021-08-10
CN113234778A (zh) 2021-08-10
CN113201566A (zh) 2021-08-03
CN113234777A (zh) 2021-08-10
CN113122597A (zh) 2021-07-16
CN113355381A (zh) 2021-09-07
CN113234775A (zh) 2021-08-10
CN113106133A (zh) 2021-07-13
CN113234779A (zh) 2021-08-10
CN113355380A (zh) 2021-09-07
CN113416763A (zh) 2021-09-21
CN113122596B (zh) 2023-01-24
CN113106134A (zh) 2021-07-13
US20230304058A1 (en) 2023-09-28
CN113278665A (zh) 2021-08-20
CN111944864B (zh) 2021-06-22
CN113136405A (zh) 2021-07-20
CN113308503A (zh) 2021-08-27
CN113337561A (zh) 2021-09-03
CN113278668A (zh) 2021-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023538643A (ja) Ｃａｐ２構造を有する新規な５’キャップアナログおよびその調製方法
JP7198555B2 (ja) カンナビノイドおよびカンナビノイド誘導体を産生するための微生物および方法
Muthukrishnan et al. Influence of 5'-terminal m7G and 2'-O-methylated residues on messenger ribonucleic acid binding to ribosomes
Behrens et al. Small nuclear ribonucleoprotein (RNP) U2 contains numerous additional proteins and has a bipartite RNP structure under splicing conditions
EP3663319A1 (en) Preparation method for novel fusion protein and use of fusion protein for improving protein synthesis
WO2018236617A1 (en) USE OF THERMOSTABLE POLYMERAS RNA TO PRODUCE RNA WITH REDUCED IMMUNOGENICITY
Fisinger et al. Thebaine synthase: a new enzyme in the morphine pathway in Papaver somniferum
CN111411099B (zh) 雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用
Baldwin et al. Exchange of the valine 2-H in the biosynthesis of L-δ-(α-aminoadipoyl)-L-Cysteinyl-D-valine
JP6635535B1 (ja) Ｅｆｐタンパク質を発現する大腸菌およびそれを用いたフラボノイド化合物製造方法
CN114703162A (zh) 一种具有高转录活性的t7 rna聚合酶突变体及其应用
Rho INITIATION OF PROTEIN SYNTHESIS IN THE EUKARYOTE, NEUROSPORA CRASSA

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230517

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230517

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20230904