BR112020012538A2 - mrna click-modificado - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um mRNA modificado com alquino e/ou azida, processos para produção de tal mRNA modificado, células que são transfectadas para inclusão de mRNA modificado, composições farmacêuticas contendo o mRNA modificado ou células incluindo o mRNA modificado, e a usos de tal mRNA, células ou com-posições farmacêuticas em aplicações terapêuticas e/ou profiláticas baseadas em mRNA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "mRNA CLICK-MODIFICADO".

[0001] A presente invenção se refere a mRNA modificado com al- quino- e/ou azida, processos para produção de tal mRNA modificado, células que são transfectadas para incluírem o mRNA modificado, composições farmacêuticas contendo o mRNA modificado ou células incluindo o mRNA modificado, e a usos de tal mRNA, células ou com- posições farmacêuticas em aplicações terapêuticas e/ou profiláticas baseadas em mRNA. Finalmente, a invenção se refere a um método de estabilização de RNA através de introdução de nucleotídeos modi- ficados com alquino- e/ou azida e/ou ainda a métodos para determina- ção de liberação de mRNA modificado em células-alvo e/ou expressão de um produto proteína codificado pelo mRNA modificado. Antecedentes da Invenção

[0002] RNA mensageiro (mRNA) é a molécula molde que é trans- crita a partir de DNA celular e é traduzida em uma sequência de ami- noácidos, isto é, uma proteína, em ribossomas nas células de um or- ganismo. De modo a controlar o nível de expressão das proteínas co- dificadas, mRNAs possuem regiões não traduzidas (UTRs) flanquean- do o real quadro de leitura aberto (ORF) que contém a informação ge- nética codificando a sequência de aminoácidos. Tais UTRs, chamadas as 5’-UTR e a 3’-UTR, respectivamente, são seções do mRNA locali- zadas antes de códon de partida e após o códon de interrupção. Ain- da, mRNA contém uma região de cauda poli(A) que é uma longa se- quência de nucleotídeos adenina que promove exportação de mRNA a partir do núcleo, tradução e em alguma extensão protege o mRNA de degradação.

[0003] Devido a suas propriedades químicas e bioquímicas, mRNA usualmente é degradado dentro de poucos minutos dentro de células, assim expressão de uma específica proteína usualmente é um proces-

so transiente. Além disso, a molécula de mRNA polianiônica não é bem apropriada para cruzar uma membrana de célula o que torna en- trega externa de mRNA extremamente difícil.

[0004] A despeito destes desafios associados com mRNA, avan- ços científicos e tecnológicos de anos recentes tornaram mRNA um promissor candidato para uma nova classe de drogas. Sahin U. et al., Nat. Publ.Gr. 13, 759-780 (2014) provêm um resumo sobre terapêuti- cas baseadas em mRNA e desenvolvimento de droga. mRNA é, por exemplo, usado para disparar produção in vivo de proteínas como an- ticorpos e enzimas, ou para estimular uma resposta imune, por exem- plo, através de expressão de específicos epítopos ou via resposta imune inata na direção de partes estruturais de mRNA. Por exemplo, RIG-1 liga extremidades 5’-trifosfato de RNA e dispara uma cascata de sinais que resulta em ativação de fatores de transcrição e liberação de citocinas como partes de uma resposta antiviral. Aplicação de mRNA para estimulação de uma resposta imune pode ser usada em novas abordagens para tratamento de câncer, AIDS e para gerar vacinas contra quase qualquer doença (cf. Pardi, N. et al., Nat.Publ.Gr. 543, 248-251 (2017) e Schlake T. et al., RNA Biol. 9, 1319-30 (2012)). Cha- ve para estes desenvolvimentos excitante é a robusta produção in vitro de mRNA estabilizado com aperfeiçoada eficiência de tradução e sua entrega em células usando especiais formulações de transfecção.

[0005] Estabilidade e eficiência de tradução de mRNA dependem de vários fatores. Especialmente as regiões não traduzidas em quais- quer extremidades do mRNA desempenham um papel crucial. Em ex- pressão de proteína eucariótica, uma estrutura de cobertura na extre- midade-5’ e a cauda poli(A) na extremidade-3’ ambas aumentam esta- bilidade de mRNA e aperfeiçoam expressão de proteína. Em adição, a 5’-UTR contém um sítio de ligação de ribossoma necessário para tra- dução e a UTR-3’ contém sequências de RNA que adotam estruturas secundárias que aperfeiçoam estabilidade e influenciam tradução. Além disso, nucleotídeos naturais modificados, por exemplo, N1-metil pseudouridina, e artificiais podem ser incorporados para aperfeiçoa- mento de estabilidade de mRNA e aperfeiçoamento de tradução do mRNA (Svitkin Y.V. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 45, No. 10, 6023-6036 (2017)).

[0006] Entrega de mRNAs em células pode ser obtida através de provimento de misturas contendo lipídeos para fusão com a membrana celular e cátions para neutralizar a carga negativa da cadeia principal de oligonucleotídeo. Formulações especiais foram criadas para otimi- zar entrega de mRNA e para conferir suficiente estabilidade in vivo pa- ra experimentos clínicos. Maioria das formulações de mRNA que são aplicadas intravenosamente são tomadas por e são expressas dentro de células de fígado. Isto é devido ao fato de que o fígado desempe- nha um papel principal em metabolismo de ácido graxo e um alto teor de lipídeos das formulações de mRNA por isso desempenha um efeito de alvejamento específico de órgão. Em maioria de casos o fígado, entretanto, não é o alvo desejado e por isso estão sendo feitos esfor- ços para modificar formulações de lipídeos para alvejar órgãos, que estão envolvidos em uma resposta imune, como, por exemplo, o baço (Kranz L.M. et al., Nature 534, 396-401 (2016)). Alternativamente, cé- lulas do sistema imune (por exemplo, linfócitos) podem ser isoladas de sangue de um paciente e aplicação de mRNA é realizada ex vivo para permitir alvejamento. Mais recentemente, alvejamento de mRNA espe- cífico de tecido usando formulações de lipídeos modificadas com fra- gmento de anticorpo foi mostrado (Moffett H.F. et al., Nat. Commun. 8, 389 (2017)).

[0007] A despeito de recentes avanços e desenvolvimentos com relação a aplicabilidade terapêutica de mRNA tanto diretamente como indiretamente, isto é, via transfecção ex vivo de células e retorno de tais células transfectadas para um paciente, ainda aperfeiçoamento de estabilidade de mRNAs e desenvolvimento de novas opções no con- texto de seu uso como terapêuticas ou drogas são objetos de pesqui- sas em curso. Além disso, é desejável prover métodos que permitam uma produção eficiente e com forma aerodinâmica de mRNA terapêu- tico. Ainda, ainda existe uma necessidade de avançada entrega alve- jada de mRNA para terapias de substituição de gene e substituição de proteína, especialmente no contexto do tratamento de doenças herda- das. Também é altamente desejável permitir o monitoramento de en- trega e expressão de proteína. Finalmente, exploração de ainda op- ções para aproveitar o efeito estimulador imune de mRNAs em, por exemplo, terapia de câncer é um outro objeto de pesquisa em curso. Sumário da Invenção

[0008] A presente invenção é direcionada ao provimento de solu- ções para os objetivos mencionados acima e se refere inter alia a um novo tipo de modificação de mRNA. Tal modificação não somente permite estabilizar mRNAs de interesse para aplicação ex vivo e para subsequente administração a um paciente humano, animal ou planta, mas também para ligar facilmente rótulos ou grupos funcionais detec- táveis que, por exemplo, permite entrega alvejada do mRNA modifica- do para específicas células ou tecidos e monitoração de tal entrega.

[0009] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a mRNA modificado que compreende uma estrutura de cobertura-5’, uma região não traduzida-5’ (UTR-5’), uma região de quadro de leitura aberto (ORF), uma região não traduzida-3’ (UTR-3’) e uma região de cauda poli(A), onde o mRNA contém pelo menos uma modificação al- quino- ou azida nos nucleotídeos dentro de pelo menos uma da ORF, a UTR-5’, a UTR-3’ e a região de cauda poli(A). Em modalidades es- pecialmente preferidas deste primeiro aspecto da presente invenção, o mRNA modificado contém um ou mais de uma molécula funcional e/ou rótulo detectável introduzida via uma reação click do mRNA modificado com uma molécula funcional ou rótulo detectável contendo azida ou alquino correspondentemente modificada.

[0010] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um pro- cesso para produção de mRNA modificado de acordo com a presente invenção, onde tal processo compreende transcrição in vitro de mRNA a partir de um molde DNA na presença de uma RNA polimerase e uma mistura de nucleotídeos contendo os nucleotídeos requeridos para transcrição de RNA, onde pelo menos uma parte dos nucleotídeos na mistura de nucleotídeos está modificada para conter uma modificação alquino ou azida no nucleotídeo. Em uma modalidade alternativa deste segundo aspecto, o mRNA modificado é produzido via um processo de fermentação. Em tal processo, células eucarióticas ou procarióticas são transformadas para conterem a informação genética (por exemplo, plasmídeo) para produção de desejado mRNA e nucleosídeos, nucleo- tídeos ou profármacos nucleotídeos modificados com alquino ou azida são incluídos no meio de crescimento. Em uma outra modalidade al- ternativa deste segundo aspecto, o mRNA da invenção é produzido sinteticamente, via síntese de fosforamidito ou de fase sólida.

[0011] Um terceiro aspecto da presente invenção se refere a um método enzimático para a preparação de um mRNA especificamente modificado em sítio da invenção que compreende uma modificação alquino ou azida em uma região definida do mRNA, por exemplo, so- mente a região de cauda poli(A). Tal processo compreende modalida- de de uma reação de adição de polimerase poli(A) sobre um mRNA na presença de adenosina trifosfato (ATP), onde a ATP está pelo menos parcialmente modificada com alquino ou azida no nucleotídeo.

[0012] Em modalidades especialmente preferidas do segundo e terceiro aspectos da invenção, uma ou mais das moléculas funcionais e/ou rótulos correspondentemente detectáveis modificados com alqui-

no ou azida são adicionados sob condições para modalidade de uma reação click para produzir um mRNA modificado compreendendo tal molécula(s) funcional ou rótulo(s) detectável.

[0013] Um quarto aspecto da presente invenção se refere a uma preparação de células, especialmente uma preparação de células do sistema imune, que contém o mRNA modificado da presente invenção e é obtida através de transfecção ex vivo.

[0014] Um quinto aspecto da presente invenção se refere a com- posições farmacêuticas que compreendem como um agente ativo ou como um adjuvante imunológico um mRNA modificado da presente invenção ou uma preparação de células que foi obtida através de transfecção ex vivo para incluir tal mRNA.

[0015] Ainda um sexto aspecto da presente invenção é um mRNA modificado de acordo com a invenção, de uma preparação de células incluindo tal mRNA ou de uma composição farmacêutica da invenção para uso em aplicações profiláticas e/ou terapêuticas baseadas em mRNA em um ser humano ou um animal.

[0016] O uso de um mRNA modificado da presente invenção para transfecção de plantas ou células de plantas ainda é um sétimo aspec- to da invenção.

[0017] Um oitavo aspecto da invenção se refere a composições diagnósticas para seleção in vitro ou in vivo para a presença, entrega e/ou distribuição do mRNA inventivo em células, tecidos ou órgãos, tais composições compreendendo um mRNA modificado da presente invenção contendo ou a seguir sendo modificado com um rótulo detec- tável, preferivelmente um fluoróforo ou um radionuclídeo.

[0018] Um nono aspecto da invenção se refere a um kit de partes para preparação e/ou entrega de um mRNA modificado da presente invenção. Em modalidades especialmente preferidas, tal kit também contém uma ou mais moléculas funcionais ou rótulos detectáveis cor-

respondentemente modificados com alquino ou azida para obtenção de mRNAs modificados contendo tais moléculas funcionais e/ou rótu- los detectáveis com modalidade de reação click entre mRNA modifica- do e molécula funcional / rótulo modificado.

[0019] Um décimo aspecto da presente invenção se refere a um processo para estabilização de RNA, especialmente mRNA, onde uma modificação alquino e/ou azida é introduzida através de inclusão de pelo menos um dos quatro tipos padrões de nucleotídeos (ATP, CTP, GTP e UTP) e/ou um outro nucleotídeo ou pseudonucleotídeo compa- tível modificado com alquino ou azida (isto é, um nucleotídeo com es- trutura falsa ou incomum como comparada aos tipos padrões de nu- cleotídeos) em forma parcial ou completamente modificada com alqui- no e/ou azida durante síntese de RNA e/ou em uma reação de adição de polimerase poli(A). Ainda uma estabilização pode ser obtida através de acoplamento das correspondentes moléculas ou grupos modifica- dos com azida e/ou alquino ao RNA modificado via uma reação click.

[0020] Um décimo primeiro aspecto da presente invenção é um método para qualitativamente e quantitativamente determinar pelo menos uma da entrega para e expressão de um mRNA da presente invenção em uma célula transfectada via exploração de célula ativada por fluorescência (FACS). Descrição Detalhada da Invenção e Modalidades Preferidas

[0021] A presente invenção emprega a assim chamada “química click” ou seus elementos e aplica esta técnica para modificar molécu- las de mRNA para proporcionar aperfeiçoada estabilidade e/ou para prover uso de tais moléculas de mRNA modificadas no contexto de inter alia terapia baseada em mRNA e tecnologias de vacina de mRNA.

[0022] Química click é um conceito que foi definido em 2001/2002 pelos grupos de Sharpless and Meldal (Sharpless, K.B. et al., Angew.

Chem. 2002, 114, 2708; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596; Meldal, M. et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 3057). Desde então, especi- almente a reação catalisada com cobre de azidas com alquinos para render 1,2,3-triazóis, uma variação da cicloadição Huisgen 1,3-dipolar (R. Huisgen, 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (Ed.: A. Padwa), Wil- ey, New York, 1984), tornou-se um método muito amplamente usado para realizar uma reação click. Como um resultado de suas condições suaves e alta eficiência, esta reação encontrou uma variedade de apli- cações em biologia e ciências de materiais, como, por exemplo, rotu- lação de DNA para vários propósitos (Gramlich, P.M.A. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8350).

[0023] Em adição à reação click catalisada com cobre, também métodos bio-ortogonais, livres de cobre foram desenvolvidos e todos tais métodos genericamente também podem ser empregados no con- texto da presente invenção. Por exemplo, ciclo adição de azida - alqui- no promovida – linhagem (SPAAC) (I.S. Marks et al., Bioconjug Chem. 2011 22(7): 1259-1263) pode ser usada tanto sozinha como em com- binação com química click catalisada com cobre (CuAAC) no contexto da presente invenção. Especialmente em casos nos quais é desejável realizar uma reação de rotulação in vivo em cultura de células ou em um organismo vivo, modalidade de tal reação usando SPAAC é prefe- rível uma vez que o método não requer o uso de substâncias tóxicas ou catalisadores externos.

[0024] Química click facilita ligação de moléculas repórteres ou rótulos a biomoléculas de interesse e é uma ferramenta muito podero- sa para identificação, localização, e caracterização de tais biomolécu- las. O método, por exemplo, permite inclusão e ligação de sondas fluo- rescentes para quantificação espectrométrica, ou de moléculas ânco- ras para permitir separação e purificação das biomoléculas alvos. Atu- almente, muitas aplicações foram desenvolvidas nas quais química click é usada como um princípio subjacente. Sequenciamento de gera- ção seguinte é uma de tais aplicações que se beneficiam desta técnica onde formação de assim chamadas “imitações de cadeia principal”, isto é, alternativas não naturais para a ligação fosfodiéster, que podem ser geradas por cicloadição de alquino azida catalisada com cobre (CuACC), é usada para ligar, por exemplo, fragmentos de DNA e se- quências adaptadoras. A despeito de presença de um anel triazol ao invés de uma ligação fosfodiéster, tais imitações de cadeia principal são substratos aceitáveis para métodos de preparação de DNA ou RNA dirigidos por polimerase como PCR ou transcrição reversa. De- tecção de proliferação de células ainda é um campo de aplicação para química click. Os métodos que são normalmente aplicados incluem adição de tanto BrdU ou análogo de nucleosídeos radiaotivos para cé- lulas durante replicação e detecção de sua incorporação em DNA. Mé- todos envolvendo radioatividade, entretanto, são antes lentos e impró- prios rápidos estudos de alta produtividade e também são inconveni- entes devido à radioatividade envolvida. Detecção de BrdU requer um anticorpo anti-BrdU e aplicação de condições desnaturantes resultan- do em degradação da estrutura do espécime. O desenvolvimento de ensaios click – EdU superou tais limitações através de inclusão de 5- etinil-2’-desoxiuridina, um análogo de timidina, na reação de replicação de DNA. A detecção via química click ao invés de um anticorpo é sele- tiva, direta, bioortogonal e não requer desnaturação de DNA para a detecção do nucleosídeo incorporado.

[0025] Dentro do contexto da presente invenção foi verificado que é possível introduzir nucleotídeos modificados com alquino e/ou azida durante transcrição in vitro de mRNA ou durante um processo de fer- mentação para produção de mRNA para resultar em um mRNA cor- respondentemente modificado. A modificação com alquino ou azida pode ser incluída em somente alguns ou todos os elementos contidos no mRNA, e precisa ser incluída em pelo menos uma das UTRs, ORF e causa poli(A). A estrutura de cobertura 5’ preferivelmente não con- tém tais modificações alquino ou azida, na medida em que mudanças para a estrutura de cobertura podem interferir com eficiente ligação de fatores de iniciação como eIF4E, eIF4F e eIF4G e assim diminuir dras- ticamente eficiência de tradução. A presença de tal modificação por um lado estabiliza o mRNA e por outro lado proporciona específicos sítios âncoras para rotulação pós-enzimática ou para ligação de ligan- tes específicos de tecido ou célula ou moléculas alvejantes via química click. Assim, a presente invenção não somente permite detecção da presença e a localização de mRNA após transfecção ou aplicação, mas também provê novas opções para entrega alvejada de mRNAs para específicos órgãos ou tipos de células no contexto de aplicações terapêuticas. Um mRNA correspondentemente modificado é uma pri- meira matéria objeto da presente invenção.

[0026] Dependendo de que tipo de nucleotídeo ou nucleotídeos são incluídos em forma modificada com alquino ou azida durante transcrição in vitro ou durante produção de mRNA em procariotas ou eucariotas via fermentação, o mRNA modificado resultante pode con- ter modificações não somente nas UTRs 5’ e 3’ e a ORF, mas também na região de cauda poli(A). Como aparente para aqueles versados na técnica, inclusão, por exemplo, de uma ou mais de CTP, GTP e UTP modificadas conduz a uma modificação dentro de UTRs e o ORF, en- quanto adicionalmente inclusão de ATP modificada resulta em uma modificação também da região de cauda poli(A). Inclusão de somente ATP modificada com alquino e/ou azida durante a transcrição conduz a modificações nas UTRs, o ORF e a região de cauda poli(A).

[0027] Nenhum efeito negativo causado pela presença de nucleo- tídeos modificados com alquino ou azida dentro de mRNA da invenção foi observado. Dependendo da quantidade de nucleotídeos modifica-

dos incluída na reação, a eficiência de transcrição in vitro e in vivo po- de ser tão efetiva como em casos onde somente nucleotídeos não modificados estão presentes na mistura de reação, ou levemente di- minuída. Além disso, a modificação do mRNA não parece prejudicar tradução de mRNA durante produção de proteína nos ribossomas. Dependendo das circunstâncias, as quantidades de nucleotídeos mo- dificados a serem incluídas na reação de transcrição in vitro ou o pro- cesso de fermentação podem ser ajustadas para provimento de máxi- mo rendi mento de mRNA ou máxima modificação. Por exemplo, quando um corante é para ser ligado ao mRNA como um rótulo detec- tável via uma reação click, pode ser desejável incluir uma sua quanti- dade adequadamente alta para assegurar e facilitar detecção, enquan- to de modo a alvejar específicos receptores de células, pode ser sufi- ciente incluir somente uma ou umas poucas moléculas ligantes para obter o desejado efeito.

[0028] Como será explicado mais tarde em mais detalhes, inclusão de nucleotídeos modificados com alquino ou azida tem um efeito esta- bilizante sobre mRNA. É para ser esperado que o efeito estabilizante da modificação inventiva é mais pronunciado se tal modificação está distribuída sobre a completa molécula de mRNA. Em tal caso, subse- quente ligação de rótulos destacáveis e/ou moléculas funcionais via química click também ocorrerá uniformemente sobre a inteira molécula de mRNA e pode mesmo prover um aperfeiçoado efeito estabilizante.

[0029] Entretanto, em alguns casos pode ser importante restringir a inclusão de rótulos ou moléculas funcionais a uma parte da molécula de mRNA que não é envolvida em subsequente tradução de mRNA durante expressão de proteína. Para tal propósito, pode ser desejável incluir nucleotídeos modificados somente na região de cauda poli(A) pelo que pode ser assegurado que atividade ribossomal não seja pre- judicada pela presença de rótulos ou moléculas funcionais especial-

mente longas ou mais volumosas como moléculas de alvejamento ou ligantes.

[0030] Por isso a presente invenção também provê um mRNA mo- dificado contendo modificação alquino ou azida somente na região de cauda poli(A). Ao invés de incluir nucleotídeos modificados com alqui- no ou azida durante transcrição in vitro de um molde mDNA ou um processo de fermentação, uma modificação somente da região de cauda poli(A) pode ser obtida para qualquer mRNA desejado através de modalidade de uma reação de adição na presença de poli(A) poli- merase e ATP modificada com alquino ou azida.

[0031] Através de controle de quantidade e tipo de modificação alquino ou azida no mRNA modificado da invenção é possível adaptar convenientemente e facilmente o mRNA resultante para proporcionar estabilização e opções para ligação pós-enzimática de moléculas de interesse quando requerido e viável com relação a qualquer aplicação pretendida.

[0032] Dentro do contexto da presente invenção a modificação azida ou alquino pode ser incluída na nucleobase ou na posição-2’ da unidade ribose do respectivo nucleotídeo. Em casos muito especiais, inclusão de um nucleotídeo contendo a modificação na posição-3’ da ribose também é possível. Em tal caso, a reação de adição de poli(A) enzimática é terminada com inclusão de um nucleotídeo modificado. Em uma modalidade preferida deste aspecto da presente invenção, o mRNA modificado contém uma modificação alquino e/ou azida na nu- cleobase ou a posição ribose-2’ em pelo men os um dos nucleotídeos dentro de pelo menos uma das UTRs, o ORF e opcionalmente tam- bém a região de cauda poli(A), e adicional mente uma modificação al- quino ou azida de terminação de cadeia na posição-3’ da ribose na cauda poli(A). Em uma modalidade preferida diferente, o mRNA da presente invenção não contém uma modificação alquino ou azida de terminação de cadeia na posição ribose-3’ na região de cauda poli(A).

[0033] O nucleotídeo modificado no mRNA da presente invenção pode ser derivado de um nucleotídeo natural e especialmente um dos nucleotídeos padrões com bases adenina, citosina, guanina ou uracila, ou pode ser uma modificação de um outro nucleotídeo ocorrendo natu- ralmente (por exemplo, derivado de pseudouridina) ou mesmo uma molécula não ocorrendo naturalmente (por exemplo, F. Eggert, S. Kath-Schorr, Chem. Commun., 2016, 52, 7284-7287) que não afeta negativamente transcrição e/ou tradução e a função do resultante mRNA modificado. Preferivelmente, o nucleotídeo modificado é deri- vado de um nucleotídeo natural ou um nucleotídeo ocorrendo natural- mente dentro de mRNA.

[0034] Apropriados grupos alquino e azida para reações click são conhecidos e disponíveis para aqueles versados na técnica e todos tais grupos podem ser usados para preparar nucleotídeos modificados e mRNAs modificados no contexto da presente invenção. O nucleotí- deo modificado com alquino preferivelmente é um nucleotídeo modifi- cado com etinila, mais preferivelmente fosfato de 5-etinil uridina ou fos- fato de 7-etinil-7-desaza adenina. Embora em princípio também seja possível empregar nucleotídeos modificados com alquino superior, es- pecialmente nucleotídeos modificados com propinila ou butinila e mesmo sistemas de anel contendo ligação tripla C-C, possíveis efeitos negativos sobre, por exemplo, a eficiência de reação de polimerase poli(A) ou transcrição assim como sobre ainda uma tradução do mRNA em uma proteína terão de ser considerados quando selecionando apropriadas moléculas alquino. Modificações azido para nucleotídeos que são úteis na presente invenção podem, por exemplo, também in- cluir grupos azido alquila nos quais a parte alquila é preferivelmente um grupo alquila inferior, especialmente um grupo metila, etila ou pro- pila. Como um nucleotídeo modificado com azida, preferivelmente fos-

fato de 5-(3-azido propil) uridina ou fosfato de 8-azido adenina são considerados para inclusão no mRNA inventivo. Um exemplo para um nucleotídeo modificado com azida causando terminação da reação de adição poli(A) é fosfato de 3’-azido-2’,3’-dideoxiadenina.

[0035] Em princípio, todos os nucleotídeos do pelo menos um tipo de nucleotídeo modificado podem ser modificados com alquino ou azi- da, ou alternativamente, somente uma parte de tais nucleotídeos está presente em forma modificada. Em uma modalidade preferida da pre- sente invenção e dependendo da desejada modificação e taxa de mo- dificação, razões de formas modificadas versus não modificadas dos vários nucleotídeos podem variar de 1:100 a 10:1, preferivelmente 1:10 a 10:1, ainda preferivelmente 1:4 a 4:1, e também preferivelmente 1:2 a 2:1. Preferivelmente, uma combinação 1:1, 1:4 ou 1:10 de nucle- otídeo modificado para não modificado é incluída no mRNA da inven- ção.

[0036] Como mencionado acima, a presença de nucleotídeos ou nucleobases modificadas com alquino ou azida nos mRNAs da pre- sente invenção confere um efeito estabilizante. Por um lado, o ataque de endorribonucleases é restrito em alguma extensão pela modifica- ção interna. Extensão da região de cauda poli(A) durante adição base- ada em polimerase poli(A) de ATPS modificadas na extremidade-3’ conduz ainda a um efeito estabilizante. Ataque sobre e degradação de moléculas mRNA por exorribonucleases ocorre nas duas extremidades de RNA. O mRNA de acordo com a invenção contém uma cobertura na extremidade-5’ que proporciona proteção de degradação naquele lado. Inclusão de adicionais nucleotídeos adenosina modificados na extremidade-3’ proporciona ainda proteção quando o ataque de exorri- bonucleases em direção 3’ → 5’ é impedido e degradação atingindo o mRNA de núcleo, especialmente o ORF, é retardada.

[0037] Em uma modalidade preferida da presente invenção, rótu-

los detectáveis e/ou moléculas funcionais podem ser introduzidos no mRNA modificado via reação click com um rótulo ou molécula funcio- nal contendo alquino ou azida correspondentemente modificado. Co- mo para a modificação de nucleotídeo, também para a modificação de rótulos detectáveis ou grupos funcionais, apropriados grupos alquino e azida são conhecidos por aqueles versados na técnica e os exemplos preferidos para tais grupos são aplicáveis como descrito acima. A rea- ção de um nucleotídeo modificado com alquino dentro de mRNA modi- ficado e um rótulo ou molécula funcional contendo azida ou a reação de um nucleotídeo modificado com azida dentro de mRNA modificado da invenção e um rótulo ou molécula funcional contendo alquino é rea- lizada sob condições para conduzir a reação click e conduz à forma- ção da metade 1,2,3-triazol heterocíclica de 5 membros que forma a ligação entre mRNA e rótulo ou molécula funcional. De acordo com a presente invenção, o termo rótulo ou molécula funcional contendo al- quino também abrange sistemas de anel contendo ligação tripla C-C como ciclo octinos que foram considerados especialmente no contexto de reações SPAAC e rotulação in vivo via reações de ligação bio- ortogonal.

[0038] O tipo e tamanho de rótulos e moléculas funcionais não são particularmente restritos e, novamente, são determinados através de uso pretendido. Exemplos preferidos para o rótulo detectável incluem rótulos proporcionando cor ou proporcionando fluorescência, por exemplo, derivados de fluoresceína como FITC, corantes Alexa Fluor ou corantes DyLight Fluor, corantes cianina como Cy5 e Cy3 ou coran- tes rodamina como Texas Red e 5-TAMRA, ou qualquer outro corante fluorescente. Mesmo moléculas pequenas não coloridas podem ser usadas (por exemplo, biotina), quando elas são substratos para uma enzima ou um conjugado de enzima – proteína ligante (por exemplo, conjugados de enzima anticorpo) e podem produzir um produto colori-

do ou luminescente através de uma cascata de reações enzimáticas e ainda um substrato. Também, radionuclídeos podem ser incluídos co- mo rótulos detectáveis, por exemplo, preferivelmente radionuclídeos emitindo pósitrons que podem ser detectados usando exploração de tomografia de emissão de pósitron. Para radionuclídeos com meias- 18 vidas curtas, por exemplo, F, a habilidade de rotulação rápida e ro- busta de mRNA usando rotulação click de produção pós mRNA pode ser o único método exequível para obter material para estudos de bio- distribuição de mRNA usando PET. Dependendo do uso pretendido, também isótopos pesados como C13 ou P33 podem ser considerados como um rótulo detectável para a presente invenção.

[0039] Moléculas funcionais a serem incluídas no mRNA modifica- do via uma reação click não são restritos e são preferivelmente ligan- tes específicos de tecido ou célula que mediam absorção alvejada do mRNA em específicos tecidos ou células incluindo células de câncer ou pelo menos permitem ligação ou ancoragem de mRNA sobre a su- perfície de célula. Tal alvejamento específico de célula ou tecido pode ser obtido, por exemplo, através de uso de específicos anticorpos ou fragmentos de anticorpos, peptídeos, metades açúcar, moléculas pe- quenas (por exemplo, ácido fólico) ou metades ácido graxo como os ligantes específicos de célula ou tecido. Respectivas substâncias fo- ram descritas para um grande número de aplicações de alvejamento e são disponíveis para aqueles versados na técnica. Algumas moléculas de alvejamento preferidas e exemplares são anticorpos ou fragmentos de anticorpos ou ligantes receptores que alvejam receptores específi- cos de células como, por exemplo, o receptor de fator de crescimento epidérmico, folato que alveja o receptor folato, apolipoproteínas que alvejam receptores de lipoproteína de baixa densidade endógena ou ácido araquidônico que alveja os receptores canabinóides endógenos. Também, a sequência de aminoácidos RGD ou sequências similares foram verificadas mediarem adesão de célula e também podem ser considerados como ligantes preferidos dentro do contexto da presente invenção.

[0040] A presença de moléculas funcionais ligadas ao mRNA ain- da pode aumentar estabilidade de mRNA contra degradação por nu- clease e foi mostrado que substituição parcial assim como total de pelo menos um dos nucleotídeos naturais dentro de mRNA por um análogo modificado com alquino ou azida e mesmo ligação de moléculas funci- onais ao mesmo não impede tradução da molécula de mRNA.

[0041] Em adição a incluir nucleotídeos modificados com alquino ou modificados com azida, também é possível que um mRNA modifi- cado inventivo contenha pelo menos um nucleotídeo em forma parcial ou completamente modificada com azida. Ainda uma opção é um mRNA incluindo pelo menos um tipo de nucleotídeo em forma parcial ou completamente modificada com alquino ou parcial ou completa- mente modificada com azida. Tal mRNA contém duas diferentes modi- ficações âncora às quais diferentes rótulos ou moléculas funcionais podem ser ligadas em uma reação click pós-enzimática à jusante. Por exemplo, mas sem limitação a tal modalidade específica, um grupo de alvejamento específico de célula modificada com alquino assim como um rótulo detectável modificado com azida então podem ser ligados resultando em uma outra modalidade preferida de um mRNA modifi- cado de acordo com a presente invenção.

[0042] Também é possível e preferido dentro do contexto da in- venção prover um mRNA modificado contendo pelo menos um nucleo- tídeo modificado com azida e um nucleotídeo modificado com alquino, onde, por exemplo, no nucleotídeo modificado com azida um rótulo detectável ou uma molécula funcional tenha sido ligada via uma rea- ção bio-ortogonal, por exemplo, SPAAC in vitro, enquanto o nucleotí- deo modificado com alquino está disponível para uma reação de rotu-

lação in vitro à jusante via uma reação CuAAC. Se condições de rea- ção CuAAC são aplicadas ao mRNA de rotulação dupla (contendo funções alquino e azida), é possível tornar circular o mRNA, o que é, por exemplo, uma alternativa valiosa para uso de íntrons de auto – união (DOI: 10. 1038/s41467-018-05096-6).

[0043] Também é, por exemplo, concebível para o mRNA modifi- cado inventivo conter um tipo de modificação nas UTRs e o ORF e uma outra modificação unicamente na cauda poli(A). Tal modificação pode ser efetuada através de modalidade de primeiro uma reação de transcrição para introduzir um ou mais tipos de nucleotídeo modificado e então seguindo com uma reação de polimerase poli(A) usando um segundo tipo de ATP contendo modificação.

[0044] Será aparente para aqueles versados na técnica que nume- rosas modificações e combinações de modificações são possíveis no contexto da presente invenção. Ainda, também é possível incluir dife- rentes rótulos ou grupos funcionais baseado na presença das modifi- cações alquino e/ou azida sobre a molécula de mRNA, mas antes também através de adição consecutiva sob condições de reação click de diferentes rótulos ou moléculas funcionais apropriadamente modifi- cadas. Consequentemente, a presente invenção provê um vasto nú- mero de opções e uma conveniente modularidade de modo a adaptar o mRNA modificado para o pretendido uso em uma maneira ótima.

[0045] Aparte de inclusão de nucleotídeos modificados com alqui- no e/ou azida, a presente invenção genericamente também permite outras modificações nos nucleotídeos tanto quanto tais outras modifi- cações não afetem adversamente produção de mRNA ou o pretendido uso do resultante mRNA em uma extensão que não seja aceitável quando contemplando o uso pretendido (isto é, a modificação seja compatível com o mRNA modificado dentro do contexto da invenção). Como um exemplo de tal outro nucleotídeo modificado ou derivado de nucleotídeo que pode ser incluído no mRNA, 5’-trifosfato de pseudou- ridina (pseudo-UTP) pode ser considerado. Pseudouridina (ou 5’- ribosiluracila) foi o primeiro ribonucleosídeo modificado que foi consta- tado. Ele é a base RNA modificada natural mais abundante e é fre- quentemente designado como o “quinto nucleosídeo” em RNA. Ele pode ser encontrado em RNAs estruturais, tais como RNA nuclear pe- queno e ribossomal, de transferência. Pseudouridina foi mostrada aperfeiçoar empilhamento e tradução de base. Ainda, 5’-trifosfato de pseudouridina é capaz de proporcionar vantajosas características de mRNA tais como aumentada estabilidade nuclease e alterada intera- ção de receptores imunes inatos com RNA transcrito in vitro. Incorpo- ração de pseudo – UTP e também ainda nucleotídeos modificados, como N1-metil pseudouridina e 5’-trifosfato de 5-metil citidina em mRNA, foi mostrada diminuir ativação imune inata em cultura e in vivo enquanto simultaneamente aperfeiçoando tradução (B. Li et al., Bio- conjugate Chemistry, 2016, 27, 849-853 and Y. Svitkin et al., Nucleic Acid Research, 2017, 45, 6023-6036). Inclusão destes e outros nucleo- tídeos apropriados e compatíveis, análogos de nucleotídeos ou molé- culas não ocorrendo naturalmente como descrito anteriormente neste relatório descritivo, em forma modificada com alquino ou azida ou em forma não modificada ainda é por isso uma opção e modalidade prefe- rida da presente invenção.

[0046] Como aparente a partir da descrição acima do mRNA modi- ficado desta invenção, existe um grande número de diferentes opções para preparar ou adaptar uma molécula de mRNA para ser benefica- mente aplicável para vários propósitos. A invenção não é restrita a um particular tipo de mRNA, o qual antes pode ser escolhido de acordo com qualquer seu uso pretendido, especialmente nas aplicações des- critas em geral ou em mais detalhes acima na seção de antecedentes assim como no que se segue. A mera introdução da modificação al-

quino ou azida transporta aperfeiçoada estabilidade para uma molécu- la de mRNA que pode ser administrada para entregar informação ge- nética para aplicações como terapia de substituição de proteína ou pa- ra entregar mRNA para propósitos imuno estimuladores ou como uma vacina – mRNA. Ainda modificação de mRNA via acoplamento – click à jusante de respectivamente rótulos modificados ou moléculas funci- onais ainda proporciona possibilidades especialmente para seleção de entrega do mRNA modificado e/ou para alvejar entrega do mRNA para específicas células ou tecidos, por exemplo, em uma terapia de repo- sição de gene ou para aperfeiçoar fármaco – cinéticas (por exemplo, diminuir depuração renal através de adição de rótulos PEG).

[0047] Dentro do contexto da presente invenção, o mRNA modifi- cado da presente invenção pode codificar uma proteína funcional de interesse. Além disso, o mRNA modificado da invenção pode codificar uma proteína recombinante como uma proteína quimérica ou ainda qualquer combinação de proteínas, peptídeos ou peptídeos e proteí- nas que podem ser vantajosamente usados para um desejado propósi- to. Especialmente um mRNA codificando uma proteína de fusão re- combinante, por exemplo, um mRNA compreendendo uma sequência codificando uma primeira proteína ou peptídeo ligado em estrutura com uma sequência codificando uma segunda proteína ou peptídeo é considerado dentro de contexto da presente invenção. A segunda pro- teína ou peptídeo pode, por exemplo, alvejar uma específica localiza- ção dentro de uma célula ou tecido. Especialmente quando conside- rando o monitoramento da entrega e a localização do mRNA modifica- do da invenção ou de uma proteína codificada pelo mRNA dentro de uma célula alvo, uma proteína de fusão da proteína de interesse com uma proteína repórter como a proteína fluorescente verde (GFP), a proteína fluorescente verde aperfeiçoada (eGFP) ou com uma proteína ou peptídeo etiqueta, por exemplo, a etiqueta snap, é considerado co-

mo ainda uma modalidade preferida da invenção. Para este propósito, o mRNA modificado da presente invenção pode ser engenheirado para expressar a proteína de fusão como uma proteína simples preferivel- mente incluindo duas ou mais diferentes funções como exemplarmente esboçado acima. Por meio de inclusão de ligantes, espaçadores ou sítios de clivagem para proteases, produção de duas ou mais proteí- nas separadas é igualmente concebível.

[0048] Na modalidade preferida de expressão de uma proteína de fusão de uma proteína de interesse e GFP ou eGFP, localização da proteína de fusão pode ser facilmente detectada sob um microscópio fluorescente usando filtros apropriados. Ainda, detecção e quantifica- ção de células transfectadas e produção da proteína também é possí- vel via outros métodos, preferivelmente via citometria de fluxo, especi- almente classificação de célula ativada com fluorescência (FACS). Uso de métodos mencionados acima permite uma seleção qualitativa e quantitativa para células que incluem uma molécula fluorescente que é especialmente tanto um rótulo introduzido via uma reação click ou um peptídeo ou proteína (co)-codificado pelo próprio mRNA.

[0049] Dentro do contexto da presente invenção, o mRNA modifi- cado da presente invenção pode ser usado junto com substâncias que são requeridas ou preferivelmente presentes para uma certa aplica- ção. Por exemplo, para transfecção ex vivo, mas também para admi- nistração in vivo, substâncias que facilitam absorção de mRNA por cé- lulas são preferivelmente combinadas com o mRNA. Formulações de lipídeos assim como nanocarreadores (por exemplo, como descrito por Moffet et al., mencionado supra) podem ser preferivelmente incluídos em respectivas composições e formulações dentro do contexto da pre- sente invenção. Da mesma maneira, uma mistura de substâncias con- tendo o mRNA modificado e pelo menos uma outra substância como mencionado acima, ou um kit de partes onde o mRNA modificado e pelo menos uma outra substância apropriada são providos em diferen- tes recipientes para subsequente uso combinado são ainda objetos da presente invenção.

[0050] Quando combinado com uma ou mais outras substâncias ativas, especialmente uma ou mais substâncias que disparam uma resposta imune adaptativa, o mRNA modificado da presente invenção também pode atuar como um adjuvante para aperfeiçoar uma resposta imune inata e, assim, um efeito imunogênico total. A eficácia de subs- tâncias como, por exemplo, vacinas de tumor baseadas em proteína ou peptídeo se beneficia tremendamente de serem administradas junto com adjuvantes ARN (por exemplo, Ziegler et al., J. Immunol. January 11, 2107, 1601129; DOI:https://doi.org/10.4049/jimmunol.1601129, ou por Heidenreich et al., Int. J. Cancer. 2015 Jul 15; 137(2):372-84, DOI:10.1002/ijc.29402). As vantagens que ainda são inerentes para o mRNA modificado inventivo como descrito acima em detalhes, assegu- ram que as propriedades adjuvantes de um mRNA modificado da pre- sente invenção são comparáveis ou mesmo mais pronunciadas que para RNA não modificado, enquanto a estabilidade da molécula é aperfeiçoada e ainda opções como entrega ou inclusão alvejada de rótulos via reação click ainda abre perspectivas.

[0051] Para a aplicação adjuvante mencionada acima, o mRNA modificado da presente invenção pode ser combinado ou complexado com outras substâncias que são conhecidas por aqueles versados na técnica como opcionais ou obrigatórias neste contexto, preferivelmente compostos catiônicos ou policatiônicos (ver, por exemplo, WO2010/037408). Formação ou combinação de complexo com tais outras substâncias confere aperfeiçoadas propriedades imunoestimu- ladoras e especialmente a formação de complexo com um elemento catiônico proporciona um efeito adjuvante particularmente forte e as- sim é considerada uma modalidade preferida da invenção.

[0052] Quando pretendido como um adjuvante, o mRNA da pre- sente invenção não é necessariamente requerido codificar uma proteí- na ou peptídeo funcional, antes também tais RNAs não codificantes que contêm uma modificação alquino ou azida e ainda opcionalmente uma molécula detectável ou um rótulo detectável introduzido via a rea- ção click, são incluídos na invenção para este propósito.

[0053] WO2010/037408 descreve uma composição imunoestimu- ladora compreendendo um componente adjuvante compreendendo pelo menos um (m)RNA preferivelmente complexado com um compos- to policatiônico ou catiônico, e pelo menos um mRNA livre (isto é, não complexado) que codifica pelo menos uma proteína, antígeno, alérge- no e/ou anticorpo terapeuticamente ativo.

[0054] Neste contexto, embora um mRNA modificado da presente invenção possa ser incluído como o único componente adjuvante, também uma combinação de um (m)RNA modificado da presente in- venção atuando como adjuvante e ainda um mRNA modificado da in- venção a ser traduzido em uma proteína, antígeno, alérgeno e/ou an- ticorpo podem ser combinados. Também, para tais usos, também po- de não ser somente tomado vantagem da possibilidade de específico alvejamento e entrega para células providos pela presente invenção mas também da estabilização conferida para os (m)RNAs pela modifi- cação como aqui mostrado anteriormente.

[0055] Um outro objeto da presente invenção é um processo para produção de mRNA modificado da presente invenção. De acordo com um primeiro processo, mRNA é transcrito in vitro a partir de um molde DNA na presença de uma RNA polimerase, usualmente T3, T7 ou SP6 RNA polimerase, e uma mistura de nucleotídeos contendo pelo menos os quatro tipos padrões de nucleotídeos (ATP, CTP, GTP, UTP) reque- ridos para transcrição de mRNA e opcional mente nucleotídeos modifi- cados ocorrendo naturalmente, como, por exemplo, trifosfato de N1-

metil pseudouridina, ou mesmo nucleotídeos artificiais apropriados. Em adição, para aperfeiçoar a eficiência de tradução é importante ge- rar uma estrutura de cobertura-5’, por exemplo, guanilato de 7-metila para eucariotas. Pelo menos uma parte de pelo menos um dos nucleo- tídeos padrões, análogo de nucleotídeo modificado ocorrendo natu- ralmente ou análogos de nucleotídeo artificial apropriado é modificado para conter uma modificação alquino ou azida no nucleotídeo.

[0056] Dependendo de qual tipo de nucleotídeo é usado para o processo, a modificação será efetuada somente nas UTRs e o ORF (para CTP, GTP ou UTP modificado, ou seus análogos) ou em todas as UTRs, o ROF e a cauda poli(A) (para ATP modificada sozinha ou em combinação com um ou mais de CTP, GTP ou UTP modificado, ou seus análogos).

[0057] As condições e métodos para realizar transcrição de mRNA in vitro (IVT) assim como uma reação de adição de polimerase poli(A) são bem conhecidas por aqueles versados na técnica (por exemplo, Cao, G.J et al, N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89, 10380-10384 and Krieg, P. A. et al,. Nucl. Acids Res. 1984, 12, 7057–7070)

[0058] Tais condições e métodos não são particularmente críticos tanto quanto um rendimento satisfatório de mRNA modificado seja ob- tido. Neste contexto, também o tipo de molde DNA usado dentro de primeiro processo descrito não é particularmente crítico. Usualmente, DNA a ser transcrito é incluído em um plasmídeo apropriado, entretan- to, ele pode também ser usado em forma linear. Adicionalmente, um molde DNA usualmente contém uma sequência promotora, especial- mente uma sequência promotora T3, T7 ou SP6.

[0059] Durante o processo de produção de mRNA modificado da presente invenção, o mRNA obtido é preferivelmente capeado usando- se métodos bem conhecidos (Muthukrishnan, S., et al., Nature 1975, 255, 33-37). Reagentes requeridos para o capeamento são comerci-

almente disponíveis, por exemplo, A.R.C.A. (trifosfato de (P1-(5’-(3’-O- metil)-7-metil guanosil) P3-(5’-guanosila)), um análogo de capeamen- to) (Peng, Z. –H, et al., Org. Lett. 2002, 4(2), 161-164). Preferivelmen- te, como um nucleotídeo modificado com alquino, nucleotídeos modifi- cados com etinila, mais preferivelmente 5-etinil UTP ou 7-etinil-7- desaza ATP, são incluídos no processo. Como um nucleotídeo modifi- cado com azida, preferivelmente 5-(3-azido propil) UTP, 3’-azido-2’,3’- dideoxi ATP (somente na extremidade 3’) ou 8-azido ATP é usado.

[0060] Dentro do contexto da presente invenção, é preferido reali- zar o processo de transcrição usando T7 RNA polimerase e prover o molde DNA em um apropriado vetor para eficiente produção de molde usando micro-organismos e subsequente transcrição in vitro após line- arização do vetor.

[0061] Como uma alternativa a transcrição in vitro, também um processo de fermentação em sistemas procarióticos ou eucarióticos para produção de mRNA da invenção é incluído no contexto da pre- sente invenção. Para este propósito, um molde DNA, que é usualmen- te incluído em um apropriado vetor de expressão, preferivelmente um plasmídeo contendo o DNA de interesse sob controle de um promotor RNA polimerase, é introduzido em células hospedeiras ou microorga- nismos e respectivas profármacos nucleosídeos ou nucleotídeo (para permitir suficiente absorção celular) como descrito acima são incluídos no meio de cultura. Produção de RNA fermentativa é conhecida por aqueles versados na técnica, cf., por exemplo, Hungaro et al. (J Food Sci Technol. 2013 Oct; 50(5): 958-964).

[0062] Para propósitos de ilustração, entretanto, não para restringir a tal específico processo, a produção de mRNA modificado com alqui- no, azidda e click via fermentação é descrita em mais detalhes para um sistema bacteriano: Um molde DNA, codificando o mRNA de inte- resse sob o controle de um promotor RNA polimerase, é introduzido em células bacterianas. Preferivelmente isto é feito via transfecção de um plasmídeo. O desenho da sequência é importante e preferivelmen- te contem todos de vários elementos necessários para produção do desejado mRNA: promotor RNA polimerase (por exemplo, promotor T7 ou SP6); o quadro de leitura aberto de interesse (ORF); e preferivel- mente também uma sequência codificando a região poli(A) (preferi- velmente 100-120 nt de comprimento). Além disso, o plasmídeo con- tém uma origem de replicação e um marcador de seleção para cresci- mento e amplificação controlados em cultura de células. É preferível ter-se um elemento regulador de gene para o quadro de leitura aberto, por exemplo, um óperon lac, para induzir seletivamente expressão do mRNA com adição de um composto externo. É importante a região poli(A), necessária para discriminação do mRNA de todos os outros RNAs (por exemplo, mRNAS bacterianos, tRNAs e rRNAs) durante purificação e para provimento de produto mRNA com suficiente estabi- lidade e eficiência de tradução. Uma região de cauda poli (A) pode, entretanto, também ser introduzida ou uma cauda poli (A) comparati- vamente curta pode ser estendida e possivelmente também modifica- da via reações de adição de polimerase A como descrito dentro do contexto desta invenção após a produção fermentativa do mRNA.

[0063] Nucleosídeos modificados com alquino ou azida são adici- onados ao meio de crescimento e são tomados pelas células bacteria- nas via transportadores ou mecanismo passivo (J. Ye, B. van den Berg, EMBO Journal, 2004, 23, 3187-3195). Intracelularmente estes nucleosídeos são fosforilados por cinases aos correspondentes trifos- fatos e podem ser incorporados no mRNA. Uma vez que a monofosfo- rilação dos nucleosídeos é um processo lento, é possível alimentar-se profármacos monofosfato dos nucleosídeos para aumentar contrações intracelulares de nucleotídeos (como para sofosbuvir).

[0064] Em caso de mRNA modificado com azida, uma reação click usando química bio-ortogonal, por exemplo, ciclo adições de azida – alquino promovidas por linhagem (SPAAC) podem ser realizadas em cultura de células.

[0065] Por isso, preferivelmente etiquetas / rótulos modificados com ciclo octino ou moléculas funcionais são adicionadas ao meio.

[0066] O mRNA recentemente sintetizado, que inclui os nucleosí- deos modificados dentro da sequência, é então, por exemplo, purifica- do através de utilização de oligonucleotídeos poli (T) ligados a uma específica resina e/ou pérolas, por exemplo, do kit de isolamento de mRNA de Sigma Aldrich (cat No: 000000011741985001).

[0067] É bem conhecido que o mRNA de células procarióticas não contem uma região poli (A) ou quando a tem a mesma não é mais lon- ga do que 20nt, o que não é suficiente para ser tomada pelos oligonu- cleotídeos poli (T) ligados à resina e/ou pérolas, assim permitindo uma eficiente separação do desejado mRNA de mRNA procariótico. Assim, um mRNA produzido fermentativamente sem regiões de cauda poli (A) ou sem uma região de cauda poli (A) suficientemente longa precisa ser purificado através de outros processos conhecidos via extração com clorofórmio fenol, precipitação e subsequente purificação do RNA celu- lar bruto através de cromatografia de troca de íons.

[0068] A linhagem bacteriana, por exemplo, por exemplo, E. coli BL21(DE), precisa ter a RNA polimerase, por exemplo, a T7 RNA po- limerase, integrada no DNA genômico (por exemplo, linhagens DE3). Produção do mRNA é então possível quando um plasmídeo contendo o promotor T7 é ttransformado e pode introduzir o nucleosídeo modifi- cado com alquino o azidda durante transcrição dentro de célula bacte- riana.

[0069] É bem conhecido que o mRNA procariótico está carecendo de estrutura 5’ CAP. Este importante elemento do mRNA modificado inventivo pode ser introduzido após a purificação do mRNA ou ele po-

de ser introduzido concorrentemente através de cotransformação de célula bacteriana com um outro plasmídeo expressando a enzima de capeamento eucariótica.

[0070] Ainda como uma alternativa, é possível produzir o mRNA modificado da presente invenção via síntese de fase sólida ou fosfo- ramidito e inclui nucleotídeos modificados como descrito ac ima. Espe- cialmente em casos onde o (m)RNA é pretendido para uso como um adjuvante e moléculas mais curtas ou sequências não codificantes po- dem ser consideradas para tal propósito, preparação sintética pode ser conveniente e eficaz. Respectivos métodos são disponíveis para aque- les versados na técnica e descritos, por exemplo, em Marshall, W. S. et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2004, Vol. 8, No. 3, 222-229.

[0071] Um segundo processo dentro do contexto da presente in- venção permite modificação somente da região de cauda poli (A), através de primeiro provimento de um mRNA de interesse através de qualquer processo apropriado e adição de ATP modificado com alqui- no ou modificada com azida (ou análogo) em uma reação de adição de poli (A) polimerase. Tais reações de adição de poli (A) polimerase e condições apropriadas são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e respectivos kits de reação são comercialmente disponíveis.

[0072] Embora o primeiro e o segundo processos descritos acima possam ser usados separadamente para provimento de mRNA modifi- cado da presente invenção, também é possível usar uma combinação de transcrição in vitro ou produção de mRNA sintético e reação de adi- ção de poli (A) polimerase para incluir nucleotídeos modificados com alquino e/ou modificados com azida nas UTRs, o ORF e a cauda poli (A) durante a etapa de transcrição de mRNA. Através de adicional- mente modalidade de segundo processo, isto é, uma reação de adição de poli (A) polimerase, ainda uma extensão da cauda poli (A) pode ser obtida, onde ATP é pelo menos parcialmente incluída na forma modifi-

cada com alquino ou azida que opcionalmente é diferente da modifica- ção que é introduzida através de primeiro processo.

[0073] Em caso de uma produção fermentativa de um mRNA em procariotas com ou sem uma região de cauda poli (A) também é pos- sível incluir uma reação de adição de poli (A) polimerase de modo a prover tal cauda poli (A) ou para estender uma existente região de cauda poli (A). Em tal modalidade, inclusão de nucleosídeos adenina modificados ou profármacos nucleotídeos adenina para a reação no meio de alimentação é uma opção preferida. Alternativamente, nucleo- sídeo trifosfatos modificados para o processo de fermentação de mRNA podem ser diretamente internalizados usando tanto expressão de proteínas transportadoras de nucleotídeos (D. A. Malyshev, K. Dhami, T. Lavergne, T. Chen, N. Dai, J. M. Foster, I. R. Correa, Jr., F. E. Romesberg, Nature 2014, 509, 385–388.) como através de adição de transportadores moleculares artificiais no meio de alimentação (Zbigniew Zawadda et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 9891- 9895).

[0074] Os processos para produção de mRNA da invenção podem ser realizados usando somente um tipo de nucleotídeo modificado ou incluindo um ou mais nucleotídeos compreendendo desejada modifi- cação alquino ou azida. Dentro do contexto da presente invenção, é preferido incluir um ou dois tipos de nucleotídeos igualmente modifica- dos, mais preferivelmente uracila ou adenina modificada com alquino ou azida. Tanto quanto a modificação com alquino está relacionada, é mais preferível incluir um grupo etinila que, devido a seu tamanho, é menos propenso a afetar negativamente a reação de transcrição .

[0075] Em uma outra modalidade preferida da invenção, dois nu- cleotídeos diferentemente modificados são incluídos com a mistura de nucleotídeos durante transcrição. Um tal processo resulta em uma mo- lécula de mRNA modificada que contem uma modificação alquino as-

sim como uma modificação azida.

[0076] Nenhuma restrição particular foi observada com relação à quantidade de nucleotídeos modificados a ser incluída durante trans- crição ou fermentação ou via reação de poli (A) polimerase. Teorica- mente, todos os nucleotídeos empregados na transcrição in vitro po- dem ser modificados para conter nucleobases modificadas com alqui- no ou azida. Entretanto, é preferido usar um ou dois tipos de nucleotí- deos modificados e também incluir tais nucleotídeos em forma modifi- cada assim como não modificada. Dependendo da desejada taxa de modificação, é preferido incluir-se formas modificadas versus não mo- dificadas dos vários nucleotídeos em uma razão de 1:100 a 10:1, pre- ferivelmente 1:10 a 10:1 e ainda preferivelmente 1:4 a 4:1 ou 1:2 a 2:1. Mais preferivelmente, somente um tipo de nucleotídeo modificado é empregado o qual pode estar presente em somente forma modificada, ou em combinação com a forma não modificada nas razões mencio- nadas acima. Preferivelmente, uma combinação 1:1, 1:2 ou 1:10 de nucleotídeo modificado para não modificado é provida.

[0077] As razões para introdução de nucleotídeos modificados cor- respondem com o número de modificações presentes no mRNA inven- tivo. Da mesma maneira, a razão de nucleosídeos modificados para não modificados dentro de mRNA ou as várias partes, isto é, as UTRs e o ORF, ou as UTRs, o ORF e a cauda poli (A), ou a cauda poli (A) sozinha também é preferivelmente 1:100 a 10:1, mais preferivelmente 1:10 a 10:1 e ainda preferivelmente 1:4 a 4:1 ou 1:2 ou 2:1, assim co- mo mais preferivelmente 1:1, 1:2 ou 1:10.

[0078] Ainda é possível e pode ser desejável incluir nucleotídeos naturais diferentemente modificados, por exemplo, pseudo uridina ou N1-metil pseudouridina e/ou nucleotídeos artificiais ou derivados de nucleotídeos para aperfeiçoamento de estabilidade de mRNA e aper- feiçoamento de tradução do mRNA produzido. Mais informação com relação a nucleotídeos diferentemente modificados e sua incorporação em mRNA durante transcrição in vitro pode ser derivada de Svitkin, Y.V. et al., Nucleic Acids Research 2017, Vol. 45, No. 10, 6023-6036.

[0079] mRNA modificado da invenção que é produzido através de transcrição de mRNA in vitro, através de reação de adição de poli (A) polimerase sobre um mRNA existente de interesse, através de um processo de fermentação ou mesmo completamente sinteticamente e que compreende pelo menos uma de uma modificação alquino ou azi- da ainda pode ser modificado via uma reação click para incorporação de outras moléculas de interesse, especialmente rótulos e/ou molécu- las funcionais como já explicado acima. Por exemplo, rótulos detectá- veis como, por exemplo, moléculas fluorescentes ou coloridas ou não coloridas como mencionado anteriormente podem ser introduzidas. Também, como explicado acima, provimento de um mRNA modificado para produzir uma proteína de fusão incluindo, por exemplo, GFP ou eGFP é uma outra opção preferida para incluir um sinal detectável. Como uma consequência, por exemplo, entrega e/ou expressão do mRNA gerado pode ser monitorada usando microscopia fluorescente, FACS ou outros métodos de detecção, especialmente em experimen- tos de cultura de células. Foi surpreendentemente observado que mesmo modificações relativamente grandes das bases dentro de ORF são aceitas durante tradução de mRNA no ribossoma. Por exemplo, mRNA eGFP (proteína fluorescente verde aperfeiçoada) modificada com 5 cianina é comercialmente disponível (TRILINK biotechnologies, código de produto LL7701) que contém uridinas modificadas 5 cianina (Cy5). Tal mRNA é facilmente traduzido para ser uma proteína funcio- nal em cultura de células.

[0080] Modificação seletiva de unicamente a região de cauda poli (A) pode ser obtida como descrito acima, quando poli (A) polimerase adiciona ATP modificada com azida ou alquino ou derivados de ATP ao mRNA. Subsequente rotulação click desta cauda poli (A) modifica- da tem somente menores efeitos sobre tradução (quando a sequência não é traduzida) e pode ser usada, por exemplo, para ligantes especí- ficos de tecido que mediam alvejada absorção do mRNA ou para au- mentar estabilidade de mRNA contra degradação nuclease, como ex- plicado ac ima. Especialmente em casos nos quais é desejado ligar moléculas muito grandes ou moléculas que devido a outras razões prejudicam tradução, acoplamento via a cauda poli (A) pode ser prefe- rida ou mesmo uma abordagem obrigatória.

[0081] A reação click é bem conhecida por aqueles versados na técnica e é genericamente referida por Sharpless et al. e Meldal et al., mencionados supra. As condições totais para a reação click são des- critas nestes documentos e é ainda referida em exposição em Himo F. et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 210-216, que se refere à preferi- da cicloadição azida – alquino catalisada com cobre (CuAAC). Ela também é referida em EP 17 194 093, onde um método preferido para acoplamento de uma primeira molécula uma segunda molécula em uma reação de ligação click é descrito. Neste contexto, a reação click catalisada com cobre é preferivelmente realizada na presença de cá- tions de metais divalentes na mistura de reação, mais preferivelmente na presença de Mg2+.

[0082] Embora os documentos mencionados acima descrevam reações click no contexto de ligação de moléculas de DNA em geral, as mesmas condições podem ser aplicadas dentro de contexto da pre- sente invenção. Assim, a reação click é preferivelmente realizada na presença de um catalisador Cu (I) heterogêneo. Ainda, é preferido in- cluir um ligante estabilizante de Cu (I) e/ou solventes orgânicos, espe- cialmente DMSO para aperfeiçoamento de eficiência da reação click, e/ou cátions divalentes (por exemplo, como mostrado em PCT/EP2018/076495).

[0083] Ainda em uma modalidade preferida, a reação click é reali- zada como uma reação de ciclo adição de azida – alquino promovida por linhagem (SPAASC) como descrito anteriormente com relação ao mRNA modificado da invenção. As exatas condições de uma reação CuAAC ou SPAAC podem ser adaptadas para as circunstâncias indi- viduais tanto quanto os requisitos básicos que são conhecidos por aqueles versados na técnica sejam observados. Como mencionado ac ima, SPAAC também pode ser realizada dentro de células. Introdu- ção de um rótulo modificado com alquino ou azida em tais células po- de ser útil de modo a, após transfecção de um RNA modificado em células, monitorar, por exemplo, a localização do mRNA na célula.

[0084] A presente invenção permite produzir em uma maneira mo- dular e altamente eficiente moléculas de mRNA modificadas que con- têm modificações que proporcionam um efeito estabilizante sobre o mRNA. As modificações também são uteis como moléculas âncoras às quais outras substâncias e moléculas podem ser ligadas via uma reação click. Tal reação click é preferivelmente realizada à jusante e separadamente da reação de transcrição o que é uma tremenda van- tagem, especialmente onde moléculas grandes e volumosas de inte- resse são para serem ligadas ao mRNA, o que pode interromper com- pletamente a reação de transcrição.

[0085] Dentro do contexto da presente invenção, pode ser sufici- ente que somente um pequeno conjunto de nucleotídeos modificados com alquino e/ou azida seja incorporado durante produção de mRNA in vitro para permitir síntese de uma inteira faixa de mRNAs densa- mente modificados. Isto permite uma rápida preparação e seleção de muitas modificações. Além disso, os mRNAs da presente invenção e processos para produção dos mesmos permitem incorporar grupos funcionais que não são facilmente ou não são aceitos pelas RNA poli- merases durante produção de mRNA mas são facilmente ligados via reação click após transcrição. Incorporação de tais grupos funcionais não pode ser efetuada através de métodos convencionais.

[0086] Assim, os mRNAs inventivos e os processos para sua pro- dução pela primeira vez proporcionam um método fácil e confiável pa- ra produção de mRNAs estabilizados e usual mente modificados que podem ser rotulados para acompanhamento de sua absorção, por exemplo, em transfecção de célula ex vivo e também podem ser modi- ficados para provimento de aperfeiçoado alvejamento específico de célula ou tecido para usos específicos em terapia ou preparação de vacina.

[0087] Uma aplicação preferida dos mRNAs da presente invenção está em transfecção de células-alvo ex vivo. Como mencionado na se- ção de antecedentes, formulações de mRNA que são aplicadas siste- micamente e especialmente intravenosamente são absorvidas princi- palmente por células do fígado, enquanto muito frequentemente célu- las do sistema imune são os alvos preferidos de modo a provocar um efeito estimulador imune ou quando mRNA é usado para vacinação direta. No caso onde é desejado incorporar o mRNA modificado da invenção em específicos tipos de células, tais células podem ser isola- das de um paciente, especialmente do sangue de paciente, e transfec- ção de mRNA pode ser realizada ex vivo.

[0088] Ainda um objeto da presente invenção, por isso, é uma preparação de células e especialmente uma preparação de células do sistema imune, que inclui um mRNA modificado da presente invenção e é obtido por transfecção ex vivo de células. Em princípio, o mRNA modificado da presente invenção pode ser usado para transfectar qualquer tipo de célula, humana, animal ou também células de planta. Em um aspecto da invenção, as células da preparação de células são de origem animal ou humana.

[0089] Este aspecto da invenção se refere inter alia a transferência de célula adotiva (ACT) e suas aplicações de distribuição e usos que foram desenvolvidas dentro de últimas décadas. Células autólogas as- sim como não autólogas podem ser tratadas de modo a, por exemplo, aperfeiçoar funcionalidade imune e outras características. Preferivel- mente, células do sistema imune são obtidas de um paciente e enge- nheiradas para produção de células imunes autólogas que provaram ser valiosas no tratamento de várias doenças incluindo câncer, por exemplo, linfoma de célula-B. A terapia baseada em célula CAR-T é uma tal abordagem onde células-T são geneticamente engenheiradas para produção de receptores de anticorpos quiméricos sobre sua su- perfície os quais reconhecem e ligam-se a específicas proteínas ou antígenos sobre células de tumor.

[0090] As preparações de células da presente invenção podem ser usadas no mesmo contexto. Dependendo do mRNA modificado que é introduzido em células, assegurar expressão de uma proteína pode prover uma variedade de efeitos de tais células após (re)aplicação a um paciente. As presentes preparações de células, da mesma manei- ra, não são restritas a um pequeno número de aplicações mas antes podem ser consideradas um veículo para expressão de mRNA in vivo após (re)aplicação de células que então produzem uma proteína de interesse e/ou exercem um certo efeito (por exemplo, estimulação imune ou tolerogênica) no paciente devido a expressão da proteína.

[0091] Métodos para transfecção de células são conhecidos por aqueles versados na técnica e podem ser adaptados para o particular tipo de célula de interesse. Como um exemplo para tal processo, é fei- ta referência a Moffett et al., mencionado supra. No contexto de trans- fecção ex vivo é especialmente preferido usar um mRNA da invenção que é modificado via reação click para conter um grupo alvo específi- co de célula que facilita absorção do mRNA na célula sem agentes de transfecção, uma vez que células imunes são especialmente danificá-

veis por alguns destes componentes de agente de transfecção.

[0092] Em adição a transfecção ex vivo de células e administração de tais células transfectadas para um paciente, o mRNA modificado da presente invenção também pode ser aplicado diretamente a um paci- ente. Ambos os casos são considerados um tratamento terapêutico (ou também profilático). Ainda uma matéria objeto da presente inven- ção é por isso uma composição farmacêutica que compreende um mRNA modificado ou uma preparação de células da presente inven- ção como um agente ativo. Como já mencionado, compostos terapêu- ticos baseados em mRNA tornaram-se importantes objetos de pesqui- sa. Um grande número de aplicações para mRNA como agentes tera- pêuticos foi descrito (por exemplo, Sahin et al., Schlake et al. e Kranz et al., todos mencionados acima) e o mRNA modificado da presente invenção pode não somente ser usado em todas tais aplicações mas pode mesmo prover vantagens e aperfeiçoamentos para as mesmas. Baseado na estabilidade aperfeiçoada do mRNA modificado e ainda baseado em um grupo funcional opcionalmente presente, vários pro- blemas podem ser resolvidos. Uma aperfeiçoada estabilidade é res- ponsável, por exemplo, por uma prolongada tradução em proteína comparado a um mRNA não modificado. Ainda, a presença de um grupo que tem por alvo tecido ou célula permite administração alveja- da e alta especificidade de um tratamento terapêutico ou imunogênico.

[0093] Entre apropriadas aplicações dos mRNAs modificados, as preparações de células e as composições farmacêuticas contendo tal mRNA ou preparação de células são terapia de substituição de gene ou proteína, engenharia de genoma e entrega de gene transiente alve- jado / edição de gene (por exemplo, mRNA codificando uma endonu- clease alvejante e um RNA guia como no sistema CRISPR/Cas9), va- cinação de doença infecciosa, imunoterapia de câncer, assim como expressão de gene específica de célula para um tratamento de doen-

ças herdadas.

[0094] Terapia de substituição de gene pode ser considerada para o tratamento de um grande número de doenças. Para muitas doenças para as quais uma deficiência ou má função em uma proteína ou en- zima é a causa ou consequência líder, administração da requerida pro- teína ativa para o paciente é essencial para evitar dano imediato ou consequente. Entretanto, administração de proteínas pode causar into- lerância ou outros efeitos colaterais negativos.

[0095] Além disso, de modo a prover quantidades suficientes de uma certa proteína para um paciente, altas concentrações de tais pro- teínas precisam ser administradas, algumas vezes tão altas como 100 mg/mL e até 20 g da proteína por dia e paciente. Ainda como um pro- blema em terapia de substituição de proteína, também pode ser difícil administrar a proteína em células. Por outro lado, pode ser mostrado que para alguns mRNAs é suficiente o provimento de 50 a 100 µg por dose para obter um nível de proteína intracelular suficientemente alto em pacientes. Assim, a presente invenção e especialmente a possibili- dade de alvejar específicas células ou tecidos, proporciona uma solu- ção conveniente para problemas encontrados com atuais abordagens de terapia de substituição de proteína. Através de uso de mRNAs mo- dificados da presente invenção em terapia de substituição de proteína, por exemplo, em muitos casos é suficiente injetar o mRNA, enquanto correntes terapias de substituição de proteína requerem infusões que são usual mente consumidoras de tempo e demandando fisicamente o paciente.

[0096] Exemplos de doenças requerendo substituição de proteína ou pelo menos constante suplementação de proteína incluem doenças de deficiência de proteína, muitas doenças metabólicas como diabetes tipo I, e também distúrbios herdados especialmente doenças de esto- cagem lisossômicas como Morbus Gaucher ou Morbus Hunter.

[0097] No contexto de terapia de substituição de gene, inclusão de mRNA modificado em células ex vivo assim como in vivo pode ser considerada. Especialmente se um grupo alvejando específica célula ou tecido é incluído com o mRNA da invenção, mesmo inserção in vivo do mRNA modificado em células-alvo é esperada ser altamente efici- ente. A presente invenção permite uma tradução endógena de mRNA em proteína, assim, evitando efeitos adversos como mencionado aci- ma. Não obstante, também inserção ex vivo do mRNA em células-alvo e (re)administração de tais células-alvo em pacientes é ainda uma op- ção dentro de contexto da presente invenção, como mencionado aci- ma.

[0098] A composição farmacêutica de acordo com a invenção também pode ser aplicada como vacina mRNA. Vacinação é efetuada baseada em expressão de proteína in situ para induzir uma resposta imune. Uma vez que qualquer proteína pode ser expressa a partir do mRNA modificado da presente invenção, as presentes composições farmacêuticas podem oferecer máxima flexibilidade com relação à de- sejada resposta imune. Uso de mRNA modificado também provê uma alternativa de imunização muito rápida comparado a métodos conven- cionais para os quais é necessário produzir vários constituintes de pro- teína ou mesmo partículas virais inativadas. Métodos convencionais usualmente requerem modalidade de diferentes processos de produ- ção enquanto usando a presente injvenção, vários mRNAs codificando diferentes proteínas ou partes de proteínas com relação ao agente in- feccioso podem ser produzidas no mesmo processo de preparação. Imunização através de vacinação com mRNA pode mesmo ser obtida através de vacinações simples e usando somente baixas doses de mRNA. Como opostas a vacinas DNA, vacinas RNA não precisam cruzar o envelope nuclear, mas é somente suficiente para elas atingi- rem citoplasma de célula através de cruzamento de membrana de plasma. Ainda informação com relação desenvolvimento de vacinas de mRNA é mostrada, por exemplo, em Schlake et al., mencionado supra, e também é aplicável no contexto da presente invenção. A composição farmacêutica incluindo o mRNA modificado da invenção pode ser em- pregado como vacinas profiláticas assim como terapêuticas. As vaci- nas podem ser direcionadas contra qualquer tipo de patógenos, por exemplo, vírus como vírus Zika que recentemente tornou-se um foco principal de interesse (Pardi et al., mencionado supra).

[0099] Em adição a uma vacinação contra patógenos exógenos, as composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser usadas como vacinas antitumor ou para estimulação de sistema imune dentro de contexto de imunoterapia de câncer. Especialmente entrega sistêmica de RNA para células dendríticas ou macrófagos ofe- rece a possibilidade de exploração de mecanismos de defesa antiviral para imunoterapia de câncer como descrito por Kranz et al., mencio- nado supra. Alvejamento de, por exemplo, macrófagos ou células den- dríticas com um mRNA expressando uma proteína específica para ou dentro do contexto de um certo tipo de câncer conduz a apresentação de partes de tal proteína por moléculas MHC e elícita uma resposta imune específica e potente. Da mesma maneira, o mRNA modificado da presente invenção também pode ser usado no contexto de farma- cologia de mRNA codificando – antígeno.

[00100] No contexto de imunoterapia baseada em RNA e vacinação , é especialmente preferido incluir um adjuvante de (m) RNA como descrito acima em uma composição farmacêutica imunoestimuladora. O adjuvante proporciona uma estimulação da resposta imune inata e assim ainda aperfeiçoa o efeito imunoterapêutico. Neste contexto, o mRNA modificado da presente invenção e o adjuvante (m)RNA inven- tivo podem ter a mesma ou uma similar sequência e mesmo codifica- rem a mesma proteína. Por outro lado, também um adjuvante (m)RNA não codificante ou um adjuvante (m)RNA codificando uma diferente proteína ou peptídeo pode ser combinado para obter o desejado efeito adjuvante.

[00101] Edição de gene alvejada usando específicas endonuclea- ses e RNAs guias é ainda uma aplicação do mRNA modificado ou composição farmacêutica da presente invenção. A tecnologia CRISPR/Cas9 ground-breaking, recentemente desenvolvida permite específica edição de gene, permite introdução, supressão ou silencia- mento de genes e é mesmo capaz de trocar nucleotídeos dentro de um gene. O método descrito por Charpentier and Doudna envolve pro- teínas-Cas que são ribonucleoproteínas e endonucleases que se ligam a específicas sequências CRISPR RNA (crRNA) quimicamente sinteti- zadas e cortam DNA na vizinhança de tais sequências de RNA. De modo a direcionar a atividade endonuclease para a desejada sequên- cia de DNA alvo, um assim chamado RNA guia pode tomar duas for- mas, tanto um complexo deRNA CRISPR de ativação-trans sintetizado quimicamente, longo (tracrRNA) plus o crRNA, ou um RNA guia sim- ples (sgRNA) expresso ou sintético que consiste em ambos o crRNA e tracrRNA como uma construção simples. O mRNA modificado da pre- sente invenção pode ser usado neste contexto para codificar uma ou ambas a endonuclease e o RNA guia, preferivelmente como um sgR- NA que é complementar a uma específica sequência de DNA de inte- resse.

[00102] A maior vantagem da expressão transiente da endonu- clease de edição de gene e RNA guia a partir de mRNA comparada a tecnologia corrente, é o reduzido risco de edição de gene não especí- fica, uma vez que expressão de gene da ferramenta genética a partir de mRNA é limitada a um curto período de tempo (uns poucos dias) e não constantemente expressa a partir de um elemento de genoma integrado.

[00103] Aplicações de edição de gene têm alta importância e po- dem ser aplicadas no contexto de uma grande variedade de aplica- ções terapêuticas, por exemplo, terapia de reposição de gene, terapia de câncer e tratamento de doenças hereditárias. Uso do mRNA modi- ficado da invenção no contexto de tais aplicações está incluído no es- copo da presente invenção .

[00104] Também para outras potenciais aplicações terapêuticas descritas para mRNAs na técnica anterior ou que sejam desenvolvidas no futuro, uso dos respectivos mRNAs incluindo as modificações como aqui descritas é de vantagem devido sua aperfeiçoada estabilidade. Ainda, inclusão de uma molécula que alveja especificamente tecido ou célula para o mRNA via a reação click à jusante, permite um uso mais específico e da mesma maneira mais eficiente em terapia. Espe- cialmente qualquer desejada expressão de proteína ou também qual- quer reação de imunização pode ser precisamente alvejada para a lo- calização em um paciente onde o efeito imunizante ou terapêutico é requerido.

[00105] Uma reali9zação preferida da composição farmacêutica da presente invenção inclui o mRNA modificado junto com um carreador, excipiente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, preferivelmen- te um adjuvante (m)RNA modificado como descrito acima contendo a mesma modificação como o mRNA modificado e que está complexado com um composto catiônico ou policatiônico. Ainda em uma modalida- de preferida, a composição farmacêutica compreende agentes de complexação, que ainda protegem o mRNA de degradação. O agente de complexação pode aperfeiçoar e aperfeiçoa absorção por células e simultânea tradução em proteína. Como agentes de complexação, li- pídeos e polímeros podem ser incluídos na composição farmacêutica. Ainda em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica pode conter o mRNA modifica encapsulado em lipossomas.

[00106] Ainda em uma modalidade preferida, a composição farma- cêutica contém lipídeos catiônicos. Agentes que ainda aperfeiçoam a entrega de ácidos nucleicos para as citossóis também podem ser pre- ferivelmente incluídos nas composições farmacêuticas da presente invenção. Tais agentes podem ser talhados para a específica rota de liberação. Em resumo, as composições farmacêuticas da presente in- venção, enquanto incluindo o mRNA modificado inventivo como agen- te ativo, ainda podem incluir quaisquer substâncias para ainda aperfei- çoamento de estabilidade da substância ativa, aperfeiçoamento de en- trega para o citoplasma de células-alvo e provimento de outro efeito complementar ou sinergístico.

[00107] Dentro do contexto da presente invenção, uma composição farmacêutica é incluída a qual como um agente ativo contém uma pre- paração de células, especialmente uma preparação de células do sis- tema imune, que é obtida através de transfecção ex vivo de células com um mRNA modificado da presente invenção . As células transfec- tadas podem ser retornadas para os pacientes de modo que os mes- mos sejam beneficiados pelos efeitos do RNA modificado incluídos nas células. Também para esta modalidade preferida de uma compo- sição farmacêutica da invenção, adjuvantes ou excipientes ou carrea- dores farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos como esbo- çado antes.

[00108] Ainda um objeto da presente invenção é uma composição diagnóstica contendo um mRNA modificado da presente invenção ou uma célula transformada com um mRNA modificado da presente in- venção para seleção in vitro ou in vivo para a presença, entrega e/ou distribuição do mRNA inventivo em células, tecidos ou órgãos. Para tal propósito, preferivelmente o mRNA modificado já inclui um rótulo de- tectável que foi introduzido via uma reação click. Tal rótulo preferivel- mente é um fluoróforo ou um radionuclídeo, preferivelmente um radio-

nuclídeo emitindo pósitrons. Detecção e possivelmente também quan- tificação de rótulo detectável permite observar e detectar entrega do mRNA modificado para células, tecidos ou órgãos, sua distribuição nos mesmos, ou monitoração da readministração de células em um paci- ente. Da mesma maneira, uma composição diagnóstica da presente invenção contém um mRNA modificado da invenção, preferivelmente um mRNA contendo pelo menos um rótulo detectável. Dentro deste contexto, inclusão de um mRNA modificado que com expressão pro- duz uma proteína detectável, por exemplo, uma proteína de fusão in- cluindo uma proteína fluorescente, é ainda uma modalidade preferida.

[00109] Ainda em um aspecto da presente invenção e como menci- onado anteriormente, também células de plantas podem ser transfec- tadas usando o mRNA da presente invenção. Tais células de plantas transfectadas também são abrangidas dentro do escopo da presente invenção. O mRNA modificado pode ser incluído, por exemplo, de mo- do a introduzir informação genética, especialmente para expressão transiente de certas proteínas em tais células de plantas, ou para pro- pósitos analíticos ou diagnósticos, por exemplo, sondas rotuladas. Conferir resistência ou tolerância a doença ou peste são somente al- guns exemplos de possíveis aplicações e efeitos benéficos de introdu- ção de mRNAs inventivos em células de plantas ou plantas. O uso de um mRNA modificado da presente invenção para transfecção de célu- las de plantas ou plantas, da mesma maneira, é um objeto da presente invenção .

[00110] Ainda um objeto da presente invenção é um kit para prepa- ração de um mRNA modificado da presente invenção. Tal kit contém as várias substâncias requeridas para preparação de mRNA modifica- do via transcrição in vitro, um processo de fermentação ou uma reação de adição de poli (A) polimerase, isto é, uma RNA polimerase e/ou poli (A) polimerase, nucleotídeos modificados com alquino ou azida assim como nucleotídeos não modificados e ainda opcionalmente substân- cias tampões e solventes ou ainda substâncias requeridas para o pro- cesso. Em modalidades preferidas, também rótulos ou moléculas fun- cionais detectáveis modificados com alquino e/ou azida assim como substâncias requeridas para modalidade de reação click entre o mRNA modificado e os rótulos ou moléculas funcionais são incluídas. Tam- bém, um kit para produção de mRNA modificado da presente invenção inteiramente sinteticamente ainda é um objeto da presente invenção. As substâncias requeridas podem ser providas em recipientes separa- dos ou podem ser combinadas tanto quanto nenhuma reação adversa ocorra entre tais substâncias combinadas. Com relação a várias subs- tâncias a serem incluídas em tal kit de partes, é referida a descrição acima com relação a mRNA modificado da invenção e os processos para preparação de tal mRNA modificado. Tanto quanto produção do adjuvanre (m)RNA modificado esteja relacionada, tal kit preferivelmen- te também contém um composto catiônico ou policatiônico que de acordo com uma modalidade preferida é usado para formar um com- plexo com o (m)RNA. Os kits de acordo com a presente invenção tam- bém podem conter ainda substâncias facilitando a entrega do mRNA modificado da invenção para células ex vivo ou in vivo.

[00111] Em modalidades preferidas, um kit inclui pelo menos um mRNA modificado da invenção, preferivelmente contendo um rótulo detectável ou uma molécula funcional introduzida via reação click, ou provê o mRNA modificado e o rótulo modificado co m alquino ou azida e/ou molécula funcional e opcional mente outros reagentes click em recipientes separados.

[00112] Ainda em uma modalidade da invenção, um kit para entre- ga do mRNA modificado para um paciente contém um mRNA e prefe- rivelmente também um adjuvante (m)RNA, ambos modificados de acordo com a presente invenção. O mRNA modificado e o adjuvante

(m)RNA modificado podem estar contidos em um recipiente simples ou em recipientes separados e ambos opcionalmente podem incluir um rótulo ou molécula funcional modificada com alquino ou azida tanto já ligado via reação click ou em recipientes separados para subsequente modalidade de reação click. O kit ainda pode conter outros carreado- res e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, novamente tanto em recipientes separados como combinados com pelo menos um outro constituinte do kit.

[00113] Será aparente para aqueles versados na técnica que mui- tas combinações diferentes de substâncias podem ser incluídas nos kits o que facilita a preparação ou o uso do mRNA modificado da in- venção. Todas as suas modalidades e variações descritas acima no contexto da presente invenção também são aplicáveis para os kits aqui descritos. Todas as combinações apropriadas de substâncias são incluídas para os propósitos da presente invenção.

[00114] Ainda um objeto da presente invenção se refere a um pro- cesso para estabilização de RNA, especialmente mRNA, tal método incluindo introdução de uma modificação alquino e/ou azida através de inclusão de pelo menos um de quatro tipos padrões de nucleotí- deos (ATP, CTP, GTP e UTP) em forma parcial ou completamente modificada com alquino e/ou azida durante síntese de RNA e/ou em uma reação de adição de poli (A) polimerase para produzir um (mRNA) modificado. Como descrito acima, a modificação de um RNA, especialmente um mRNA através de inclusão de nucleotídeos modifi- cados com alquino e/ou azida, e especial mente através de opcional inclusão de um ou mais de um rótulo detectável e uma molécula funci- onal via uma reação click, resulta em um efeito estabilizante sobre as moléculas de RNA. Assim, um correspondente método é considerado ainda um importante aspecto incluído com a presente invenção.

[00115] Ainda um objeto da presente invenção é um método in vitro para determinar qualitativamente ou quantitativamente a presença e/ou expressão de um mRNA de acordo com a presente invenção em células-alvo. Neste contexto, a eficiência de transfecção, uma quantifi- cação de entrega e expressão de mRNA podem ser determinadas em uma resolução de célula simples via análises FACS. Classificação / exploração de célula ativada por fluorescência, FACS, é bem conheci- da por aqueles versados na técnica. Os rótulos fluorescentes que po- dem ser introduzidos no mRNA modificado da presente invenção via reação click podem ser determinados baseados neste método. Além disso, entrega e expressão de mRNA da proteína codificada podem ser detectadas usando uma proteína fluorescente, por exemplo, a proteína GFP ou proteína eGFP que em uma modalidade preferida pode ser coexpressa com uma proteína de interesse como uma pro- teína de fusão ou como duas proteínas separadas, como descrito aci- ma.

[00116] Da mesma maneira, usando o método FACS, a influência da modificação sobre transfecção de célula e nível de expressão da proteína codificada pelo mRNA modificado da invenção podem ser fa- cilmente determinados. Também estudos de efeitos de diferentes rótu- los sobre o nível de expressão podem ser realizados via análises FACS.

[00117] Em tais análises FACS, por exemplo, uma comparação de células não transfectadas e células transfectadas permite detectar si- nais fluorescentes que podem ser atribuídos ao rótulo fluorescente in- cluído no mRNA modificado da invenção ou a proteína fluorescente expressa através de tradução do mRNA modificado da invenção. Também uma comparação de reações de transfecção das mesmas células-alvo com mRNA modificado da invenção versus mRNA não modificado tendo a mesma sequência de nucleotídeos pode assegurar que a modificação per se não influencia negativamente a eficiência de transfecção.

[00118] Toda informação mostrada acima com relação a um objeto da presente invenção é considerada aplicar-se igualmente no contexto a outros objetos para os quais esta informação, mesmo se não explici- tamente repetida, tem reconhecível relevância dentro do contexto da invenção. Breve Descrição das Figuras

[00119] A Figura 1 é um esquema genérico de produção e aplica- ção de mRNA modificado. Usando, por exemplo, 5-etinil UTP (EUTP) é possível inserir grupos alquinos disponíveis para reação click com a 5’-UTR, 3’-UTR e o ORF. Rotulação seletiva da cauda poli (A) é possí- vel usando, por exemplo, 7-etinil-7-desaza ATP e uma poli (A) polime- rase.

[00120] A Figura 2 mostra a produção esquemática genérica de mRNA modificado com alquino usando, por exemplo, T7 RNA polime- rase e uma mistura de nucleotídeos incluindo EUTP (fórmula estrutu- ral).

[00121] A Figura 3 mostra os resultados de transfecção de mRNA modificado com não alquino (A), alquino (B) e corante (C) para eGFP em células HeLa.

[00122] A Figura 4 mostra a produção esquemática genérica de mRNA modificado com alquino usando, por exemplo, poli (A) polime- rase e o nucleotídeo modificado com alquino EATP (fórmula estrutu- ral).

[00123] A Figura 5 mostra os resultados de transfecção de mRNA modificado com Eterneon-red 645 (modificação alquino somente em cauda poli (A)) codificando eGFP em células HeLa.

[00124] A Figura 6 mostra um mapa e a sequência completa (a par- tir de promotor T7 para extremidade poli (A)) do plasmídeo usado em forma linearizada como molde DNA durante reação T7 RNA polimera-

se nos Exemplos. A sequência também é referida como SEQ ID NO:

2.

[00125] A Figura 7 mostra o resultado de experimentos para provar incorporação de EATP na cauda poli (A) de um RNA como descrito no Exemplo 3.

[00126] A Figura 8 mostra um esquema genérico da produção de mRNA modificado com azida específico – sítio (azida simples somente na extremidade de cauda poli (A)) usando poli (A) polimerase de leve- dura e o nucleotídeo modificado com azida AzddATP como descrito no Exemplo 4.

[00127] A Figura 9 mostra uma transfecção de mRNA modificado com cauda 3’-poli (A) Cy3 para eGFP em células HeLa. Após 24 horas de incubação a 37oC fluorescência verde da eGFP foi observada (filtro eGFP). Para o mRNA rotulado com Cy3 a localização do mRNA foi observada usando conjuntos de filtros Cy3.

[00128] A Figura 10 mostra um esquema genérico para produção de mRNA modificado com azida / alquino rotulado duplo (grupos alqui- nos internos usando T7 RNA polimerase e EUTP, uma azida terminal em extremidade 3’ usando AzddATP e poli (A) polimerase de levedu- ra), como no Exemplo 5.

[00129] A Figura 11 mostra a transfecção de mRNA modificado com cauda 3’-poli (A) Cy3 codificando eGFP em células HeLa. Após 24 ho- ras de incubação a 37oC fluorescência verde da eGFP foi observada (filtro eGFP). Para o mRNA rotulado com Cy3a localização do mRNA foi observada usando montagens de filtro Cy3, para o mRNA rotulado com Eterneon Red a localização do mRNA foi observada usando mon- tagens de filtros Cy5.

[00130] As Figuras 12 a 16 mostram os resultados de análises FACS para células HeLa não transfectadas (Fig. 12), células HeLa transfectadas com mRNA não modificado codificando eGFP (Fig. 13),

células HeLa ttransfectadas com mRNA modificado com alquino codi- ficando eGFP (Fig. 14) e mRNA modificado com Eterneon Red - / al- quino codificando eGFP (Figuras 15 e 16) e permitem quantificação de expressão de proteína dependendo da modificação e absorção de mRNA rotulado com corante (Figuras 15 e 16).

[00131] A Figura 17 mostra uma representação esquemática de uma modalidade da invenção: células bacterianas são alimentadas com, por exemplo, 5-etinil uridina e transformadas com um plasmídeo contendo a sequência necessária para a produção do mRNA. O mRNA recentemente sintetizado contendo EU é então purificado por resina poli (T) e/ou pérolas tendo oligonucleotídeos poli (T) ligados.

[00132] Os exemplos que se seguem ainda ilustram a invenção. Exemplos Exemplo 1:

[00133] mRNA modificado com alquino codificando a proteína fluo- rescente verde aperfeiçoada (eGFP) foi produzido através de transcri- ção in vitro (IVT) a partir de um molde DNA usando T7 RNA polimera- se e misturas de nucleotídeos. Aqui 5’-trifosfato de 5-etinil uridina (EUTP) foi incluído na mistura de nucleotídeos para geração de um mRNA modificado com alquino de acordo com a Figura 2 para subse- quente transfecção em células imortais Henrietta Lacks (Células He- La). O mRNA gerado contém uma folga-5’, regiões não traduzidas (UTR), a parte codificando proteína (quadro de leitura aberto, ORF) e uma cauda poli (A). Produção de mRNA

[00134] Em um volume de reação de 50 microlitros 20 unidades de T7 RNA polimerase, 1 micrograma de DNA molde e vários nucleotí- deos foram combinados em tampão de transcrição (40 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl2, 4 mM espermidina, 10 mM DTT).

[00135] A) concentrações finais de nucleotídeos para produção de mRNA modificado com não alquino foram: GTP 1,0 mM, A.R.C.A. 4,0 mM (P1-(5’-(3’-O-metil)-7-metil guanosil) P3-(5’-(guanosil)) trifosfa- to, Cap Analog), CTP 1,25 mM, UTP 1,25 mM, ψUTP 1,25 mM (pseu- douridina trifosfato), ATP 1,5 mM.

[00136] B) Concentrações finais de nucleotídeos para produção de mRNA modificado com alquino foram: GTP 1,0 mM, A.R.C.A. 4,0 mM (P1-(5’-(3’-O-metil)-7-metil guanosil) P3-(5’-(guanosil)) trifosfato, Cap Analog), CTP 1,25 mM, EUTP 1,25 mM (5-etinil uridina trifosfato), ψ UTP 1,25 mM (pseudouridina trifosfato), ATP 1,5 mM.

[00137] C) Concentrações finais de nucleotídeos para produção de mRNA modificado com alquino e subsequente rotulação click fo- ram: GTP 1,0 mM, A.R.C.A. (P1-(5’-(3’-O-metil)-7-metil guanosil) P3- (5’-(guanosil)) trifosfato, Cap Analog) 4,0 mM, CTP 1,25 mM, EUTP (5- etinil uridina trifosfato) 0,625 mM, ψUTP 0,625 mM (pseudouridina tri- fosfato), UTP 0,625 mM, ATP 1,5 mM.

[00138] A mistura foi incubada por 2 horas a 37oC e então 2 unida- des de DNAse I foram adicionadas e incubadas por 15 minutos a 37oC. O mRNA foi purificado através de um processo de coluna de rotação de acordo com as instruções do fabricante para produtos de PCR (kit de purificação com PCR de Qiagen). Isto rendeu 13,3 microgramas de mRNA para A, 12,3 microgramas para B e 14,3 microgramas para C, que foram diretamente usados para transfecção quando nenhuma ro- tulação click foi necessária (A e B). Quando rotulação click foi realiza- da (C), 2 microgramas de RNA, 1 nmol de azida Eterneon Red 645 (baseclick GmbH), um pélete de reator simples e 0,7 microlitro de 10x Activator (baseclick GmbH, Oligo Click Kit) foram combinados em um volume total de reação de 7 microlitros. A mistura de reação foi incu- bada a 45oC por 30 minutos e então limpa usando um método de colu- na de rotação de acordo com instruções do fabricante para produtos de PCR (PCR purification kit from Qiagen).

[00139] Para transfecção em um kit comercial (jetMESSENGER de Polyplus Transfection) foi usado de acordo com instruções do fabrican- te usando 0,5 micrograma de mRNA e 25.000 células HeLa (CLS GmbH) atingindo confluência. As células foram incubadas a 37oC por 24 horas antes de análise sob microscópio de fluorescência, filtro GFP: (excitação 470/22; emissão 510/42) e filtro Cy5 (excitação 628/40; emissão 692/40) foram usados.

[00140] A Figura 3 mostra os resultados de transfecção de mRNA modificado com não alquino (A), alquino (B) e corante (C) codificando eGFP em células HeLa. Após 24 horas de incubação a 37oC fluores- cência verde da eGFP foi observada (filtro GFP). Para o mRNA rotula- do com Eterneon Red (C) a localização do mRNA foi observada usan- do montagens de filtros Cy5.

[00141] Na morfologia de célula de imagem de campo brilhante de células HeLa foi observada (Figura 3, A-C), usando o filtro GFP ex- pressão de proteína da eGFP foi visível (tempo de exposição de 120 ms para A-B, 250 ms para C). Para o mRNA rotulado click (Figura 3, C) também a localização do mRNA foi observada usando as instala- ções de filtro de Cy5 do microscópio. Informação Suporte:

[00142] Estrutura dos nucleotídeos modificados usados durante a reação de T7 RNA polimerase descrita acima.

[00143] O mapa e sequência completa (a partir de promotor T7 para extremidade poli (A)) do plasmídeo usado em uma forma linearizada como molde DNA durante a reação T7 RNA polimerase descrita acima é mostrada na Figura 6. A sequência também é referida como SEQ ID NO: 2. Exemplo 2

[00144] mRNA modificado com alquino codificando a proteína fluo- rescente verde aperfeiçoada (eGFP) foi produzido através de transcri- ção in vitro (IVT) a partir de molde DNA (Figura 6) usando T7 RNA po- limerase e misturas de nucleotídeos. Aqui 7-etinil adenina-5’-trifosfato (EATP) foi incorporado no mRNA IVT após a reação de T7 RNA poli- merase através de poli (A) polimerase para gerar um mRNA modifica- do com alquino de acordo com a Figura 4 para subsequente rotulação click e transformação em células imortais Henrietta Lacks (células He-

La). O mRNA gerado contém uma folga-5’, regiões não traduzidas (UTR), a parte codificando proteína (quadro de leitura aberto, ORF) e uma cauda poli (A) rotulada com alquino. Produção de mRNA

[00145] Em um volume de reação de 50 microlitros 20 unidades de T7 RNA polimerase, 1 micrograma de DNA molde linearizado e vários nucleotídeos foram combinados em tampão de transcrição (Tris-HCl 40 mM, pH 7,9, MgCl2 6 mM, espermidina 4 mM, DTT 10 mM).

[00146] Concentrações finais de nucleotídeos para produção de mRNA modificado com não alquino foram: GTP 1,0 mM, A.R.C.A. (P1- (5’-(3’-O-metil)-7-metil guanosil) P3-(5’-(guanosil)) trifosfato, Cap Ana- log), CTP 1,25 mM, ψUTP (pseudouridina trifosfato) 1,25 mM, ATP 1,5 mM.

[00147] A mistura foi incubada por 2 horas a 37oC e então 2 unida- des de DNAse I foram adicionadas e incubadas por 15 minutos a 37oC. O mRNA foi purificado por um método de coluna de rotação de acordo com instruções do fabricante para produtos de PCR (PCR purification kit from Qiagen). Isto rendeu 12,3 microgramas de mRNA que foram usados diretamente para reação de poli (A) polimerase com EATP.

[00148] Em um volume de reação de 20 microlitros 5 unidades de E.coli poli (A) polimerase, 4,2 microgramas de mRNA preparado ante- riormente e uma solução de EATP 1 mM foram combinados em tam- pão de reação (NaCl 250 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, pH 7,9).

[00149] A mistura foi incubada por 1 hora a 37oC. O mRNA foi puri- ficado através de um método de coluna de rotação de acordo com ins- truções do fabricante (PCR purification kit from Qiagen). Isto rendeu 4 microgramas de mRNA.

[00150] A rotulação click foi realizada usando 1,1 microgramas de RNA, 1 nmol de azida Eterneon Red 645 (baseclick GmbH), um pélete de reator simples e 0,7 microlitro de 10x Activator (baseclick GmbH,

Oligo2 Click Kit) foram combinados em um volume total de reação de 7 microlitros. A mistura de reação foi incubada a 45oC por 30 minutos e então limpa usando um método de coluna de rotação de acordo com intruções do fabricante para produtos de PCR (PCR purification kit from Qiagen).

[00151] Para transfecção um kit comercial (jetMESSENGER de POLYPLUS TRANSFECTION) foi usado de acordo com as instruções do fabricante usando 0,5 micrograma de mRNA e 25000 células HeLa (CLS GmbH) atingindo confluência. As células foram incubadas a 37oC por 24 horas antes de análise sob o microscópio fluorescente, filtro GFP: (excitação 470/22; emissão 510/42) e filtro Cy5 (excitação 628/40; emissão 692/40) foram usados.

[00152] A Figura 5 mostra os resultados de transfecção de mRNA modificado com Eterneon Red codificando eGFP em células HeLa. Após 24 horas de incubação a 37oC fluorescência verde da eGFP foi observada (filtro GFP). Para o mRNA rotulado com Eterneon Red a localização do mRNA foi observada usando conjuntos de filtro Cy5.

[00153] Em imagem de campo brilhante morfologia de célula de cé- lulas HeLa saudáveis foi observada (Figura 5), usando o filtro GFP ex- pressão de proteína da eGFP foi visível (tempo de exposição de 120 ms). Localização do mRNA rotulado com Et-Red foi observada usando as montagens de filtro Cy5 do microscópio. Exemplo 3

[00154] De modo a provar a incorporação da EATP (etinil adenosi na-5’-trifosfato) dentro de cauda poli (A) um oligonucleotídeo RNA (31 meros, CUAGUGCAGUACAUGUAAUCGACCAGAUCAA, SEQ ID NO: 1) foi usado como molde para a reação poli (A) polimerase usando: A) 1 mM ATP B) 1 mM EATP; C) 0,5 mM ATP e 0.5 mM EATP.

[00155] Em um volume de reação de 20 microlitros 5 unidades de Escherichia coli poli (A) polimerase, 2 microgramas de RNA (31 me- ros) e nucleotídeo (concentração final de A-C) foram combinados em tampão de reação (NaCl 250 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, pH 7,9). As misturas foram incubadas por 30 minutos a 37oC ou por 16 horas a 37oC.

[00156] Os resultados foram analisados através de eletroforese de gel de poliacrilamida desnaturante (ureia 7 M, 1x TBE, gel de poliacri- lamida 7%, voltagem constante 100 V, 1 h). Comparado ao oligonucle- otídeo RNA molde (Figura 7, Faixa 2) uma banda ou esfregaço de maior peso molecular apareceu para todas as amostras, as quais fo- ram incubadas na presença da poli (A) polimerase usando diferentes nucleotídeos e durações de incubação (Figura 7, Faixa 3-7). Isto indi- cou incorporação bem-sucedida de ATP ou seu análogo alquino EATP. Dentro de 30 minutos de incubação a incorporação de ATP (Fi- gura 7, Faixa 3) foi mais eficiente comparada a EATP (Figura 7, Faixa 4) ou uma mistura de EATP e ATP (Figura 7, Faixa 5). Através de ex- tensão de tempo de incubação para a incorporação de EATP para 16 horas, o comprimento da adição-poli-EA foi aumentado (Figura 7, Li- nha 6) em comparação a 30 minutos de incubação (Figura 7, Faixa 4). Interessantemente, para a mistura de nucleotídeos contendo ATP e EATP nenhuma mudança foi observada após 16 h (Figura 7, Faixa 7) comparada a 30 minutos.

[00157] A Figura 7 mostra o gel de poliacrilamida desnaturante 7% manchado com brometo de etídio de diferentes reações de poliadeni- lação como descrito ac ima. Em cada faixa 500 ng de RNA foram car- regados. Faixa 1: escada DNA de baixo peso molecular (New England Biolabs), Faixa 2: RNA oligonucleotídeo molde de 31 meros, Faixa 3: reação de poliadenilação com ATP 1 mM por 30 minutos, Faixa 4: se- melhante a 3 mas EATP 1 mM, Faixa 5: semelhante a 3 mas EATP 0,5 mM e ATP 0,5 mM, Faixa 6: como 4 mas 16 h de incubação, Faixa 7: como 5 mas 16 h de incubação. Exemplo 4

[00158] mRNA modificado com azida codificando a proteína fluo- rescente verde aperfeiçoada (eGFP) foi produzido através de transcri- ção in vitro (IVT) a partir de um molde DNA usando T7 RNA polimera- se e mistura de nucleotídeos. Aqui 3’-azido-2’,3’-dideoxiadenosina (AzddATP) foi incorporada, assim terminando a elongação, no mRNA de IVT após reação de T7 RNA polimerase usando poli (A) polimerase de levedura para gerar um mRNA modificado com azida simples espe- cífico – sítio de acordo com a figura 8 para subsequente transfecção em células imortais Henrietta Lacks (células HeLa). O mRNA gerado contém uma cobertura-5’, regiões não traduzidas (UTR), a parte codifi- cando proteína (quadro de leitura aberto, ORF) e uma cauda poli (A) com uma azida terminal simples. Produção de mRNA

[00159] Em um volume de reação de 50 microlitros 20 unidades de T7 RNA polimerase, 1 micrograma de DNA molde e vários nucleotí- deos foram combinados em tampão de transcrição (Tris-HCl 40 mM, pH 7,9, MgCl2 6 mM, espermidina 4 mM, ditiotreitol 10 mM). Concen- trações finais de nucleotídeos foram: GTP 1,0 mM, A.R.C.A. (P1-(5’- (3’-O-metil)-7-metil guanosil) P3-(5’-(guanosil)) trifosfato, cap analog), CTP 1,25 mM, UTP 1,25 mM, ψUTP (pseudouridina trifosfato) 1,25 mM, ATP 1,5 mM.

[00160] A mistura foi incubada por 2 horas a 37oC e então 2 unida- des de DNAse I foram adicionadas e incubadas por 15 minutos a 37oC. O mRNA foi purificado por um método de coluna de rotação de acordo com as instruções dos fabricantes para produtos de PCR (PCR purifi- cation kit de Qiagen). Isto rendeu 13,7 microgramas de mRNA que fo- ram diretamente usados para adição de poli (A) de levedura com o análogo ATP contendo azida AzddATP.

[00161] Em um volume de reação de 25 microlitros 600 unidades de poli (A) polimerase de levedura, 5,8 microgramas de mRNA IVT purifi- cado e AzddATP 0,5 mM foram combinados em tampão de reação (glicerol 10% (v/v), Tris-HCl 20 mM, MnCl2 0,6 mM, EDTA 20 µM, DTT 0,2 mM, BSA acetilado 100 µg/mL, pH 7,0) e a solução foi incubada por 20 minutos a 37oC. mRNA modificado foi purificado através de um método de coluna de rotação de acordo com as instruções do fabrican- te para produtos de PCR (PCR purification kit de Qiagen). Isto rendeu 4,8 microgramas de mRNA.

[00162] Rotulação click foi realizada usando 4,8 microgramas de RNA e 2 nmoles de DBCO-sulfo-Cy3 (Jena Bioscience cat. No. CLK- A140-1), combinados em um volume de reação total de 30 microlitros. A mistura de reação foi incubada em temperatura ambiente por toda noite e então limpa usando um método de coluna de rotação de acor- do com as instruções do fabricante para produtos de PCR (PCR purifi- cation kit de Qiagen). Isto rendeu 4,0 microgramas de mRNA.

[00163] Para transfecção de mRNA modificado foi usado um kit comercial (jetMESSENGER de POLYPLUS TRANSFECTION) de acordo com as instruções do fabricante usando 0,5 micrograma de mRNA rotulado com Cy3 e 25.000 células HeLa (CLS GmbH) atingin- do confluência. As células foram incubadas a 37 oC por 24 horas antes de análise sob microscópio fluorescente, filtro GFP: (excitação 470/22; emissão 510/42) e filtro Cy3 (excitação 531/40; emissão 593/40) foram usados.

[00164] Na imagem de campo brilhante morfologia de célula de cé- lulas HeLa saudáveis foi observada (Figura 9 mostra a), usando o filtro GFP expressão de proteína de eGFP foi visível (tempo de exposição de 120 ms). Localização do mRNA rotulado com Cy3 foi observada usando as montagens de filtro Cy3 do microscópio.

Exemplo 5

[00165] mRNA modificado com azida / alquino codificando proteína fluorescente verde aperfeiçoada (eGFP) foi produzido através de transcrição in vitro (IVT) a partir de molde DNA usando T7 RNA poli- merase e mistura de nucleotídeos e poli (A) polimerase de levedura. Aqui 5-etinil-uridina-5’-trifosfato (EUTP) foi incluída na mistura de nu- cleotídeos para gerar um mRNA modificado com alquino seguido por incorporação de 3’-azido-2’,3’-dideoxiadenosi na (AzddATP), assim terminando a elongação e introduzindo uma azida simples. Este é o primeiro exemplo de rotulação dual do mRNA. Produção de mRNA

[00166] Em um volume de reação de 50 microlitros 20 unidades de T7 RNA polimerase, 1 micrograma de DNA molde e vários nucleotí- deos foram combinados em tampão de transcrição (Tris-HCl 40 mM, pH 7,9, MgCl2 6 mM, espermidina 4 mM, ditiotreitol 10 mM). Concen- trações finais de nucleotídeos foram: GTP 1,0 mM, A.R.C.A. (P1-(5’- (3’-O-metil)-7-metil-guanosil) P3-(5’-(guanosil)) trifosfato, Cap Anal og), CTP 1,25 mM, EUTP 0,625 mM (5-etinil uridina trifosfato), ψUTP (pseudouridina trifosfato) 0,625 mM, UTP 0,625 mM, ATP 1,5 mM.

[00167] A mistura foi incubada por 2 horas a 37oC e então 2 unida- des de DNAse I foram adicionadas e incubadas por 15 minutos a 37oC. O mRNA foi purificado através de um método de coluna de rotação de acordo com instruções do fabricante para produtos de PCR (PCR puri- fication kit de Qiagen). Isto rendeu 13,9 microgramas de mRNA que foram usados diretamente para adição de poli (A) de levedura com o análogo de ATP contendo azida AzddATP.

[00168] Em um volume de reação de 25 microlitros 600 unidades de Poli (A) polimerase de levedura, 5,8 microgramas de mRNA IVT purifi- cado e AzddATP 0,5 mM foram combinados em tampão de reação (glicerol 10% (v/v), Tris-HCl 20 mM, MnCl2 0,6 mM, EDTA 20 µM, DTT

0,2 mM, BSA acetilado 100 µg/mL, pH 7,0) e a solução foi incubada por 20 minutos a 37oC. mRNA modificado foi purificado através de um método de coluna de rotação de acordo com instruções do fabricante para produtos de PCR (PCR purification kit de Qiagten). Isto rendeu 4,35 microgramas de mRNA.A primeira rotulação click (adição de azi- da – cicloalquino promovida por linhagem, SPAAC) foi realizada usando 4,35 microgramas de RNA e 2 nmoles de DBCO-sulfo-Cy3 (Jena Bioscience cat no. CLK-A140-1), combinados em um volume total de reação de 30 microlitros. A mistura de reação foi incubada em temperatura ambiente por toda noite e então limpa usando um método de coluna de rotação de acordo com instruções do fabricante para produtos de PCR (PCR purification kit de Qiagen). Isto rendeu 2,55 microgramas de mRNA.

[00169] Uma segunda reação click (adição de azida – cicloalquino catalisada com Cu, CuAAC) foi realizada com 2 microgramas de RNA, 1 nmol de Azida Eterneon Red 645 (baseclick GmbH), um pélete de reator simples e 0,7 microlitro de 10x Activator (baseclick GmbH, Oli- go2 Click Kit) combinados em um volume total de reação de 7 microli- tros. A mistura de reação foi incubada a 45oC por 30 minutos e então limpa usando um método de coluna de rotação de acordo com instru- ções do fabricante para produtos de PCR (PCR purification kit de Qia- gen).

[00170] Para transfecção foi usado um kit comercial (jetMESSEN- GER de POLYPLUS TRANSFECTION) de acordo com instruções do fabricante usando 0,5 micrograma de mRNA e 25.000 células HeLa (CLS GmbH) atingindo confluência. As células foram incubadas a 37oC por 24 horas antes de análise sob microscópio fluorescente, filtro GFP: (470/22Ex; 510/42 Em), filtro Cy5 (628/40Ex; 692/40 Em) e filtro Cy3 (excitação 531/40; emissão 593/40) foram usados.

[00171] Na imagem de campo brilhante morfologia de célula de cé-

lulas HeLa saudáveis foi observada (Figura 11). Usando filtro GFP, expressão de proteína da eGFP foi visível (tempo de exposição de 120 ms). Localização do mRNA rotulado com Cy3 e Eterneon Red foi ob- servada usando as montagens de filtros Cy3 e Cy5 do microscópio, provendo rotulação dual com duas moléculas diferentes. Exemplo 6: Quantificação relativa de expressão de mRNA via classificação / exploração de célula ativada – fluorescência (FACS)

[00172] Este experimento foi pretendido para avaliar o nível de ex- pressão de mRNA eGFP transcrito in vitro (IVT) em células usando um dispositivo FACS. Expressão de eGFP é monitorada diretamente via sua emissão de fluorescência em 509 nm com excitação em 475 nm e pode indicar se introdução de um grupo funcional no RNA, por exem- plo, um alquino terminal ou uma molécula corante pode alterar o nível de expressão. Além disso, absorção de mRNA modificado com coran- te pode ser monitorada sobre um segundo canal de fluorescência. Va- riações no nível de expressão dentro de população de cultura de célu- las podem ser detectadas para avaliação de homogeneidade de pre- paração de mRNA.

[00173] Três diferentes mRNAs IVT foram preparados usando a T7 RNA polimerase e um molde de DNA com diferentes misturas de nu- cleotídeos, e se necessário uma subsequente reação click: A) mistura de nucleotídeos não modificados (= mRNA eGFP não modificado), B) mistura de nucleotídeos contendo 5-etinil-uridina 5’-trifosfato ( = mRNA eGFP modificado com alquino), C) como B) mas subsequente reação click na presença de azida Eterneon-Red (análogo Cy5, baselick GmbH) (= mRNA eGFP Eterne- on Red).

[00174] 2 microgramas de cada preparação foram usados para transfecção em células imortais Henrietta Lacks (HeLa) e tampão sem mRNA como um controle negativo. Após 24 horas de incubação a 37oC as células foram destacadas, fixadas e então pelo menos 10.000 células foram analisadas usando FACS (FACS Canto II, Becton Dickinson).

[00175] Todas as amostras foram analisadas usando dois canais, um para fluorescência de eGFP para avaliar a expressão de proteína e um para a fluorescência de corante Eterneon Red para avaliar a pre- sença de mRNA rotulado com corante. Isto resultou em um histograma e gráfico de ponto que são mostrados para cada experimento e canal de fluorescência como reportado abaixo. O histograma mostra o nú- mero de células contadas por intensidade de fluorescência e o gráfico de pontos mostra a organização interna de célula (SSC) em correlação à intensidade de fluorescência (eGFP ou Eterneon Red). Dados de

10.000 contagens (= 10.000 células) foram coletados para cada amos- tra.

[00176] a) Células HeLa, que não foram transfectadas com mRNA, foram analisadas como um controle negativo e para estabele- cimento de nível da fluorescência intrínseca. Isto permitiu fixar um por- tão (P1) nos gráficos de pontos que definiu o nível a partir do qual cé- lulas são consideradas expressando a proteína eGFP. Cada ponto dentro de portão P1 foi definido como uma célula expressando eGFP com uma específica intensidade de fluorescência. O resultado é mos- trado na Figura 12.

[00177] b) quando transfectadas com mRNA eGFP não modifica- do (A) quase todas as células com P1 igual a 96,5% estavam expres- sando a proteína fluorescente (população vermelha). Os resultados são mostrados na Fig. 13. Um resultado muito similar foi obtido quan- do células HeLa foram transfectadas com mRNA eGFP modificado com alquino (B) e um valor P1 de 96,4%. Os resultados deste experi-

mento são mostrados na Fig. 14.

[00178] c) Quando células HeLa foram transfectadas com mRNA eGFP Eterneon Red (C) uma população P1 de 75% foi observada, significando que mesmo através de ligação de uma molécula de coran- te estereamente demandante ao mRNA eGFP os ribossomas ainda são capazes de traduzir o mesmo em uma proteína funcional com 78% de nível de expressão relativa como comparado ao mRNA eGFP não modificado. Resultados podem ser vistos na Fig. 15.

[00179] d) Além disso, devido o mRNA ser rotulado com o coran- te Eterneon Red foi possível observar a quantidade relativa de mRNA por célula. Quando as células definidas como não expressando eGFP foram analisadas (portão P2 em cinza claro) foi observado que todas elas correspondem às células que internalizam baixas quantidades de mRNA rotulado com Eterneon Red. Esta assunção deriva do canal Eterneon Red onde P2 (cinza claro) corresponde aos valores mais baixos de intensidade de fluorescência. Os resultados são mostrados em Fig. 16.

Claims (27)

REIVINDICAÇÕES

1. RNA mensageiro modificado (mRNA), caracterizado pelo fato de que contém pelo menos uma de uma modificação alquino ou azida em pelo menos um nucleotídeo em a) o ORF e as UTRs, b) o ORF, as UTRs e a cauda poli (A), ou c) somente a cauda poli (A).

2. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos quatro tipos padrões de nucleotídeos (AMP, CMP, GMP, UMP) está parcial ou completamente modificado, preferivelmente modificado com etinila ou azido em uracila ou adenina.

3. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleotídeo está modificado com alquino e pelo menos um nucleotídeo estar modificado com azida.

4. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com qualquer uma de reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos quatro tipos padrões de nucleotídeos está presen- te em forma modificada comparado à forma não modificada em uma razão de 1:100 a 10:1, preferivelmente 1:10 a 1:10 ou 1:1.

5. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que contém nucleotídeos naturais ou artificiais de outro modo modificados, preferivelmente pseudouridina ou N1-metil pseudouridina.

6. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que contém um ou mais de um rótulo detectável e uma molécula funcional introduzidos via uma reação click do mRNA modificado com um cor- respondentemente modificado rótulo detectável ou molécula funcional contendo alquino ou azida.

7. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o rótulo detectável é uma molécula colorida ou fluorogênica e/ou a molécula funcional é um grupo ou ligante alvejante específico de tecido ou célula, preferivel- mente uma metade açúcar ou uma metade ácido graxo.

8. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com qualquer uma de reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é complexado com um composto catiônico ou policatiônico.

9. Processo para a produção do mRNA modificado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende transcrição in vitro de mRNA a partir de um molde DNA ou alternativamente realiza um processo de fermentação usando células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas para expres- são de molde DNA contido em um vetor de expressão onde o proces- so é realizado na presença de uma RNA polimerase e uma mistura de nucleotídeos contendo os quatro tipos padrões de nucleotídeos reque- ridos para transcrição de mRNA, em cuja mistura de nucleotídeos pelo menos uma parte de pelo menos um dos quatro tipos de nucleotídeos está modificada para conter uma modificação alquino ou azida.

10. Processo para a produção de um mRNA modificado contendo uma modificação alquino ou azida na cauda poli (A), caracte- rizado pelo fato de que compreende modalidade de uma reação de adição de poli (A) polimerase na cauda poli (A) sobre um mRNA na presença de ATP, onde ATP está pelo menos parcialmente modificada com alquino ou azida na adenosina.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, carac- terizado pelo fato de ainda compreender adição de um rótulo e/ou mo- lécula funcional detectável correspondentemente modificado com al- quino ou azida sob condições para modalidade de uma reação click para produzir um mRNA modificado de acordo com as reivindicações 6 ou 7.

12. Preparação de células, caracterizada pelo fato de que é obtida através de transfecção ex vivo de correspondentes células pa- rentes humanas, de animais ou plantas com um mRNA modificado como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 8.

13. Preparação de células de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que as células são células do sistema imune humano ou animal.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um mRNA modificado como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 8 ou uma célula como definida na reivindi- cação 12 ou 13 como um agente ativo, opcionalmente em combinação com um adjuvante, ou excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou contida em um carreador farmaceuticamente aceitável.

15. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou uma composição farmacêu- tica de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é para uso em aplicações terapêuticas e/ou profiláticas baseadas em mRNA.

16. Uso de um RNA mensageiro modificado (mRNA) como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 8 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido uso é para a preparação de uma composição ou kit para aplicações terapêuticas e/ou profiláticas baseadas em mRNA.

17. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com qualquer uma de reivindicações 1 a 8 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que é para uso em aplicação terapêutica e/ou profilática de acordo com a reivindicação 15, onde a aplicação terapêutica e/ou profilática compreende entrega alvejada em terapia de reposição de gene, terapia alvejada de gene em combinação com específicas endonucleases codificadas pelo mRNA (por exemplo, CRISPR/Cas9), em vacinação, em terapia de câncer e para expressão de gene específica de célula ou edição de gene para tratamento de doenças 9herdadas) e aberrações genéticas, ou o uso como um adju- vante imunológico.

18. RNA mensageiro modificado (mRNA) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 ou uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que é para uso em aplicação terapêutica e/ou profilática de acordo com as reivindicações 15 ou 17 em um hu- mano ou um animal.

19. Uso de um mRNA modificado como definido em qual- quer uma de reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é pa- ra transfecção de plantas e células de plantas.

20. Kit caracterizado pelo fato de que é para produção e/ou entrega de um mRNA modificado como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 8.

21. Composição diagnóstica caracterizada pelo fato de que é para a seleção in vitro para a presença, entrega e/ou distribuição do mRNA modificado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em células, tecido ou órgãos, onde a composição contém o mRNA modificado incluindo um rótulo detectável, preferivelmente um rótulo fluoróforo ou um rótulo radionuclídeo.

22. Composição diagnóstica caracterizada pelo fato de que é para uso em seleção in vivo para a presença, entrega e/ou distribui- ção do mRNA modificado como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 8 ou para monitoramento in vivo da readministração de uma célula como definida na reivindicação 12 ou 13, onde a composi-

ção contém o mRNA modificado incluindo um rótulo fluoróforo ou um rótulo radionuclídeo, ou a célula é transfectada por um mRNA modifi- cado incluindo um rótulo fluoróforo ou um rótulo radionuclídeo.

23. Método para estabilização de RNA, caracterizado pelo fato de que a modificação alquino e/ou azida é introduzida através de inclusão de pelo menos um dos quatro tipos padrões de nucleotídeos (ATP, CTP, GTP e UTP) em forma parcial ou completamente modifi- cada com alquino e/ou azida durante síntese de RNA e/ou em uma reação de adição de poli (A) polimerase para produzir um mRNA modi- ficado como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 8, e opci- onalmente um ou mais de um rótulo detectável e uma molécula funci- onal são introduzidos via uma reação click do (m)RNA modificado com uma molécula funcional ou rótulo detectável contendo alquino ou azida correspondentemente modificado.

24. Método in vitro caracterizado pelo fato de que é para determinar qualitativamente ou quantitativamente entrega e transfec- ção de um mRNA modificado como definido em qualquer uma de rei- vindicações 1 a 8, para células-alvo via uma análise de exploração de célula ativada por fluorescência, onde o mRNA modificado contém uma ou mais moléculas fluorogênicas introduzidas via uma reação click para o mRNA modificado com uma molécula fluorogênica con- tendo alquino ou azida correspondentemente modificada e/ou cujo mRNA modificado codifica uma proteína fluorescente.

25. Método in vitro de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizado pelo fato de que sinais de fluorescência emitidos pela mo- lécula fluorogênica ou a proteína fluorescente são determinados para células-alvo transfectadas com o mRNA modificado e comparados a células-alvo não transfectadas.

26. Uso de um RNA mensageiro modificado (mRNA) como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 8 ou uma célula como definida na reivindicação 12 ou 13, em que o RNA mensageiro modifi- cado (mRNA) inclui um rótulo fluoróforo ou um rótulo radionuclídeo, ou a célula é transfectada por um mRNA modificado incluindo um rótulo fluoróforo ou um rótulo radionuclídeo, caracterizado pelo fato de que o referido uso é para a preparação de uma composição ou kit para sele- ção in vivo para a presença, entrega e/ou distribuição do mRNA modi- ficado ou célula.

27. Invenção, caracterizada pelo fato de que está sob qual- quer forma das suas concretizações ou em qualquer categoria de rei- vindicação que se possa reivindicar, por exemplo, produto, ou proces- so, ou uso abrangido pelo objeto inicialmente descrito, revelado, ou ilustrado no pedido de patente.