KR20200103750A

KR20200103750A - 클릭-변형된 mRNA

Info

Publication number: KR20200103750A
Application number: KR1020207021072A
Authority: KR
Inventors: 토마스 프리슈무트; 사샤 제르튜코브; 비르기트 그라프; 스테파노 크로체
Original assignee: 바제클리크 게엠베하
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2020-09-02
Also published as: EP3728602A1; AU2018391796A1; CN112673106A; JP2023153794A; US20230226094A1; BR112020012538A2; US20210069232A1; JP2021511016A; WO2019121803A1; CA3086237A1

Abstract

본 발명은 알킨- 및/또는 아지드-변형된 mRNA, 이러한 변형된 mRNA를 제조하는 방법, 변형된 mRNA를 포함하도록 형질감염된 세포, 변형된 mRNA 또는 변형된 mRNA를 포함하는 세포를 함유하는 약학적 조성물, 및 mRNA 기반 치료적 및/또는 예방적 적용에 있어서 이러한 mRNA, 세포 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

클릭-변형된 mRNA

본 발명은 알킨- 및/또는 아지드-변형된 mRNA, 이러한 변형된 mRNA를 제조하는 방법, 변형된 mRNA를 포함하도록 형질감염된 세포, 변형된 mRNA 또는 변형된 mRNA를 포함하는 세포를 함유하는 약학적 조성물, 및 mRNA 기반 치료적 및/또는 예방적 적용에 있어서 이러한 mRNA, 세포 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 알킨- 및/또는 아지드-변형된 뉴클레오티드를 도입하여 RNA를 안정화시키는 방법 및/또는 추가적으로 변형된 mRNA의 표적 세포로의 전달 및/또는 변형된 mRNA에 의해 코딩된 단백질 산물의 발현을 결정하는 방법에 관한 것이다.

mRNA (Messenger RNA)는 세포 DNA로부터 전사되고, 유기체 세포내 리보솜에서 아미노산 서열, 즉 단백질로 번역되는, 주형 분자이다. 코딩된 단백질의 발현 수준을 조절하기 위해서, mRNA는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 정보를 함유하는 실제 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 플랭킹 (flanking)된 비번역 영역 (untranslated region: UTR)을 보유한다. 이러한 UTR은 각각 5'-UTR 및 3'-UTR이라고 하며, 개시 코돈 앞과 종결 코돈 뒤에 위치하는 mRNA의 부분이다. 또한, mRNA는 핵으로부터 mRNA의 유출, 번역을 촉진하고, mRNA 분해를 어느 정도까지 보호하는 아데닌 뉴클레오티드의 긴 서열인 폴리(A) 테일 영역을 함유한다.

mRNA의 화학적 및 생화학적 특성으로 인해, 이는 통상 세포 내에서 몇 분내에 분해되므로, 특정 단백질의 발현은 일반적으로 일시적 과정이다. 더욱이, 다중음이온성 mRNA 분자는 세포막을 통과하는데 적합하지 않으므로, 이는 mRNA의 외부 전달을 매우 어렵게 한다.

mRNA와 관련된 이러한 문제에도 불구하고, 최근 몇 년간 과학 및 기술의 진보는 mRNA를 신규한 부류의 약물에 대한 유망한 후보로 만들었다. Sahin U. et al., Nat.Publ.Gr. 13, 759-780 (2014)은 mRNA-기반 치료제 및 약물 개발에 대한 개요를 제공하였다. mRNA는 예를 들어 항체 및 효소와 같은 단백질의 인 비보 (in vivo) 생성을 유도하거나, 또는 특정 에피토프의 발현에 의해서 또는 구조적 mRNA 부분에 대한 선천적 면역 반응을 통해 면역 반응을 자극하는데 사용된다. 예를 들어, RIG-1은 RNA의 5'-트리포스페이트 말단에 결합하고, 전사 인자의 활성화 및 항바이러스 반응의 일부로서 시토킨의 방출을 유도하는 신호 캐스케이드 (signal cascade)를 유발한다. 면역 반응 자극을 위한 mRNA의 적용은 암, AIDS를 치료하고, 거의 모든 질병에 대한 백신을 생성하는 신규한 접근법에 사용될 수 있다 (cf. Pardi, N. et al., Nat. Publ . Gr . 543, 248-251 (2017) and Schlake T. et al., RNA Biol . 9, 1319-30 (2012)). 이러한 흥미로운 개발의 핵심은 향상된 번역 효율을 갖는 안정화된 mRNA의 강력한 인 비트로 (in vitro) 생성 및 특정 형질감염 제제를 사용한 이의 세포로의 전달에 있다.

mRNA 안정성 및 번역 효율은 몇 가지 요인에 의존한다. 특히 상기 mRNA의 각 말단에서 비번역 영역은 중요한 역할을 한다. 진핵생물의 단백질 발현에서, 5'-말단에서 캡 구조 (cap structure) 및 3'-말단에서 폴리(A) 테일 모두는 mRNA 안정성을 증가시키고, 단백질 발현을 증진시킨다. 또한, 상기 5'-UTR은 번역에 필요한 리보솜 결합 부위를 함유하고, 3'-UTR은 안정성을 향상시키고 번역에 영향을 주는 2차 구조를 채택하는 RNA 서열을 함유한다. 더욱이, N1-메틸슈도우리딘과 같은 변형된 천연 뉴클레오티드 및 인공 뉴클레오티드가 mRNA 안정성을 향상시키고, mRNA 번역을 증진시키기 위해 혼입될 수 있다 (Svitkin Y.V. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 45, No. 10, 6023-6036 (2017)).

mRNA의 세포로의 전달은 세포막과의 융합을 위한 지질 및 올리고뉴클레오티드 백본의 음전하를 중화시키는 양이온을 함유하는 혼합물을 제공함으로써 달성될 수 있다. mRNA 전달을 최적화하고 임상 시험에 충분한 인 비보 안정성이 부여된 특별한 제제가 형성되었다. 정맥내로 적용되는 대부분의 mRNA 제제는 간 세포에 의해 흡수되어 간 세포내에서 발현된다. 이는 지방산 대사작용에서 간이 주요 역할을 하므로, mRNA 제제의 높은 지질 함량이 장기-특이적 표적 효과 (organ-specific targeting effect)를 나타낸다는 사실에 기인한다. 그러나, 대부분의 경우에, 간은 원하는 표적이 아니므로, 예컨대 비장과 같이 면역 반응에 관여하는 표적 장기에 대해 지질 제제를 변형시키려는 노력이 이루어졌다 (Kranz L.M. et al., Nature 534, 396-401 (2016)). 대안으로서, 면역계 세포 (예: 림프구)는 환자 혈액으로부터 분리될 수 있고, 표적화를 허용하기 위해 mRNA 적용이 엑스 비보 (ex vivo)로 수행된다. 최근에, 항체 단편 변형된 지질 제제를 사용한 mRNA의 조직-특이적 표적화가 개시되었다 (Moffett H.F. et al., Nat. Commun. 8, 389 (2017)).

세포의 엑스 비보 형질감염 및 이러한 형질감염된 세포를 환자에게 복귀시킴으로써, mRNA의 직접적 또는 간접적 치료 적용 가능성과 관련된 최근의 진보 및 발전에도 불구하고, mRNA 안정성의 추가적 향상 및 치료제 또는 약물로서 이의 사용과 관련한 신규한 옵션 개발이 지속적인 연구 목적이다. 더욱이, 치료적 mRNA의 능률적이고 효율적인 제조를 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 특히 유전병 치료와 관련하여, 단백질 치환 및 유전자 대체 요법을 위한 mRNA의 표적화된 전달의 진보가 여전히 필요하다. 또한, 전달 및 단백질 발현의 모니터링을 가능하게 하는 것이 매우 바람직하다. 마지막으로, 예컨대 암 치료에서 mRNA의 면역 자극 효과를 이용하기 위한 추가적 옵션을 탐색하는 것이 지속적인 연구의 또 다른 목적이다.

본 발명은 전술한 목적에 대한 해결책을 제공하고, 특히 신규한 종류의 mRNA 변형에 관한 것이다. 이러한 변형은 엑스 비보 적용 및 후속한 인간 환자, 동물 또는 식물에게의 투여를 위해 관심 있는 mRNA를 안정화시킬 뿐만 아니라, 상기 변형된 mRNA의 특정 세포 또는 조직으로의 표적화된 전달 및 이러한 전달을 모니터할 수 있는 검출 가능한 표지 또는 관능기를 용이하게 부착시킬 수 있다.

제1 양상에서, 본 발명은 5'-캡 구조, 5'-비번역 영역 (5'-UTR), 오픈 리딩 프레임 영역 (ORF), 3'-비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리(A) 테일 영역을 포함하는 변형된 mRNA에 관한 것이며, 상기 mRNA는 상기 ORF, 5'-UTR, 3'-UTR 및 폴리(A) 테일 영역 중 적어도 하나의 영역내 뉴클레오티드에서 적어도 하나의 알킨- 또는 아지드 변형을 함유한다. 본 발명의 제1 양상의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 변형된 mRNA는, 상기 변형된 mRNA와 상응하는 변형된 알킨- 또는 아지드-함유 검출가능한 표지 또는 관능성 분자의 클릭 반응 (click reaction)을 통해 도입된, 하나 이상의 검출가능한 표지 및/또는 관능성 분자를 함유한다.

제2 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 변형된 mRNA를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 RNA 폴리머라제 및 RNA 전사에 필요한 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물의 존재 하에 DNA 주형으로부터 mRNA의 인 비트로 전사를 포함하며, 상기 뉴클레오티드 혼합물 중에 뉴클레오티드의 적어도 일부는 상기 뉴클레오티드에서 알킨- 또는 아지드-변형을 함유하도록 변형된다. 상기 제2 양상의 대체 구체예에서, 상기 변형된 mRNA는 발효 공정을 통해 생성된다. 이러한 공정에서, 진핵 또는 원핵 세포가 원하는 mRNA 생성을 위한 유전자 정보 (예: 플라스미드)를 함유하도록 형질전환되고, 알킨- 또는 아지드-변형된 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 프로드러그가 성장 배지 중에 포함된다. 상기 제2 양상의 또 다른 대체 구체예에서, 본 발명의 mRNA는 고체상 (solid phase) 또는 포스포르아미다이트 (phosphoramidite) 합성을 통해, 합성으로 제조된다.

본 발명의 제3 양상은 상기 mRNA의 정의된 영역, 예컨대 폴리(A) 테일 영역에서만 알킨- 또는 아지드-변형을 함유하는, 본 발명의 부위-특이적으로 변형된 mRNA를 제조하는 효소적 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 존재하에 mRNA에서 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응을 수행하는 단계를 포함하며, 상기 ATP는 상기 뉴클레오티드에서 적어도 부분적으로 알킨- 또는 아지드-변형된다.

본 발명의 제2 및 제3 양상의 특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 상응하는 알킨- 또는 아지드-변형된 검출가능한 표지 및/또는 관능성 분자는 클릭 반응을 수행하기 위한 조건하에 부가되어 이러한 검출가능한 표지(들) 또는 관능성 분자(들)를 포함하는 변형된 mRNA를 제조한다.

본 발명의 제4 양상은 세포 제제, 특히 면역계 세포 제제에 관한 것이며, 이는 본 발명의 변형된 mRNA를 함유하고, 엑스 비보 형질감염에 의해 수득된다.

본 발명의 제5 양상은 활성제 또는 면역학적 아쥬반트 (adjuvant)로서 본 발명의 변형된 mRNA 또는 이러한 mRNA를 포함하도록 엑스 비보 형질감염에 의해 수득된 세포 제제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 제6 양상은 인간 또는 동물에서 mRNA-기반 치료적 및/또는 예방적 적용에 있어서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 변형된 mRNA, 이러한 mRNA를 포함하는 세포 제제, 또는 본 발명의 약학적 조성물이다.

식물 또는 식물 세포를 형질감염시키기 위한 본 발명의 변형된 mRNA의 용도는 본 발명의 추가적 제7 양상이다.

본 발명의 제8 양상은 본 발명의 mRNA의 세포, 조직 또는 장기에서의 존재, 전달 및/또는 분포를 인 비트로 또는 인 비보 스크리닝 (screening)하기 위한 진단용 조성물에 관한 것이며, 이러한 조성물은 검출가능한 표지, 바람직하게는 형광단 또는 방사성핵종 (radionuclide)을 함유하거나 또는 이후에 이로 변형되는, 본 발명의 변형된 mRNA를 포함한다.

본 발명의 제9 양상은 본 발명의 변형된 mRNA를 제조 및/또는 전달하기 위한 부품의 키트에 관한 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 이러한 키트는 또한 변형된 mRNA와 변형된 표지/관능성 분자 사이의 클릭 반응을 수행 시에 이러한 검출가능한 표지 및/또는 관능성 분자를 함유하는 변형된 mRNA를 수득하기 위해, 하나 이상의 상응하는 알킨- 또는 아지드-변형된 검출가능한 표지 또는 관능성 분자를 함유한다.

본 발명의 제10 양상은 RNA, 특히 mRNA를 안정화시키는 방법에 관한 것이며, RNA 합성 중에 및/또는 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응에서 4가지 표준 타입의 뉴클레오티드 중 적어도 하나 (ATP, CTP, GTP 및 UTP) 및/또는 다른 알킨- 또는 아지드-변형된 적합한 뉴클레오티드 또는 슈도뉴클레오티드 (즉, 표준 타입의 뉴클레오티드와 비교하여 거짓 (false) 또는 비정상적인 (unusual) 구조를 갖는 뉴클레오티드)를 부분적 또는 완전하게 알킨- 및/또는 아지드-변형된 형태로 포함함으로써, 알킨- 및/또는 아지드-변형이 도입된다. 클릭 반응을 통해 상응하는 아지드- 및/또는 알킨-변형된 분자 또는 기를 상기 변형된 RNA에 커플링 (coupling)함으로써 추가적인 안정화가 수득될 수 있다.

본 발명의 제11 양상은 형광-활성화된 세포 스캐닝 (fluorescence-activated cell scanning: FACS)을 통해 형질감염된 세포에서 본 발명의 mRNA의 전달 및 발현 중 적어도 하나를 정성적 및 정량적으로 결정하는 방법이다.

본 발명은 소위 "클릭 화학 (click chemistry)" 또는 이의 요소를 사용하며, 이 기술을 적용하여 mRNA 분자를 변형시키서 개선된 안정성을 부여하고 및/또는 특히 mRNA 기반 요법 및 mRNA 백신 기술과 관련하여 이러한 변형된 mRNA 분자의 용도를 제공한다.

클릭 화학은 Sharpless 및 Meldal 그룹에 의해 2001/2002에 정의된 개념이다 (Sharpless, K.B. et al., Angew . Chem. 2002, 114, 2708; Angew . Chem . Int . Ed. 2002, 41, 2596; Meldal, M. et al., J. Org . Chem . 2002, 67, 3057). 그 이후에, 특히 1,3-쌍극자 Huisgen 고리부가반응 (1,3-dipolar Huisgen cycloaddition)의 변형인, 1,2,3-트리아졸을 제공하는 아지드와 알킨의 구리 촉매화 반응 (R. Huisgen, 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (Ed.: A. Padwa), Wiley, New York, 1984)이 클릭 반응을 수행하는 매우 널리 사용되는 방법이 되었다. 온화한 조건과 높은 효율의 결과로, 상기 반응은 다양한 목적을 위한 DNA 표지화와 같이 생물학과 재료 과학에서 많은 응용을 발견하였다 (Gramlich, P.M.A. et al., Angew . Chem . Int . Ed. 2008, 47, 8350).

구리 촉매화 클릭-반응 이외에, 구리가 없는 생체 직교 방법 (copper-free, bio-orthogonal methods)이 개발되었고, 이러한 모든 방법은 일반적으로 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다. 예컨대, SPAAC (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition) (I.S. Marks et al., Bioconjug Chem . 2011 22(7): 1259-1263)는 본 발명과 관련하여 단독으로 또는 구리-촉매화 클릭 화학 (CuAAC)과 조합하여 사용될 수 있다. 특히 세포 배양 또는 생물체에서 인 비보 표지화 반응을 수행하는 것이 바람직한 경우에, SPAAC를 사용하여 이러한 반응을 수행하는 것은 상기 방법이 독성 물질 또는 외부 촉매의 사용을 필요로 하지 않기 때문에 바람직하다.

클릭 화학은 리포터 분자 또는 표지를 관심 있는 생체분자에 용이하게 부착하여, 이러한 생체분자를 동정, 국소화 및 특성을 규명하는 매우 강력한 도구이다. 예를 들어 상기 방법은 표적 생체분자의 분리 및 정제를 위한 분광학적 정량화를 위한 형광 프로브, 또는 앵커 분자 (anchor molecules)의 포함 및 부착을 가능하게 한다. 지금까지, 클릭 화학을 기본 원리로 사용하는 많은 응용이 개발되었다. 차세대 시퀀싱 (Next-generation sequencing)은 이러한 응용 중 하나로, 이는 구리-촉매화 아지드 알킨 고리부가반응 (CuACC)에 의해 생성될 수 있는 포스포디에스테르 결합에 대한 비-천연 대체물인 소위 "백본 모방체 (backbone mimics)"의 형성이 예컨대 DNA 단편 및 어댑터 서열 (adapter sequences)을 연결하는데 사용되는 경우 이 기술이 유익하다. 포스포디에스테르 결합 대신에 트리아졸 고리의 존재에도 불구하고, 이러한 백본 모방체는 PCR 또는 역전사와 같은 폴리머라제 구동 DNA 또는 RNA 제조 방법에 허용 가능한 기질이다. 세포 증식 검출도 클릭-화학에 대한 추가의 응용 분야이다. 통상적으로 적용되는 방법은 복제 중에 BrdU 또는 방사성 뉴클레오시드 유사체를 세포에 부가하고, 이의 DNA로의 혼입을 검출하는 단계를 포함한다. 그러나, 방사능과 관여된 방법은 속도가 느려서, 신속한 고처리 연구 (rapid high-throughput studies)에는 적합하지 않으며, 또한 관여된 방사능 때문에 불편하다. BrdU를 검출하려면 항-BrdU 항체를 필요로 하며, 변성 조건을 적용하여 시편 (specimen) 구조의 분해를 초래하였다. EdU-클릭 분석법의 개발은 DNA 복제 반응에서 티미딘 유사체인 5-에티닐-2'-데옥시우리딘을 포함시킴으로써 이러한 한계를 극복하였다. 항체 대신에 클릭 화학을 통한 검출은 선택적, 직접적, 생체 직교성 (bioorthogonal)이며, 혼입된 뉴클레오시드 검출을 위한 DNA 변성을 필요로 하지 않는다.

본 발명의 맥락에서, mRNA의 인 비트로 전사 중에 또는 mRNA 생성을 위한 발효 공정 중에 알킨- 및/또는 아지드-변형된 뉴클레오티드를 도입하여 상응하는 변형된 mRNA를 생성하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 상기 알킨- 또는 아지드-변형은 mRNA에 함유된 일부 또는 모든 요소에 포함될 수 있으며, UTR, ORF 및 폴리(A) 테일 중 적어도 하나에 포함될 필요가 있다. 상기 캡 구조의 변화는 eIF4E, eIF4F 및 eIF4G와 같은 개시 인자의 효율적인 결합을 방해하여 번역 효율을 급격하게 감소시킬 수 있기 때문에, 5'캡 구조는 이러한 알킨- 또는 아지드 변형을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 변형의 존재는 한편으로는 mRNA를 안정화시키고, 다른 한편으로는 클릭 화학을 통한 조직- 또는 세포-특이적 리간드 또는 표적화 분자의 부착 또는 후속-효소적 표지화 (post-enzymatic labeling)를 위해 특정 앵커 부위를 제공한다. 따라서, 본 발명은 형질감염 또는 적용 후에 mRNA의 존재 및 국소화의 검출을 가능하게 할뿐만 아니라 치료적 적용과 관련하여 mRNA의 특정 장기 또는 세포 타입으로의 표적화된 전달에 대한 새로운 옵션을 제공한다. 상응하는 변형된 mRNA는 본 발명은 제1 주제이다.

인 비트로 전사 중에 또는 원핵생물 또는 진핵생물에서 발효를 통한 mRNA 생성 중에 알킨- 또는 아지드-변형된 형태로 포함된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 타입에 따라, 결과의 변형된 mRNA는 5'- 및 3'-UTR 및 ORF뿐만 아니라, 폴리(A) 테일 영역에서 변형을 함유할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 예컨대 하나 이상의 변형된 CTP, GTP 및 UTP를 포함하면 UTR 및 ORF 내에 변형을 초래하고, 또한 변형된 ATP를 포함하면 폴리(A) 테일 영역의 변형을 초래한다. 전사 중에 알킨- 및/또는 아지드-변형된 ATP만을 포함하면 UTR, ORF 및 폴리(A) 테일 영역에서 변형을 초래한다.

본 발명의 mRNA 내에 알킨- 또는 아지드-변형된 뉴클레오티드의 존재에 의해 야기된 심각한 부정적인 효과는 관찰되지 않았다. 상기 반응에 포함된 변형된 뉴클레오티드의 양에 따라, 인 비트로 및 인 비보 전사 효율은 비-변형된 뉴클레오티드가 반응 혼합물 중에 존재하는 경우와 같이 효과적일 수 있거나 또는 약간 감소될 수 있다. 또한, 상기 mRNA의 변형은 리보솜에서 단백질 생성 중에 mRNA의 번역을 손상시키지 않는 것으로 보인다. 환경에 따라, 인 비트로 전사 반응 또는 발효 공정에 포함될 변형된 뉴클레오티드의 양은 최대 mRNA 수율 또는 최대 변형을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 클릭 반응을 통해 염료가 검출가능한 표지로서 mRNA에 부착되는 경우, 검출을 보장하고 용이하게 하기 위해 이의 충분히 많은 양을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 반면에 특정 세포 수용체를 표적화하기 위해서, 원하는 효과를 달성하기 위해 단 1개 또는 몇 개의 개별 리간드 분자를 포함하는 것으로 충분할 수 있다.

이후에 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 알킨- 또는 아지드-변형된 뉴클레오티드를 포함하여 mRNA에 대한 안정화 효과를 갖는다. 본 발명의 변형의 안정화 효과는 이러한 변형이 전체 mRNA 분자에 대해 분포되어 있는 경우 가장 현저할 것으로 기대된다. 이러한 경우에, 클릭 화학을 통한 검출가능한 표지 및/또는 관능성 분자의 후속 부착은 또한 전체 mRNA 분자에 걸쳐 균일하게 발생할 것이고, 심지어 향상된 안정화 효과를 제공할 수 있다.

그러나, 일부 경우에, 단백질 발현 중에 mRNA의 후속하는 번역에는 관여되지 않는 mRNA 분자의 일부로 표지 또는 관능성 분자의 포함을 제한하는 것이 중요할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 폴리(A) 테일 영역에서만 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 이에 의해 리보솜 활성이 리간드 또는 표적화 분자와 같은 특히 더 길거나 또는 더 부피가 큰 표지 또는 관능성 분자의 존재에 의해 손상되지 않도록 보장될 수 있다.

그러므로 본 발명은 또한 폴리(A) 테일 영역에서만 알킨- 또는 아지드-변형을 함유하는 변형된 mRNA를 제공한다. DNA 주형의 인 비트로 전사 또는 발효 공정 중에 알킨- 또는 아지드 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 대신에, 폴리(A) 폴리머라제 및 알킨- 또는 아지드-변형된 ATP의 존재하에 부가 반응을 수행함으로써 임의의 원하는 mRNA를 위해 폴리(A) 테일 영역에서만 변형을 달성할 수 있다.

본 발명의 변형된 mRNA에서 알킨- 또는 아지드-변형의 양 및 타입을 조절함으로써, 임의의 의도된 적용과 관련하여 관심 있는 분자의 후속-효소적 부착을 위한 옵션 및 안정화를 요구되는 바와 같이 실행 가능하게 부여하도록 결과의 mRNA를 편리하고 용이하게 조정할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 상기 아지드- 또는 알킨-변형은 핵염기 (nucleobase)에서 또는 개별 뉴클레오티드의 리보스 유닛 (ribose unit)의 2'-위치에서 포함될 수 있다. 매우 특별한 경우에, 상기 리보스의 3'-위치에서 변형을 함유하는 뉴클레오티드의 포함이 또한 가능하다. 이러한 경우에, 상기 효소적 폴리(A) 부가 반응은 하나의 변형된 뉴클레오티드의 포함 시에 종결된다. 본 발명의 이 양상의 바람직한 일 구체예에서, 상기 변형된 mRNA는 UTR, ORF 및 또한 선택적으로 폴리(A) 테일 영역 중 적어도 하나의 영역내 적어도 하나의 뉴클레오티드에서 2'-리보스 위치 또는 핵염기에서 알킨- 및/또는 아지드-변형, 및 부가로 폴리(A) 테일내 리보스의 3'-위치에서 사슬-종결 알킨- 또는 아지드-변형을 포함한다. 다른 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 mRNA는 폴리(A) 테일 영역내 3'-리보스 위치에서 사슬-종결 알킨- 또는 아지드-변형을 함유하지 않는다.

본 발명의 mRNA에 포함된 변형된 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드, 특히 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실 염기를 갖는 표준 뉴클레오티드 중 하나로부터 유래될 수 있거나, 또는 이는 결과의 변형된 mRNA의 전사 및/또는 번역 및 기능에 부정적인 영향을 미치지 않는 다른 자연 발생하는 뉴클레오티드 (예: 슈도우리딘 유도체) 또는 심지어 비-자연 발생하는 분자 (예: F. Eggert, S. Kath-Schorr, Chem . Commun ., 2016, 52, 7284-7287)의 변형일 수 있다. 바람직하게, 상기 변형된 뉴클레오티드는 mRNA내 천연 뉴클레오티드 또는 자연 발생하는 뉴클레오티드로부터 유래된다.

클릭 반응에 적절한 알킨- 및 아지드-기가 당업자에게 알려져 있고, 입수 가능하며, 이러한 모든 기가 본 발명과 관련하여 변형된 뉴클레오티드 및 변형된 mRNA를 제조하는데 사용될 수 있다. 상기 알킨-변형된 뉴클레오티드는 바람직하게는 에티닐-변형된 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 5-에티닐우리딘 포스페이트 또는 7-에티닐-7-데아자아데닌 포스페이트이다. 원칙적으로 고급 알킨-변형된 뉴클레오티드, 구체적으로 프로피닐 또는 부티닐 변형된 뉴클레오티드, 심지어 C-C 삼중 결합-함유 고리계를 사용하는 것이 또한 가능하지만, 적절한 알킨 분자를 선택할 때 예컨대 전사 또는 폴리(A) 폴리머라제 반응 효율뿐만 아니라 mRNA의 단백질로의 추가적 번역에 대한 가능한 부정적 영향을 고려해야 할 것이다. 본 발명에 유용한 뉴클레오티드에 대한 아지도-변형은 예컨대 알킬 부분이 바람직하게는 저급 알킬기, 구체적으로 메틸, 에틸 또는 프로필기인 아지도알킬기를 포함할 수 있다. 아지드-변형된 뉴클레오티드로서, 본 발명의 mRNA에 포함을 위해 바람직하게는 5-(3-아지도프로필)-우리딘 포스페이트 또는 8-아지도아데닌 포스페이트가 고려되었다. 폴리(A) 부가 반응의 종결을 유발하는 아지드-변형된 뉴클레오티드의 예는 3'-아지도-2',3'-디데옥시 아데닌 포스페이트이다.

원칙적으로, 적어도 하나의 타입의 변형된 뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 알킨- 또는 아지드-변형될 수 있거나, 또는 대안으로서, 이러한 뉴클레오티드의 일부만이 변형된 형태로 존재한다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에서 목적하는 변형 및 변형 속도에 따라, 다양한 뉴클레오티드의 변형된 형태 대 비-변형된 형태의 비율은 1:100 내지 10:1, 바람직하게는 1:10 내지 10:1, 더 바람직하게는 1:4 내지 4:1, 또한 바람직하게는 1:2 내지 2:1의 범위일 수 있다. 바람직하게, 변형된 뉴클레오티드 대 비-변형된 뉴클레오티드의 1:1, 1:4 또는 1:10의 조합이 본 발명의 mRNA에 포함된다.

상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 변형된 mRNA에서 알킨- 또는 아지드-변형된 뉴클레오티드 또는 핵염기의 존재는 안정화 효과를 부여한다. 한편, 엔도리보뉴클레아제의 공격은 내부 변형에 의해 어느 정도 제한된다. 3'-말단에서 변형된 ATP의 폴리(A) 폴리머라제 기반 부가 중에 폴리(A) 테일 영역의 연장은 추가적인 안정화 효과를 초래한다. 엑소리보뉴클레아제에 의한 mRNA 분자의 공격 및 분해는 RNA의 두 말단에서 발생한다. 본 발명에 따른 mRNA는 5'-말단에서 캡을 함유하며, 이는 상기 측면에서 분해로부터 보호를 제공한다. 3'-말단에서 추가 변형된 아데노신 뉴클레오티드를 포함시킴으로써 추가적 보호를 부여하며, 이는 3'→5' 방향으로 엑소리보뉴클레아제의 공격이 방해받고, 코어 mRNA, 특히 ORF에 도달하는 분해가 지연되기 때문이다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 검출가능한 표지 및/또는 관능성 분자는 상응하는 변형된 알킨- 또는 아지드-함유 표지 또는 관능성 분자와의 클릭 반응을 통해 변형된 mRNA로 도입될 수 있다. 뉴클레오티드 변형, 또한 검출가능한 표지 또는 관능기의 변형에 있어서, 적절한 알킨- 및 아지드기가 당업자에게 알려져 있으며, 이러한 기에 대한 바람직한 예는 상기에 기재된 바와 같이 적용 가능하다. 변형된 mRNA내 알킨-변형된 뉴클레오티드 및 아지드-함유 표지 또는 관능성 분자의 반응 또는 본 발명의 변형된 mRNA내 아지드-변형된 뉴클레오티드 및 알킨-함유 표지 또는 관능성 분자의 반응은 클릭 반응을 수행하는 조건 하에 수행되며, mRNA와 표지 또는 관능성 분자 간의 연결을 형성하는 5-원 헤테로사이클릭 1,2,3-트리아졸 모이어티 형성을 초래한다. 본 발명에 따르면, 용어 알킨-함유 표지 또는 관능성 분자는 또한 SPAAC 반응 및 생체 직교 연결 반응 (bio-orthogonal ligation reactions)을 통한 인 비보 표지화와 관련하여 특히 고려되었던 시클로옥틴과 같은 C-C 삼중 결합-함유 고리계를 포함한다.

상기 표지 및 관능성 분자의 타입 및 크기는 특별히 제한되지 않으며, 의도된 용도에 의해 결정된다. 검출가능한 표지에 대해 바람직한 예는 색상 부여 또는 형광 부여 표지, 예컨대 플루오레세인 유도체 예컨대 FITC, Alexa Fluor 염료 또는 DyLight Fluor 염료, 시아닌 염료 예컨대 Cy5 및 Cy3 또는 로다민 염료 예컨대 Texas Red 및 5-TAMRA, 또는 임의의 다른 형광 염료를 포함한다. 무색 (non-colored) 소분자 (예: 바이오틴)가 효소 또는 결합 단백질-효소 접합체 (예: 항체 효소 접합체)에 대한 기질일 때 사용될 수 있고, 효소 반응 캐스케이드 및 추가적 기질을 통해 유색 또는 발광 산물을 생성할 수 있다. 또한, 방사성핵종은 검출가능한 표지로서, 예컨대 바람직하게는 양전자 방출 단층촬영 스캔을 사용하여 검출될 수 있는 양전자 방출 방사성핵종을 포함할 수 있다. 반감기가 짧은 방사성핵종, 예컨대 ¹⁸F의 경우, mRNA 생성 후 클릭 표지화를 사용한 mRNA의 빠르고 강력한 표지화 능력은 PET를 사용한 mRNA 생체분포 연구를 위한 물질을 수득하는 유일한 실행 가능한 방법일 수 있다. 의도된 용도에 따라, 본 발명을 위한 검출가능한 표지로서 C¹³ 또는 P³³과 같은 중질의 동위원소 (heavy isotopes)도 고려될 수 있다.

클릭 반응을 통한 변형된 mRNA에 포함되는 관능성 분자는 제한되지 않으며, 바람직하게는 상기 mRNA를 암 세포를 포함하는 특정 조직 또는 세포로의 표적화된 흡수를 매개하거나 또는 상기 mRNA를 세포-표면에 적어도 부착 또는 고착시키는 세포- 또는 조직-특이적 리간드이다. 이러한 세포- 또는 조직-특이적 표적화는 예를 들어 세포- 또는 조직-특이적 리간드로서 특정 항체 또는 항체 단편, 펩티드, 당 모이어티, 소분자 (예: 엽산) 또는 지방산 모이어티를 사용하여 달성될 수 있다. 다수의 표적화 적용을 위한 개별 물질이 개시되었으며, 당업자가 이용 가능하다. 일부 바람직하고 예시되는 표적화 분자는 표피 성장인자 수용체와 같은 세포 특이적 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편 또는 수용체 리간드, 폴레이트 (folate) 수용체를 표적으로 하는 폴레이트, 내인성 저밀도 지질단백질 수용체를 표적으로 하는 아포지질단백질 또는 내인성 카나비노이드 (cannabinoid) 수용체를 표적으로 하는 아라키돈산이 있다. 또한, 아미노산 서열 RGD 또는 유사한 서열이 세포 부착을 매개하는 것으로 밝혀졌으며, 또한 본 발명의 맥락에서 바람직한 리간드로 고려될 수 있다.

상기 mRNA에 부착된 관능성 분자의 존재는 뉴클레아제 분해에 대한 mRNA 안정성을 추가적으로 증가시킬 수 있고, 이는 상기 mRNA 내 적어도 하나의 천연 뉴클레오티드의 알킨- 또는 아지드-변형된 유사체로 일부 및 전부 대체 및 이에 관능성 분자의 부착이 mRNA 분자의 번역을 방해하지 않는 것으로 밝혀졌다.

알킨-변형된 또는 아지드-변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것 이외에, 본 발명의 변형된 mRNA는 부분적으로 또는 완전히 알킨-변형된 형태로 적어도 하나의 뉴클레오티드 및 부분적으로 또는 완전히 아지드-변형된 형태로 적어도 하나의 다른 뉴클레오티드를 함유하는 것도 가능하다. 추가적 옵션은 부분적으로 또는 완전히 알킨- 뿐만 아니라 부분적으로 또는 완전히 아지드-변형된 형태의 뉴클레오티드의 적어도 하나의 타입을 포함하는 mRNA이다. 이러한 mRNA는 효소 클릭 반응 후에 하류에서 상이한 표지 또는 관능성 분자가 부착될 수 있는 2개의 상이한 앵커 변형을 함유한다. 예를 들어, 이러한 특정 구체예에 한정되지 않고, 알킨-변형된 세포-특이적 표적화 기뿐만 아니라 아지드-변형된 검출가능한 표지가 부착되어 본 발명에 따른 변형된 mRNA의 다른 바람직한 구체예를 유도할 수 있다.

또한, 본 발명의 맥락에서 적어도 아지드-변형된 뉴클레오티드 및 알킨-변형된 뉴클레오티드를 함유하는 변형된 mRNA를 제공하는 것이 가능하고 바람직하며, 예컨대 아지드-변형된 뉴클레오티드에서 검출가능한 표지 또는 관능성 분자가 생체 직교 반응, 예컨대 SPAAC 인 비트로를 통해 부착되었고, 상기 알킨-변형된 뉴클레오티드는 CuAAC 반응을 통해 하류 인 비트로 표지화 반응에 이용 가능하다. CuAAC 반응 조건이 이중 표지화된 mRNA (알킨 및 아지드 기능 함유)에 적용하는 경우, 상기 mRNA를 원형화하는 것이 가능하며, 이는 예컨대 자기-스플라이싱 인트론을 사용하는 것에 대한 유용한 대안이다 (DOI: 10.1038/s41467-018-05096-6).

예를 들어, 본 발명의 변형된 mRNA는 UTR 및 ORF에서 한 종류의 변형 및 폴리(A) 테일에서 단독으로 다른 변형을 함유하는 것도 가능할 수 있다. 이러한 변형은 먼저 하나 이상의 제1 타입의 변형된 뉴클레오티드를 도입하기 위한 전사 반응을 수행한 다음에, 제2 타입의 변형-함유 ATP를 사용한 폴리(A) 폴리머라제 반응을 수행하여 이루어질 수 있다.

당업자에게는 다수의 변형 및 변형들의 조합이 본 발명과 관련하여 가능할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 또한, 상기 mRNA 분자 상에 알킨- 및/또는 아지드-변형의 존재에 기반하여 상이한 표지 또는 관능기를 포함할 수 있지만, 오히려 상이한 적절하게 변형된 표지 또는 관능성 분자의 클릭 반응 조건 하에서 연속 부가에 의해 또한 가능하다. 결과적으로, 본 발명은 상기 변형된 mRNA를 최적의 방식으로 의도된 용도로 조정하기 위한 방대한 수의 옵션 및 편리한 모듈 (modularity)을 제공한다.

알킨- 및/또는 아지드-변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것 외에, 본 발명은 또한 일반적으로 다른 변형이 mRNA 제조 또는 의도된 용도를 고려할 때 결과의 mRNA의 의도된 용도가 허용 가능하지 않은 정도로 유해한 영향을 나타내지 않는 한 (즉, 상기 변형이 본 발명의 맥락에서 변형된 mRNA에 적합함) 상기 뉴클레오티드에서 다른 변형을 허용한다. 상기 mRNA에 포함될 수 있는 이러한 다른 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 예로서, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트 (pseudo-UTP)가 고려될 수 있다. 슈도우리딘 (또는 5'-리보실우라실)은 발견된 최초의 변형된 리보뉴클레오시드였다. 이는 가장 풍부한 천연 변형된 RNA 염기이며, 종종 RNA에서 "제5 뉴클레오시드"로 지칭된다. 이는 전달, 리보솜 및 소핵 RNA와 같은 구조적 RNA에서 발견될 수 있다. 슈도우리딘은 염기 스태킹 (base stacking) 및 번역을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트는 증가된 뉴클레아제 안정성 및 선천성 면역 수용체와 인 비트로 전사된 RNA와의 변경된 상호작용과 같은 유리한 mRNA 특성을 부여할 수 있다. 슈도-UTP 및 추가의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 N1-메틸슈도우리딘 및 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트의 mRNA로의 혼입은 배양 및 인 비보에서 선천성 면역 활성화를 감소시키면서, 동시에 번역을 향상시키는 것으로 밝혀졌다 (B. Li et al., Bioconjugate Chemistry, 2016, 27, 849-853 and Y. Svitkin et al., Nucleic Acid Research, 2017, 45, 6023-6036). 그러므로, 본 명세서에서 앞서 기재된 바와 같이 이들 및 다른 적절하고 적합한 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 비-자연 발생하는 분자를 알킨- 또는 아지드- 변형된 또는 비-변형된 형태로 포함하는 것이 본 발명의 추가적 옵션 및 바람직한 구체예이다.

본 발명의 변형된 mRNA의 상기 설명으로부터 명백한 바와 같이, mRNA 분자를 다양한 목적에 유리하게 적용할 수 있도록 제조 또는 조정하는 다수의 상이한 옵션이 존재한다. 본 발명은 특정 타입의 mRNA에 제한되지 않으며, 이는 임의의 의도된 용도에 따라, 특히 일반적으로 기재된 적용 또는 상기 배경기술 및 하기에서 보다 상세하게 기재된 적용에 따라 선택될 수 있다. 알킨- 또는 아지드-변형의 단순한 도입으로 단백질 대체 요법과 같은 적용을 위해 유전자 정보를 전달하기 위해 또는 면역자극 목적을 위해 또는 mRNA-백신으로서 전달하기 위해 투여될 수 있는 mRNA 분자에 향상된 안정성을 부여한다. 각각의 변형된 표지 또는 관능성 분자의 하류 클릭-커플링을 통한 mRNA를 추가적으로 변형시킴으로써 특히 상기 변형된 mRNA 전달을 스크리닝하고 및/또는 예컨대 유전자 대체 요법에서 상기 mRNA의 특정 세포 또는 조직으로 표적 전달하거나 또는 약동학 (예: PEG 표지를 부가함으로써 신장 제거율이 더 느림)을 향상시키는 추가적 가능성을 제공한다.

본 발명의 맥락에서, 본 발명의 변형된 mRNA는 관심 있는 기능성 단백질을 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 변형된 mRNA는 키메라 단백질과 같은 재조합 단백질 또는 원하는 목적을 위해 유익하게 사용될 수 있는 단백질, 펩티드 또는 펩티드 및 단백질의 임의의 추가적 조합을 코딩할 수 있다. 특히, 재조합 융합 단백질을 코딩하는 mRNA, 예컨대 제1 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열을 제2 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열과 프레임으로 연결된 mRNA가 본 발명의 맥락에서 고려된다. 상기 제2 단백질 또는 펩티드는 예컨대 세포 또는 조직내에 특정 위치를 표적으로 할 수 있다. 특히, 본 발명의 변형된 mRNA 또는 표적 세포내 상기 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 전달 및 국소화의 모니터링을 고려할 때, 관심 있는 단백질과 리포터 단백질 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 또는 단백질 또는 펩티드 태그, 예컨대 스냅 태그 (snap tag)와의 융합 단백질이 본 발명의 추가의 바람직한 구체예로서 고려된다. 이를 위해, 본 발명의 변형된 mRNA는 융합 단백질이 바람직하게는 상기에 예시된 바와 같이 2 이상의 상이한 기능을 포함하는 단일 단백질로서 발현하도록 조작될 수 있다. 링커, 스페이서 또는 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함함으로써, 2 이상의 개별 단백질의 생성이 동등하게 고려될 수 있다.

관심 있는 단백질 및 GFP 또는 eGFP의 융합 단백질 발현의 바람직한 구체예에서, 상기 융합 단백질의 국소화는 적절한 필터를 사용하여 형광 현미경하에서 용이하게 검출될 수 있다. 또한, 형질감염된 세포의 검출 및 정량화 및 단백질 생성은 또한 다른 방법, 바람직하게는 유세포 분석, 구체적으로 형광-활성화된 세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting: FACS)를 통해 가능하다. 상기 언급된 방법을 사용하면 특히 클릭 반응을 통해 도입된 표지 또는 mRNA 자체에 의해 (공동-) 코딩된 펩티드 또는 단백질인 형광 분자를 포함하는 세포에 대한 정성적 및 정량적 스크리닝을 가능하게 한다.

본 발명의 맥락에서, 본 발명의 변형된 mRNA는 소정의 적용을 위해 요구되거나, 바람직하게는 이를 위해 존재하는 물질과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 엑스 비보 세포 형질감염뿐만 아니라 인 비보 투여를 위해, 세포에 의해 mRNA 흡수를 촉진시키는 물질이 바람직하게는 mRNA와 조합된다. 지질 제제뿐만 아니라 나노담체 (nanocarriers) (예: 상기에 언급된 Moffett 등에 기재됨)는 바람직하게는 본 발명의 맥락에서 각 조성물 및 제제에 포함될 수 있다. 따라서, 상기에 언급된 바와 같이 변형된 mRNA 및 적어도 하나의 다른 물질을 함유하는 물질들의 혼합물, 또는 상기 변형된 mRNA 및 적어도 하나의 다른 적절한 물질이 다른 용기내에 제공되어 이후에 조합하여 사용되는 부재들의 키트가 본 발명의 추가 주제이다.

하나 이상의 다른 활성 물질, 구체적으로 적응 면역 반응을 유발하는 하나 이상의 물질과 조합되는 경우, 본 발명의 변형된 mRNA는 또한 선천성 면역 반응을 증진시켜서 전체 면역학적 효과를 증진시키기 위해 아쥬반트로서 작용할 수 있다. 단백질- 또는 펩티드-기반 종양 백신과 같은 물질의 유효성은 RNA 아쥬반트와 함께 투여될 때 큰 이점을 갖는다 (예: Ziegler et al., J. Immunol . January 11, 2107, 1601129; DOI:https://doi.org/10.4049/jimmunol.1601129, or by Heidenreich et al., Int . J. Cancer. 2015 Jul 15; 137(2):372-84, DOI:10.1002/ijc.29402). 상기에 상세하게 기재된 바와 같이 본 발명의 변형된 mRNA에 고유한 추가적 이점은 본 발명의 변형된 mRNA의 아쥬반트 특성이 비-변형된 RNA와 유사하거나 또는 이 보다 훨씬 더 현저한 반면에, 상기 분자의 안정성이 향상되고, 클릭 반응을 통한 표적 전달 또는 표지 혼입과 같은 추가 옵션이 추가적 관점들을 열어 준다.

상기에 언급된 아쥬반트 적용의 경우, 본 발명의 변형된 mRNA는 이러한 맥락에서 선택적 또는 의무적인 것으로 당업자에게 알려져 있는 다른 물질, 바람직하게는 양이온성 또는 다중양이온성 화합물과 조합되거나 또는 복합체를 형성할 수 있다 (예컨대 WO2010/037408 참조). 이러한 다른 물질과 복합체 형성 또는 조합은 개선된 면역자극 특성을 부여하고, 특히 양이온성 원소와의 복합체 형성은 특히 강력한 아쥬반트 효과를 제공함으로써, 본 발명의 바람직한 구체예로 고려된다.

아쥬반트로서 의도되는 경우, 본 발명의 mRNA는 기능성 단백질 또는 펩티드를 코딩할 필요는 없지만, 클릭 반응을 통해 도입된 알킨- 또는 아지드-변형 및 선택적으로 추가의 관능성 분자 또는 검출가능한 표지를 함유하는 비-코딩 RNA가 상기 목적을 위해 본 발명에 포함된다.

WO2010/037408은 적어도 하나의 치료적으로 활성인 단백질, 항원, 알레르겐 및/또는 항체를 코딩하는 적어도 하나의 유리 (즉 복합체를 형성하지 않음) mRNA, 및 바람직하게는 양이온성 또는 다중양이온성 화합물과 복합체를 형성하는 적어도 하나의 (m)RNA를 포함하는 아쥬반트 성분을 포함하는 면역자극 조성물을 개시하였다.

이와 관련하여, 본 발명의 변형된 mRNA는 아쥬반트 성분으로서만 포함될 수 있지만, 아쥬반트로서 작용하는 본 발명의 변형된 (m)RNA 및 단백질, 항원, 알레르겐 및/또는 항체로 번역될 본 발명의 추가 변형된 mRNA가 조합될 수 있다. 또한, 이러한 사용의 경우, 본 발명에 의해 제공된 세포에 대한 특이적 표적화 및 전달 가능성뿐만 아니라 본원에서 앞서 개시된 변형에 의해 (m)RNA에 부여되는 안정화를 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 주제는 본 발명의 변형된 mRNA를 제조하는 방법이다. 제1 공정에 따르면, mRNA가 RNA 폴리머라제, 통상 T3, T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제, 및 mRNA 전사에 필요한 적어도 4가지 표준 타입의 뉴클레오티드 (ATP, CTP, GTP, UTP)를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물 및 선택적으로 자연 발생하는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 N1-메틸슈도우리딘 트리포스페이트, 또는 심지어 적절한 인공 뉴클레오티드의 존재하에 DNA 주형으로부터 인 비트로 전사된다. 또한, 번역 효율을 향상시키기 위해, 진핵생물의 경우 7-메틸구아닐레이트와 같은 5'-캡 구조를 생성하는 것이 중요하다. 적어도 하나의 표준 뉴클레오티드, 자연 발생하는 변형된 뉴클레오티드 유사체 또는 적절한 인공 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 일부는 상기 뉴클레오티드에서 알킨- 또는 아지드-변형을 함유하도록 변형된다.

상기 공정에 사용되는 뉴클레오티드의 타입에 따라, 변형은 (변형된 CTP, GTP 또는 UTP, 또는 이의 유사체의 경우) UTR 및 ORF에서만, 또는 (변형된 ATP 단독 또는 하나 이상의 변형된 CTP, GTP 또는 UTP와 조합된 ATP, 또는 이의 유사체의 경우) UTR, ORF 및 폴리(A) 테일 모두에서 수행될 것이다.

인 비트로 mRNA 전사 (IVT) 뿐만 아니라 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응을 수행하는 조건 및 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다 (예: Cao, G.J et al, N. Proc . Natl. Acad . Sci . USA. 1992, 89, 10380-10384 and Krieg, P. A. et al,. Nucl . Acids Res. 1984, 12, 7057-7070).

이러한 조건 및 방법은 변형된 mRNA의 만족스러운 수율이 수득되는 한 특별히 중요하지 않다. 이와 관련하여, 제1 개시된 공정 내에 사용된 DNA 주형의 종류도 특별히 중요하지 않다. 통상, 전사될 DNA가 적절한 플라스미드 내에 포함되며, 그러나 이는 또한 선형 형태로 사용될 수 있다. 또한, DNA 주형은 통상 프로모터 서열, 특히 T3, T7 또는 SP6 프로모터 서열을 함유한다.

본 발명의 변형된 mRNA를 제조하는 방법 중에, 수득된 mRNA는 바람직하게는 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 캡핑된다 (Muthukrishnan, S., et al, Nature 1975, 255, 33-37). 캡핑에 필요로 하는 반응물은 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들어 A.R.C.A. (P1-(5'-(3'-O-메틸)-7-메틸-구아노실) P3-(5'-구아노실)) 트리포스페이트, 캡 유사체) (Peng, Z.-H. et al, Org . Lett . 2002, 4(2), 161-164)가 있다. 바람직하게, 알킨-변형된 뉴클레오티드로서, 에티닐-변형된 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 5-에티닐 UTP 또는 7-에티닐-7-데아자 ATP가 상기 방법 중에 포함된다. 아지드-변형된 뉴클레오티드로서, 바람직하게는 5-(3-아지도프로필) UTP, 3'-아지도-2',3'-디데옥시 ATP (3'-말단에서만) 또는 8-아지도 ATP가 사용된다.

본 발명의 맥락에서, T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사 공정을 수행하고, 미생물을 이용한 효율적인 주형 생성에 적절한 벡터에서 DNA 주형을 제공하여 상기 벡터 선형화 후에 후속한 인 비트로 전사를 수행하는 것이 바람직하다.

인 비트로 전사에 대한 대안으로서, 본 발명의 mRNA를 생성하는 원핵생물계 또는 진핵생물계에서 발효 공정이 본 발명과 관련하여 포함된다. 상기 목적을 위해, 적절한 발현 벡터에 통상 포함되는 DNA 주형, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절 하에 관심 DNA를 함유하는 플라스미드가 숙주 세포 또는 미생물로 도입되고, 상기에 기재된 바와 같이 각 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 프로드러그 (충분한 세포 흡수를 허용하기 위함)가 배양 배지 중에 포함된다. 발효 RNA 생성은 당업자에게 알려져 있으며, 예컨대 Hungaro et al. (J Food Sci Technol. 2013 Oct; 50(5): 958-964)을 참조한다.

그러나, 이러한 특정 공정에 제한되지 않고, 예시 목적을 위해, 발효를 통한 알킨-, 아지드- 및 클릭-변형된 mRNA의 생성은 박테리아 시스템에서 보다 상세하게 개시되어 있고: RNA 폴리머라제 프로모터의 제어 하에 관심 mRNA를 코딩하는 DNA 주형이 박테리아 세포로 도입된다. 바람직하게, 이는 플라스미드의 형질감염을 통해 수행된다. 상기 서열 디자인이 중요하며, 바람직하게는 원하는 mRNA 생성에 필요한 여러 요소들 모두를 함유한다: RNA 폴리머라제 프로모터 (예: T7 또는 SP6 프로모터); 관심 있는 오픈 리딩 프레임 (ORF); 및 바람직하게는 또한 폴리(A) 영역을 코딩하는 서열 (바람직하게는 100-120 nt 길이). 더욱이, 상기 플라스미드는 세포 배양에서 조절된 성장 및 증폭을 위한 선별 마커 및 복제 기원을 함유한다. 이는 외부 화합물의 부가 시에 mRNA의 발현을 선택적으로 유도하기 위해, 오픈 리딩 프레임에 대한 유전자 조절 요소, 예컨대 lac 오페론 (operon)을 갖는 것이 바람직하다. 정제 중에 모든 다른 RNA (예: 박테리아 mRNA, tRNA 및 rRNA)로부터 mRNA를 구별하고, 충분한 안정성 및 번역 효율을 갖는 mRNA 산물을 제공하는데 필요한 폴리(A) 영역이 중요하다. 그러나, 폴리(A) 테일 영역이 또한 도입될 수 있거나, 또는 비교적 짧은 폴리(A) 테일이 상기 mRNA의 발효 생성 후에 본 발명의 맥락에서 기재된 바와 같이 폴리머라제 A 부가 반응을 통해 연장되고, 가능하다면 변형될 수 있다.

알킨- 또는 아지드 변형된 뉴클레오시드가 성장 배지에 부가되고, 운반인자 (transporters) 또는 수동 기전 (passive mechanism)을 통해 박테리아 세포에 의해 흡수된다 (J. Ye, B. van den Berg, EMBO journal, 2004, 23, 3187-3195). 세포내 이들 뉴클레오시드는 키나제에 의해 상응하는 트리포스페이트로 포스포릴화되어, mRNA에 혼입될 수 있다. 상기 뉴클레오시드의 모노포스포릴화는 느린 공정이기 때문에, 세포내 뉴클레오티드 농도를 증가시키기 위해 상기 뉴클레오시드의 모노포스페이트 프로드러그를 공급할 수 있다 (sofosbuvir의 경우와 유사).

아지드-변형된 mRNA의 경우에, 생체 직교 화학을 사용한 클릭-반응, 예컨대 SPAAC (strain promoted azide-alkyne cycloadditions)가 세포 배양에서 수행될 수 있다.

그러므로, 바람직하게는 시클로옥틴 변형된 태그/표지 또는 관능성 분자가 상기 배지에 부가된다.

그 다음에 상기 서열 내에 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 새롭게 합성된 mRNA는 예컨대 특정 수지 및/또는 비드 (beads)에 부착된 폴리(T) 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 정제된다. 예컨대 Sigma Aldrich제 mRNA 단리 키트 (cat No: 000000011741985001).

원핵 세포의 mRNA는 폴리(A) 영역을 함유하지 않거나, 또는 이를 함유하는 경우 20nt 보다 길지 않으며, 이는 수지 및/또는 비드에 부착된 폴리(T) 올리고뉴클레오티드에 의해 흡수되기에 충분하지 않아서, 원핵생물 mRNA로부터 원하는 mRNA의 효율적인 분리가 가능하다고 잘 알려져 있다. 따라서, 폴리(A) 테일 영역이 없거나 또는 충분히 긴 폴리(A) 테일 영역이 없는 발효로 생성된 mRNA는 클로로포름 페놀 추출, 침전 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 조질의 세포 RNA의 후속하는 정제를 통한 다른 알려져 있는 방법에 의해 정제되어야 한다.

박테리아 균주, 예컨대 E. 콜리 (E. coli) BL21(DE)는 게놈 DNA (예: DE3 균주)에 통합된 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7 RNA 폴리머라제를 가질 필요가 있다. 그 다음에 상기 mRNA의 생성은 T7 프로모터 함유 플라스미드가 형질전환될 때 가능하고, 박테리아 세포내 인 비보 전사 중에 알킨- 또는 아지드 변형된 뉴클레오시드를 도입할 수 있다.

원핵생물 mRNA에는 5' 캡 구조가 결여되어 있다고 잘 알려져 있다. 본 발명의 변형된 mRNA의 중요 요소가 상기 mRNA의 정제 후에 도입될 수 있거나 또는 이는 진핵생물 캡핑 효소를 발현하는 다른 플라스미드로 상기 박테리아 세포를 동시-형질전환시킴으로써 동시에 도입될 수 있다.

추가적 대안으로서, 고체상 또는 포스포르아미다이트 합성을 통해 본 발명의 변형된 mRNA를 생성하고, 상기에 기재된 바와 같이 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특히 (m)RNA가 아쥬반트로서 사용을 의도하는 경우, 더 짧은 분자 또는 비-코딩 서열이 이러한 목적을 위해 고려될 수 있고, 합성 제조가 편리하고 효율적일 수 있다. 각 방법은 당업자가 이용 가능하고, 예컨대 Marshall, W. S. et al. Curr. Opin . Chem . Biol . 2004, Vol. 8, No. 3, 222-229에 개시되어 있다.

본 발명의 맥락에서 제2 방법은 먼저 임의의 적절한 방법에 의해 관심 mRNA를 제공하고, 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응에서 변형된 알킨- 또는 아지드-변형된 ATP (또는 유사체)를 부가함으로써 폴리(A) 테일 영역만을 변형시켰다. 이러한 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응 및 적절한 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 각 반응 키트는 상업적으로 입수 가능하다.

상기에 기재된 제1 및 제2 방법이 개별적으로 사용되어 본 발명의 변형된 mRNA를 제공할 수 있지만, 또한 mRNA 전사 단계 중에 UTR, ORF 및 폴리(A) 테일 중에 변형된 알킨 및/또는 아지드-변형된 뉴클레오티드를 포함하도록 인 비트로 전사 또는 합성 mRNA 생성 및 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응을 조합하여 사용할 수 있다. 제2 방법, 즉 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응을 추가적으로 수행함으로써, 폴리(A) 테일의 추가적 연장이 달성될 수 있으며, 선택적으로 상기 제1 방법에 의해 도입되는 변형과는 다른, 알킨- 또는 아지드-변형된 형태로 ATP가 적어도 일부 포함된다.

폴리(A) 테일 영역을 갖거나 또는 이를 갖지 않는 원핵생물에서 mRNA의 발효 생성의 경우에, 이러한 폴리(A) 테일을 제공하거나 또는 존재하는 폴리(A) 테일 영역을 연장하기 위해 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응을 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 공급 배지 중에 반응을 위해 변형된 아데닌 뉴클레오시드 또는 아데닌 뉴클레오티드 프로드러그를 포함하는 것은 바람직한 옵션이다. 대안으로서, mRNA 발효 공정을 위한 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 뉴클레오티드 운반인자 단백질의 발현을 직접 사용하거나 (D. A. Malyshev, K. Dhami, T. Lavergne, T. Chen, N. Dai, J. M. Foster, I. R. Correa, Jr., F. E. Romesberg, Nature 2014, 509, 385-388.) 또는 공급 배지 중에 인공 분자 운반인자를 부가함으로써 (Zbigniew Zawada et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 9891-9895) 내재될 수 있다.

본 발명의 mRNA를 제조하는 방법은 하나의 타입의 변형된 뉴클레오티드만을 사용하거나 또는 원하는 알킨- 또는 아지드-변형을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하여 수행될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 하나 또는 두가지 타입의 동일하게 변형된 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 알킨- 또는 아지드-변형된 우라실 또는 아데닌을 포함하는 것이 바람직하다. 알킨-변형이 관여되는 한, 에티닐기를 포함하는 것이 가장 바람직하며, 이는 그 크기로 인해, 전사 반응에 부정적인 영향을 최소화한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드가 전사 중에 뉴클레오티드 혼합물에 포함된다. 이러한 과정으로 알킨-변형뿐만 아니라 아지드-변형을 함유하는 변형된 mRNA 분자가 유도된다.

전사 또는 발효 중에 또는 폴리(A) 폴리머라제 반응을 통해 포함되는 변형된 뉴클레오티드의 양과 관련하여 특별한 제한이 관찰되지 않았다. 이론적으로, 인 비트로 전사에 사용되는 모든 뉴클레오티드가 알킨- 또는 아지드-변형된 핵염기를 함유하도록 변형될 수 있다. 그러나, 하나 또는 두가지 타입의 변형된 뉴클레오티드를 사용하고, 또한 변형된 형태뿐만 아니라 비-변형된 형태의 이러한 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 원하는 변형 비율에 따라, 다양한 뉴클레오티드의 변형된 형태 대 비-변형된 형태를 1:100 내지 10:1, 바람직하게는 1:10 내지 10:1, 더 바람직하게는 1:4 내지 4:1 또는 1:2 내지 2:1의 비율로 포함하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게, 변형된 형태 단독, 또는 전술한 비율로 비-변형된 형태와 조합하여 존재할 수 있는 한가지 타입의 변형된 뉴클레오티드만이 사용된다. 바람직하게, 변형된 뉴클레오티드 대 비-변형된 뉴클레오티드의 1:1, 1:2 또는 1:10 조합이 제공된다.

변형된 뉴클레오티드 도입 비율은 본 발명의 mRNA에 존재하는 변형의 수에 해당한다. 따라서, 상기 mRNA 또는 다양한 부분, 즉 UTR 및 ORF, 또는 UTR, ORF 및 폴리(A)테일, 또는 폴리(A) 테일 단독 내에 변형된 뉴클레오시드 대 비-변형된 뉴클레오시드의 비율은 또한 바람직하게는 1:100 내지 10:1, 보다 바람직하게는 1:10 내지 10:1, 더 바람직하게는 1:4 내지 4:1 또는 1:2 또는 2:1, 가장 바람직하게는 1:1, 1:2 또는 1:10이다.

mRNA 안정성을 향상시키고, 생성된 mRNA의 번역을 증진시키기 위해 상이하게 변형된 천연 뉴클레오티드, 예컨대 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘 및/또는 인공 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 또한 포함할 수 있고, 바람직할 수 있다. 상이하게 변형된 뉴클레오티드 및 인 비트로 전사 중에 이의 mRNA로의 혼입에 관한 추가 정보는 Svitkin, Y.V. et al., Nucleic Acids Research 2017, Vol. 45, No. 10, 6023-6036으로부터 유래될 수 있다.

인 비트로 mRNA 전사, 관심 있는 기존의 mRNA에서 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응, 발효 공정 또는 심지어 완전히 합성으로 제조되고, 적어도 하나의 알킨- 또는 아지드-변형을 포함하는 본 발명의 변형된 mRNA는 이미 상기에서 설명된 바와 같이 다른 관심 있는 분자, 특히 표지 및/또는 관능성 분자를 혼입시키기 위해 클릭 반응을 통해 추가적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기에 언급된 바와 같이 검출가능한 표지, 예컨대 형광 또는 유색 분자 또는 무색 분자가 도입될 수 있다. 또한, 상기에 설명된 바와 같이, 예컨대, GFP 또는 eGFP를 포함하는 융합 단백질을 제조하기 위해 변형된 mRNA를 제공하는 것은 검출가능한 신호를 포함하기 위한 다른 바람직한 옵션이다. 결과적으로, 예컨대 생성된 mRNA의 전달 및/또는 발현은 특히 세포 배양 실험에서 형광 현미경, FACS 또는 다른 검출 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 놀랍게도, ORF내 염기의 비교적 큰 변형이 리보솜에서 mRNA의 번역 중에 허용되는 것이 관찰되었다. 예를 들어, 시아닌 5 (Cy5) 변형된 우리딘을 함유하는 시아닌 5 변형된 eGFP (증진된 녹색 형광 단백질) mRNA가 상업적으로 입수 가능하다 (TRILINK biotechnologies, 제품 코드 LL7701). 이러한 mRNA는 세포 배양에서 기능성 단백질로 쉽게 번역된다.

폴리(A) 폴리머라제가 아지드- 또는 알킨-변형된 ATP 또는 ATP 유도체를 mRNA에 부가할 때, 상기에 기재된 바와 같이 폴리(A) 테일 영역 만의 선택적 변형이 달성될 수 있다. 상기 변형된 폴리(A) 테일의 후속하는 클릭 표지화는 번역에 있어서 약간의 영향만을 미치며 (상기 서열은 번역되지 않기 때문에), 예컨대 상기에 설명된 바와 같이 mRNA의 표적 흡수를 매개하거나 또는 뉴클레아제 분해에 대한 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 조직-특이적 리간드에 사용될 수 있다. 특히 매우 큰 분자 또는 다른 이유로 인해 번역을 손상시키는 분자를 부착시키는 것이 바람직한 경우에, 폴리(A) 테일을 통한 커플링이 바람직하거나 또는 심지어는 필수적인 접근법일 수 있다.

클릭 반응은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일반적으로 상기에 언급된 Sharpless 등 및 Meldal 등을 참조한다. 클릭 반응의 전반적인 조건은 이들 문헌에 개시되어 있고, 또한 바람직한 구리-촉매화 아지드-알킨 고리부가 반응 (CuAAC)과 관련된 Himo F. et al., J. Am. Chem . Soc ., 2005, 127, 210-216의 개시내용을 참조한다. 또한, 클릭 반응에 대한 조건 및 반응물과 관련한 EP 2 416 878 B1뿐만 아니라 EP 17 194 093을 참조하며, 클릭 연결 반응에서 제1 분자를 제2 분자에 커플링하는 바람직한 방법이 개시되어 있다. 이와 관련하여, 상기 구리-촉매화 클릭 반응은 바람직하게는 반응 혼합물 중에 2가 금속 양이온의 존재하에, 가장 바람직하게는 Mg² ⁺의 존재하에 수행된다.

전술한 문헌은 DNA 분자 연결과 관련하여 클릭 반응을 서술하지만, 일반적으로 동일한 조건이 본 발명과 관련하여 적용될 수 있다. 따라서, 상기 클릭 반응은 불균일 Cu (I) 촉매의 존재하에 수행된다. 또한, Cu (I) 안정화 리간드 및/또는 상기 클릭 반응의 효율을 향상시키기 위한 유기 용매, 특히 DMSO, 및/또는 2가 양이온을 포함하는 것이 바람직하다 (예: PCT/EP2018/076495에 개시된 바와 같음).

추가의 바람직한 일 구체예에서, 상기 클릭 반응은 본 발명의 변형된 mRNA와 관련하여 상기에 기재된 바와 같이 SPAAC (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition reaction)로서 수행된다. CuAAC 또는 SPAAC 반응의 정확한 조건은 당업자에게 알려져 있는 기본 요건이 관찰되는 한 개별 환경으로 조정될 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, SPAAC는 또한 세포내에서 수행될 수 있다. 알킨- 또는 아지드-변형된 표지를 이러한 세포로 도입하는 것은 변형된 mRNA의 세포로의 형질감염 후에 예컨대 세포내 mRNA의 국소화를 모니터링하는데 유용할 수 있다.

본 발명은 mRNA에 안정화 효과를 부여하는 변형을 함유하는 변형된 mRNA 분자를 모듈식의 매우 효율적인 방식으로 생성할 수 있게 한다. 상기 변형은 또한 다른 물질 및 분자가 클릭 반응을 통해 연결될 수 있는 앵커 분자로서 유용하다. 이러한 클릭 반응은 바람직하게는 전사 반응과는 별개로 다운스트림에서 수행되며, 이는 특히 크고 부피가 큰 관심 분자를 mRNA에 연결시켜서 전사 반응을 완전히 방해할 수 있는 큰 이점이 있다.

본 발명의 맥락에서, 인 비트로 mRNA 생성 중에 전체 범위의 조밀하게 변형된 mRNA의 합성을 가능하게 하기 위해 소량의 알킨- 및/또는 아지드-변형된 뉴클레오티드 세트만을 혼입하는 것으로 충분할 수 있다. 이는 많은 변형을 빠르게 제조 및 스크리닝할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 mRNA 및 이를 제조하는 방법은 mRNA 생성 중에 RNA 폴리머라제에 의해 쉽게 허용되지 않거나 또는 전혀 허용되지 않지만, 전사 후에 클릭 반응을 통해 용이하게 부착되는 관능기를 혼입할 수 있게 한다. 이러한 관능기의 혼입은 기존의 방법에 의해 수행될 수 없다.

따라서, 본 발명의 mRNA 및 이의 제조 방법은 예를 들어 엑스 비보 세포 형질감염에서 이의 흡수를 추적하기 위해 표지화될 수 있고, 요법 또는 백신 제조에서 특정 사용을 위해 개선된 세포- 또는 조직-특이적 표적화를 제공하도록 변형될 수 있는, 안정하고 관습적으로 변형된 mRNA를 제조하는 용이하고 신뢰할 수 있는 방법을 처음으로 제공하였다.

본 발명의 mRNA의 하나의 바람직한 적용은 표적 세포의 엑스 비보 형질감염에 있다. 배경기술 부분에서 언급된 바와 같이, 전신, 특히 정맥내로 적용되는 mRNA 제제는 주로 간 세포에 의해 흡수되지만, 반면에 면역 자극 효과를 유발하기 위해서 또는 mRNA가 직접 백신화에 사용되는 경우, 종종 면역계 세포가 바람직한 표적이다. 본 발명의 변형된 mRNA를 특정 세포 타입에 혼입하는 것이 바람직한 경우, 이러한 세포는 환자, 특히 환자 혈액으로부터 분리될 수 있고, mRNA 형질감염이 엑스 비보로 수행될 수 있다.

그러므로 본 발명의 추가 주제는 세포 제제, 특히 면역계 세포 제제이며, 이는 본 발명의 변형된 mRNA를 포함하고, 세포의 엑스 비보 형질감염에 의해 수득된다. 원칙적으로, 본 발명의 변형된 mRNA는 임의의 종류의 세포, 인간, 동물 또는 식물 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 일 양상에서, 상기 세포 제제의 세포는 동물 또는 인간 기원의 세포이다.

본 발명의 이러한 양상은 지난 수십 년 동안 개발된 특히 ACT (adoptive cell transfer) 및 이의 매니폴드 적용 및 용도에 관한 것이다. 예를 들어 면역 기능성 및 다른 특성을 향상시키기 위해서 자가 세포뿐만 아니라 비-자가 세포로 치료될 수 있다. 바람직하게, 면역계 세포는 환자로부터 입수되고, 조작되어서 B-세포 림프종과 같은 암을 포함하는 다양한 질환을 치료하는데 유용한 것으로 입증된 자가 면역 세포를 생성하였다. CAR-T 세포 기반 요법은 종양 세포 상의 특정 단백질 또는 항원을 인식하고, 이에 부착되는 이의 표면에서 키메라 항체 수용체를 생성하도록 T-세포가 유전자 조작되는 하나의 접근법이다.

본 발명의 세포 제제는 동일한 맥락에서 사용될 수 있다. 세포로 도입되는 변형된 mRNA에 따라, 후속하는 단백질 발현은 환자에게 (재)적용 후에 이러한 세포의 다수의 효과를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명의 세포 제제는 적은 수의 적용에 제한되지 않고, 오히려 세포의 (재)적용 후에 mRNA의 인 비보 발현을 위한 비히클로 고려될 수 있으며, 이는 이후 관심 있는 단백질을 생성하고 및/또는 상기 단백질의 발현으로 인해 환자에서 소정의 효과 (예: 면역 자극 또는 면역 허용 유발 (tolerogenic))를 발휘한다.

세포 형질감염 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 관심 있는 특정 세포 타입에 조정될 수 있다. 이러한 과정의 일례로서, 상기에 언급된 Moffett 등을 참조한다. 엑스 비보 형질감염과 관련하여, 면역-세포는 특히 형질감염 제제 성분 중 일부에 의해 손상될 수 있기 때문에, 형질감염 제제 없이 mRNA의 세포로의 흡수를 촉진하는 세포-특이적 표적화 그룹을 함유하도록, 클릭 반응을 통해 변형된 본 발명의 mRNA를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

세포의 엑스 비보 형질감염 및 이러한 형질감염된 세포를 환자에게 투여하는 것 이외에, 본 발명의 변형된 mRNA는 또한 환자에게 직접 적용될 수 있다. 이들 사례 모두는 치료적 (또는 또한 예방적) 치료로 간주된다. 그러므로 본 발명의 추가 주제는 본 발명의 변형된 mRNA 또는 세포 제제를 활성제로서 포함하는 약학적 조성물이다. 이미 언급된 바와 같이, mRNA 기반 치료제는 최근에 중요한 연구 주제가 되었다. mRNA의 치료제로서의 다수의 적용이 개시되어 있으며 (예: Sahin et al, Schlake et al. 및 Kranz et al, 모두 상기에 언급됨), 본 발명의 변형된 mRNA는 모든 이러한 적용에 사용될 수 있을뿐만 아니라 이에 대한 이점 및 개선을 제공할 수 있다. 상기 변형된 mRNA의 향상된 안정성에 기반하고, 또한 선택적으로 본 발명의 관능기에 기반하여, 다양한 문제를 해결할 수 있다. 향상된 안정성은 예컨대 비-변형된 mRNA와 비교하여 단백질로의 연장된 번역을 설명한다. 또한, 조직- 또는 세포-표적화 그룹의 존재는 표적화된 투여 및 치료적 또는 면역원성 치료의 높은 특이성을 허용한다.

상기 변형된 mRNA의 적합한 적용 중에, 세포 제제 및 이러한 mRNA 또는 세포 제제를 함유하는 약학적 조성물은 유전자 또는 단백질 대체 요법, 표적화된 일시적 유전자 전달 및 게놈 조작/유전자 편집 (예: CRISPR/Cas9 시스템에서와 같이 표적화 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA (guide RNA)를 코딩하는 mRNA 또는 유사형태), 감염성 질환 백신화, 암 면역요법뿐만 아니라 유전 질환 치료를 위한 세포-특이적 유전자 발현이다.

유전자 대체 요법이 많은 질병 치료를 위해 고려될 수 있다. 단백질 또는 효소의 결핍 또는 기능 장애가 주요 원인 또는 결과인 많은 질병의 경우, 요구되는 활성 단백질을 환자에게 투여하는 것은 즉각적 또는 결과적 손상을 피하는데 필수적이다. 그러나, 단백질을 지속적으로 투여하면 불내성 (intolerance) 또는 다른 부정적인 부작용을 유발할 수 있다.

또한, 충분한 양의 소정의 단백질을 환자에게 제공하기 위해서, 환자 및 1일당 때로는 100　mg/ml, 최대 20 g의 단백질만큼, 이러한 단백질의 높은 농도를 투여할 필요가 있다. 단백질 대체 요법의 추가적 문제로서, 또한 상기 단백질을 세포로 투여하는 것이 어려울 수 있다. 한편, 일부 mRNA의 경우, 환자에서 충분히 높은 세포내 단백질 수준을 달성하기 위해서 투여 (dose)당 50 내지 100　μg을 제공하는 것으로 충분하다고 밝혀졌다. 따라서, 본 발명, 특히 특정 세포 또는 조직을 표적으로 할 가능성은 현재 단백질 대체 요법 접근법에서 직면하는 문제에 대한 편리한 해결책을 제공한다. 단백질 대체 요법에서 본 발명의 변형된 mRNA를 사용함으로써, 예를 들어 많은 경우에 mRNA를 주사하는 것으로 충분하지만, 현재의 단백질 대체 요법은 일반적으로 환자에게 시간 소모적이고 물리적으로 요구되는 주입을 필요로 한다.

단백질 대체 또는 적어도 일정한 단백질 보충을 필요로 하는 질환의 예는 단백질 결핍 질환, 타입 I 당뇨병과 같은 많은 대사 질환, 또한 유전 장애, 구체적으로 고쉐병 (Morbus Gaucher) 또는 헌터병 (Morbus Hunter)과 같은 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage diseases)을 포함한다.

유전자 대체 요법의 맥락에서, 변형된 mRNA를 세포로 엑스 비보 및 인 비보 포함하는 것이 고려될 수 있다. 특히 세포- 또는 조직-특이적 표적화-그룹이 본 발명의 mRNA에 포함되는 경우, 상기 변형된 mRNA의 표적 세포로의 인 비보 삽입이 매우 효율적일 것으로 예상된다. 본 발명은 mRNA의 단백질로의 내인성 번역을 허용하므로, 상기에 언급된 바와 같은 유해 효과를 피할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 또한 상기 mRNA의 표적 세포로의 엑스 비보 삽입 및 이러한 표적 세포의 환자에게의 (재)투여는 상기에 언급된 바와 같이 본 발명과 관련하여 추가적 옵션이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 mRNA 백신으로서 적용될 수 있다. 백신화는 면역 반응을 유도하기 위해 인 시추 (in situ) 단백질 발현에 기반하여 수행된다. 본 발명의 변형된 mRNA로부터 임의의 단백질이 발현될 수 있기 때문에, 본 발명의 약학적 조성물은 원하는 면역 반응과 관련하여 최대 유연성 (flexibility)을 제공할 수 있다. 상기 변형된 mRNA를 사용하면 다양한 단백질 구성성분 또는 심지어 불활성화된 바이러스 입자를 제공하는데 필요한 기존의 방법과 비교하여 대안으로서 매우 빠른 면역화를 제공한다. 기존 방법은 일반적으로 상이한 제조 방법을 수행하는 것을 필요로 하며, 반면에 본 발명을 사용하면 감염체와 관련된 상이한 단백질 또는 단백질 부분을 코딩하는 다양한 mRNA는 동일한 제조 방법에서 제조될 수 있다. mRNA 백신화에 의한 면역화는 단일 백신화에 의해서 적은 mRNA 용량 만을 사용하여 달성될 수 있다. DNA 백신과는 달리, RNA 백신은 핵 외피를 통과할 필요가 없고, 이들은 원형질막을 통해 세포질에 도달한다. mRNA 백신의 개발과 관련된 추가적 정보는 예컨대 상기에 언급된 Schlake et al에 개시되어 있고, 또한 본 발명과 관련하여 적용할 수 있다. 본 발명의 변형된 mRNA를 포함하는 약학적 조성물은 예방적 백신뿐만 아니라 치료적 백신으로서 사용될 수 있다. 상기 백신은 모든 종류의 병원체, 예컨대 최근에 주목받고 있는 지카 바이러스 (Zika virus)와 같은 바이러스에 관한 것일 수 있다 (상기에 언급된 Pardi et al).

외인성 병원체에 대한 백신화 이외에, 본 발명의 약학적 조성물은 또한 암 면역요법의 맥락에서 항-종양 백신으로서 또는 면역계를 자극하는데 사용될 수 있다. 특히 수지상 세포 또는 마크로파지 (macrophages)로의 전신 RNA 전달은 상기에 언급된 Kranz 등에 의해 개시된 바와 같이 암 면역요법을 위한 항바이러스 방어 기전을 이용할 가능성을 제공한다. 소정의 암 타입에 대해 특이적이거나 또는 이의 맥락에서 단백질을 발현하는 mRNA를 가진 마크로파지 또는 수지상 세포를 표적화하면 MHC 분자에 의한 이러한 단백질의 일부의 제시를 이끌고, 강력하고 특정한 면역 반응을 유도한다. 따라서, 본 발명의 변형된 mRNA는 또한 항원-코딩 mRNA 약리학의 맥락에서 사용될 수 있다.

RNA-기반 면역요법 및 백신화와 관련하여, 면역자극 약학적 조성물에 상기에 기재된 바와 같은 (m)RNA 아쥬반트를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 상기 아쥬반트는 선천성 면역 반응의 자극을 제공하므로, 면역치료 효과를 추가적으로 향상시킨다. 이와 관련하여, 본 발명의 변형된 mRNA 및 본 발명의 (m)RNA 아쥬반트는 동일하거나 또는 유사한 서열을 가질 수 있고, 심지어 동일한 단백질을 코딩할 수 있다. 한편, 또한 비-코딩 (m)RNA 아쥬반트 또는 상이한 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 (m)RNA 아쥬반트가 조합되어 원하는 아쥬반트 효과를 달성할 수 있다.

특정 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA를 사용하는 표적화된 유전자 편집은 본 발명의 변형된 mRNA 또는 약학적 조성물의 추가적 적용이다. 최근에 개발된 획기적인 CRISPR/Cas9 기술은 특정 유전자 편집을 사용하여, 유전자를 도입, 결실 또는 침묵시키고, 심지어 유전자내 뉴클레오티드를 교환할 수 있다. Charpentier 및 Doudna에 의해 개시된 방법은 특정 화학적으로 합성된 CRISPR RNA (crRNA) 서열에 결합하고, 이러한 RNA 서열 부근의 DNA를 절단하는 리보뉴클레오단백질 및 엔도뉴클레아제인 Cas-단백질을 포함한다. 상기 엔도뉴클레아제 활성을 원하는 표적 DNA 서열로 향하게 하기 위해, 표적 DNA 서열에 상보적인 소위 가이드 RNA가 사용된다. 상기 가이드 RNA는 길고, 화학적으로 합성된 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 플러스 crRNA의 복합체, 또는 단일 구조체로서 crRNA 및 tracrRNA로 구성된 합성 또는 발현된 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 두가지 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 변형된 mRNA는 이러한 맥락에서 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는데, 바람직하게는 관심 있는 특정 DNA 서열에 상보적인 sgRNA로서 사용될 수 있다.

현재 기술과 비교하여, mRNA로부터 가이드 RNA 및 유전자 편집 엔도뉴클레아제의 일시적 발현의 주요 이점은 비-특이적 유전자 편집의 위험이 감소된 것이며, 이는 mRNA로부터 유전자 툴 (genetic tool)의 유전자 발현은 짧은 시간 (몇 일)으로 제한되고 통합된 게놈 요소로부터 일정하게 발현되지 않는다.

유전자 편집 적용은 매우 중요하며, 유전자 대체 요법, 암 요법 및 유전 질환 치료와 같은 다양한 치료적 적용과 관련하여 적용될 수 있다. 이러한 모든 적용과 관련하여 본 발명의 변형된 mRNA의 용도는 본 발명의 범위내에 포함된다.

또한, 종래 기술에서 mRNA에 대해 개시되거나 또는 미래에 개발될 다른 잠재적인 치료적 적용에 있어서, 본원에 개시된 바와 같이 변형을 포함하는 각 mRNA의 용도는 이의 개선된 안정성으로 인해 유익하다. 또한, 다운스트림 클릭 반응을 통해 조직- 또는 세포-특이적 표적화 분자를 mRNA에 포함시킴으로써 치료에서 보다 특이적이고 따라서 보다 효율적인 사용을 가능하게 한다. 특히 임의의 원하는 단백질 발현 또는 또한 임의의 면역화 반응은 환자에서 치료 또는 면역 효과를 필요로 하는 위치를 정확하게 표적으로 할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 구체예는 변형된 mRNA와 함께 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 아쥬반트, 바람직하게는 상기 변형된 mRNA와 동일한 변형을 함유하고 양이온성 또는 다중양이온성 화합물과 복합체를 형성하는, 상기에 기재된 바와 같은 변형된 (m)RNA 아쥬반트를 포함한다. 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 상기 mRNA가 추가적으로 분해되는 것을 보호하는 착화제 (complexing agents)를 포함한다. 상기 착화제는 세포에 의한 흡수되고, 동시에 단백질로의 번역을 개선 및 향상시킬 수 있다. 착화제로서, 지질 또는 폴리머가 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 리포좀으로 캡슐화된 변형된 mRNA를 함유할 수 있다.

추가의 바람직한 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 양이온성 지질을 함유한다. 핵산의 시토졸로의 전달을 추가적으로 향상시키는 제제가 또한 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 제제는 특정 전달 경로에 맞게 조정될 수 있다. 요약하면, 본 발명의 약학적 조성물은 활성제로서 본 발명의 변형된 mRNA를 포함하고, 활성 물질의 안정성을 추가적으로 개선시키고, 표적 세포의 세포질로의 전달을 향상시키며, 다른 상보적 또는 상승적 효과를 제공하기 위한 임의의 추가 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 약학적 조성물은 활성제로서 세포 제제, 특히 면역계 세포 제제를 함유하며, 이는 본 발명의 변형된 mRNA로 세포를 엑스 비보 형질감염하여 수득된다. 상기 형질감염된 세포는 상기 세포내 포함된 변형된 RNA의 효과로부터 이익을 얻기 위해 환자에게 복귀될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 구체예에서, 약학적으로 허용가능한 아쥬반트 또는 부형제 또는 담체는 상기에 기재된 바와 같이 포함될 수 있다.

본 발명의 추가 주제는 본 발명의 변형된 mRNA, 또는 세포, 조직 또는 장기에서 본 발명의 mRNA의 존재, 전달 및/또는 분포를 인 비트로 또는 인 비보 스크리닝하기 위해 본 발명의 변형된 mRNA로 형질전환된 세포를 함유하는 진단용 조성물이다. 이러한 목적을 위해, 바람직하게 상기 변형된 mRNA는 클릭 반응을 통해 도입된 검출가능한 표지를 포함한다. 이러한 표지는 바람직하게는 형광단 또는 방사성핵종, 바람직하게는 양전자 방출 방사성핵종이다. 상기 검출가능한 표지를 검출, 가능하다면 정량화하여 상기 변형된 mRNA의 세포, 조직 또는 장기로의 전달, 그 안의 분포를 관찰 및 검출, 또는 세포를 환자로의 재-투여를 모니터할 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 진단용 조성물은 본 발명의 변형된 mRNA, 바람직하게는 적어도 하나의 검출가능한 표지를 함유하는 mRNA를 함유한다. 이러한 맥락에서, 발현시에 검출가능한 단백질, 예컨대 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는 변형된 mRNA가 추가의 바람직한 구체예이다.

본 발명의 추가의 양상에서, 상기에 언급된 바와 같이, 또한 식물 세포가 본 발명의 변형된 mRNA를 사용하여 형질감염될 수 있다. 이러한 형질감염된 식물 세포가 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 예컨대 유전자 정보를 도입하기 위해서, 특히 이러한 식물 세포에서 소정의 단백질의 일시적 발현을 위해, 또는 표지된 프로브와 같이 분석 또는 진단 목적을 위해 상기 변형된 mRNA가 포함될 수 있다. 질병 또는 해충 저항성 또는 내성을 부여하는 것이 본 발명의 mRNA를 식물 세포 또는 식물로 도입하는 가능한 적용 및 유익한 효과의 일부 예이다. 따라서 식물 세포 또는 식물의 형질감염을 위한 본 발명의 변형된 mRNA의 용도는 또한 본 발명의 주제이다.

본 발명의 또 다른 추가의 주제는 본 발명의 변형된 mRNA를 제조하기 위한 키트이다. 이러한 키트는 인 비트로 전사, 발효 공정 또는 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응을 통해 변형된 mRNA를 제조하는데 필요한 다양한 물질, 즉 RNA 폴리머라제 및/또는 폴리(A) 폴리머라제, 알킨- 또는 아지드-변형된 뉴클레오티드뿐만 아니라 비변형된 뉴클레오티드 및 선택적으로 추가의 버퍼 물질 및 용매 또는 상기 공정을 위해 필요한 추가 물질을 함유한다. 바람직한 구체예에서, 또한 알킨- 및/또는 아지드-변형된 검출가능한 표지 또는 관능성 분자뿐만 아니라 상기 변형된 mRNA와 표지 또는 관능성 분자 사이에 클릭 반응을 수행하는데 필요한 물질을 포함한다. 또한, 전체 합성으로 본 발명의 변형된 mRNA를 제조하기 위한 키트는 본 발명의 추가 주제이다. 필요로 하는 물질이 개별 용기에 제공될 수 있거나 또는 이러한 조합된 물질들 간에 유해 반응이 발생하지 않는 한 조합될 수 있다. 이러한 부재들의 키트에 포함될 다양한 물질과 관련하여, 본 발명의 변형된 mRNA 및 이러한 변형된 mRNA를 제조하는 방법에 관한 상기 설명을 참조한다. 상기 변형된 (m)RNA 아쥬반트의 제조가 관여되는 한, 이러한 키트는 바람직하게는 또한 바람직한 구체예에 따라 상기 (m)RNA와 복합체를 형성하는데 사용되는 양이온성 또는 다중양이온성 화합물을 함유한다. 본 발명에 따른 키트는 또한 본 발명의 변형된 mRNA의 세포로의 엑스 비보 또는 인 비보 전달을 촉진하는 추가 물질을 함유할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 키트는 본 발명의 적어도 하나의 변형된 mRNA를 포함하고, 바람직하게는 클릭 반응을 통해 도입된 검출가능한 표지 또는 관능성 분자를 함유하거나, 또는 이는 상기 변형된 mRNA 및 알킨- 또는 아지드-변형된 표지 및/또는 관능성 분자 및 선택적으로 다른 클릭 시약을 개별 용기로 제공한다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 상기 변형된 mRNA의 환자로의 전달을 위한 키트는 mRNA 및 바람직하게는 또한 (m)RNA 아쥬반트를 함유하며, 모두는 본 발명에 따라 변형된다. 상기 변형된 mRNA 및 상기 변형된 (m)RNA 아쥬반트는 하나의 단일 용기 중에 또는 개별 용기 중에 함유될 수 있고, 상기 모두는 클릭 반응을 통해 이미 부착된 알킨- 또는 아지드-변형된 표지 또는 관능성 분자를 선택적으로 포함할 수 있거나 또는 상기 클릭 반응을 후속 수행하기 위한 개별 용기에 함유될 수 있다. 상기 키트는 추가로 다른 약학적으로 허용가능한 담체 및 아쥬반트를, 다시 개별 용기 중에 또는 상기 키트 중 적어도 하나의 다른 구성성분과 조합하여 함유할 수 있다.

당업자에게는 본 발명의 변형된 mRNA의 제조 또는 사용을 용이하게 하는 물질들의 많은 상이한 조합들이 키트내에 포함될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 본 발명의 맥락에서 상기에 기재된 모든 구체예 및 이의 변형은 본원에 기재된 키트에 적용 가능하다. 물질들의 모든 적절한 조합들이 본 발명의 목적을 위해 포함된다.

본 발명의 추가 주제는 RNA, 특히 mRNA를 안정화시키는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 변형된 (mRNA)를 제조하기 위한 RNA 합성 중에 및/또는 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응에서 4가지 표준 타입의 뉴클레오티드 (ATP, CTP, GTP 및 UTP) 중 적어도 하나를 부분적으로 또는 완전히 알킨- 및/또는 아지드-변형된 형태로 포함함으로써 알킨- 및/또는 아지드-변형을 도입하는 단계를 포함한다. 상기에 기재된 바와 같이, 알킨- 및/또는 아지드-변형된 뉴클레오티드를 포함시킴으로써, 특히 클릭 반응을 통해 하나 이상의 검출가능한 표지 및 관능성 분자를 선택적으로 포함시킴으로써, RNA, 특히 mRNA의 변형으로 RNA 분자에 있어서 안정화 효과를 유도한다. 따라서, 상응하는 방법은 본 발명에 포함된 추가의 중요한 양상으로 고려된다.

본 발명의 또 다른 추가 주제는 표적 세포에서 본 발명에 따른 mRNA의 존재 및/또는 발현을 정성적 또는 정량적으로 결정하는 인 비트로 방법이다. 이와 관련하여, 형질감염 효율, mRNA 전달의 정량화 및 발현은 FACS 분석을 통해 단일 세포 해상도로 결정될 수 있다. FACS (Fluorescence-activated cell sorting/scanning)는 당업자에게 잘 알려져 있다. 클릭 반응을 통해 본 발명의 변형된 mRNA로 도입될 수 있는 형광 표지는 상기 방법에 기반하여 결정될 수 있다. 또한, mRNA 전달 및 코딩된 단백질의 발현은 형광 단백질, 예컨대 상기에 기재된 바와 같이 바람직한 일 구체예에서 관심 있는 단백질과 융합 단백질로서 또는 2개의 개별 단백질로서 동시-발현될 수 있는 GFP 단백질 또는 eGFP 단백질을 사용하여 검출될 수 있다.

따라서, 상기 FACS 방법을 사용하여, 세포 형질감염에 대한 변형의 영향 및 본 발명의 변형된 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준이 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 발현 수준에 있어서 상이한 표지의 효과 연구는 FACS 분석을 통해 수행될 수 있다.

이러한 FACS 분석에서, 예컨대 비-형질감염된 세포와 형질감염된 세포의 비교로 본 발명의 변형된 mRNA에 포함된 형광 표지 또는 본 발명의 변형된 mRNA의 번역에 의해 발현된 형광 단백질에 기여될 수 있는 형광 신호를 검출할 수 있게 한다. 또한, 본 발명의 변형된 mRNA 대 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 비-변형된 mRNA를 가진 동일한 표적 세포의 형질감염 반응의 비교로 변형 자체는 형질감염 효율에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 보장할 수 있다.

본 발명의 하나의 주제와 관련하여 상기에 기재된 모든 정보는 명시적으로 반복되지 않더라도 상기 정보가 본 발명의 맥락에서 인식가능한 관련성을 갖는 다른 주제의 맥락에 동일하게 적용되는 것으로 인정된다.

도 1은 변형된 mRNA 제조 및 적용의 일반적 개략도를 나타낸다. 예컨대 5-에티닐 UTP (EUTP)를 사용하여, 클릭 반응에 이용 가능한 알킨기를 5'-UTR, 3'-UTR 및 ORF에 삽입할 수 있다. 예컨대 7-에티닐 7-데아자 ATP 및 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 상기 폴리(A) 테일의 선택적 표지화가 가능하다.
도 2는 예컨대 T7 RNA 폴리머라제 및 EUTP를 포함하는 뉴클레오티드 혼합물 (구조식)을 사용한 알킨-변형된 mRNA 제조의 일반적 개략도를 나타낸다.
도 3은 eGFP를 코딩하는 비-알킨 (A), 알킨 (B) 및 염료 (C) 변형된 mRNA의 HeLa 세포로의 형질감염 결과를 나타낸다.
도 4는 예컨대 폴리(A) 폴리머라제 및 알킨 변형된 뉴클레오티드 EATP (구조식)를 사용한 알킨-변형된 mRNA 제조의 일반적 개략도를 나타낸다.
도 5는 eGFP를 코딩하는 에테르네온-레드 645 (Eterneon-red 645) 변형된 mRNA (폴리(A) 테일에서만 알킨 변형)의 HeLa 세포로의 형질감염 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예에서 T7 RNA 폴리머라제 반응 중에 DNA 주형으로서 선형화된 형태로 사용된 플라스미드의 맵 (map) 및 전체 서열 (T7 프로모터에서 폴리(A) 말단까지)을 나타낸다. 상기 서열은 또한 서열 번호: 2를 참조한다.
도 7은 실시예 3에서 기재되는 바와 같이 EATP가 RNA의 폴리(A) 테일에 혼입되는 것을 입증하기 위한 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 4에 기재된 바와 같이 효모 폴리(A) 폴리머라제 및 아지드-변형된 뉴클레오티드 AzddATP를 사용한 부위-특이적 아지드-변형된 mRNA (폴리(A) 테일 말단에서만 단일 아지드) 제조의 일반적 개략도를 나타낸다.
도 9는 eGFP를 코딩하는 3'-폴리(A) 테일 Cy3 변형된 mRNA의 HeLa 세포로의 형질감염을 나타낸다. 37　℃에서 24시간 인큐베이션 후에, 상기 eGFP의 녹색 형광이 관찰되었다 (eGFP 필터). Cy3 표지된 mRNA의 경우, mRNA의 국소화는 Cy3 필터 세팅을 사용하여 관찰되었다.
도 10은 실시예 5에서와 같이, 이중 표지된 아지드/알킨 변형된 mRNA (내부 알킨기는 T7 RNA 폴리머라제 및 EUTP를 사용하고, 3´말단에서 하나의 말단 아지드는 AzddATP 및 효모 폴리(A) 폴리머라제를 사용함) 제조를 위한 일반적 개략도를 나타낸다.
도 11은 eGFP를 코딩하는 내부 에테르네온 레드 변형되고 3'-폴리(A) 테일 Cy3 변형된 mRNA의 HeLa 세포로의 형질감염을 나타낸다. 37　℃에서 24시간의 인큐베이션 후에, 상기 eGFP의 녹색 형광이 관찰되었다 (eGFP 필터). Cy3 표지된 mRNA의 경우, 상기 mRNA의 국소화는 Cy3 필터 세팅을 사용하여 관찰되고, 에테르네온 레드 표지된 mRNA의 경우, 상기 mRNA의 국소화는 Cy5 필터 세팅을 사용하여 관찰되었다.
도 12 내지 16은 형질감염되지 않은 HeLa 세포 (도 12), eGFP를 코딩하는 비-변형된 mRNA로 형질감염된 HeLa 세포 (도 13), eGFP를 코딩하는 알킨-변형된 mRNA로 형질감염된 HeLa 세포 (도 14) 및 eGFP를 코딩하는 에테르네온 레드-/알킨-변형된 mRNA (도 15 및 16)에 대한 FACS 분석 결과를 나타내고, 염료-표지된 mRNA의 변형 및 흡수에 따라 단백질 발현을 정량화하였다 (도 15 및 16).
도 17은 본 발명의 일 구체예의 개략도를 나타낸다: 박테리아 세포에 예컨대 5-에티닐우리딘을 공급하고, mRNA 제조에 필요한 서열을 함유하는 플라스미드로 형질전환하였다. 그 다음에 EU를 함유하는 새롭게 합성된 mRNA를 폴리(T) 수지 및/또는 폴리(T) 올리고뉴클레오티드가 부착된 비드로 정제하였다.
하기 실시예는 본 발명을 추가적으로 예시한다:

실시예

실시예 1:

증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코딩하는 알킨-변형된 mRNA를, T7 RNA 폴리머라제 및 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 DNA 주형으로부터 인 비트로 전사 (IVT)에 의해 제조하였다. 여기서 5-에티닐-우리딘-5'-트리포스페이트 (EUTP)는 상기 뉴클레오티드 혼합물 중에 포함되어, HeLa 세포 (Henrietta Lacks' immortal cells)로의 후속한 형질감염을 위해 도 2에 따라 알킨-변형된 mRNA를 생성하였다. 상기 생성된 mRNA는 5'-캡, 비번역 영역 (UTR), 단백질 코딩 부분 (오픈 리딩 프레임, ORF) 및 폴리(A) 테일을 함유한다.

mRNA 제조

50　μL 반응 부피로 20 유닛의 T7 RNA 폴리머라제, 1　μg의 주형 DNA 및 몇몇 뉴클레오티드를 전사 버퍼 (40 mM Tris-HCl, pH 7.9, 6 mM MgCl₂, 4 mM 스퍼미딘 (spermidine), 10 mM DTT) 중에 조합하였다.

A) 비-알킨 변형된 mRNA 제조를 위한 최종 뉴클레오티드 농도는 하기와 같다:

1.0　mM GTP, 4.0　mM A.R.C.A. (P1-(5'-(3'-O-메틸)-7-메틸-구아노실) P3-(5'-(구아노실))트리포스페이트, 캡 유사체), 1.25　mM CTP, 1.25　mM UTP, 1.25　mM ψUTP (슈도우리딘 트리포스페이트), 1.5　mM ATP.

B) 알킨 변형된 mRNA 제조를 위한 최종 뉴클레오티드 농도는 하기와 같다:

1.0　mM GTP, 4.0　mM A.R.C.A. (P1-(5'-(3'-O-메틸)-7-메틸-구아노실) P3-(5'-(구아노실))트리포스페이트, 캡 유사체), 1.25　mM CTP, 1.25　mM EUTP (5-에티닐우리딘 트리포스페이트), 1.25　mM ψUTP (슈도우리딘 트리포스페이트), 1.5　mM ATP.

C) 알킨 변형된 mRNA 제조 및 후속한 클릭 표지화를 위한 최종 뉴클레오티드 농도는 하기와 같다:

1.0　mM GTP, 4.0　mM A.R.C.A. (P1-(5'-(3'-O-메틸)-7-메틸-구아노실) P3-(5'-(구아노실))트리포스페이트, 캡 유사체), 1.25　mM CTP, 0.625　mM EUTP (5-에티닐우리딘 트리포스페이트), 0.625　mM ψUTP (슈도우리딘 트리포스페이트), 0.625　mM UTP, 1.5　mM ATP.

상기 혼합물을 37　℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 2 유닛의 DNAse I을 부가하고, 37　℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 상기 mRNA를 PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법으로 정제하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 상기는 A에 대해 mRNA 13.3　μg, B에 대해 12.3　μg 및 C에 대해 14.3　μg을 수득하였고, 이는 클릭 표지화를 필요로 하지 않는 경우 (A 및 B) 형질감염에 직접 사용하였다. 클릭 표지화가 수행되는 경우 (C), 2　μg의 RNA, 1　nmol 에테르네온 레드 645 아지드 (baseclick GmbH), 단일 반응기 펠렛 및 0.7　μL 10x 활성화제² (baseclick GmbH, Oligo²Click Kit)를 7　μL의 전체 반응 부피로 조합하였다. 상기 반응 혼합물을 45　℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법을 사용하여 세척하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트).

형질감염을 위해, 시판되는 키트 (Polyplus transfection®제 jetMESSENGER^TM)를 제조자 지시에 따라 0.5　μg의 mRNA 및 25,000 HeLa 세포 (CLS GmbH)를 사용하여 합류에 도달하였다. 상기 세포를 37　℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후에 형광 현미경하에서 분석하였다, GFP 필터: (470/22 여기; 510/42 방출) 및 Cy5 필터 (628/40 여기; 692/40 방출)를 사용하였다.

도 3은 eGFP를 코딩하는 비-알킨 (A), 알킨 (B) 및 염료 (C) 변형된 mRNA의 HeLa 세포로의 형질감염 결과를 나타내었다. 37　℃에서 24시간 인큐베이션 후에, 상기 eGFP의 녹색 형광이 관찰되었다 (GFP 필터). 에테르네온 레드 표지된 mRNA (C)의 경우, 상기 mRNA의 국소화는 Cy5 필터 세팅을 사용하여 관찰되었다.

명시야 이미지 세포에서 건강한 HeLa 세포의 형태가 관찰되었고 (도 3, A-C), GFP 필터를 사용하여 상기 eGFP의 단백질 발현이 보였다 (A-B에 대해 노출 시간 120　ms, C에 대해 250 　ms). 상기 클릭 표지된 mRNA의 경우 (도 3, C), 상기 mRNA의 국소화는 현미경의 Cy5 필터 세팅을 사용하여 관찰되었다.

지원 정보:

상기에 기재된 T7 RNA 폴리머라제 반응 중에 사용된 변형된 뉴클레오티드의 구조

상기에 기재된 T7 RNA 폴리머라제 반응 중에 DNA 주형으로서 선형화된 형태로 사용된 플라스미드의 맵 및 전체 서열 (T7 프로모터에서 폴리(A) 말단까지)을 도 6에 도시하였다. 상기 서열은 또한 서열 번호: 2를 참조한다.

실시예 2:

증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코딩하는 알킨-변형된 mRNA를, T7 RNA 폴리머라제 및 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 DNA 주형 (도 6)으로부터 인 비트로 전사 (IVT)에 의해 제조하였다. 여기서 7-에티닐-아데닌-5'-트리포스페이트 (EATP)를 폴리(A) 폴리머라제에 의한 T7 RNA 폴리머라제 반응 후에 IVT mRNA 중에 혼입하여, 후속한 HeLa 세포 (Henrietta Lacks' immortal cells)로의 클릭 표지화 및 형질감염을 위해 도 4에 따라 알킨-변형된 mRNA를 생성하였다. 생성된 mRNA는 5'-캡, 비번역 영역 (UTR), 단백질 코딩 부분 (오픈 리딩 프레임, ORF) 및 표지화된 폴리(A) 테일 알킨을 함유한다.

mRNA 제조

50　μL 반응 부피로 20 유닛의 T7 RNA 폴리머라제, 1　μg의 선형화된 주형 DNA 및 몇몇 뉴클레오티드를 전사 버퍼 (40　mM Tris-HCl, pH　7.9, 6　mM MgCl₂, 4 mM 스퍼미딘, 10 mM DTT) 중에 조합하였다.

비-알킨 변형된 mRNA 제조를 위한 최종 뉴클레오티드 농도는 하기와 같다:

상기 혼합물을 37　℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 2 유닛의 DNAse I을 부가하고, 37　℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법에 의해 mRNA를 정제하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 이는 12.3　μg의 mRNA를 수득하고, 이는 EATP와 폴리(A) 폴리머라제 반응에 직접 사용하였다.

20 　μL 반응 부피로 5 유닛의 E. 콜리 폴리(A) 폴리머라제, 4.2 μg의 이전에 제조한 mRNA 및 1　mM EATP 용액을 반응 버퍼 (250　mM NaCl, 50　mM Tris-HCl, 10　mM MgCl₂, pH　7.9) 중에 조합하였다.

상기 혼합물을 37　℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법에 의해 mRNA를 정제하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 이는 4　μg의 mRNA를 수득하였다.

클릭 표지화는 7　μL의 전체 반응 부피로 조합된, 1.1　μg의 RNA, 1　nmol 에테르네온 레드 645 아지드 (baseclick GmbH), 단일 반응기 펠렛 및 0.7　μL 10x 활성화제²(baseclick GmbH, Oligo²Click Kit)를 사용하여 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 45　℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법을 사용하여 세척하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트).

형질감염을 위해 0.5　μg의 mRNA 및 25,000 HeLa 세포 (CLS GmbH)를 사용하여 합류에 이를 때까지 제조자 지시에 따라 시판되는 키트 (Polyplus transfection®제 jetMESSENGER^TM)를 사용하였다. 상기 세포를 37　℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후에 형광 현미경 하에 분석하였다, GFP 필터: (470/22 여기; 510/42 방출) 및 Cy5 필터 (628/40 여기; 692/40 방출)를 사용하였다.

도 5는 eGFP를 코딩하는 에테르네온 레드 변형된 mRNA의 HeLa 세포로의 형질감염 결과를 나타내었다. 37℃에서 24시간 인큐베이션 후에, 상기 eGFP의 녹색 형광이 관찰되었다 (GFP 필터). 에테르네온 레드 표지된 mRNA의 경우, 상기 mRNA의 국소화는 Cy5 필터 세팅을 사용하여 관찰되었다.

명시야 이미지 세포에서 건강한 HeLa 세포의 형태가 관찰되었고 (도 5), GFP 필터를 사용하여 상기 eGFP의 단백질 발현이 보였다 (노출 시간 120　ms). Et-Red로 표지된 mRNA의 국소화는 현미경의 Cy5 필터 세팅을 사용하여 관찰되었다.

실시예 3:

폴리(A) 테일 내에 EATP (에티닐-아데노신-5'-트리포스페이트)의 혼입을 입증하기 위해서, 하기를 사용하는 폴리(A) 폴리머라제 반응을 위한 주형으로서 짧은 RNA 올리고뉴클레오티드 (31　mer, CUAGUGCAGUACAUGUAAUCGACCAGAUCAA, 서열 번호: 1)를 사용하였다:

A) 1　mM ATP

B) 1　mM EATP;

C) 0.5　mM ATP 및 0.5　mM EATP.

20　μL 반응 부피로 5 유닛의 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli) 폴리(A) 폴리머라제, 2　μg의 RNA (31 mer) 및 뉴클레오티드 (A-C의 최종 농도)를 반응 버퍼 (250　mM NaCl, 50　mM Tris-HCl, 10　mM MgCl₂, pH　7.9) 중에 조합하였다. 상기 혼합물을 37　℃에서 30분 또는 37　℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.

변성된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (7　M 우레아, 1x　TBE, 7% 폴리아크릴아미드 겔, 일정 전압 100　V, 1　h)에 의해 결과를 분석하였다. 주형 RNA 올리고뉴클레오티드와 비교하여 (도 7, 레인 2), 더 높은 분자량의 밴드 또는 도말 (smear)이 모든 샘플에 대해 나타났고, 이를 상이한 뉴클레오티드 및 인큐베이션 기간을 사용하여 폴리(A) 폴리머라제의 존재하에 인큐베이션하였다 (도 7, 레인 3-7). 이는 ATP 또는 이의 알킨 유사체 EATP의 성공적인 혼입을 나타내었다. 30분 인큐베이션에서, ATP의 혼입 (도 7, 레인 3)은 EATP (도 7, 레인 4) 또는 EATP 및 ATP의 혼합물 (도 7, 레인 5)과 비교하여 보다 효율적이었다. EATP의 혼입을 위해 인큐베이션 시간을 16시간까지 연장시킴으로써, 폴리-EA-부가의 길이는 30분 인큐베이션 (도 7, 레인 4)과 비교하여 증가하였다 (도 7, 레인 6). 흥미롭게도, ATP 및 EATP를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물의 경우, 30분과 비교하여 16시간 후에 변화가 관찰되지 않았다 (도 7, 레인 7).

도 7은 상기에 기재된 바와 같이 상이한 폴리아데닐화 반응의 에티디움 브로마이드 염색된 7% 변성된 폴리아크릴아미드 겔을 나타내었다. 각 레인에서 500 ng의 RNA를 로딩하였다. 레인 1: 저분자량 DNA 래더 (New England Biolabs), 레인 2: 31　mer RNA 올리고뉴클레오티드 주형, 레인 3: 30분 동안 1　mM ATP와의 폴리아데닐화 반응, 레인 4: 레인 3과 유사하지만 1　mM EATP 사용, 레인 5: 레인 3과 유사하지만 0.5　mM EATP 및 0.5　mM ATP 사용, 레인 6: 레인 4와 유사하지만 16시간 인큐베이션, 레인 7: 레인 5와 유사하지만 16시간 인큐베이션.

실시예 4

증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코딩하는 아지드-변형된 mRNA를, T7 RNA 폴리머라제 및 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 DNA 주형으로부터 인 비트로 전사 (IVT)에 의해 제조하였다. 여기서 3'-아지도-2',3'-디데옥시아데노신 (AzddATP)을 혼입하여, 효모 폴리(A) 폴리머라제를 사용하는 T7 RNA 폴리머라제 반응 후에 IVT mRNA에서 신장을 종료하여, 후속한 HeLa 세포 (Henrietta Lacks´ immortal cells)에서 형질감염을 위해 도 8에 따라 부위-특이적 단일 아지드 변형된 mRNA를 생성하였다. 생성된 mRNA는 5´-캡, 비번역 영역 (UTR), 단백질 코딩 부분 (오픈 리딩 프레임, ORF) 및 단일 말단 아지드를 갖는 폴리(A)-테일을 함유한다.

mRNA 제조

50　μL 반응 부피로 20 유닛의 T7 RNA 폴리머라제, 1　μg의 주형 DNA 및 몇몇 뉴클레오티드를 전사 버퍼 (40　mM Tris-HCl, pH 7.9, 6　mM MgCl₂, 4　mM 스퍼미딘, 10　mM 디티오트레이톨) 중에 조합하였다. 최종 뉴클레오티드 농도는 하기와 같다:

1.0　mM GTP, 4.0　mM A.R.C.A. (P1-(5'-(3'-O-메틸)-7-메틸-구아노실) P3-(5'-(구아노실)) 트리포스페이트, 캡 유사체), 1.25　mM CTP, 1.25　mM UTP, 1.25　mM ψUTP (슈도우리딘 트리포스페이트), 1.5　mM ATP.

상기 혼합물을 37　℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 2 유닛의 DNAse I을 부가하고, 37　℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법에 의해 mRNA를 정제하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 이는 13.7　μg의 mRNA를 수득하였고, 이는 아지드-함유 ATP 유사체 AzddATP와 효모 폴리(A) 부가를 위해 직접 사용하였다.

25　μL 반응 부피로 600 유닛의 효모 폴리(A) 폴리머라제, 5.8　μg의 정제된 IVT mRNA 및 0.5　mM AzddATP를 반응 버퍼 (10% (v/v) 글리세롤, 20　mM Tris-HCl, 0.6　mM MnCl₂, 20　μM EDTA, 0.2　mM DTT, 100　μg/mL 아세틸화 BSA, pH　7.0) 중에 조합하고, 상기 용액을 37　℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법에 의해 변형된 mRNA를 정제하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 이는 4.8　μg의 mRNA를 수득하였다.

클릭 표지화는 전체 반응 부피 30 μL로 조합된, 4.8　μg의 RNA 및 2　nmol의 DBCO-설포-Cy3 (Jena Bioscience cat. no. CLK-A140-1)을 사용하여 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하고, 그 다음에 PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법을 사용하여 세척하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 이는 4.0　μg의 mRNA를 수득하였다.

변형된 mRNA의 형질감염을 위해, 0.5　μg의 Cy3 표지된 mRNA 및 25.000 HeLa 세포 (CLS GmbH)를 사용하여 합류에 도달하도록 제조자 지시에 따라 시판되는 키트 (Polyplus transfection®제 jetMESSENGER^TM)를 사용하였다. 상기 세포를 37　℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후에 형광 현미경 하에 분석하였다, GFP 필터: (470/22 여기; 510/42 방출) 및 Cy3 필터 (531/40 여기; 593/40 방출)를 사용하였다.

명시야 이미지 세포에서, 건강한 HeLa 세포의 형태가 관찰되었고 (도 9), GFP 필터를 사용하여 eGFP의 단백질 발현이 보였다 (노출 시간 120　ms). Cy3으로 표지된 mRNA의 국소화는 현미경의 Cy3 필터 세팅을 사용하여 관찰되었다.

실시예 5:

증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코딩하는 아지드/알킨-변형된 mRNA를, T7 RNA 폴리머라제 및 뉴클레오티드 혼합물 및 효모 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 DNA 주형으로부터 인 비트로 전사 (IVT)에 의해 제조하였다. 여기서 5-에티닐-우리딘-5'-트리포스페이트 (EUTP)를 뉴클레오티드 혼합물 중에 포함시켜서, 알킨-변형된 mRNA를 생성하고, 그 다음에 3'-아지도-2',3'-디데옥시아데노신 (AzddATP)을 혼입함으로써, 신장을 종료하고, 하나의 단일 아지드를 도입하였다. 이는 상기 mRNA의 이중 표지화의 제1 예이다.

mRNA 제조

상기 혼합물을 37　℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 2 유닛의 DNAse I을 부가하고, 37　℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법에 의해 mRNA를 정제하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 이는 13.9　μg의 mRNA를 수득하였고, 이는 아지드-함유 ATP 유사체 AzddATP와 효모 폴리(A) 부가를 위해 직접 사용하였다.

25　μL 반응 부피로 600 유닛의 효모 폴리(A) 폴리머라제, 5.8　μg의 정제된 IVT mRNA 및 0,5　mM AzddATP를 반응 버퍼 (10% (v/v) 글리세롤, 20　mM Tris-HCl, 0.6　mM MnCl₂, 20 μM EDTA, 0.2 mM DTT, 100 μg/mL 아세틸화 BSA, pH　7.0) 중에 조합하고, 상기 용액을 37　℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법에 의해 변형된 mRNA를 정제하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 이는 4.35　μg의 mRNA를 수득하였다.

제1 클릭 표지화 (SPAAC (strain promoted azide-alkyne cyclo-addition))는 전체 반응 부피 30 μL로 조합된, 4.35　μg의 RNA 및 2　nmol의 DBCO-설포-Cy3 (Jena Bioscience cat no. CLK-A140-1)을 사용하여 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하였고, 그 다음에 PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법을 사용하여 세정하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트). 이는 2.55　μg의 mRNA를 수득하였다.

제2 클릭 반응 (CuAAC (Cu catalysed azide-alkyne Cyclo-addition))은 전체 반응 부피 7　μL로 조합된, 2　μg의 RNA, 1　nmol 에테르네온 레드 645 아지드 (baseclick GmbH), 단일 반응기 펠렛 및 0.7　μL 10x 활성화제² (baseclick GmbH, Oligo²Click Kit)로 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 45　℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 PCR 산물을 위한 제조자 지시에 따라 스핀 컬럼 방법을 사용하여 세척하였다 (Qiagen제 PCR 정제 키트).

형질감염을 위해, 0.5　μg의 mRNA 및 25,000 HeLa 세포 (CLS GmbH)를 사용하여 합류되도록 제조자의 지시에 따라 시판되는 키트 (Polyplus transfection®제 jetMESSENGER^TM)를 사용하였다. 상기 세포를 37　℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후에 형광 현미경 하에 분석하였다, GFP 필터: (470/22Ex;510/42 Em), Cy5 필터 (628/40Ex;692/40 Em) 및 Cy3 필터 (531/40 여기; 593/40 방출)를 사용하였다.

명시야 이미지 세포에서 건강한 HeLa 세포의 형태가 관찰되었다 (도 11). GFP 필터를 사용하여, eGFP의 단백질 발현이 보였다 (노출 시간 120　ms). Cy3 및 에테르네온 레드로 표지된 상기 mRNA의 국소화는 현미경의 Cy3 및 Cy5 필터 세팅을 사용하여 관찰되고, 2개의 상이한 분자로 이중 표지화를 입증하였다.

실시예 6: FACS (fluorescence-activated cell sorting/scanning)를 통한 mRNA 발현의 상대 정량화

FACS 장치를 사용하여 세포에서 인 비트로 전사된 (IVT) eGFP mRNA의 발현 수준을 평가하기 위한 실험을 의도하였다. eGFP 발현은 475　nm에서 여기 시에 509　nm에서 이의 형광 방출을 통해 직접 모니터링하고, 관능기의 RNA로의 도입 여부를 나타낼 수 있으며, 예컨대 말단 알킨 또는 염료 분자는 발현 수준을 변화시킬 수 있다. 더욱이, 염료-변형된 mRNA의 흡수는 제2 형광 채널에서 모니터링하였다. 세포 배양 모집단내 발현 수준의 변화는 mRNA 제제 균일성을 평가하기 위해 검출될 수 있다.

3개의 상이한 IVT mRNA는 T7 RNA 폴리머라제 및 상이한 뉴클레오티드 혼합물을 가진 DNA 주형을 사용하고, 필요하다면 후속 클릭 반응에 의해 제조하였다:

A) 비변형된 뉴클레오티드 혼합물 (= 비변형된 eGFP mRNA),

B) 5-에티닐-우리딘 5'-트리포스페이트를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물 (= 알킨 변형된 eGFP mRNA),

C) B)와 유사하지만, 에테르네온-레드 아지드 (Cy5 유사체, baseclick GmbH)의 존재하에 후속하는 클릭 반응 (= 에테르네온 레드 eGFP mRNA).

HeLa 세포 (Henrietta Lacks' immortal cells)로의 형질감염을 위해 2　μg의 각 mRNA 제제 및 음성 대조군으로서 mRNA가 없는 버퍼를 사용하였다. 37　℃에서 24시간 인큐베이션 후에, 세포를 박리하고, 고정시킨 후에 적어도 10000개의 세포를 FACS (FACS Canto II, Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.

하나는 단백질 발현을 평가하기 위한 eGFP 형광에 대해 및 하나는 염료-표지된 mRNA의 존재를 평가하기 위해 에테르네온 레드 염료 형광에 대한, 2개의 채널을 사용하여 모든 샘플을 분석하였다. 이는 하기에 보고된 바와 같이 각 실험 및 형광 채널에 대해 도시된 히스토그램 (histogram) 및 도트 플롯 (dot plot)으로 나타내었다. 상기 히스토그램은 형광 세기당 계수된 세포의 수를 나타내고, 도트 플롯은 형광 세기 (eGFP 또는 에테르네온 레드)와 관련된 세포 내부 조직 (cell internal organization: SSC)을 나타내었다. 각 샘플에 대해 10.000개 (= 10.000 세포)의 데이터를 수집하였다.

a) mRNA로 형질감염되지 않은 HeLa 세포를 음성 대조군으로서 분석하고, 고유 형광의 수준을 수립하였다. 이는 세포가 eGFP 단백질을 발현하는 것으로 고려되는 수준을 정의하는 도트 플롯에서 게이트 (P1)를 설정하도록 하였다. 상기 P1 게이트내의 모든 도트는 특정 형광 세기를 갖는 eGFP 발현 세포로서 정의되었다. 결과는 도 12에 도시되어 있다.

b) 비변형된 eGFP mRNA (A)로 형질감염된 경우, P1이 96.5　%인 거의 모든 세포는 형광 단백질 (적색 모집단)을 발현하였다. 결과는 도 13에 도시되어 있다. HeLa 세포가 알킨 변형된 eGFP mRNA (B)로 형질감염된 경우 매우 유사한 결과를 수득하였고, P1 값은 96.4　%이다. 이 실험 결과는 도 14에 도시되어 있다.

c) HeLa 세포가 에테르네온 레드 eGFP mRNA (C)로 형질감염된 경우, 75%의 P1 모집단이 관찰되었고, 이는 입체적으로 까다로운 염료 분자를 eGFP mRNA에 부착하여도 상기 리보솜은 비변형된 eGFP mRNA와 비교하여 78%의 상대 발현 수준으로 이를 기능성 단백질로 번역할 수 있음을 의미한다. 결과는 도 15에서 볼 수 있다.

d) 또한, 상기 mRNA가 에테르네온 레드 염료로 표지되기 때문에, 세포당 상대 mRNA 양을 관찰할 수 있었다. eGFP를 발현하지 않는 것으로 정의된 세포를 분석하는 경우 (연회색의 게이트 P2), 이들 모두는 소량의 에테르네온 레드 표지된 mRNA가 내재된 세포에 해당하는 것으로 관찰되었다. 이 가정은 P2 (연회색)가 형광 세기의 최저 값에 해당하는 경우 에테르네온 레드 채널로부터 유래되었다. 결과는 도 16에 도시되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> baseclick GmbH <120> Click-modified mRNA <130> 64932P WO <150> EP 17 209 585 <151> 2017-12-21 <150> EP 18 157 703 <151> 2018-02-20 <150> EP 18 202 542 <151> 2018-10-25 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 1 cuagugcagu acauguaauc gaccagauca a 31 <210> 2 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequence of pSTI-A120-luc+rbs (from T7 promoter to poly(A)) <400> 2 taatacgact cactataggg cgaactagta agcaaggagg cgtgcagatg gtgagcaagg 60 gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 120 gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc 180 tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc 240 tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 300 tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg 360 gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 420 agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 480 actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga 540 acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 600 agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc 660 agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg 720 tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtccggc cggactcaga 780 tctcgagctc aagcttcgaa ttgatccaga tcttaagtaa gtaagctcga gagctcgctt 840 tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct aagtccaact actaaactgg 900 gggatattat gaagggcctt gagcatctgg attctgccta ataaaaaaca tttattttca 960 ttgctgcgtc gagagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 1020 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 1080 taataaaaaa catttatttt cattgctgcg tcgagagcta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1239

Claims

5'-캡 구조, 5'-비번역 영역 (5'-UTR), 오픈 리딩 프레임 영역 (ORF), 3'-비번역 영역 (3'-UTR) 및 폴리(A) 테일 영역을 포함하는 변형된 mRNA (messenger RNA)로서, 상기 ORF, 5'-UTR, 3'-UTR 및 폴리(A) 테일 영역 중 적어도 하나의 영역내 적어도 하나의 뉴클레오티드에서 적어도 하나의 알킨- 또는 아지드-변형을 함유하는 것을 특징으로 하는 변형된 mRNA.
청구항 1에 있어서, 상기 변형된 mRNA는 하기 내에 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 변형된 mRNA:
a) ORF 및 UTR,
b) ORF, UTR 및 폴리(A) 테일, 또는
c) 폴리(A) 테일 단독.
청구항 1 또는 2에 있어서, 4가지 표준 타입의 뉴클레오티드 (AMP, CMP, GMP, UMP) 중 적어도 하나가 부분적으로 또는 완전히 변형되고, 바람직하게는 우라실 또는 아데닌에서 에티닐- 또는 아지도-변형되는 것인 변형된 mRNA.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오티드는 알킨-변형되고, 적어도 하나의 뉴클레오티드는 아지드-변형되는 것인 변형된 mRNA.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4가지 표준 타입의 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 변형된 형태로 존재하고, 비-변형된 형태와 비교하여 1:100 내지 10:1, 바람직하게는 1:10 내지 1:10 또는 1:1의 비율로 존재하는 것인 변형된 mRNA.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 mRNA는 다르게 변형된 천연 또는 인공 뉴클레오티드, 바람직하게는 슈도우리딘 (pseudouridine) 또는 N1-메틸슈도우리딘을 함유하는 것을 특징으로 하는 변형된 mRNA.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 mRNA는, 상기 변형된 mRNA와 상응하는 변형된 알킨- 또는 아지드-함유 검출가능한 표지 또는 관능성 분자의 클릭 반응 (click reaction)을 통해 도입된, 하나 이상의 검출가능한 표지 및 관능성 분자를 함유하는 것인 변형된 mRNA.
청구항 7에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 유색 또는 형광발생 분자이고, 및/또는 상기 관능성 분자는 조직 또는 세포 특이적 표적화 기 또는 리간드, 바람직하게는 당 모이어티 (sugar moiety) 또는 지방산 모이어티인 것인 변형된 mRNA.
적어도 하나의 뉴클레오티드에서 적어도 하나의 알킨- 또는 아지드-변형을 함유하는 변형된 RNA 또는 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA에 있어서, 양이온성 또는 다중양이온성 화합물과 복합체를 형성하는 것인 변형된 RNA.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 DNA 주형으로부터 mRNA를 인 비트로 전사하는 단계 또는 대안으로서 발현 벡터내에 함유된 DNA 주형을 발현시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 사용한 발효 공정을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 RNA 폴리머라제 및 mRNA 전사에 필요한 4가지 표준 타입의 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물의 존재하에 수행되며, 상기 뉴클레오티드 혼합물에서 4가지 타입의 뉴클레오티드 중 적어도 하나의 뉴클레오티드의 적어도 일부가 알킨- 또는 아지드-변형을 포함하도록 변형된 것인 방법.
폴리(A) 테일에서 알킨- 또는 아지드-변형을 함유하는 변형된 mRNA를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 ATP의 존재하에 mRNA 상의 폴리(A) 테일에서 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 ATP는 아데노신에서 적어도 부분적으로 알킨- 또는 아지드-변형된 것인 방법.
청구항 10 또는 11에 있어서, 청구항 7 또는 8에 따른 변형된 mRNA를 제조하기 위한 클릭 반응을 수행하는 조건하에 상응하는 알킨- 또는 아지드-변형된 검출가능한 표지 및/또는 관능성 분자를 부가하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
엑스 비보 형질감염시킴으로써 수득된 세포로서, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA로 상응하는 인간, 동물 또는 식물 모체 세포를 엑스 비보 형질감염시킴으로써 수득된 세포.
청구항 13에 있어서, 상기 세포는 상기 인간 또는 동물 면역계 세포인 것인 세포.
활성제로서 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA 또는 청구항 13 또는 14에 따른 세포를, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 아쥬반트 또는 부형제와 조합하여 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체 중에 함유하여, 포함하는 약학적 조성물.
mRNA 기반 치료적 및/또는 예방적 적용에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA 또는 청구항 15에 따른 약학적 조성물.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항 또는 청구항 15, 특히 청구항 16에 있어서, 상기 치료적 및/또는 예방적 적용은 유전자 대체 요법, mRNA에 의해 코딩된 특정 엔도뉴클레아제와 조합된 표적 유전자 요법 (예: CRISPR/Cas9), 백신화 (vaccination), 암 요법에서 및 (유전) 질환 및 유전자 이상의 치료를 위한 세포 특이적 유전자 발현 또는 유전자 편집을 위한 표적 전달, 또는 면역학적 아쥬반트로서의 용도를 포함하는 것인 변형된 mRNA 또는 약학적 조성물, 특히 치료적 및/또는 예방적 적용에서 사용하기 위한 변형된 mRNA 또는 약학적 조성물.
인간 또는 동물에서, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA 또는 청구항 15에 따른 약학적 조성물, 특히 청구항 16 또는 17에 따른 치료적 및/또는 예방적 적용에서 사용하기 위한 변형된 mRNA 또는 약학적 조성물.
식물 및 식물 세포의 형질감염을 위한, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA의 용도.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA의 제조 및/또는 전달을 위한 키트.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA의 세포, 조직 또는 장기에서의 존재, 전달 및/또는 분포를 인 비트로 스크리닝 (screening)하기 위한 진단용 조성물로서, 상기 조성물은 검출가능한 표지, 바람직하게는 형광단 표지 또는 방사성핵종 표지를 포함하는 mRNA를 함유하는 진단용 조성물.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA의 존재, 전달 및/또는 분포를 인 비보 스크리닝하는데 사용하기 위한 또는 청구항 13 또는 14에 따른 세포의 재투여의 인 비보 모니터링을 위한 진단용 조성물로서, 상기 조성물은 형광단 표지 또는 방사성핵종 표지를 포함하는 변형된 mRNA를 함유하거나, 또는 상기 세포는 형광단 표지 또는 방사성핵종 표지를 포함하는 변형된 mRNA에 의해 형질감염되는 것인 진단용 조성물.
RNA, 특히 mRNA를 안정화시키는 방법으로서, 변형된 (m)RNA를 제조하기 위한 RNA 합성 중에 및/또는 폴리(A) 폴리머라제 부가 반응에서 4가지 표준 타입의 뉴클레오티드 (ATP, CTP, GTP 및 UTP) 중 적어도 하나를 부분적으로 또는 완전히 알킨- 및/또는 아지드-변형된 형태로 포함함으로써 알킨- 및/또는 아지드-변형이 도입되고, 선택적으로 하나 이상의 검출가능한 표지 및 관능성 분자는 상기 변형된 (m)RNA와 상응하는 변형된 알킨- 또는 아지드-함유 검출가능한 표지 또는 관능성 분자의 클릭 반응을 통해 도입되는 것인 방법.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 변형된 mRNA의 형광-활성화 세포 스캐닝 분석 (fluorescence-activated cell scanning analysis)을 통한 표적 세포로의 전달 및 형질감염을 정성적 또는 정량적으로 결정하는 인 비트로 방법으로서, 변형된 mRNA는, 상기 변형된 mRNA와 상응하는 변형된 알킨- 또는 아지드-함유 형광발생 분자에 대한 클릭 반응을 통해 도입된, 하나 이상의 형광발생 분자를 함유하며, 및/또는 변형된 mRNA는 형광 단백질을 코딩하는 것인 인 비트로 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 형광발생 분자 또는 형광 단백질에 의해 방출된 형광 신호는 상기 변형된 mRNA로 형질감염된 표적 세포에 대해 결정되고, 형질감염되지 않은 표적 세포와 비교되는 것인 인 비트로 방법.