附图说明
图1为单一种类化学修饰mRNA在细胞内与胞内toll样受体TRL3结合 水平;
图2~图9为多种类化学修饰的mRNA在细胞内与胞内toll样受体TRL3 结合水平;
图10为单一种类化学修饰mRNA在细胞内与胞内toll样受体TRL7结 合水平;
图11~图18为多种类化学修饰的mRNA在细胞内与胞内toll样受体 TRL7结合水平;
图19为单一种类化学修饰mRNA在细胞内与胞内toll样受体TRL8结 合水平;
图20~27为多种类化学修饰的mRNA在细胞内与胞内toll样受体TRL8 结合水平;
图28为单一种类化学修饰mRNA在细胞内与胞内toll样受体RIG-1结 合水平;
图29~图36为多种类化学修饰的mRNA在细胞内与胞内toll样受体 RIG-1结合水平;
图37为单一种类化学修饰mRNA注射小鼠后,小鼠血清中IL-8的含量 变化;
图38~图44为多种类化学修饰的mRNA注射小鼠后,小鼠血清 中IL-8的含量变化;
图45为单一种类化学修饰mRNA注射小鼠后,小鼠血清中TNFα的含 量变化;
图46~图53为多种类化学修饰的mRNA注射小鼠后,小鼠血清中TNFα 的含量变化;
图54为单一种类化学修饰mRNA注射小鼠后,小鼠体内荧光素酶表达 情况;
图55~图62为多种类化学修饰mRNA注射小鼠后,小鼠体内荧光素酶 表达情况;
图63为单一种类化学修饰mRNA注射小鼠后,小鼠血清中促红细胞生 成素(EPO)表达情况;
图64~图71为多种类化学修饰mRNA注射小鼠后,小鼠血清中促红细 胞生成素(EPO)的含量;
图72为单一种类化学修饰mRNA注射小鼠后,小鼠的红细胞压积;
图73~图80为多种类化学修饰mRNA注射小鼠后,小鼠的红细胞压积;
图81为不同赋形剂对mRNA药物存储条件下pH的影响;
图82为不同赋形剂对mRNA药物存储条件下纯度的影响;
图83为不同赋形剂对mRNA药物存储条件下浓度的影响;
图84为修饰碱基的掺入比例与荧光素酶(Luc)mRNA表达水平的高低 之间的关系;
图85为部分碱基修饰和全部碱基修饰对新型冠状病毒2019-nCov的刺 突蛋白(S)的mRNA表达水平的影响。
图86为不同化学修饰策略的新冠病毒RBD mRNA表达蛋白浓度结果;
图87为不同化学修饰策略的新冠病毒RBD mRNA表达蛋白抗体滴度结 果;
图88为不同化学修饰策略的人转化生长因子TGFβ3mRNA表达结果;
上述附图中,
A1为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
A2为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
A3为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
A4为2-氟-2-脱氧尿苷和5-甲基胞苷联合修饰;
A5为2-氟-2-脱氧尿苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
A6为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
A7为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
A8为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
A9为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
B1为假尿苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
B2为假尿苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
B3为假尿苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
B4为假尿苷和5-甲基胞苷联合修饰;
B5为假尿苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
B6假尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
B7假尿苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
B8假尿苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
B9假尿苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
C1为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
C2为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
C3为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
C4为N1-甲基-假尿苷和5-甲基胞苷联合修饰;
C5为N1-甲基-假尿苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
C6为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
C7为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
C8为N1-甲基-假尿苷2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
C9为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
D1为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
D2为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
D3为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
D4为5-甲氧基尿苷和5-甲基胞苷联合修饰;
D5为5-甲氧基尿苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
D6为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
D7为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
D8为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
D9为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
E1为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
E2为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
E3为N4-乙酰基胞苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
E4为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
E5为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
E6为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
E7为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
E8为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
F1为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
F2为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
F3为N6-甲基腺苷和5-甲基胞苷联合修饰;
F4为N6-甲基腺苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
F5为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
F6为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
F7为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
F8为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
F9为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
F10为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
G1为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
G2为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
G3为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
G4为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
G5为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
G6为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
G7为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
G8为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
G9为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
G10为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
G11为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
H1为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
H2为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
H3为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
H4为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
H5为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
H6为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
H7为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
H8为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
H9为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
H10为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
H11为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
H12为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
H13为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
H14为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
H15为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
H16为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
H17为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰。
具体实施方式
本发明提供了一种修饰的核酸,包括尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤 核苷、鸟嘌呤核苷和化学修饰的核苷;所述化学修饰的核苷包括化学修饰的 尿嘧啶核苷、化学修饰的胞嘧啶核苷、化学修饰的腺嘌呤核苷和化学修饰的 鸟嘌呤核苷中的一种或几种。
本发明对所述修饰的核酸的具体序列没有特殊限定,任意序列的核酸均 可;所述核酸可以为编码生物体内已知的蛋白酶、蛋白激素;也可以为编码 生物体内不存在的或未知的蛋白酶;所述核酸还包括编码病毒刺突蛋白的 mRNA;所述核酸优选编码疾病相关的蛋白质。在本发明中,具体以荧光素酶(Luc)的mRNA、促红细胞生成素(EPO)的mRNA、新型冠状病毒 2019-nCov的刺突蛋白(S)、编码人转化生长因子TGFβ3的mRNA为例。
本发明对所述修饰的核酸中化学修饰的核苷的种类和数量没有特殊限 定;在一条修饰的核酸中,可以存在1~4种的修饰的核苷(包括化学修饰的 尿嘧啶核苷、化学修饰的胞嘧啶核苷、化学修饰的腺嘌呤核苷和化学修饰的 鸟嘌呤核苷);针对某一种核苷,在一条修饰的核酸中,可以存在不同种类的化学修饰;针对某一种的化学修饰,在一条修饰的核酸中,可以存在不同 数量的修饰位点。
在本发明中,所述化学修饰的核苷中的化学修饰包括同分异构和/或基团 取代;所述基团取代包括甲基取代、甲氧基取代、卤代和N4-乙酰基取代中 的一种或几种。在本发明中,所述化学修饰还包括脱氧。
在本发明中,针对尿嘧啶核苷,所述化学修饰的尿嘧啶核苷优选的选自 2-氟-2-脱氧尿苷、假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、2-氟-2-脱氧- 假尿苷、2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷中的一种或几种。
在本发明中,针对胞嘧啶核苷,所述化学修饰的胞嘧啶核苷选自N4-乙 酰基胞苷、2-氟-2-脱氧胞苷、5-甲基胞苷、2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷和2-氟-2- 脱氧-N4-乙酰基胞苷、中的一种或几种。
在本发明中,针对腺嘌呤核苷,所述化学修饰的腺嘌呤核苷选自N6-甲 基腺苷、2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷中的一种或几种。
在本发明中,针对鸟嘌呤核苷,所述化学修饰的鸟嘌呤核苷选自2-氟-2- 脱氧鸟苷、N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷中的一种或几种。
在本发明中,针对一条修饰的核酸,在本发明具体实施过程中,多种类 的化学修饰优选的包括前述A1~A9、B1~B9、C1~C9、D1~D9、E1~E8、F1~F9、G1~G11和H1~H17中记载的情况。本发明还包括其他修饰组合的情况,本 发明实施例中所列举的上述修饰情况,仅为举例说明,不作为本发明保护范 围的限定;本发明还包括其他修饰组合的情况。
在本发明中,所述修饰的核酸优选为mRNA,所述修饰的核酸优选的包 括包括Kozak序列的5'UTR、3'UTR和5'帽子结构。在本发明中,为了便 于收集纯化,所述修饰的核酸优选的还包括聚A尾。本发明对所述包括Kozak 序列的5'UTR、3'UTR、5'帽子结构和聚A尾没有特殊限定,采用本领域公知的上述结构即可;本发明中,所述修饰的核酸优选的还包括启动子序列, 例如T7启动子、T3启动子和SP6启动子中一种;在本发明中,所述聚A 尾的长度优选的在20~500bp之间。本发明在具体实施过程中涉及到的相关 序列如表1所示。
本发明提供了所述修饰的核酸在制备疾病诊断剂和/或治疗剂中的应用。 在本发明中,根据修饰的核酸的具体序列确定所述修饰的核酸的应用。在本 发明中,所述修饰的核酸具有以下优势:相对于天然的核酸,修饰的核酸提 高了表达率、半衰期和/或蛋白浓度,优化了蛋白定位,并且能够减低天然的 免疫应答反应,避免生物体内的降解途径。
在本发明中,当所述修饰的核酸为编码病毒相关蛋白的mRNA时,还 提供了所述修饰的核酸在制备疫苗中的应用;所述修饰的核酸的表达效率更 高。本发明通过化学修饰碱基编码病毒相关蛋白的mRNA能够增强mRNA 的稳定性、提高蛋白(抗原)表达量,高表达量的抗原能够更好的实现疫苗 的免疫反应。
本发明还提供了一种药物制剂,包括所述修饰的核酸和赋形剂。在本发 明中,所述赋形剂优选的选自生理盐水、柠檬酸缓冲液和柠檬酸-生理盐水 缓冲液中的一种。在本发明中,所述柠檬酸缓冲液的pH值优选为6.35~6.45, 更优选为6.4;所述柠檬酸缓冲液中柠檬酸的浓度优选为0.08~0.12mol/L,更 优选为0.10mol/L。在本发明中,所述柠檬酸-生理盐水缓冲液优选的以生理 盐水为溶剂溶解柠檬酸,所述柠檬酸-生理盐水缓冲液中柠檬酸的浓度优选 为0.08~0.12mol/L,更优选为0.10mol/L。本发明对所述修饰的核酸在所述药 物制剂中浓度没有限定。在本发明中,所述赋形剂能够提高所述修饰的核酸 在浓度、纯度和pH值方面的稳定,利于储存。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
DNA模板制备
1)PCR法制备荧光素酶(Luc)和促红细胞生成素(EPO)DNA模板, 在96孔PCR仪器中进行。
PCR产物中至少包括
A)一个启动子序列(T7启动子、T3启动子或SP6启动子中任选一个);
B)包含至少一个Kozak序列的5'UTR;
C)3'UTR;
D)Luc或EPO编码序列;
E)聚A尾(polyA tail)。
本发明中涉及的具体序列如表1所示。
表1
按如下反应体系进行DNA模板的扩增:
反应体积,50μL(为单个管的反应体积,一次同时反应多管),具体的 反应体系见表2。
表2反应体系
组分 |
体积 |
PrimeSTAR Max Premix(2×) |
25μl |
PrimeSTAR Max DNA Polymerase |
1μl |
dNTPs |
1μl |
Mg2+ |
1μl |
10μmol/L引物F |
1.5μl |
10μmol/L引物R |
1.5μl |
1ng/μl人工合成的EPO或Luc质粒模板 |
1μl |
水 |
18μl |
反应程序如下:预变性98℃3min;变性98℃10s,退火60℃5s, 延伸72℃4min,共34个循环;最后延伸72℃10min。
反应结束后,将反应液合并于1.5ml Tube管中。取10μl进行DNA琼脂糖 凝胶电泳检测以确定反应成功(琼脂糖凝胶电泳检测条件:1.5%琼脂糖, 5V/min,40min)。
2)线性质粒作为DNA模板
该质粒包含以下元件:
A)一个启动子序列;
B)包含至少一个Kozak序列的5'UTR;
C)Luc或EPO编码序列;
D)3'UTR;
E)可能含有聚腺苷酸序列(polyA);
F)D)或E)后面有一个限制性内切酶位点;
质粒线性化方法
标准反应体系:
DNA模板超滤
Millipore 30Kd超滤管浓缩Luc或EPO DNA模板。
DNA模板FPLC纯化
FPLC纯化Luc或EPO DNA模板,用NanoDrop检测纯化后模板的浓度, 以及260/280、260/230的比值;选择260/280比值范围为1.78~1.82的模板进行后续操作。
取样进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测(1.5%琼脂糖,5V/min,40min)。
FPLC纯化后模板超滤
Millipore 30Kd超滤管浓缩FPLC纯化后模板,用RNase-free水洗脱溶解。
用NanoDrop检测超滤后模板的浓度,以及260/280、260/230的比值。
最终用RNase-free水稀释至300ng/μl。
mRNA的体外合成
在恒温反应器中,进行mRNA的体外合成。
按照如下合成体系进行(反应试剂按照表格从上至下添加):
反应体积,1600μl(置于2ml RNase-free Tube管中,为单个管的反应体 积,一次同时反应多管)。
表3化学修饰的mRNA合成体系
/>
*为尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷或化学修饰核 苷组成。
Cap analogue#为市售帽结构类似物;
将恒温器的热盖启动,设置为42℃。
点击恒温器反应系统,37℃,6h。
其中化学修饰的核苷包括以下情况:
2-氟-2-脱氧尿苷、假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、2-氟-2-脱氧-假尿苷、 2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷或2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷。
N4-乙酰基胞苷、2-氟-2-脱氧胞苷、5-甲基胞苷、2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷或2-氟-2- 脱氧-N4-乙酰基胞苷。
N6-甲基腺苷、2-氟-2-脱氧腺苷或2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷。
2-氟-2-脱氧鸟苷、N7-甲基-鸟苷或2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷。
A1为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
A2为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
A3为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
A4为2-氟-2-脱氧尿苷和5-甲基胞苷联合修饰;
A5为2-氟-2-脱氧尿苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
A6为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
A7为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
A8为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
A9为2-氟-2-脱氧尿苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
B1为假尿苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
B2为假尿苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
B3为假尿苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
B4为假尿苷和5-甲基胞苷联合修饰;
B5为假尿苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
B6假尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
B7假尿苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
B8假尿苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
B9假尿苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
C1为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
C2为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
C3为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
C4为N1-甲基-假尿苷和5-甲基胞苷联合修饰;
C5为N1-甲基-假尿苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
C6为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
C7为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
C8为N1-甲基-假尿苷2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
C9为N1-甲基-假尿苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
D1为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
D2为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
D3为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
D4为5-甲氧基尿苷和5-甲基胞苷联合修饰;
D5为5-甲氧基尿苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
D6为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
D7为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
D8为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
D9为5-甲氧基尿苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
E1为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧腺苷联合修饰;
E2为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
E3为N4-乙酰基胞苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
E4为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
E5为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
E6为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
E7为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
E8为N4-乙酰基胞苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
F1为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧胞苷联合修饰;
F2为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧鸟苷联合修饰;
F3为N6-甲基腺苷和5-甲基胞苷联合修饰;
F4为N6-甲基腺苷和N7-甲基-鸟苷联合修饰;
F5为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
F6为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
F7为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
F8为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
F9为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
F10为N6-甲基腺苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
G1为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
G2为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
G3为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
G4为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
G5为2-氟-2-脱氧胞苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
G6为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
G7为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
G8为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
G9为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
G10为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
G11为2-氟-2-脱氧鸟苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
H1为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
H2为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
H3为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
H4为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
H5为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
H6为2-氟-2-脱氧腺苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
H7为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
H8为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
H9为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷联合修饰;
H10为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
H11为5-甲基胞苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
H12为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷联合修饰;
H13为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-假尿苷联合修饰;
H14为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷联合修饰;
H15为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷联合修饰;
H16为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷联合修饰;
H17为N7-甲基-鸟苷和2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷联合修饰;
加尾反应(可选)
若PCR法或线性质粒法中所得的DNA模板中不含有聚腺苷酸序列 (polyA),则此处需有加尾反应,具体步骤如下:
1、室温下配制如下反应体系在50ml Tube管中;
表4加尾反应体系
化学合成的mRNA |
20μl |
Nuclease-free water |
36μl |
5×E-PAP Buffer |
20μl |
25nM MnCl2 |
10μl |
10nM ATP |
10μl |
2、向所述加尾反应体系中加入4μl E-PAP酶,37℃孵育1h。
DNase I消化去除DNA模板
向mRNA的体外合成后的每个Tube管中各加入120μl DNase I。上下颠倒 10次混匀,1000rpm离心10s。重新置于恒温反应器中,37℃,1h(恒温器热 盖设置为42℃)。反应结束后,将反应液合并到RNase-free 50ml Tube管中, 检测DNA片段的残留。
mRNA沉淀回收
向加尾反应后的每个50ml Tube管中,加入等体积的醋酸铵溶液。上下 颠倒10次混匀。置于-20℃2h,沉淀。17000g,4℃离心,30min。去掉上清,用70%乙醇洗涤沉淀。17000g,4℃离心,10min。去掉70%乙醇,于超净台 中蒸干,每管加入RNase-free水20ml。静置10min后,用枪头轻吹混匀。
用NanoDrop检测回收后的mRNA浓度,以及260/280、260/230的比值。
取1μl,稀释10倍,进行RNA ScreenTape assay以及琼脂糖凝胶电泳检测 其片段完整性。
FPLC纯化mRNA
将上一步骤中的mRNA进行FPLC纯化。
10mRNA超滤
Millipore 30Kd超滤FPLC纯化后的mRNA。
用生理盐水洗脱和溶解。
用NanoDrop检测溶解后的mRNA浓度,以及260/280、260/230的比值。
取1μl样,稀释10倍,进行RNA ScreenTape assay以及琼脂糖凝胶电泳检 测其片段完整性。条带大小正确、清晰、无杂带、无降解视为片段完整。
实施例2
根据本发明的编码EPO的单一种类修饰或多种类修饰mRNA,检测其免 疫原性,评价标准为修饰mRNA免疫沉淀测试(RIP分析)检测Toll样受体 TRL3、TRL7、TRL8和RIG-1与mRNA的结合水平;具体步骤如下:
细胞转染
接种完293T细胞(购自中国科学院细胞库)后约24h,观察6孔板内的细 胞状态,汇合度在88%~92%。在生物安全柜内,配制90%(体积百分含量) DMEM+10%(体积百分含量)FBS培养基。转染前30min弃掉孔板的培养基, 每孔加入1ml新鲜培养基,即90%(体积百分含量)DMEM+10%(体积百分含量)FBS培养基。
配制转染体系:取200μl opti-MEM,加入10μg供试品(浓度2μg/μl,5μl) 或阴性对照GFP-mRNA,用枪头轻轻吹打混匀,再加入60μl PEI(浓度 1mg/ml),立即置于漩涡振荡器上振荡10次,每次1s,充分混匀,静置10min。 将配制好的转染体系,直接均匀滴加进入培养的细胞中,再前后左右摇匀, 使得转染体系均匀分布于细胞上。转染后6h换液,吸掉旧的培养基,每孔换 为2ml新鲜培养基(90%DMEM+10%FBS)。转染后30~36h收获。吸掉旧的 培养基,用1ml PBS清洗一遍。吸掉PBS,继续用1ml PBS将细胞吹打下来, 收集于1.5ml离心管中,300g离心5min。将离心后的上清尽量吸去干净,沉淀的细胞用于检测。
细胞因子检测
用转染各种mRNA后获得的细胞,研究人PBMCs中TNFα和IL-8水平。
用人类IL-8和TNFa试剂盒(RayBio)进行酶联免疫吸附分析(elisa)。
RNA免疫沉淀
1、用10μg mRNA转染106个人PBMCs细胞,24h之后消化细胞,400rpm 10min离心沉淀细胞。用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于 冰上静置5min。每管分装200μl细胞裂解液,贮存于-80℃
2、吸取50μl重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管,每管加入500μl RIP WashBuffer,涡旋震荡,将enpendoff管置于磁力架上,并左右转动15°使磁 珠吸附成一条直线,去上清,重复一次。用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁 珠,分别加入约5μg TRL3、TRL7、TRL8和RIG-1于每个样品中,室温孵育 30min。将enpendoff管置于磁力架上,弃上清。加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后置于冰上。
3、将前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900μl RIPImmunoprecipitation Buffer迅速解冻第一步制备的细胞裂解液,14,000rpm, 4℃离心10min。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml。4℃孵育过夜。短暂离心,将enpendoff管放在磁力架上,弃上清。 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上,弃上 清,重复清洗6次。
4、用150μl Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物55℃孵育 30min。孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的 enpendoff管中。于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer。于每管加入 400μl苯酚:氯仿:异戊醇,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min。小 心的吸取350μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管。于每管加入400μl氯仿, 涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min。小心的吸取300μl上层水相,吸 入另一新的enpendoff管。每管加入50μl Salt SolutionⅠ,15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer,850μl无水乙醇(无RNase),混合,-80℃保持过夜。 14,000rpm,4℃离心30min,小心去上清。用80%乙醇冲洗一次,14,000rpm,4℃离心15min,小心去上清,空气中晾干。10~20μl DEPC水溶解,-80℃保 存或进行下游qPCR实验。
定量RT-PCR
将RIP所得的RNA样品利用takara逆转录试剂盒进行cDNA合成,利用 BioRad SYBRGREEN kit进行定量PCR实验,计算不修饰mRNA、单一种类 修饰mRNA和多种类修饰mRNA样品之间的拷贝数关系。
结果如图1~37所示,本发明所述的化学修饰EPO mRNA与TRL3、TRL7、 TRL8和RIG-1的结合相对于未修饰的EPO mRNA显著减少,且TNFα和IL-8 水平也显著减少,多种类修饰比单种类修饰明显更有效。本实施例表明基于 本发明的单一种类修饰和多种类修饰的mRNA显著减少Toll样受体的结合,从而减少免疫应答,使这些修饰mRNA能够更好的用于体内诊断或治疗。
实施例3
根据本发明的编码EPO的单修饰或多修饰mRNA,检测其免疫原性,评 价标准为修饰mRNA对小鼠进行肌肉注射后血清中TNFα和IL-8水平。
将6-8周龄的balbc小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)在 SPF条件下,并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养,将以上单 一种类修饰或多种类修饰的EPO mRNA对balb/c小鼠进行肌肉注射,每只小 鼠的注射剂量为100μg,24h后对小鼠进行眼眶取血,分离血清。用小鼠IL-8 和TNFa试剂盒(RayBio)进行酶联免疫吸附分析(elisa)。
结果如图46~63所示,在小鼠体内,本发明提供的修饰策略合成的mRNA 的免疫原性远远小于对照组未修饰的核酸。
实施例4
将上述实施例中制备的修饰荧光素酶(Luc)mRNA,通过气管内给药 的高压喷雾装置直接引入小鼠肺部,体内生物荧光信号表征修饰mRNA在 体内的表达强度和表达时间。
雾化器气管内给药
将Balb/c小鼠戊巴比妥钠麻醉,腹部朝上固定在注射平台上,使得上齿 的角度为45°,利用小型压舌板打开小鼠下颌,并用钝头夹钳将舌头牵引至 一侧从而暴露口咽部,将高压雾化器针头插入气管,连续施用30μl Luc mRNA(1μg/μl)溶液,随后取走小鼠。
小动物成像
将D-荧光素底物溶解于生理盐水,浓度为15mg/ml,将100μl该溶液经 尾静脉注射进入小鼠体内。10min后,使用IVIS小动物成像系统定量分析肺部信号强弱。
结果如下图55~63所示,3h即可检测到体内荧光素酶表达,24h不修饰 Luc mRNA组荧光开始下降,3天降到无法检测水平,而单修饰和多修饰分 别持续观察到高表达值直到10天。
实施例5
通过检测血液中EPO蛋白含量及红细胞压积值来评估上述实施例中制 备的化学修饰的EPO的mRNA的表达效力。
100μg未修饰和100μg修饰EPO mRNA经尾静脉注射进入h体内,24h后对 小鼠进行眼眶取血,进行ELISA实验检测EPO含量,以及7d检测小鼠全血的 红细胞压积值。
ELISA检测EPO含量
1.标准品稀释:用coatingbuffer将EPO标准品依次稀释到ST1:3857ng/ml、 ST2:1928ng/ml、ST3:964ng/ml、ST4:482ng/ml、ST5:241ng/ml、ST6: 121ng/ml,以coatingbuffer为阴性对照。
2.包被:取96孔板依次加入标准品溶液、小鼠血清、阴性对照100μl/孔, 平行2孔。2~8℃封闭过夜。
3.洗涤液(1×)配制:用灭菌注射用水将50×的Washing buffer稀释50倍, 混匀,即得。
4.洗板:从4℃冰箱取出包被好的96孔板,将板孔内液体倾倒于废液缸中, 在吸水纸上拍干,每孔加入300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体 倾倒于废液缸中,如此重复洗板4次拍干板孔。
5.封闭:加入Blocking buffer,250μl/孔,封上封板膜,室温封闭2h。
6.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
7.用dilution buffer将EPO Rab(abcam)稀释1000倍,100μl/孔,封上封 板膜,室温孵育1.5h。
8.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
9.用dilutionbuffer将GoatpAb to Rb IgG(HRP)稀释10000倍,100μl/孔, 封上封板膜,室温孵育1h。
10.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
11.加TMB buffer,100μl/孔。混匀,置室温避光孵育20min。
12.孵育结束后,每孔加入Stop buffer 100μl。
13.尽快将孔板放入酶标仪,于450nn波长下测定吸光度。
14.数据处理:以标准品的平均OD值为纵坐标,浓度为横坐标,采用四 参数逻辑拟合方程。
红细胞压积测定
取小鼠血液300μl,加入10μl肝素钠抗凝,混匀后加入温氏血沉管,3100g 离心30min,记录红细胞所占体积比例。
结果如图64~81所示,不修饰的EPO mRNA表达量不高,而修饰的EPO mRNA非常稳定,除了持续表达产生EPO蛋白之外,红细胞压积持续升高, 可被用于治疗促红细胞生成缺陷。多种类修饰mRNA稳定性和表达效力高于 单种类修饰mRNA。
实施例6
将制备的EPO mRNA溶解在RNase-free水、生理盐水、柠檬酸缓冲液 以及柠檬酸-生理盐水缓冲液中,初始浓度为2224ng/μl。包装在1ml中性硼 硅西林瓶、注射液用卤化丁基胶塞11-B以及铝盖轧盖。考察mRNA在2~8℃\ 强光(4500±500Lx)条件下,其主要成分mRNA浓度(含量)、纯度、pH 的稳定性。
考察结果如图82~84所示,不同赋形剂中的mRNA在2~8℃,4500±500Lx 条件下放置5个月条件,纯度和浓度有下降趋势。
溶解在水中的mRNA纯度由原来的99.3%下降至93.2%,整体下降了 6.14%,浓度由原来的2224ng/μl下降至1900ng/μl,整体下降了14.57%,pH 值上升0.9。
溶解在生理盐水中的mRNA纯度由原来的99.2%下降至94.0%,整体下 降了5.24%,浓度由原来的2224ng/μl下降至1924ng/μl,整体下降了13.49%, pH值上升0.7。
溶解在柠檬酸缓冲液中的mRNA纯度由原来的99.3%下降至95.1%,整 体下降了4.23%,浓度由原来的2224ng/μl下降至1947ng/μl,整体下降了 12.46%,pH值上升0.8。
溶解在柠檬酸生理盐水缓冲液中的mRNA纯度由原来的99.3%下降至 96.7%,整体下降了2.62%,浓度由原来的2224ng/μl下降至2048ng/μl,整 体下降了7.91%,pH值上升0.3。
实施例7
在合成Luc mRNA时,设置以下实验组,分别为无修饰组、25%假尿嘧 啶+75%尿嘧啶、50%假尿嘧啶+50%尿嘧啶、75%假尿嘧啶+25%尿嘧啶、完 全假尿嘧啶替代组。
将上述实施例中制备的修饰荧光素酶(Luc)mRNA,通过气管内给药 的高压喷雾装置直接引入小鼠肺部,体内生物荧光信号表征修饰mRNA在 体内的表达强度和表达时间。
雾化器气管内给药
将Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)戊巴比妥钠 麻醉,腹部朝上固定在注射平台上,使得上齿的角度为45°,利用小型压舌 板打开小鼠下颌,并用钝头夹钳将舌头牵引至一侧从而暴露口咽部,将高压 雾化器针头插入气管,连续施用30μlLuc mRNA(1μg/μl)溶液,随后取走 小鼠。24h后检测荧光素酶在小鼠体内的表达情况。
小动物成像
将D-荧光素底物溶解于生理盐水,浓度为15mg/ml,将100μl该溶液经 尾静脉注射进入小鼠体内。10min后,使用IVIS小动物成像系统定量分析肺部信号强弱。
结果如图84所示,修饰碱基的掺入比例与mRNA表达水平的高低具有 显著相关性,修饰碱基的掺入比例越高,mRNA的表达水平越高。
实施例8
人工合成编码新型冠状病毒2019-nCov的刺突蛋白(S)的mRNA,修饰方 案为不修饰、2-氟-2-脱氧尿苷/N4-乙酰基胞苷/N7-甲基鸟苷/N6-甲基腺苷单 独分别修饰以及四种碱基完全修饰。通过检测血液中S蛋白特异性抗体滴度 来评估本实施例中制备的化学修饰的mRNA的表达效力差异。
100μg未修饰和100μg修饰S蛋白的mRNA经肌肉注射进入小鼠体内,4周 后对小鼠进行眼眶取血,进行ELISA实验检测抗体滴度。
ELISA检测抗体滴度
1.标准品稀释:用coating buffer将S蛋白标准品稀释200ng/ml以coatingbuffer为阴性对照。
2.包被:取96孔板依次加入标准品溶液、阴性对照100μl/孔,平行2孔。 2~8℃封闭过夜。
3.洗涤液(1×)配制:用灭菌注射用水将50×的Washing buffer稀释50倍, 混匀,即得。
4.洗板:从4℃冰箱取出包被好的96孔板,将板孔内液体倾倒于废液缸中, 在吸水纸上拍干,每孔加入300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体 倾倒于废液缸中,如此重复洗板4次拍干板孔。
5.封闭:加入Blocking buffer,250μl/孔,封上封板膜,室温封闭2h。
6.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
7.用dilutionbuffer将小鼠血清稀释40、400、4000、40000、400000倍, 100μl/孔,封上封板膜,室温孵育1.5h。
8.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
9.用dilutionbuffer将GoatpAb to mouse IgG(HRP)稀释10000倍,100μl/ 孔,封上封板膜,室温孵育1h。
10.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
11.加TMB buffer,100μl/孔。混匀,置室温避光孵育20min。
12.孵育结束后,每孔加入Stop buffer 100μl。
13.尽快将孔板放入酶标仪,于450nn波长下测定吸光度。
14.数据处理:以标准品的平均OD值为纵坐标,浓度为横坐标,采用四 参数逻辑拟合方程。
实验结果如图85所示,mRNA部分碱基修饰和全碱基修饰时,表达效 率具有较大差异,全碱基修饰的表达效率高于部分碱基修饰的表达效率。
实施例9
人工合成编码新型冠状病毒2019-nCov的刺突蛋白受体结合区(RBD)的 mRNA,修饰方案为不修饰、2-氟-2-脱氧尿苷/N4-乙酰基胞苷/2-氟-2-脱氧鸟 苷/N6-甲基腺苷单独分别修饰以及四种碱基完全修饰。通过检测血液中RBD 蛋白浓度以及特异性抗体滴度来评估本实施例中制备的化学修饰的mRNA 的表达效力差异。
100μg未修饰和100μg修饰RBD蛋白的mRNA经肌肉注射进入小鼠体内,24h后对小鼠进行眼眶取血,进行ELISA实验检测RBD浓度。同时2周后再次 眼眶取血,检测RBD抗体滴度。
ELISA检测RBD浓度:
1.标准品稀释:用coating buffer将RBD蛋白标准品稀释成400ng/ml,并依 次10倍稀释6个梯度,以coating buffer为阴性对照。
2.包被:取96孔板依次加入7个浓度梯度的标准品溶液、小鼠血清、阴性 对照,100μl/孔,平行2孔。2~8℃封闭过夜。
3.洗涤液(1×)配制:用灭菌注射用水将50×的Washing buffer稀释50倍, 混匀,即得。
4.洗板:从4℃冰箱取出包被好的96孔板,将板孔内液体倾倒于废液缸中, 在吸水纸上拍干,每孔加入300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体 倾倒于废液缸中,如此重复洗板4次拍干板孔。
5.封闭:加入Blocking buffer,250μl/孔,封上封板膜,室温封闭2h。
6.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入300μl 的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复洗板4 次拍干板孔。
7.用dilutionbuffer将兔抗RBD一抗稀释1000倍,加入200μl,封上封板膜, 室温孵育1.5h。
8.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
9.用dilutionbuffer将GoatpAb to rabbit IgG(HRP)稀释10000倍,200μl/ 孔,封上封板膜,室温孵育1h。
10.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
11.加TMB buffer,100μl/孔。混匀,置室温避光孵育20min。
12.孵育结束后,每孔加入Stop buffer 100μl。
13.尽快将孔板放入酶标仪,于450nn波长下测定吸光度。
14.数据处理:以标准品的平均OD值为纵坐标,浓度为横坐标,采用四 参数逻辑拟合方程。
Elisa检测RBD抗体滴度
除标准品为RBD蛋白外,与实施例8测定S蛋白抗体滴度方法相同。
实验结果如图86~87所示,本发明所示的化学修饰碱基能够显著增加 RBD mRNA在小鼠体内的表达强度,从而引发更高的免疫反应。
实施例10
人工合成编码人转化生长因子TGFβ3的mRNA,修饰方案为不修饰及本 发明中所有碱基单独修饰。通过检测细胞中TGFβ3蛋白的含量评估本实施例 中制备的化学修饰的mRNA的表达效力差异。
100μg未修饰和100μg修饰的mRNA对293细胞进行转化,24h后收取细胞 沉淀,裂解细胞,裂解液进行elisa实验检测TGFβ3蛋白浓度。
ELISA检测TGFβ浓度:
1.标准品稀释:用coating buffer将TGFβ蛋白标准品稀释成1μg/ml,并依 次10倍稀释6个梯度,以coating buffer为阴性对照。
2.包被:取96孔板依次加入7个浓度梯度的标准品溶液、细胞裂解液、阴 性对照,100μl/孔,平行2孔。2~8℃封闭过夜。
3.洗涤液(1×)配制:用灭菌注射用水将50×的Washing buffer稀释50倍, 混匀,即得。
4.洗板:从4℃冰箱取出包被好的96孔板,将板孔内液体倾倒于废液缸中, 在吸水纸上拍干,每孔加入300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体 倾倒于废液缸中,如此重复洗板4次拍干板孔。
5.封闭:加入Blocking buffer,250μl/孔,封上封板膜,室温封闭2h。
6.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
7.用dilutionbuffer将兔抗TGFβ3一抗稀释1000倍,加入200μl,封上封板 膜,室温孵育1.5h。
8.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
9.用dilutionbuffer将GoatpAb to rabbit IgG(HRP)稀释10000倍,200μl/ 孔,封上封板膜,室温孵育1h。
10.洗板:将板孔内液体倾倒于废液缸中,在吸水纸上拍干,每孔加入约 300μl的洗涤液(1×),静置30s,将板孔内液体倾倒于废液缸中,如此重复 洗板4次拍干板孔。
11.加TMB buffer,100μl/孔。混匀,置室温避光孵育20min。
12.孵育结束后,每孔加入Stop buffer 100μl。
13.于450nn波长下测定吸光度。
14.数据处理:以标准品的平均OD值为纵坐标,浓度为横坐标,采用四 参数逻辑拟合方程。
实验结果如图88所示,本发明所示的化学修饰碱基能够显著增加TGFβ3 在细胞内的表达效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的 普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和 润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市瑞吉生物科技有限公司
<120> 一种修饰的核酸及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
taatacgact cactatagg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aattaaccct cactaaag 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atttaggtga cactataga 19
<210> 4
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcttactggc ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tccacaattc 60
gggcggcggc tgctgctgcc tgtggcccgg gcggctggga gaagccgagt gttggtgagt 120
gacgcggcgg aggtgtagtt tgacgcggtg tgttacgtgg gggagagaat aaaactccag 180
cgagatccgg gccgcgaacg aaagcagtga cggaggagct tgtac 225
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agctctagca tttaggtgac actatagaat a 31
<210> 6
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60
accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240
tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720
gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780
cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900
atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960
aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320
ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440
cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500
tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560
gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620
aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg taa 1653
<210> 7
<211> 582
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540
aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 59
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<213> Artificial Sequence
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ctcgtacaga agctaatacg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cagaaggcag cttacgcggc 20