CN111744019A - 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用 - Google Patents

基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用，所述mRNA可以编码一种或多种目标多肽并包含至少一个甘露糖修饰。本发明技术方案通过对mRNA分子进行甘露糖修饰，从而使得mRNA可以与甘露糖直接高效偶联，在不需要载体的情况下实现mRNA的靶向递送。

Description

基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用。
背景技术
凝集素受体是一类分布于细胞膜表面的糖蛋白、糖脂或糖复合物，能特异性识别并结合部分糖基。甘露糖(mannose)受体是最重要的高效内吞凝集素受体，其功能包括清除内源性分子、促进抗原呈递、调节细胞激活和运输，其也与肿瘤的免疫逃逸和转移密切相关，主要表达于巨噬细胞，树突细胞和肿瘤细胞，可特异性识别甘露糖糖基分子。甘露糖基作为最有潜力的靶向基团，具有无毒、无免疫原性、生物相容性和生物可降解性良好等诸多优点，可广泛用于核酸药物传递系统的糖基化修饰。
脂质体是一种类似生物膜结构的双分子层囊泡，纳米脂质体是粒径小于100nm的脂质体结构，纳米脂质体是最经典的纳米靶向给药载体。现有技术中有研究人员在纳米脂质体上耦合甘露糖以提高其靶向性。
但是，纳米脂质体的制备过程中使用大量对人体有害的有机溶剂残留，而且这些传统的纳米脂质体制备方法还存在包封率低、脂质体膜易破裂、稳定性差、贮藏稳定性不足、难以实现大规模生产、成本高等问题。因此如果能够将甘露糖直接与核酸药物进行偶联，则可以省去纳米脂质体。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种mRNA修饰方法，通过该方法实现对成熟mRNA分子的甘露糖修饰，从而使得mRNA可以与甘露糖直接高效偶联，从而不需要载体就可以将mRNA进行靶向递送。
为实现上述目的，本发明第一方面提出一种mRNA-甘露糖偶联物，所述mRNA-甘露糖偶联物包括：
编码多肽的mRNA，所述mRNA结构包括至少一个5'帽结构、至少一个Kozak序列的5'UTR、3'UTR和polyA尾，所述mRNA由尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷和/或其化学修饰核苷组成，所述mRNA的末端修饰有至少一个甘露糖。
可选地，所述化学修饰核苷选自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉恩、5-氮杂-泽布拉恩、5-甲基-泽布拉恩、5-氮杂-2-硫代-泽布拉恩、2-硫代-泽布拉恩、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌昤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、Y核苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷中的一种或多种。
可选地，所述至少一个5'帽结构选自Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-2-甲氧基腺嘌呤-鸟苷中的一个或几个。
可选地，所述mRNA的末端修饰有氨基，所述至少一个甘露糖通过所述氨基与所述mRNA连接。
本发明第二方面提出一种试剂盒，包括：mRNA，所述mRNA的3’端标记有氨基；
甘露糖，所述甘露糖与所述氨基通过异脲键共价连接。
本发明第三方面提出一种试剂盒，包括：mRNA前体，所述mRNA前体包含编码特定蛋白质的编码序列；
多聚腺苷酸，所述多聚腺苷酸的3’端标记有氨基；
甘露糖，所述甘露糖与所述氨基通过异脲键共价连接；
连接酶，所述连接酶用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸。
本发明第四方面提出一种试剂盒，包括：mRNA前体，所述mRNA前体包含编码特定蛋白质的编码序列；
3’端带有氨基的多聚腺苷酸与甘露糖的偶联物；
连接酶，所述连接酶用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸。
可选地，所述连接酶包括T4 RNA连接酶。
可选地，所述连接酶包括T4 DNA连接酶，所述试剂盒还包括用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸的夹板DNA。
本发明第五方面还提出一种mRNA组合物的制备方法，包括：
合成3’端标记有氨基的多聚腺苷酸；
将mRNA前体的3’端与所述多聚腺苷酸的5’端连接，得到3’端标记有氨基的mRNA；
将所述3’端标记有氨基的mRNA与甘露糖连接，制备得到所述mRNA组合物。
本发明第六方面还提出一种mRNA组合物的制备方法，包括：
合成3’端标记有氨基的多聚腺苷酸；
将所述多聚腺苷酸与甘露糖通过异脲键连接，得到多聚腺苷酸-甘露糖偶联物；
将所述多聚腺苷酸-甘露糖偶联物与mRNA前体连接，制备得到所述mRNA组合物。
本发明第七方面还提出一种mRNA药物，所述mRNA药物包括mRNA-甘露糖偶联物。
本发明还提出一种药物组合物，包括mRNA-甘露糖偶联物和药学上可接受的赋形剂。
本发明还提出mRNA-甘露糖偶联物或上述药物组合物在制备用于在哺乳动物受试者中表达目标多肽的药物中的用途。
本发明技术方案通过对成熟mRNA分子进行甘露糖修饰，从而使得mRNA可以与甘露糖直接高效偶联，从而不需要纳米脂质体作为载体就可以将mRNA进行靶向递送。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明mRNA组合物制备方法一实施例的流程示意图；
图2为本发明mRNA组合物制备方法一实施例的一制备过程示意图；
图3为本发明mRNA组合物制备方法一实施例的又一制备过程示意图；
图4为本发明mRNA组合物制备方法又一实施例的流程示意图；
图5为本发明mRNA组合物制备方法又一实施例的一制备过程示意图；
图6为本发明mRNA组合物制备方法又一实施例的又一制备过程示意图；
图7为本发明mRNA-甘露糖偶联物的递送过程示意图；
图8为本发明mRNA-甘露糖偶联物的氨基含量检测结果图；
图9为本发明mRNA-甘露糖偶联物质谱分析结果图；
图10为本发明mRNA-甘露糖偶联物胞内摄取实验结果图；
图11为本发明mRNA-甘露糖偶联物胞内摄取竞争实验结果图；
图12为本发明mRNA-甘露糖偶联物体内递送实验结果图；
图13为本发明mRNA-甘露糖偶联物对小鼠成活率的影响实验结果图；
图14为本发明mRNA-甘露糖偶联物稳定性实验结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种mRNA组合物的制备方法，参见图1，包括：
S1：合成3’端标记有氨基的多聚腺苷酸；
S3：将mRNA前体的3’端与所述多聚腺苷酸的5’端连接，得到3’端标记有氨基的mRNA；
S5：将所述3’端标记有氨基的mRNA与甘露糖连接，制备得到所述mRNA组合物。
本发明技术方案通过给mRNA的3’端修饰氨基，从而使得mRNA通过氨基的异脲键与甘露糖连接，得到mRNA-甘露糖偶联物，该mRNA-甘露糖偶联物不需要载体就能靶向特定的细胞，简化了mRNA药物的制备过程，大大提高mRNA药物的开发利用水平。
在本发明实施例过程中，可以理解的是，该制备方法得到或使用的原始材料包括3’端标记有氨基的多聚腺苷酸、mRNA前体、甘露糖和连接酶，该些材料可以以试剂盒的形式存在，从而得到一种试剂盒，包括：mRNA前体，所述mRNA前体包含编码特定蛋白质的编码序列；多聚腺苷酸，所述多聚腺苷酸的3’端标记有氨基；甘露糖，所述甘露糖与所述氨基通过异脲键共价连接；连接酶，所述连接酶用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸。
另一方面，该制备方法得到的中间产物为3’端标记有氨基的mRNA，从而可以根据中间产物得到一种试剂盒，包括：mRNA，所述mRNA的3’端标记有氨基；甘露糖，所述甘露糖与所述氨基通过异脲键共价连接。该试剂盒制备mRNA-甘露糖偶联物的过程更简单，方便使用。
具体的，氨基的化学式为-NH2，本发明并不仅限于使用-NH2，具有通式为RNH2的伯胺皆可以，可以生成通式为R2NH的仲胺。
具体的，所述多聚腺苷酸合成的长度可以为1-300bp，所述多聚腺苷酸通常为mRNA的PolyA尾序列，当mRNA的PolyA尾序列太长时，多聚腺苷酸也可以是PolyA尾序列的一部分，可以理解的是，多聚腺苷酸的长度可以为PolyA尾序列的任一部分长度。所述mRNA前体为mRNA不包括所述多聚腺苷酸序列的部分，所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸构成完整的mRNA序列，所述mRNA除了PolyA尾以外还具有至少一个5’帽结构、至少一个Kozak序列的5'非编码区(UTR)、3’非编码区(UTR)、开放阅读框架(ORF)等，所述mRNA由尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷和/或其化学修饰核苷组成。
更具体的，所述化学修饰核苷选自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉恩、5-氮杂-泽布拉恩、5-甲基-泽布拉恩、5-氮杂-2-硫代-泽布拉恩、2-硫代-泽布拉恩、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌昤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、Y核苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷中的一种或多种。
更具体的，所述至少一个5'帽结构选自Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-2-甲氧基腺嘌呤-鸟苷中的一个或几个。5'帽结构可以提高mRNA的稳定性。
mRNA不像质粒DNA和病毒载体，其一旦从细胞外进入细胞质就立刻被翻译，不需要整合到宿主基因组中，避免了插入基因突变的风险，并且进入细胞的外源性mRNA能够通过生理代谢完全降解。同时，mRNA的生产简易、成本低，极大地缩短和降低了新药开发的周期和成本，使得mRNA药物具有很大优势。
mRNA药物一方面需要解决不稳定的问题，通过对mRNA进行化学修饰，调节与mRNA翻译和新陈代谢有关的结构元件，可以延长外源mRNA的活性。另一个重要的方面是如何使修饰后的mRNA进入到机体特定的细胞和组织之中。本发明通过将mRNA分子3’端连接甘露糖(mannose)，得到一种mRNA药物，通过与巨噬细胞上的甘露糖受体相互作用实现mRNA的组织特异性递送，从而增加mRNA药物分子的药效。
可选地，参照图2，图2为本实施例mRNA组合物的制备方法的一种途径，合成的3’端标记有氨基的多聚腺苷酸与mRNA前体通过T4 RNA连接酶连接，形成成熟的mRNA，再与甘露糖连接，得到mRNA-甘露糖偶联物。
具体的，本发明实施例制备方法得到或使用的材料对应的试剂盒中连接酶包括T4RNA连接酶。
在一较佳实施例中，参照图3，图3为本实施例mRNA组合物的制备方法的另一种途径，合成的3’端标记有氨基的多聚腺苷酸与mRNA前体通过T4DNA连接酶和甲板DNA连接，甲板DNA包含一段mRNA前体3’端的碱基序列，以及一段多聚腺苷酸5’端的碱基序列，甲板DNA作为桥梁连接mRNA前体和多聚腺苷酸，使用T4 DNA连接酶的连接效率更高。
可以理解的是，在本发明实施例中，该制备方法得到或使用的材料对应的试剂盒中连接酶包括T4 DNA连接酶，所述试剂盒还包括用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸的甲板DNA。
本发明还提出一种mRNA组合物的制备方法，参见图4，包括：
S1’：合成3’端标记有氨基的多聚腺苷酸；
S3’：将所述多聚腺苷酸与甘露糖通过异脲键连接，得到多聚腺苷酸-甘露糖偶联物；
S5’：将所述多聚腺苷酸-甘露糖偶联物与mRNA前体连接，制备得到所述mRNA组合物。
具体的，该制备方法的中间产物为所述多聚腺苷酸-甘露糖偶联物，此时可以获得一种试剂盒，包括：mRNA前体，所述mRNA前体包含编码特定蛋白质的编码序列；3’端带有氨基的多聚腺苷酸与甘露糖的偶联物；连接酶，所述连接酶用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸。该试剂盒制备mRNA-甘露糖偶联物的过程同样更简单，方便使用。
具体的，参照图5，图5为本实施例mRNA组合物的制备方法的一种途径，多聚腺苷酸-甘露糖偶联物与mRNA前体通过T4 RNA连接酶连接；参照图6，图6为本实施例mRNA组合物的制备方法的另一种途径，多聚腺苷酸-甘露糖偶联物与mRNA前体通过T4 DNA连接酶和甲板DNA连接，提高连接效率。
可以理解的是，在本发明实施例中，该制备方法得到或使用的材料对应的试剂盒中连接酶同样可以为T4 RNA连接酶，也可以为T4 DNA连接酶，所述试剂盒中的连接酶为T4DNA连接酶时，还包括用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸-甘露糖偶联物的甲板DNA。
上述所有实施例制备得到的mRNA-甘露糖偶联物包括：编码多肽的mRNA，所述mRNA结构包括至少一个5'帽结构、至少一个Kozak序列的5'UTR、3'UTR和PolyA尾，所述mRNA由尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷和/或其化学修饰核苷组成，所述mRNA的末端修饰有至少一个甘露糖。可以理解的是，mRNA的甘露糖修饰并不仅限于通过氨基连接在mRNA的3’端，其它通过如酶催化等方法将所述甘露糖连接在mRNA末端的方法同样在本发明保护范围内。
本发明得到的mRNA-甘露糖偶联物通过图7所示的途径内吞进特异表达甘露糖受体的细胞中进行翻译，首先胞外甘露糖配体与膜表面的甘露糖受体结合，形成配体-受体复合物；所述配体-受体复合物在网格蛋白参与下侧向扩散形成Clathrin-coated pit(有被小窝)；然后动力蛋白促使细胞膜内陷形成Clathrin-coated vesicle(有被囊泡)；随后有被囊泡去掉网格蛋白与溶酶体融合，在质子海绵效应作用下受体与配体解离，mRNA-甘露糖偶联物进入细胞中翻译为蛋白质。
本发明还提供一种mRNA药物，所述mRNA药物包括mRNA-甘露糖偶联物。所述mRNA-甘露糖偶联物可以通过上述任一实施例制备得到，或者上述任一试剂盒制备得到。该mRNA药物可以为治疗肿瘤的药物，也可以为mRNA疫苗等。
本发明还提供一种药物组合物，包括mRNA-甘露糖偶联物和药学上可接受的赋形剂。所述mRNA-甘露糖偶联物可以通过上述任一实施例制备得到，或者上述任一试剂盒制备得到。
本发明还提供mRNA-甘露糖偶联物或上述药物组合物在制备用于在哺乳动物受试者中表达目标多肽的药物中的用途。所述mRNA-甘露糖偶联物可以通过上述任一实施例制备得到，或者上述任一试剂盒制备得到。
本发明实施例实现了mRNA与甘露糖的偶联，使得mRNA可以通过甘露糖受体靶向特异性的细胞，该方法不依赖于物理方法和化学转染试剂方法，安全有效。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1 mRNA-甘露糖偶联物的制备
1、多聚腺苷酸的合成
根据用途在NCBI库中查找目的基因序列，设计相应载体序列，通过体外转录方法得到mRNA前体序列。另外，通过商业化合成多聚腺苷酸尾序列，并在多聚腺苷酸的3’端连接-NH2，得到的多聚腺苷酸为：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-NH2-3’。
2、成熟mRNA的合成
利用T4 RNA连接酶将上述5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-NH2-3’连接到mRNA前体的3’端，形成3’端标记有氨基的mRNA：mRNA-NH2。
3、mRNA-甘露糖偶联物的合成
在pH 9.0的碳酸氢钠溶液中，加入200μg(1μg/μl，约32nmol)的mRNA-NH2与100μg(1μg/μl，约32nmol)的纯度≥95％的4-异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖苷，25℃反应过夜。反应后，α-D-甘露糖通过异脲键共价结合到上述mRNA-NH2的3’端，得到mRNA-Mannose偶联物。反应完成后，通过使用脱盐柱(MWCO 7kDa)纯化来去除未反应的mRNA-NH2和4-异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖。
实施例2 mRNA-甘露糖偶联物的氨基含量测定
使用荧光氨测定法测定氨基的数量，荧光氨本身没有荧光性，和伯氨反应后生成有荧光性的物质，mRNA-NH2带有的氨基为伯氨，mRNA-NH2与甘露糖偶联之后原来的伯氨变为仲氨，因此可以通过荧光数量的多少来判断mRNA-NH2与mRNA-Mannose偶联物中的-NH2数量。
将150μg实施例1合成的mRNA-Mannose偶联物与荧光氨试剂在2mg/ml的丙酮溶液中混合，并孵育10分钟，mRNA-Mannose偶联物与荧光氨的体积比为10：1。孵育完成之后，用荧光分光光度计(Gemini EMmicroplate reader，Molecular Device，CA，USA)在激发波长和发射波长分别为390nm和475nm下测量溶液的荧光强度，使用mRNA-NH2的荧光强度作为标准计算mRNA-Mannose偶联物中-NH2的量。实验结果如图8所示，从图中可看出，实施例1得到的mRNA-Mannose偶联物中几乎不含有可检测的氨基-NH2，证明mRNA与Mannose的连接效果很好。
实施例3 mRNA-甘露糖偶联物的质谱分析
将干燥的mRNA-Mannose偶联物样品与20,40,60-三羟基苯乙酮(THAP)在70％乙腈(ACN)/0.1％三氟乙酸(TFA)溶液中混合。使用MADI/MS(Ultraflextreme，布鲁克，德国)，以smartbeam-IITM激光作为电离源分析样品。所有光谱都需要在正模式下使用25kV离子源电压和1kHz重复频率进行，平均发射5000次。实验结果如图9所示，其中mRNA-NH2作为对照，用来指示未连接Mannose时mRNA的峰的位置，从图中可看出，本发明制备方法能高效制备得到mRNA-Mannose偶联物，在mRNA-Mannose偶联物中不存在未连接Mannose的mRNA-NH2。
实施例4 mRNA-甘露糖偶联物的胞内摄取实验
因为有甘露糖受体CD206在吞噬溶酶体中与mRNA-甘露糖偶联物结合，因此mRNA-甘露糖偶联物在细胞内的递送不需要复杂的细胞内途径，仅使用mRNA-甘露糖偶联物处理巨噬细胞而没有其它的载体。
为了确定mRNA-甘露糖偶联物中的α-D-甘露糖是否可以促进其内化进入巨噬细胞，将荧光标记的mRNA与α-D-甘露糖偶联得到荧光标记的mRNA-甘露糖偶联物，其制备方法参照实施例1，在此不再赘述，并用于处理RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)24h，同时以荧光标记的mRNA-NH2处理RAW264.7细胞24h作为对照，处理完成之后使用流式细胞仪检测带有荧光的细胞数量。
实验结果如图10所示，用mRNA-NH2和mRNA-甘露糖偶联物处理后检测到的带荧光的细胞总通量分别为9.73±0.42和27.34±1.8，荧光标记的mRNA-Mannose处理巨噬细胞后检测到的荧光数远高于荧光标记的mRNA-NH2处理巨噬细胞后检测到的荧光数，证明mRNA-Mannose的摄取量远大于mRNA-NH2的摄取量，α-D-甘露糖可以促进mRNA-甘露糖偶联物内化进入巨噬细胞。
实施例5 mRNA-甘露糖偶联物的胞内摄取竞争实验
为了验证RAW264.7细胞摄取mRNA-甘露糖偶联物是通过甘露糖受体CD206以甘露糖特异性方式介导的，使用D-甘露糖氨在RAW264.7细胞中进行竞争性摄取实验。将RAW264.7细胞与D-甘露糖氨预温育后，用带荧光标记的mRNA-甘露糖偶联物处理1小时，同时以荧光标记的mRNA-NH2作为对照，测定带有荧光的细胞通量。实验结果如图11所示，通过添加D-甘露糖氨逐渐减少了巨噬细胞内的mRNA-甘露糖偶联物的量。当D-甘露糖氨的处理浓度为1，10和100mM时，荧光细胞总通量显著下降。然而，巨噬细胞对mRNA–NH2的摄取没有因为添加D-甘露糖氨显著下降。该结果清楚地表明，mRNA-Mannose偶联物通过甘露糖受体介导的内吞作用而被RAW264.7细胞摄取。
实施例6 mRNA-甘露糖偶联物在小鼠体内的靶向递送实验
为了确定mRNA-甘露糖偶联物被细胞内吞后在小鼠体内的递送的靶向性，设计了编码荧光素酶Luciferase的mRNA-甘露糖对小鼠进行静脉注射，以编码荧光素酶Luciferase的mRNA-NH2作为对照，24小时后对小鼠腹腔注射荧光素酶底物荧光素Luciferin，荧光素酶高表达部位可观察到荧光。结果表明，如图12所示，脾脏是mRNA-甘露糖的主要靶器官。
实施例7 mRNA-甘露糖疫苗对小鼠存活影响实验
为了对比编码PD-1抗体的mRNA-甘露糖偶联物(mRNA-Man)和mRNA单体(mRNA-NH2)的抗肿瘤作用，设计了肿瘤小鼠存活率实验。PD-1抗体通过结合免疫细胞表面的PD-1蛋白，从而阻断了PD-1与癌细胞表面的PD-L1蛋白相结合，进而激活了免疫细胞的活性，使肿瘤细胞无法免疫逃逸，最终被免疫细胞杀死。实验结果如图13所示，其中Control为空白对照，注射PD-1mRNA-Man和PD-1mRNA-NH2对荷黑色素瘤人源化小鼠的存活率都有明显提升，并且注射PD-1mRNA-甘露糖的小鼠存活率明显高于注射PD-1mRNA-NH2的小鼠。该结果清楚地表明，编码PD-1抗体的mRNA-Man偶联物注射小鼠后更容易被靶细胞内吞，表达出PD-1抗体，从而提高荷瘤小鼠的存活率。
实施例8 mRNA-甘露糖偶联物稳定性实验
进行mRNA体外自然降解实验，将装有mRNA(100ng/μl)和mRNA-Mannose(100ng/μl)的PCR管(Rnase free)放置在37度温箱，分别在1，2，3...30天收集纯化mRNA并用NanoDrop超微量分光光度计测定浓度，实验结果如图14所示，结果显示mRNA-Mannose半衰期能到达13-14天，而普通mRNA半衰期只有6-7天，证明mRNA-甘露糖偶联物较稳定。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (14)

1.一种mRNA-甘露糖偶联物，其特征在于，所述mRNA-甘露糖偶联物包括：
编码多肽的mRNA，所述mRNA结构包括至少一个5'帽结构、至少一个Kozak序列的5'UTR、3'UTR和PolyA尾，所述mRNA由尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷和/或其化学修饰核苷组成，所述mRNA的末端修饰有至少一个甘露糖。
2.如权利要求1所述的一种mRNA-甘露糖偶联物，其特征在于，所述化学修饰核苷选自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉恩、5-氮杂-泽布拉恩、5-甲基-泽布拉恩、5-氮杂-2-硫代-泽布拉恩、2-硫代-泽布拉恩、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌昤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、Y核苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的一种mRNA-甘露糖偶联物，其特征在于，所述至少一个5'帽结构选自Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-2-甲氧基腺嘌呤-鸟苷中的一个或几个。
4.如权利要求1所述的一种mRNA-甘露糖偶联物，其特征在于，所述mRNA的末端修饰有氨基，所述至少一个甘露糖通过所述氨基与所述mRNA连接。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括：
mRNA，所述mRNA的3’端标记有氨基；
甘露糖，所述甘露糖与所述氨基通过异脲键共价连接。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括：
mRNA前体，所述mRNA前体包含编码特定蛋白质的编码序列；
多聚腺苷酸，所述多聚腺苷酸的3’端标记有氨基；
甘露糖，所述甘露糖与所述氨基通过异脲键共价连接；
连接酶，所述连接酶用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括：
mRNA前体，所述mRNA前体包含编码特定蛋白质的编码序列；
3’端带有氨基的多聚腺苷酸与甘露糖的偶联物；
连接酶，所述连接酶用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸。
8.如权利要求6或7所述的一种试剂盒，其特征在于，所述连接酶包括T4 RNA连接酶。
9.如权利要求6或7所述的一种试剂盒，其特征在于，所述连接酶包括T4 DNA连接酶，所述试剂盒还包括用于连接所述mRNA前体与所述多聚腺苷酸的夹板DNA。
10.一种mRNA组合物的制备方法，其特征在于，包括：
合成3’端标记有氨基的多聚腺苷酸；
将mRNA前体的3’端与所述多聚腺苷酸的5’端连接，得到3’端标记有氨基的mRNA；
将所述3’端标记有氨基的mRNA与甘露糖连接，制备得到所述mRNA组合物。
11.一种mRNA组合物的制备方法，其特征在于，包括：
合成3’端标记有氨基的多聚腺苷酸；
将所述多聚腺苷酸与甘露糖通过异脲键连接，得到多聚腺苷酸-甘露糖偶联物；
将所述多聚腺苷酸-甘露糖偶联物与mRNA前体连接，制备得到所述mRNA组合物。
12.一种mRNA药物，其特征在于，所述mRNA药物包括mRNA-甘露糖偶联物。
13.一种药物组合物，其特征在于，包括mRNA-甘露糖偶联物和药学上可接受的赋形剂。
14.mRNA-甘露糖偶联物或权利要求13所述的药物组合物在制备用于在哺乳动物受试者中表达目标多肽的药物中的用途。
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