CN114828881A - 基孔肯雅病毒样颗粒疫苗及其使用方法 - Google Patents

基孔肯雅病毒样颗粒疫苗及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种改进的病毒样颗粒(VLP)组合物及疫苗，用于在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒(CHIKV)感染的免疫应答及/或保护性免疫，例如通过在施用单次剂量的组合物或疫苗之后的7天内，于所述受试者内诱导针对基孔肯雅病毒(CHIKV)感染的中和抗体应答。

Description

基孔肯雅病毒样颗粒疫苗及其使用方法
相关申请参考资料
本申请主张2019年10月25日申请的美国临时申请申请案第62/926,357号以及2020年3月23日申请的美国临时申请案第62/993,563号的优先权，各内容的内容通过引用而整体并入本文中。
以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起以电子方式提交的ASCII文本档案(名称：2479_215PC02_Seqlisting_ST25；大小：44,121字节；及创建日期：2020年10月22日)的序列表的内容通过引用整体并入本文中。
背景技术
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是披衣病毒科(Togaviridae)的蚊媒甲病毒(mosquito-borne alphavirus)，其于1952年在坦桑尼亚首次被发现。基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的亲缘关系分析显示存在三种基因型：亚洲、东非/中非/南非及西非。感染此种病毒会引起人类疾病，其特征是突然发烧、肌肉疼痛、头痛、皮疹及关节发炎。虽然发烧通常是短期的，但严重的关节炎症状可能会持续数年。炎症病症的慢性与肌肉骨骼疾病有关，所述肌肉骨骼疾病例如远端筋膜炎及近端肌腱炎，其需要药物及物理治疗。老年人及患有神经系统、呼吸系统或心血管疾病等合并症的人罹患更严重疾病的风险更高。
自从于2004年基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)在肯尼亚重新出现以来，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)已经感染非洲、欧洲及亚洲的数百万人。一些报告表明高达40％的全球人口面临基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)暴露的风险。在缺乏疫苗或抗病毒疗法的情况下，病毒向新地理区域的演变及传播，以及疾病的严重程度构成严重的公共卫生威胁。目前并未批准针对此种疾病的特定治疗方法或疫苗。现有范例主要针对缓解疾病症状，例如提供常用药物，包括退热药、镇痛药及液体。
发明内容
本公开的某些方面涉及一种组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括(a)病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的衣壳蛋白及包膜蛋白；(b)氢氧化铝佐剂(例如，氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000021
))；(c)糖；(d)缓冲剂及/或pH调节剂；及(e)载体。
本公开的某些方面涉及一种组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的衣壳蛋白及包膜蛋白，其中所述组合物或疫苗在向一受试者施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后的7天内，在所述受试者体内诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答(neutralizing antibody response)。及/或(ii)在向所述受试者施用单次剂量之后，诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。本公开的某些方面涉及一种组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的衣壳蛋白及包膜蛋白，其中在施用单次剂量之后，所述组合物或疫苗在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答，其中所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。在一些方面，所述组合物或疫苗进一步包括佐剂，例如氢氧化铝佐剂(例如，氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000022
))。
在一些方面，所述衣壳蛋白是基孔肯雅病毒C(Chikungunya virus C，CHIKV C)蛋白。在一些方面，所述包膜蛋白是基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)蛋白，所述基孔肯雅病毒蛋白是选自由E3、E2、6K、E1及其任意组合。在一些方面，所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)包括基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜蛋白E2及E1。在一些方面，所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)包括基孔肯雅病毒C(Chikungunya virus C，CHIKV C)、E2及E1蛋白。在一些方面，在所述组合物或疫苗中，所述基孔肯雅病毒C(Chikungunya virus C，CHIKV C)、E2及E1蛋白占所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)蛋白的至少95％。在一些方面，所述病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)不包括基孔肯雅病毒E3及/或6K。在一些方面，所述衣壳蛋白及包膜蛋白是源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的病毒株37997。
在一些方面，所述组合物或疫苗是适合肌肉注射的悬浮剂。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约6μg至200μg的病毒样颗粒病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)或约20μg至100μg的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)(例如，约40μg)。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约25μg/mL至75μg/mL的病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)(例如，约50μg/mL)。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括佐剂，例如，氢氧化铝佐剂(例如，氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000032
)，其量为约30μg至3000μg或约100μg至500μg(例如，约300μg)。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约250μg/mL至625μg/mL的氢氧化铝凝胶(例如，Alhydrogel)
Figure BDA0003613305600000031
)。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约0.5mL至2mL的体积或约0.5mL至1mL的体积(例如，约0.8mL)。
在一些方面，所述组合物或疫苗包括糖(例如，蔗糖、乳糖及其任意组合)。在一些方面，所述组合物或疫苗包括缓冲剂及/或pH调节剂(例如，磷酸二氢钾(potassiumphosphate monobasic)、磷酸氢二钾(potassium phosphate dibasic)、脱水柠檬酸钠(sodium citrate dehydrate)及其任意组合)。在一些方面，所述组合物或疫苗不包括防腐剂或抗生素。
在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括：(a)约6μg至60μg的所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，及(b)约200μg至500μg的所述氢氧化铝，其中所述单次剂量体积是介于约0.5mL与1.0mL之间。
在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括：(a)约6μg至60μg的所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)；(b)约200μg至500μg的所述氢氧化铝；(c)约20mg至80mg的蔗糖；(d)约0.2mg至1.0mg的磷酸二氢钾；(e)约0.2mg至1.5mg的磷酸氢二钾；(f)约2mg至10mg的脱水柠檬酸钠；及(g)水，其中所述单次剂量体积是介于约0.5mL与1.0mL之间(例如，0.8mL)。
在一些方面，所述组合物或疫苗包括病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)诱导针对基孔肯雅病毒基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的同源或异源的病毒株的抗体。在一些方面，所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)诱导针对一或多种基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的谱系的抗体，所述基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的谱系的抗体是选自由东非/中非/南非(East/Central/South African，ECSA)、西非及亚洲所组成的群组。
在一些方面，在向一受试者施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后的7天内，在所述受试者中诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答。在一些方面，在施用单次剂量之后，所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少28天。在一些方面，在施用单次剂量之后，所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少六个月。在一些方面，在施用单次剂量之后，所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答会持续至少一年、至少18个月或至少2年。在一些方面，在施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后的7天内，所述血清中和抗体效价是≥30或≥40。
本公开的某些方面涉及一种预填充注射器，所述预填充注射器包括单次剂量的如本文中所述的组合物或疫苗。
本公开的某些方面涉及一种在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的免疫应答及/或保护性免疫的方法，所述方法包括步骤：向所述受试者施用如本文中所述的组合物或疫苗。
本公开的某些方面涉及一种在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的中和抗体应答的方法，所述方法包括步骤：向所述受试者施用如本文中所述的组合物或疫苗。
本公开的某些方面涉及一种用于在一受试者中治疗、预防或降低基孔肯雅热(Chikungunya)感染的风险的方法，所述方法包括步骤：向所述受试者施用有效量的如本文中所述的组合物或疫苗。
本公开的某些方面涉及一种为一受试者接种针对基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)感染的方法，所述方法包括步骤：向所述受试者施用有效量的如本文中所述的组合物或疫苗。
本公开的某些方面涉及一种在一受试者中引起针对基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的免疫应答及/或保护性免疫的方法，所述方法包括步骤：向所述受试者施用组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括(a)病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的衣壳蛋白及包膜蛋白，以及(b)佐剂，其中所述组合物或疫苗的单次剂量包括约6μg至200μg的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，以及其中施用单次剂量的所述组合物或疫苗在施用之后的7天内，在所述受试者内会引起基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)特异性的中和抗体。
本公开的某些方面涉及一种在一群体中诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的保护性免疫的方法，所述方法包括步骤：向所述群体施用组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括(a)病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的衣壳蛋白及包膜蛋白，以及(b)佐剂，其中所述组合物或疫苗的单次剂量包括约6μg至200μg的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，以及其中至少60％的所述群体在施用所述组合物或疫苗的单次剂量之后的7天内，产生针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答。在一些方面，在施用所述组合物或疫苗的单次剂量之后，至少40％、至少50％，或至少60％的所述群体在至少28天、至少6个月、至少一年或至少两年内保持血清中和抗体效价≥30或≥40。
在一些方面，所述中和抗体应答为所述受试者接种针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的多种血清型及/或基因型的疫苗。在一些方面，在施用所述单次剂量之后，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答会持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。在一些方面，所述组合物或疫苗的一或多剂加强剂可在所述受试者的整个生命周期内施用，例如在施用所述单次剂量之后的至少28天、至少6个月、至少1年、至少2年、至少5年、至少10年，或20年或更长时间。在一些方面，在施用所述第二剂之后，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答会持续至少六个月。在一些方面，在施用所述第二剂之后，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答(例如，在单次剂量或一或多剂之后)会持续至少30个月、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年,或20年或更长时间。在一些方面，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答在所述受试者的整个生命周期中持续。在一些方面，在施用所述组合物或疫苗之后的7天，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或至少98％的所述受试者产生针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答。在一些方面，在施用所述组合物或疫苗之后的7天、28天、一年或两年，血清应答率(seroresponse rate)是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％。在一些方面，所述血清中和抗体效价是≥30或≥40或≥50。
在一些方面，所述组合物或疫苗是肌肉内给药。
在一些方面，所述组合物或疫苗是以有效量给药。
在一些方面，所述受试者是人类。在一些方面，所述受试者在施用所述组合物或疫苗之前并未暴露于基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)抗原或基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)疫苗。在一些方面，所述受试者在施用所述组合物或疫苗之前不具有可检测的基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)抗体效价。在一些方面，所述受试者在施用所述组合物或疫苗之前具有可检测的基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)抗体效价≤5或≤10。
附图说明
在说明本发明的实施例的附图中，其中相似的附图标记表示在各个视图中的对应部分。
图1显示基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)基因组的示意图。
图2显示在还原及变性的条件下，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的SDS-PAGE凝胶。
图3A至图3D是来自CHIKV VLP蛋白的(A)衣壳、(B)E2，及(C)E1，相较于(D)对照HSP70 1A在MALDI-TOF分析之后的质谱图。
图4显示基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(CHIKV VLP)的RP-HPLC色谱图。
图5显示峰1、2、3的SDS-PAGE凝胶，其是从RP-HPLC中分离出来。
图6A至图6B显示(A)基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(CHIKV VLP)的透射电子显微镜图像，以及(B)基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(CHIKV VLP)的低温电子显微镜图像。
图7显示作为基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(CHIKV VLP)浓度的函数的光密度图。
图8显示相较于仅使用明矾(Alum)及刺激之前，施用1.25μg CHIKV VLP+明矾(Alum)、6μg CHIKV VLP+明矾(Alum)、仅施用20μg CHIKV VLP，以及施用20μg CHIKV VLP+明矾(Alum)接种后，在食蟹猴(Cynomolgus macaques)中的血清中和抗体应答。
图9A至图9B显示相较于仅使用明矾(Alum)，使用从施用1.25μg CHIKV VLP+明矾(Alum)、6μg CHIKV VLP+明矾(Alum)、仅施用20μg CHIKV VLP以及20μg CHIKV VLP+明矾(Alum)的受刺激的猕猴中分离的血清所进行的噬菌斑分析的(A)血浆中的峰病毒血症以及(B)血浆中的AUC斑块的结果。
图10A至图10B显示相较于在仅使用明矾(Alum)，在受刺激的猕猴中，对于(A)佐剂v.接种疫苗，以及(B)施用1.25μg CHIKV VLP+明矾(Alum)、6μg CHIKV VLP+明矾(Alum)、仅施用20μg CHIKV VLP，以及20μg CHIKV VLP+明矾(Alum)的关节病理分数(jointpathology scores)。
图11A至图11D显示相较于仅使用明矾(Alum)，从施用1.25μg CHIKV VLP+明矾(Alum)、6μg CHIKV VLP+明矾(Alum)、仅施用20μg CHIKV VLP，以及20μg CHIKV VLP+明矾(Alum)的受刺激的猕猴中所扩增的病毒RNA的量。样品是收集自(12A)踝关节毛细血管及软骨、(12B)带有肌腱的右股四头肌、(12C)膝关节毛细血管及软骨，以及(12D)腕关节毛细血管及软骨。
图12显示施用两剂CHIKV VLP的CHIKV初始
Figure BDA0003613305600000091
受试者的免疫应答的持续时间。
图13显示第2期研究CHIKV VLP疫苗的剂量和时程设计。病毒样颗粒(VLP)剂量以μg为单位；A＝明矾(alum)；PLA＝安慰剂。
图14显示第1至8组在接种CHIKV VLP疫苗后(天数)的中和抗体的几何平均效价的量化。
图15显示第1至9组(参见表7)在接种后第760天的抗基孔肯雅热(chikungunya)的抗体的平均效价。
图16显示第1至8组(参见表7)在接种后第365天的效价的反向累积分布。
图17显示第1至8组(参见表7)在第760天的几何平均效价(Geometric MeanTiter，GMT)数据(参见表8)。
图18A至图18B显示各组受试者(参见表7)具有抗基孔肯雅病毒(CHIKV)中和效价(NT80)分别为≥15及≥40的百分比。
具体实施方式
本发明涉及一种改进的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)组合物及疫苗，用于在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染的免疫应答及/或保护性免疫，例如通过在施用单次剂量的组合物或疫苗之后的7天内，在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答，及/或其中在施用单次剂量之后，所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年，或至少2年。
定义：
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语具有与所述的方法及组合物相关的本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文中所提供的定义是为了便于理解本文中经常使用的某些术语。
除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文中所使用，术语“或”被理解为包容。除非特别说明或从上下文显而易见，如本文中所使用，术语“一(a)”、“一(an)”，及“所述”应理解为单数或复数。
在本公开中，“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含(containing)”及“具有(having)”等可具有在美国专利法中赋予其的含义，且可表示“包括(includes)”、“包括(includes)”等；“基本上由…所组成(consisting essentially of)”或“基本上由…所组成(consists essentially)”同样具有美国专利法中赋予的含义，且此术语是开放式的，只要所引用的内容具有基本或新颖的特征，则允许存在较所引用的内容更多的内容，但不包括现有技术实施例，不因存在多于所列举的内容而改变。
除非特别说明或从上下文显而易见，如本文中所使用，术语“约”被理解为在本领域的正常公差的范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。大约可理解为在所陈述的数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％，或0.01％以内。除非上下文另有明确说明，否则本文中所提供的所有数值皆由术语约修改。
如本文中所使用，“试剂”是指任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
如本文中所使用，术语“佐剂”是指当与制剂(例如疫苗)中的特定免疫原组合使用时，将增强、改变或修饰所得到的免疫应答的化合物。在某些实施例中，佐剂与病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)组合使用。免疫应答的修饰包括增强或扩大抗体及细胞免疫应答之一或两者的特异性。免疫应答的修饰亦可能意味着减少或抑制某些抗原特异性免疫应答。在某些方面，佐剂是氢氧化铝佐剂(例如，氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000101
)2％)。
Figure BDA0003613305600000111
是一种氢氧化铝(简称明矾(alum))湿凝胶悬浮液。
如本文中所使用，“甲病毒(alphavirus)”是指含有RNA的病毒，所述病毒属于病毒的披衣病毒科(Togaviridae family)。示例性披衣病毒包括但不限于EEEV、WEEV、VEEV、SFV、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)、阿尼昂尼昂(O’nyong-nyong)病毒、辛德比斯(Sindbis)病毒、马雅罗(Mayaro)病毒、罗斯河(Ross River)病毒、巴马森林(BarmahForest)病毒及奥科伯(Ockelbo)病毒。
术语“基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)”及“基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)”在本文中可互换使用。
如本文中所使用，“基孔肯雅病毒结构蛋白”是指与天然存在的基孔肯雅病毒衣壳或包膜蛋白具有至少约85％氨基酸序列的同一性的多肽或其片段。在一些方面，氨基酸序列的同一性为至少约90％、95％、98％、99％或更多。
如本文中所使用，“改善”是指减少、抑制、减弱、减弱、阻止或稳定疾病或其症状的发展或进展。
如本文中所使用，关于多肽序列或多核苷酸序列，“改变”是指多肽序列或多核苷酸序列中特定位置处的氨基酸或核苷酸的改变。如本文中所使用，改变包括在多肽或多核苷酸的特定位置处氨基酸或核苷酸的取代、缺失或插入。在一些方面，甲病毒衣壳蛋白核定位信号的改变包括利用不带电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或天冬酰胺，或除了诸如赖氨酸或精氨酸的碱性带电荷氨基酸之外的任何氨基酸)替换带电荷的氨基酸(例如，赖氨酸或精氨酸)。
如本文中所使用，关于基因或多肽的表达水平或活性，如本文所述，“改变”是指如通过标准领域已知的方法所检测的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)。如本文中所使用，改变包括表达水平的10％、25％、50％、75％、100％或更大的变化。改变包括表达水平的10倍、20倍、50倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更大的变化。
如本文中所使用，“类似物”是指不相同但具有类似功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留相应天然存在的多肽的生物活性，同时具有某些生化修饰，此等修饰增强类似物相对于天然存在的多肽的功能。
如本文中所使用，“加强(boosting)”或“加强剂(booster)”剂量或免疫是指在较早的剂量，例如初次剂量(priming dose)之后再次暴露于免疫抗原。
“检测”是指识别待检测的分析物的存在、不存在或量。
“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何症状(condition)或病症(disorder)。疾病的实例包括病毒感染，包括基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)。
如本文中所使用，组合物或疫苗的“有效量”是指相对于未治疗的患者预防、降低基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染的可能性或改善基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染的症状所需的所述组合物或疫苗的量。用于预防、降低基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染的可能性，或治疗基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染的本公开的组合物或疫苗的有效量可根据受试者的施用方式、年龄、体重和及一般健康状况而变化。在某些方面，有效量是在7天内提供针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答及/或保护的本公开的所述组合物或疫苗的量。
如本文中所使用，“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。此部分包含例如参考核酸分子的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或95％，或多肽。片段可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
“杂交”是指互补核碱基之间的氢键，所述氢键可为沃森-克里克(Watson-Crick)、霍斯汀(Hoogsteen)或反向霍斯汀(Hoogsteen)氢键。例如，腺嘌呤及胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核碱基。
如本文中所使用“诱导免疫”意指针对抗原所产生的任何免疫应答。在一些方面，免疫是通过针对传染原的抗体所介导，所述抗体是由脊椎动物(例如，人类)表现出来，其预防或改善感染或减少其至少一种症状。本公开的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)可刺激抗体的产生，例如，中和传染原、阻断传染原进入细胞、阻断传染原的复制及/或保护宿主细胞免受感染及破坏。所述术语亦可指通过T淋巴细胞及/或其他白细胞所介导的针对感染原的免疫应答，通过脊椎动物(例如，人类)表现出来，其预防或改善感染，例如基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染，或减轻其至少一种症状。
如本文中所使用“中和抗体应答”是指诱导与感染体(例如，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV))的抗原结合的抗体，其中所述抗体对于感染体在细胞上的感染性具有中和或抑制作用。在某些方面，中和抗体应答可通过检测血清中和抗体(serumneutralizing antibody，SNA)效价来确定。在某些方面，血清中和抗体(serumneutralizing antibody，SNA)效价可通过表征在血清的存在下，感染性的降低(例如，NT80血清中和抗体，通过使用荧光素酶载体的荧光素酶分析及/或噬菌斑减少分析)来确定。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)中和抗体效价80(NT80)是血清稀释度的倒数，相较于仅有病毒的对照，提供约80％的Vero细胞免受CHIKV-Luc感染或减少80％的萤光素酶活性。在某些方面，20、25、30、35、40、45或50或更高的NT80效价表明针对一或多种或所有的基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)谱系的保护。
如本文中所使用，例如在“获得试剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方式获得所述试剂。
如本文中所使用“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内的彼等化合物、材料、组合物及/或剂型，适用于与人类及动物的组织接触，无过度的毒性、刺激性、过敏应答，或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
如本文中所使用“群体”是指从中抽取统计样本的个体库或个体组。在本公开的一些方面，用于疫苗接种的目标群体可为尚未从基孔肯雅病毒引发且是初始的(例如，针对一或多种基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的病毒株)的群体。在其他方面，目标群体可为先前已经暴露于基孔肯雅热(chikungunya)感染或疫苗接种(例如，针对一或多种多种基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的病毒株)的群体。所述群体，例如目标群体，可包括任何年龄及种族的个体。
“减少”是指至少10％、25％、50％、75％、85％、95％，或100％的负变化。
“参考”是指标准或控制条件。
“参考序列(reference sequence)”是指用作序列比较基础的定义序列。参考序列可为指定序列的子集或全部；例如，一段全长cDNA或基因序列，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸，及约35个氨基酸、约50个氨基酸，或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常为至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约75个核苷酸，及约100个核苷酸或约300个核苷酸或其附近或之间的任何整数。
如本文中所使用“特异性结合”可指化合物或抗体，所述化合物或抗体识别及结合本公开的多肽，但基本上不识别及结合在一样品中的其他分子，所述样品例如生物样品，所述生物样品天然地包括本公开的多肽。
可用于本公开的方法的核酸分子包括任何的核酸分子，所述任何的核酸分子编码本公开的多肽或其片段。此种核酸分子无需总是与内源核酸序列100％相同，但通常会表现出实质上的同一性。与内源序列具有“实质同一性(substantial identity)”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链进行杂交。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％相同，但通常会表现出实质同一性。与内源序列具有“实质同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链进行杂交。“杂交”是指在各种严格条件下配对，以在互补的多核苷酸序列(例如，本文中所述的基因)或其部分之间形成双链分子。(参见，例如，瓦尔，G.M.及S.L.伯杰(1987)Methods Enzymol.152:399；金梅尔，A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
“基本上相同(substantially identical)”是指多肽或核酸分子与参考氨基酸序列(例如，本文中所述的任何一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文中所述的任何一核酸序列)。在某些方面，序列在氨基酸水平或核酸水平上与用于比较的序列具有至少60％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％，或至少99％的同一性。
可使用序列分析软件(例如，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程式)检测序列同一性。此种软件通过将同源性的程度分配给各种替换、缺失及/或其他修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可使用BLAST程式，其中在e-3与e-100之间的概率分数表示密切相关的序列。
“结构多蛋白”是指复合氨基酸分子，所述复合氨基酸分子包括至少两个可分离多肽，所述可分离多肽有助于病毒衣壳或包膜。在一方面，多肽易于被病毒酶(例如，衣壳自身蛋白酶(autoproteinase)及信号酶(signalases))切割。
“受试者”是指哺乳动物，包括，但不限于人类或非人类哺乳动物，例如牛、马、犬、羊或猫。在某些方面，所述受试者是人类。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可能患有或易患疾病或病症，但可能或可能不表现出疾病或病症的症状。
本文中所提供的范围应理解为在所述范围内所有数值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括任何数字、数字的组合或来自以下组的子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如本文中所使用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指减少或改善与其相关的病症及/或症状。应当理解，尽管不排除，治疗病症或症状无需完全消除与之相关的病症、病症或症状。在一些方面，本文中所公开的治疗可预防性地用于预防或降低相关疾病或病症的风险。
如本文中所使用，短语“治疗有效”旨在限定组合物(例如，疫苗)的量，或在组合治疗的情况下的活性成分的组合量。此量或组合量将实现治疗、预防或降低相关疾病或病症的风险的目标。
如本文中所使用，术语“疫苗”是指用于产生免疫应答的组合物。在特定方面，本公开的疫苗包括病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)、DNA或其他基于基因的疫苗载体，其形式为能够施用于受试者，并诱导保护性免疫应答，所述保护性免疫应答足以诱导免疫以预防及/或改善感染，及/或减轻感染的至少一症状，及/或增强另一剂的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)或DNA疫苗的功效。通常，所述疫苗包括药学上可接受的赋形剂，例如悬浮或溶解本公开的组合物的常规盐水或缓冲水溶液介质。在此种形式中，本公开的组合物可方便地用于预防、改善或以其他方式治疗感染。一旦引入宿主后，所述疫苗会诱导免疫应答，包括，但不限于抗体及/或细胞因子的产生，及/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞的活化，及/或其他细胞应答。在某些方面，疫苗亦可为蛋白质。例如，已经通过基因工程细胞产生重组蛋白，以产生一或多个外源基因，此等外源基因又产生充当免疫原的蛋白质。
如本文中所使用“病毒样颗粒”(virus-like particle，VLP)是指至少在一属性上类似于病毒的结构，但所述结构尚未被证明具有传染性。根据本公开的病毒样颗粒不携带编码病毒样颗粒的蛋白质的遗传信息。一般而言，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，因此是非传染性的。
本文中对变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单一实施例或与本文中所公开的任何其他的实施例或其部分组合的实施例。
本文中所提供的任何组合物或方法可与本文中所提供的任何其他组合物及方法中的一或多种组合。
病毒样颗粒(virus like particle，VLP)
本公开的某些方面涉及一种病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒是由源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)，例如塞内加尔(Senegal)病毒株37997的结构蛋白所组成。基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是甲病毒(alphavirus)属的成员(RNA(+)基因组)，且具有三个谱系：东非/中非/南非(East/Central/South African，ECSA)、西非及亚洲。基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)基因组包括4个非结构蛋白及5个结构蛋白(图1)，野生型基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)病毒体(virion)包括C、E1及E2蛋白。
在某些方面，基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)包括三种重组基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白：衣壳/核心(约35kDa)、包膜1(envelope 1，E1，约55kDa)及包膜2(envelope 2，E2，约50kDa)。所述三种结构蛋白可组装形成基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)。
基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKVVLP)衣壳核心的结构包括围绕核衣壳的各个2倍轴的六聚体，及在各个5倍顶点处的五聚体。所述衣壳核心与E1及E2蛋白通过约
Figure BDA0003613305600000181
宽的脂质膜隔开。代表E1及E2羧基末端区域的成对α螺旋穿过膜。低温电子显微镜显示由E1及E2的三个异二聚体所组成的各别的刺突的三聚体的外观。可观察到在E1结构域III中的β链。孙，S.，等人，eLife 2013；2:e00435。
申请人已经通过负染色及穿透电子显微术以及通过低温电子显微术分析分析由目前所公开的方法所产生的重组基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)。通过负染色，基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)显示为具有规则表面结构的近似球形颗粒，且在某些方面，完全形成的成熟病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)约为65nm。在一些方面，病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)为约60nm至70nm。在某些方面，病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)尺寸可通过显微镜及/或动态光散射(dynamic lightscattering,DLS)来确认。
在本公开的某些方面，基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)包括一或多种基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)蛋白。在某些方面，病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)包括至少三种重组基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白，例如衣壳核心蛋白(core，C)、包膜1蛋白(Envelope 1，E1)和包膜2蛋白(Envelope 2，E2)。在一些方面，病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)亦可包括包膜3蛋白(Envelope 3，E3)及/或6k蛋白(6K)。
在一些方面，衣壳蛋白是基孔肯雅病毒C(Chikungunya virus C，CHIKV C)蛋白。
在一些方面，包膜蛋白是基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)蛋白，所述基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)蛋白是选自由以下所组成的群组：E3、E2、6K、E1及其任何组合。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜蛋白E2及E1。
本公开的一些方面涉及一种病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒包括CHIKV C、E2及E1蛋白。在某些方面，病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)不包括CHIKV E3及/或6K。
在某些方面，衣壳及包膜蛋白是源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的病毒株37997。下表1列出对应于基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)(病毒株37997)结构蛋白C、E3、E2、6K及E1的氨基酸序列，以及编码所述结构蛋白C、E3、E2、6K及E1核酸序列。
表1.基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)(病毒株37997)序列
Figure BDA0003613305600000191
Figure BDA0003613305600000201
Figure BDA0003613305600000211
Figure BDA0003613305600000221
在一些方面，所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)可包括基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白，其包括本文中所公开的氨基酸序列的功能片段。在一些方面，所述功能片段是基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白全长的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％，或99％，且所述基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)功能片段可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。
在一些方面，所述病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)可包括基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白或其片段，其包括与本文中所公开的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)衣壳(Capsid,C)蛋白或其功能片段包括与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，且可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜3(Envelope 3，E3)蛋白或其功能片段包括与SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，且可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜2(Envelope 2，E2)蛋白或其功能片段包括与SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，且可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，CHIKV 6K蛋白或其功能片段包括与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，且可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜1(Envelope1，E1)蛋白或其功能片段包括与SEQ ID NO：12的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，且可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。
在一些方面，所述重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)可包括基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白或其片段，其是由与本文中所公开的核酸序列具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列编码。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)衣壳(Capsid，C)蛋白或其功能片段是由与SEQ ID NO：5的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列编码，及编码的C蛋白可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜3(Envelope 3，E3)蛋白或其功能片段是由与SEQ ID NO：7的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列编码，其编码的E3蛋白可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜2(Envelope 2，E2)蛋白或其功能片段是由与SEQ ID NO：9的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列编码，及编码的E2蛋白可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)6K蛋白或其功能片段是由与SEQ ID NO：11的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列编码，及编码的6K蛋白可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜1(Envelope 1，E1)蛋白或其功能片段是由与SEQ IDNO：13的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列编码，编码的E1蛋白可用于形成本公开的重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。
本公开的某些方面包括包括病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒包括一或多种基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)多肽。所述病毒样颗粒亦包括一或多种基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)多肽或其片段，其以增强或不抑制其调节免疫应答的能力的方式进行修饰。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)氨基酸序列或核酸序列包含改变。此种改变可包括某些突变、缺失、插入或转译后修饰。在一些方面，包括本公开的天然存在的多肽的类似物。类似物可通过氨基酸序列差异、通过转译后修饰或两者而与天然存在的多肽不同。本公开的类似物可展现与全部或部分天然存在的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。序列比较的长度可为至少10、13、15个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基，或超过35个氨基酸残基。
基孔肯雅病毒(CHIKUNGUNYA VIRUS，CHIKV)多肽的改变可包括但不限于定点(site-directed)、随机点诱变、同源重组(DNA置换)(DNA shuffling)、使用包含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定点诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用有缺口的双链DNA的诱变等。其他合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主病毒株的诱变、限制性筛选及限制性纯化、缺失诱变、通过全基因合成的诱变、双链断裂修复等。诱变，例如，涉及嵌合构建体，亦包括在本公开中。在某些方面，诱变可由天然存在的分子或改变或突变的天然存在分子的已知信息所引导，例如序列、序列比较、物理性质、晶体结构等。
在某些方面，本公开提供不同于参考多肽的多肽变体。术语“变体”是指相对于参考序列被一或多个氨基酸所改变的氨基酸序列。所述变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如利用异亮氨酸替代亮氨酸。或者，变体可具有“非保守”变化，例如，利用色氨酸替换甘氨酸。类似的微小变化亦可包括氨基酸缺失或插入，或两者。使用本领域熟知的计算机程式，例如DNASTAR软件，可找到确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或删除而不消除生物性或免疫性活性的引导。理想地，变体显示显着的生物性活性。在一些方面，蛋白质变体在施用于一受试者时形成病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，并引发抗体应答。
除了全长多肽，本公开亦包括本公开的多肽的功能片段。
免疫原性组合物及疫苗
本公开的某些方面涉及一种组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括本文中所公开的基于蛋白质的非感染性基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在某些方面，本文中所公开的组合物或疫苗可包括：病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，其包括源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的衣壳蛋白及包膜蛋白，其中所述组合物或疫苗在向一受试者施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后的7天内，在所述受试者体内诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答，及/或在向所述受试者施用单次剂量之后，诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。在一些方面，血清中和应答包括≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价。在一些方面，所述组合物或疫苗进一步包括佐剂(例如，氢氧化铝佐剂)。
在某些方面，本公开的组合物或疫苗包括基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)，其包括一或多种基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)蛋白。在某些方面，所述组合物或疫苗的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)包括至少三种重组基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)结构蛋白，例如衣壳核心蛋白(capsid core，C)、包膜1蛋白及包膜2蛋白(Envelope 2，E2)。在一些方面，所述病毒样颗粒(virus like particle，VLP)亦可包括包膜3蛋白(Envelope 3，E3)及/或6k蛋白(6K)。在一些方面，所述衣壳蛋白是基孔肯雅病毒C(Chikungunya virus C，CHIKVC)蛋白。在一些方面，所述包膜蛋白是基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)蛋白，所述基孔肯雅病毒是选自由以下所组成的群组：E3、E2、6K、E1及其任何组合。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)包膜蛋白E2及E1。在一些方面，所述组合物或疫苗的病毒样颗粒(virus like particle，VLP)包括基孔肯雅病毒C(Chikungunya virus C，CHIKV C)、E2及E1蛋白。在某些方面，所述组合物或疫苗的病毒样颗粒(virus likeparticle，VLP)不包括CHIKV E3及/或6K。在一些方面，所述组合物或疫苗衣壳及包膜蛋白是源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的病毒株37997。在某些方面，所述组合物或疫苗包括基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)，其包括衣壳、E1及E2蛋白，所述衣壳、E1及E2蛋白存在于所述组合物或疫苗中的总基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)蛋白的至少95％、至少96％，或至少97％的量。
在某些方面，本公开的组合物或疫苗包括病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，例如在单次剂量制剂中(例如，介于约5mL至1.0mL之间的体积)，所述病毒样颗粒的量为约6μg至200μg、约10μg至200μg、约20μg至200μg、约20μg至150μg、约20μg至100μg、约20μg至80μg、约20μg至60μg，或约20μg至50μg。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约6μg至60μg(例如，约40μg VLP)的量的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，所述组合物或疫苗包括约6μg至60μg的病毒样颗粒。在一些方面，所述组合物或疫苗包括以下量的病毒样颗粒：约6μg、约10μg、约20μg、约22μg、约24μg、约26μg、约28μg、约30μg、约32μg、约34μg、约36μg、约38μg、约40μg、约42μg、约44μg、约46μg、约48μg、约50μg或约60μg。在一些方面，所述组合物或疫苗包括约40μg的病毒样颗粒。在某些方面，本公开的组合物或疫苗包括以下剂量的病毒样颗粒：约7.5μg/mL至75μg/mL、约12.5μg/mL至75μg/mL、25μg/mL至75μg/mL、37.5μg/mL至62.5μg/mL，或40μg/mL至60μg/mL。在某些实施例中，所述本公开的组合物或疫苗包括以下剂量的病毒样颗粒：约25μg/mL、约50μg/mL，或约75μg/mL。在某些实施例中，所述本公开的组合物或疫苗包括约50μg/mL剂量的病毒样颗粒。在一些方面，本公开的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)可使用铝佐剂，例如氢氧化铝凝胶(例如
Figure BDA0003613305600000283
)作为佐剂。在一些方面，所述组合物或疫苗在每约300μg的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000282
)包括约40μg。
在某些方面，所述佐剂是氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000281
)(亦称为明矾(alum))。在一些方面，例如，在单次剂量的制剂中(例如，在介于约0.5mL与1.0mL之间的体积中)，所述组合物或疫苗可包括以下量的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000284
)：约30μg至3000μg、约50μg至2500μg、约100μg至2000μg、约100μg至1000μg、约100μg至750μg、约100μg至500μg、约150μg至500μg，或约200μg至400μg。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约100μg至500μg(例如，约300μg的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000285
))的量的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000288
)。在一些方面，所述单次剂量包括约250μg/mL至625μg/mL的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000286
)。在一些方面，所述单次剂量包括约375μg/mL的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000287
)。在一些方面，所述组合物或疫苗可在每约40μg的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)包括约300μg的氢氧化铝凝胶(例如
Figure BDA0003613305600000289
)。
在某些方面，本公开的组合物或疫苗包括糖。在一些方面，所述糖是选自由以下所组成的群组：蔗糖、乳糖及其任意组合。在一些方面，所述糖是蔗糖。在一些方面，例如，在单次剂量的制剂中(例如，在介于约0.5毫升至1.0毫升之间的体积中)，所述组合物或疫苗可包括以下量的糖：约10mg至200mg、约10mg至150mg、约10mg至100mg、约20mg至200mg、约20mg至150mg、约20mg至100mg、约30mg至100mg、约40mg至100mg，或约40mg至80mg。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约40mg至80mg(例如，50mg至70mg的糖)的量的糖(例如，蔗糖)。在一些方面，所述组合物或疫苗包括约50mg、约51mg、约52mg、约53mg、约54mg、约55mg、约56mg、约57mg、约58mg、约59mg、约60mg、约61mg、约62mg、约63mg，或约64μg的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，所述组合物或疫苗包括约59mg至60mg(例如，59.7mg)的VLP病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。
在某些方面，所述组合物或疫苗进一步包括缓冲剂及/或pH调节剂。在一些方面，所述缓冲剂及/或pH调节剂是选自由以下所组成的群组：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、脱水柠檬酸钠及其任意组合。在一些方面，例如，在单次剂量的制剂中(例如，在介于约0.5mL与1.0mL之间的体积中)，所述组合物或疫苗可包括以下量的缓冲剂及/或pH调节剂：约0.2mg至20mg、约0.2mg至15mg、约0.2mg至10mg，或约0.4mg至10mg。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约0.2mg至20mg的量的缓冲剂及/或pH调节剂(例如，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或脱水柠檬酸钠中的一或多者)(例如，0.2mg至10mg的缓冲液及/或pH调节剂)。在某些方面，所述组合物或疫苗包括约0.2mg至1.0mg的磷酸二氢钾(例如，约0.4mg的磷酸二氢钾)；约0.2mg至1.5mg的磷酸氢二钾(例如，约0.9mg的磷酸氢二钾)；及/或约2mg至10mg的脱水柠檬酸钠(例如，约5.9mg的脱水柠檬酸钠)。
在某些方面，所述组合物或疫苗进一步包括载体、稀释剂或其他赋形剂，例如，药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可包括，但不限于水、盐水、缓冲盐水、甘油、无菌等渗水性缓冲液及其组合。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.当前版本)中全面讨论药学上可接受的载体、稀释剂及其他的赋形剂。在一些方面，所述载体是水。
在某些方面，所述组合物或疫苗不包括防腐剂或抗生素。
在某些方面，本文中所公开的组合物或疫苗可包括：(a)病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的衣壳蛋白及包膜蛋白；(b)佐剂(例如，氢氧化铝佐剂)。在某些方面，在体积介于约0.5mL与1.0mL(例如，约0.8mL)之间中，所述组合物或疫苗包括：(a)约6μg至60μg(例如，40μg)的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)；及(b)约200μg至500μg(例如，300μg)的氢氧化铝。
在一些方面，在体积介于约0.5mL与1.0mL(例如，约0.8mL)之间中，所述组合物或疫苗包括：(a)约6μg至60μg(例如，约40μg)的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)；(b)约200μg至500μg的氢氧化铝(例如，约300μg)；(c)约20mg至80mg的蔗糖(例如，约55mg至65mg)；(d)约0.2mg至1.0mg的磷酸二氢钾(例如，约0.2mg至0.8mg)；(e)约0.2mg至1.5mg的磷酸氢二钾(例如，约0.5至1.5mg)；(f)约2mg至10mg的脱水柠檬酸钠(例如，约5.5mg至6.5mg)；(g)水。
在一些方面，所述组合物或疫苗被配制成悬浮液，例如，用于肌肉注射。本公开的组合物或疫苗可为适用于单次剂量肌内注射(例如，在预填充注射器中的0.8mL剂量)的悬浮液。
在一些方面，所述组合物或疫苗被配制成悬浮液，并在使用前储存在2℃至8℃(36°F至46°F)的小瓶中。在一些方面，所述组合物或疫苗被配制成悬浮液，并在使用前储存在2℃至8℃(36°F至46°F)的预填充注射器中。
在某些方面，所述本公开的组合物或疫苗是以有效量给药。在一些方面，所述有效量是本公开的组合物或疫苗的量，其在7天内提供针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答及/或保护。
在某些方面，本文中所公开的组合物或疫苗在施用后的7天内诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答，例如单次剂量施用。在一些方面，所述组合物或疫苗诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的同源或异源的病毒株的抗体。在一些方面，在施用后，例如在单次剂量施用之后，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少21天、至少22天、至少28天、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少一年、至少18个月或至少两年。在一些方面，在施用后，例如在单次剂量的施用之后，或在单次剂量施用及一或多次加强剂量给药之后，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答在所述受试者的整个生命周期中持续。
在某些方面，本文中所公开的组合物或疫苗在施用后的7天内诱导≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价，例如，通过基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)中和分析(例如，通过荧光素酶分析或噬菌斑分析的NT80血清中和抗体(Serum Neutralizing Antibodies，SNA))在人类血清中进行检测。在某些方面，本文中所公开的组合物或疫苗在施用后的7天内诱导血清中和抗体效价为介于20与10,000之间、介于20与15,000之间、介于30与10,000之间、介于30与15,000之间、介于40与10,000之间，或介于40与15,000之间，例如，通过基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)中和分析(例如，通过荧光素酶分析或噬菌斑分析的NT80血清中和抗体(serum neutralizingantibodies，SNA))在人类血清中进行检测。在一些方面，≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价是持续至少21天、至少22天、至少28天、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月，及/或至少2年。在一些方面，≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价是持续至少30个月、2年、3年、4年、5年、10年或20年或更长时间。在一些方面，在施用，例如，在单次剂量施用之后或在单次剂量量施用及一或多次加强剂量施用之后，≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价是在所述受试者的整个生命周期中持续。在某些方面，接种本文中所公开的组合物或疫苗的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的受试者，在施用病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)之后的7天会产生针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答。在某些方面，在施用本文中所公开的组合物或疫苗后(例如，在单次剂量之后或在单次剂量施用及一或多次加强剂量施用之后)，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％的群体维持血清中和抗体效价≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)至少21天、至少22天、至少28天、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月，及/或至少2年。在一些方面，在本文中所公开的组合物或疫苗的第一次单次剂量之后的至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少14个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少20个月、至少22个月，或至少2年，施用本文中所公开的组合物或疫苗的第二剂，例如加强剂。在一些方面，可在所述受试者的整个生命周期中施用一或多剂加强剂，以维持保护性血清中和抗体效价≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)。
在某些方面，在接种疫苗后，所述中和抗体应答在7天内出现，且在7天内的血清应答率为至少60％、至少70％，或至少80％。在某些方面，所述应答在接种疫苗后持续至少2年，且血清应答率为至少50％或至少60％。
剂量及给药：
本公开的某些方面涉及本文中所公开的组合物或疫苗的剂量及给药。本文中所公开的组合物及疫苗可以单次剂量(例如，一次剂量)或多剂量(例如，初次剂量(prime)及加强剂量)进行给药。在一些方面，所述组合物或疫苗被配制成单次剂量。在一些实施例中，所述组合物或疫苗的单次剂量施用一次。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量是作为一或多剂加强剂(例如，至少2剂、至少3剂、至少4剂、至少5剂，或至少6剂)施用。在某些方面，第一剂(例如，初次剂量)及任何后续的加强剂可以相同或不同(例如，各剂更多或更少的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP))。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量是施用一次，且加强剂量是在本文中所公开的组合物或疫苗的第一次单次剂量之后的至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少14个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少20个月、至少22个月或至少2年给药。在一些方面，可在所述受试者的整个生命周期中施用一或多剂加强剂，以维持保护性血清中和抗体效价。
在一些方面，本公开的组合物或疫苗被配制用于肌肉内(intramuscular，IM)或静脉内(intravenous，IV)给药。在某些方面，所述给药是肌肉内(intramuscular，IM)给药。在一些方面，将单次剂量的本文中所公开的组合物或疫苗肌肉内给药至上臂。
在某些方面，本公开的组合物或疫苗被配制及/或作为用于一次性给药的单次剂量给药。本公开的此方面与商业化的基于HPV、HEV及HAV VLP的疫苗，包括基于铝盐的佐剂形成对比，其各自作为多剂量给药(参见，例如，西米卡及加拉萨，Clin Immunol.2017；183：99-108)。
在某些方面，本公开的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的单次剂量(例如，一次性单次剂量、初次剂量及/或加强剂量)包括约6μg至200μg、约6μg至100μg，或约6μg至60μg(例如，约20μg至60μg，例如，约40μg)，例如配制在预填充注射器中，所述预填充注射器例如，用于约0.5mL至1.0mL的单次剂量体积(例如，约0.8mL)。在某些方面，本公开的组合物或疫苗的单次剂量(例如，一次性单次剂量、初次剂量及/或加强剂量)包括以下剂量的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)：约7.5μg/mL至75μg/mL、约12.5μg/mL至75μg/mL、25μg/mL至75μg/mL、37.5μg/mL至62.5μg/mL，或40μg/mL至60μg/mL。在某些实施例中，本公开的组合物或疫苗的单次剂量(例如，一次性单次剂量、初次剂量及/或加强剂量)包括以下剂量的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)：约25μg/mL、约50μg/mL，或约75μg/mL。在某些实施例中，本公开的组合物或疫苗的单次剂量(例如，一次性单次剂量、初次剂量及/或加强剂量)包括约50μg/mL剂量的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，所述的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)辅以铝佐剂，例如氢氧化铝凝胶(例如
Figure BDA0003613305600000341
)。在一些方面，所述氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000342
)的量为约100μg至500μg(例如，约300μg的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000343
))。在一些方面，本公开的组合物或疫苗的单次剂量(例如，一次性单次剂量、初次剂量及/或加强剂量)包括约250μg/mL至625μg/mL的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000344
)。在一些方面，所述单次剂量包括约375μg/mL的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000345
)。在一些方面，所述剂型是混悬剂，例如用于肌肉内给药。
在某些方面，本文中所公开的组合物或疫苗的单次剂量(例如，一次性单次剂量、初次剂量及/或加强剂量)包括以下的的体积：约0.5mL至5mL、约0.5mL至4mL、约0.5mL至4mL、约0.5mL至2mL，或约0.5mL至1mL。在一些方面，本文中所公开的组合物或疫苗的单次剂量包括约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL，或约1.0mL的体积。在一些方面，所述组合物或疫苗的单次剂量包括约6μg至60μg(例如，约20μg至60μg的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP))的量的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，所述组合物或疫苗包括约40μg的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。在一些方面，本公开的的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)可用铝佐剂，例如，氢氧化铝凝胶(例如
Figure BDA0003613305600000351
)作为佐剂。在一些方面，所述氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000352
)的量为约100μg至500μg(例如，约300μg的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000353
))。在一些方面，本公开的组合物或疫苗的单次剂量包括约40μg/约300μg的氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000354
)，其配制用于包括约0.5mL至1.0mL(例如，约0.8毫升)的单次给药剂量。
在某些方面，本文中所公开的组合物或疫苗的各个剂量可包括约6μg至约60μg(例如，约40μg)的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)、约100μg至500μg(例如，约300μg)的铝(例如，作为氢氧化铝佐剂)、约20mg至80mg(例如，约59.7mg)的蔗糖、约0.2mg至0.8mg(例如，约0.4mg)的磷酸二氢钾、约0.5mg至1.5mg(例如，约0.9mg)磷酸氢二钾、约1mg至10mg(例如，约5.9mg)的二水合柠檬酸钠及水，以用于注射。
在某些方面，本公开的组合物或疫苗以有效量给药。在一些方面，所述有效量是本公开的组合物或疫苗的量，其在7天内提供针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答及/或保护。在一些实施例中，所述有效量是通过单次剂量实现的。在一些实施例中，有效量是通过单次剂量及一或多次加强剂量实现的。
本文中所公开的方法亦包括一次性单次剂量以及多种初次剂量-加强剂量方案。在某些方面，可在一或多次初免免疫(priming immunization)之后进行一或多次加强免疫(boosting immunization)。对于各次免疫，免疫原性组合物或疫苗可相同或不同，且所述免疫原性组合物或疫苗的剂量、途径及制剂亦可变化。
使用方法：
本公开的某些方面涉及一种本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型的用途，提供主动免疫以预防或降低个体或群体因基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染所引起的疾病的风险。在一些方面，所述受试者是成人(例如，≥12岁)或儿童(例如，<12岁、6个月至<12岁、1岁至<12岁)。
本公开的某些方面提供一种用于在一受试者，特别是人类中诱导免疫应答的组合物及方法，其包括向所述受试者施用病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，所述病毒样颗粒包括基孔肯雅病毒(CHIKUNGUNYA VIRUS，CHIKV)多肽或其片段，其被配制用于诱导或增强免疫应答。在一些方面，免疫应答保护所述受试者免于受到基孔肯雅病毒(CHIKUNGUNYA VIRUS，CHIKV)感染或其炎症症状(例如，关节炎)。本文中所公开的免疫性组合物或疫苗的施用可用于治疗治疗已经经历基孔肯雅病毒(CHIKUNGUNYA VIRUS，CHIKV)感染的受试者，或可用于预防性地预防或降低基孔肯雅病毒(CHIKUNGUNYA VIRUS，CHIKV)感染的风险。
在某些方面，所述方法包括步骤：以有效量的本文中所公开的组合物、疫苗或剂型进行给药。在一些方面，所述有效量是本公开的组合物或疫苗的量，其在7天内提供针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答及/或保护。在一些实施例中，有效量是通过单次一次性剂量实现的。在一些实施例中，有效量是通过单次剂量及一或多次加强剂量实现的。在一些方面，在施用单次剂量或单次剂量及一或多剂加强剂后，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年，或至少2年。在一些方面，在施用单次剂量或单次剂量及一或多剂加强剂量后，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少30个月、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年，或20年或更长时间。在一些方面，在施用单次剂量或单次剂量及一或多剂加强剂后，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答在所述受试者的整个生命周期中持续存在。在一些方面，所述血清中和应答包括≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价。
在一些方面，本公开涉及一种在一受试者中诱导对基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的中和抗体应答的方法，所述方法包括步骤：包括向所述受试者施用本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型。在一些方面，所述中和抗体应答是针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的E1及/或E2蛋白。
本公开的某些方面涉及一种在一受试者中引起针对基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的免疫应答及/或保护性免疫的方法，所述方法包括步骤：向所述受试者施用本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型。在某些方面，免疫保护免于受到至少一种、多于一种或所有的基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)谱系(例如，ECSA、亚洲及/或西非的一种或多种)感染。
在一些方面，本公开内容涉及一种在一受试者中治疗、预防或降低基孔肯雅热(Chikungunya)感染的风险的方法，所述方法包括步骤：向有需要的受试者施用本文中所公开组合物、疫苗及/或剂型。在一些方面，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)疾病的保护是通过引起针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的E1及/或E2蛋白的中和抗体来提供的。
本公开的某些方面涉及一种在一受试者中引起针对基孔肯雅病毒(CHIKV)的免疫应答及/或保护性免疫的方法，所述方法包括步骤：向所述受试者施用组合物、疫苗及/或剂型，所述组合物、疫苗及/或剂型包括(a)病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的衣壳蛋白及包膜蛋白，其中单次剂量的组合物、疫苗及/或剂型包括约6μg至60μg(例如，约40μg)的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，且其中施用单次剂量的组合物、疫苗及/或剂型在施用后的7天内，在所述受试者中引起基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)特异性中和抗体的产生，及/或在向所述受试者施用单次剂量后的至少28天、至少6个月、至少1年，或至少2年，引起基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)特异性中和抗体的产生。在一些方面，所述基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)特异性中和抗体效价包括≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)。在某些方面，所述组合物、疫苗及/或剂型进一步包括佐剂(例如，铝佐剂)。在一些方面，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)特异性中和抗体是针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的E1及/或E2蛋白。
在一些方面，本公开内容涉及一种对一受试者或群体进行疫苗接种以抵抗基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)感染，包括步骤：向所述受试者或群体施用本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型。
在某些方面，本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型在施用后的7天内诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答，例如单次剂量施用。在一些方面，所述组合物、疫苗及/或剂型诱导针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的同源或异源的病毒株的抗体。在一些方面，在给药后，例如单次剂量给药，所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答持续至少21天、至少22天、至少28天、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少一年、至少18个月，或至少两年。在一些方面，在单次给药或单次给药及一或多次加强剂量给药后，所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答及/或保护性免疫持续至少1年、至少18个月、至少30个月、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年，或20年或更长时间。在一些方面，在施用单次剂量或单次剂量及一或多剂加强剂量后，所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答及/或保护性免疫在所述受试者的整个生命周期中持续。
在某些方面，在给药后的7天内，≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45或≥50(例如，≥40)的本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型诱导血清中和抗体效价，例如，通过基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)中和测定法在人血清中测量(例如，通过荧光素酶分析的(serum neutralizing antibodies，SNA))。在一些方面，≥40的血清中和抗体效价持续至少21天、至少22天、至少28天、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月，及/或至少2年。
在某些方面，在接种本文中所公开的组合物、疫苗，及/或剂型的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的受试者，在施用病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)之后的7天会产生针对基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)的中和抗体应答。在某些方面，在施用本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型后(例如，在单次剂量之后)，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％的群体维持血清中和抗体效价≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)至少21天、至少22天、至少28天、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月，及/或至少2年。在一些方面，在单次剂量之后，本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型维持血清中和抗体效价≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)至少1年、至少18个月、至少30个月、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年、15年，或20年或更长时间。在一些方面，在本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型的第一次单次剂量之后的至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少14个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少20个月、至少22个月，或至少2年，施用本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型的第二剂，例如加强剂。在一些方面，在本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型的第一次单次剂量之后的至少1年、至少18个月、至少30个月、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年、至少15年，或20年或更长时间，施用本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型的第二剂，例如加强剂。
在某些方面，在接种本文中所公开的组合物、疫苗，及/或剂型的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多的受试者，在施用所述含有病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的组合物、疫苗及/或剂型之后的7天具有血清转化(seroconversion)。在某些方面，在接种本文中所公开的组合物、疫苗，及/或剂型的60％至99％、60％至98％、65％至98％、70％至98％，或74％至98％的受试者，在施用所述含有病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的组合物、疫苗及/或剂型之后的7天具有血清转化(seroconversion)。在某些方面，在接种本文中所公开的组合物、疫苗，及/或剂型的至少％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多的受试者，在施用所述含有病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的组合物、疫苗及/或剂型之后的第25天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天，或第30天具有血清转化(seroconversion)。在某些方面，免疫应答持续至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月，或至少24个月。
在某些方面，所述中和抗体应答使受试者针对以下的病毒的多种血清型、基因型或谱系进行疫苗接种：基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)(ECSA(例如，坦桑尼亚1953、印度2000、马来西亚2008)、亚洲(例如，圣马丁2013、印度尼西亚2007)及西非(例如，尼日利亚1965、塞内加尔2005、塞内加尔1983))。在一些方面，所述中和抗体应答是≥75％IgG3、≥80％IgG3、≥85％IgG3，或≥90％IgG3。
在某些方面，针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答在施用单次剂量后持续至少28天、6个月、一年、18个月，或两年。在某些方面，所述组合物或疫苗的第二(加强剂)剂量在较早的单次剂量后约28天、约3个月、约6个月、约一年、约18个月，或约2年施予所述受试者。在一些方面，由单次剂量提供的中和抗体应答持续至少1年。在一些方面，第二剂(加强剂)不在接受初始剂量后的9个月、12个月、18个月、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年，或5.5年内给药。
在某些方面，所述针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答在施用第二剂后持续至少约六个月、至少约1年、至少约18个月，或至少约两年。
在某些方面，在施用单次剂量的本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型后的7天内，个体产生≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价。在某些方面，在施用单次剂量的所述组合物、疫苗及/或剂型后，个体维持≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价至少约一年或约两年。在某些方面，在施用单次剂量的所述组合物、疫苗及/或剂型后，在所述受试者的整个生命周期中，个体≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45或≥50(例如，≥40)的维持血清中和抗体效价。
在某些方面，在施用单次剂量的本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型后的7天内，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％，或至少98％的经接种疫苗的群体产生≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价。
在某些方面，在施用单次剂量的所述组合物、疫苗及/或剂型后，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％，或至少98％的经接种疫苗的群体维持≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45，或≥50(例如，≥40)的血清中和抗体效价达1年或2年。
在某些方面，在施用单次剂量的本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型后的7天内、28天、6个月、9个月、一年、18个月或两年内，所述血清应答率为至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％，或至少98％。
在一些方面，本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型可作为联合疗法的一部分进行给药。例如，本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型可与其他的免疫原性组合物、抗病毒剂及/或抗生素共同施用或配制。本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型可与另一种免疫原性组合物、抗病毒剂、抗生素，或预防或治疗基孔肯雅热(Chikungunya)感染的任何其他药剂的同时、之后或依次进行给药。
基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKVVLP)疫苗生产：
本公开的某些方面涉及一种制备及配制本文中所公开的病毒样颗粒(virus likeparticle，VLP)作为免疫原性组合物或疫苗。
可制备重组构建体，并将其用于转染(transfect)、感染或转化(transform)，且可将包括本文所述的彼等的病毒蛋白表达至真核细胞及/或原核细胞中。因此，本公开提供宿主细胞，所述宿主细胞包括载体(或多种载体)，所述载体含有编码基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构基因的核酸，所述结构基因包括衣壳、E3、E2、6K及E1或其部分，及/或上述任何嵌合分子，且允许在可形成病毒样颗粒(virus like particle，VLP)的条件下，在所述宿主细胞中表达基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构基因，包括衣壳E3、E2、6K和E1，或其部分，及/或本文中所述的任何嵌合分子。
在某些方面，包含本公开的一或多种基孔肯雅病毒(CHIKUNGUNYA VIRUS，CHIKV)多肽(例如CHIKV C、E1及E2蛋白)的非感染性重组病毒样颗粒(virus like particle，VLP)可通过合适的宿主细胞进行转化或转染来产生，所述宿主细胞具有含有编码多肽的核酸分子或其片段的表达载体。在某些方面，编码多肽的核酸分子可包括序列，所述序列与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或其任意组合具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％的同一性。
在某些方面，本公开的病毒样颗粒(virus like particle，VLP)通过利用用表达质粒转染HEK293细胞或源自HEK293细胞的细胞(例如，VRC293细胞)产生，所述质粒编码一种或多种基孔肯雅病毒(CHIKUNGUNYA VIRUS，CHIKV)结构蛋白基因(例如，C、E3、E2、6K及/或E1基因)。所述经表达的蛋白质可自组装成病毒样颗粒(virus like particle，VLP)，之后从细胞培养基中收获及纯化。在某些方面，可通过超滤、渗滤及阴离子交换色谱法纯化病毒样颗粒(virus like particle，VLP)，之后进行无菌过滤。在一些方面，所述病毒样颗粒(virus like particle，VLP)可与适量的制剂缓冲液混合，且之后吸附在无菌氢氧化铝佐剂(例如，氢氧化铝凝胶(例如，
Figure BDA0003613305600000431
)2％)上。在某些方面，配制的病毒样颗粒(virus like particle，VLP)不含防腐剂或抗生素。
VRC293细胞是源自人类胚肾(human embryonic kidney，HEK)293细胞(例如，来自ATCC)。所述HEK293细胞适合在无动物CD293培养基中的悬浮培养中进行生长。
在某些方面，本文公开的病毒样颗粒(virus like particle，VLP)是通过利用编码基孔肯雅病毒(CHIKUNGUNYA VIRUS，CHIKV)结构基因的DNA质粒瞬时转染VRC293细胞所产生。在一些方面，在纯化之后，病毒样颗粒(virus like particle，VLP)可被稀释至含有蔗糖的柠檬酸盐缓冲液中，并填充至单次剂量的玻璃小瓶或预填充注射器中，以形成最终的药物产品。
更具体地，制备过程可分为两个主要阶段：上游生产(细胞生长及抗原表达)及下游纯化。在第一步中，所述VRC293细胞可从工作细胞库(working cell bank，WCB)中进行扩增。之后利用编码基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)结构蛋白(衣壳、E1、E2、E3及6K)的表达质粒转染所述细胞。在一些方面，所述表达质粒包括SEQ ID NO：1的序列。本公开的某些方面涉及一种WCB或稳定细胞株(例如，HEK293或HEK293衍生的细胞)，所述WCB或稳定细胞株表达本公开的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)。
在某些方面，基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)药物物质包括三种重组CHIKV结构蛋白：(衣壳/核心)(约35kDa)、包膜1(Envelope 1，E1)(约55kDa)及包膜2(Envelope2，E2)(约50kDa))。在某些方面，所述三种蛋白质在VRC293细胞中共表达，并自组装形成从培养基中所收获的包膜的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)。所述基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)是非传染性及非复制性的，但在向免疫系统呈递抗原方面的结构上类似于亲本病毒。在VRC293细胞中生产后，可从培养基中纯化基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)，例如，通过柱层析、超滤/渗滤(ultrafiltration/diafiltration，UF/DF)及直流过滤(direct-flowfiltration)步骤的组合。在某些方面，基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)包括衣壳、E1及E2蛋白，所述衣壳、E1及E2蛋白的量是存在于基孔肯雅病毒的病毒样颗粒中的总基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)蛋白的至少95％、至少96％，或至少97％。
在一些方面，最终的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)药物物质包括可在≤-60℃下储存的无菌水溶液。在某些方面，所述产品储存在-45℃至-10℃。在一些方面，所述组合物或疫苗被配制成悬浮液，且在使用前储存在2℃至8℃(36°F至46°F)的容器(例如，小瓶或预填充注射器)中。在某些方面，所述基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)可在室温下储存至少或最多约6小时、至少或最多约12小时、至少或最多约18小时，或至少或最多约24小时。在某些方面，所述基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)可在2℃至8℃下储存至少或最多约12小时、至少或最多约24小时、至少或最多约7天，或至少或最多2周。在某些方面，所述基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)可-45℃至-10℃下储存至少或最多约3个月、至少或最多约6个月、至少或最多约9个月、至少或最多约12个月、至少或最多约12个月、至少或最多约2年。
在某些方面，可将所述基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)药物物质的无菌水性缓冲溶液以40±10μg/mL填充至单次剂量小瓶中。在一些方面，所述小瓶具有约0.8mL的标称填充体积，以允许提取约0.5mL。
在一些方面，所述药物物质与佐剂一起配制，并填充至预填充注射器(例如，第I型玻璃鲁尔锁预填充注射器)中。所述药物产品的制备可作为无菌填充完成过程进行。
在某些方面，所述预填充注射器包括本文中所公开的组合物或疫苗，例如，组合物或疫苗包括约6μg至约60μg(例如，约40μg)的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)、约100μg至500μg(例如，约300μg)的铝(例如，作为氢氧化铝佐剂)、约20mg至80mg(例如，约59.7mg)的蔗糖、约0.2mg至0.8mg(例如，约0.4mg)的磷酸二氢钾、约0.5mg至1.5mg(例如约0.9mg)的磷酸氢二钾、约1mg至10mg(例如约5.9mg)的二水合柠檬酸钠和水，以用于注射。
试剂盒：
本公开的某些方面涉及一种药物试剂盒，所述药物试剂盒包括一或多个容器，所述容器填充有本文中所公开的组合物、疫苗或剂量制剂的一种或多种成分。在一些方面，所述试剂盒包括两个容器，其中一容器包括病毒样颗粒(virus like particle，VLP)，另一容器包括佐剂。在一些方面，所述试剂盒包括单个容器(例如，预填充注射器或小瓶)，所述容器包括病毒样颗粒(virus like particle，VLP)及任选的佐剂。与此种容器相关的信息可由监管药品或生物制品的制备、使用或销售的政府机构规定，其通知书反映通过制备、使用或销售的机构对人类给药的批准。
在某些方面，组合物、疫苗及/或剂型(例如，一次性单次剂量、初始剂量或加强剂量)是以液体形式提供，例如，以适当浓度的悬浮液用于对一受试者给药(例如，肌肉内给药)。
本公开的某些方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括本公开的组合物、疫苗及/或剂型(例如，在预填充注射器中)及使用说明书。
在某些方面，所述试剂盒包括第一容器及第二容器，所述第一容器包括含有本文中所公开的含有病毒样颗粒(virus like particle，VLP)的组合物、疫苗及/或剂型，所述第一容器包括佐剂(例如，铝佐剂)，以及说明书，以用于组合所述多个容器，并将混合物施用于一受试者。
在某些方面，所述试剂盒包括容器(例如，小瓶或预填充注射器)，所述容器包括本文中所公开的组合物、疫苗及/或剂型，其包括病毒样颗粒(virus like particle，VLP)及佐剂(例如，铝佐剂)，以及说明书，以对一受试者施用所述组合物、疫苗及/或剂型。
在某些方面，所述试剂盒包括用于肌内给药的无菌悬浮液，其可在小瓶或单次剂量预填充注射器中获得(包括约0.5mL至1.5mL(例如，约0.8mL)的体积)。在某些方面，各个剂量包括约6μg至约60μg(例如，约40μg)的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)、约100μg至500μg(例如，约300μg)的铝(例如，作为氢氧化铝佐剂)、约20mg至80mg(例如，约59.7mg)的蔗糖、约0.2mg至0.8mg(例如，约0.4mg)的磷酸二氢钾，约0.5mg至1.5mg(例如，约0.9mg)的磷酸氢二钾、约1mg至10mg(例如，约5.9mg)的柠檬酸钠二水合物，及水，以用于注射。
实例
实例1：基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的制备制备含有基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白(衣壳(C)、E3、E2、6K及E1)的编码序列的质粒。所述质粒是从3744个碱基对的合成基因(SEQ ID NO：2)所制备，所述合成基因编码五个基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构基因：衣壳(核心)、E3、E2、6K及E1病毒株37997。将基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)基因插入至质粒的方向与基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)基因组相同。所述合成基因利用XbaI及BamHI限制性核酸内切酶位置进行构建。通过利用XbaI及BamHI限制性核酸内切酶消化所述载体，以将此基因插入表达载体的多克隆位置。此载体利用人类巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)早期立即启动子/增强子及人类T细胞白血病病毒第1型的5’长末端重复序列的调节性R区域，以在人类细胞中有效及高水平地表达感兴趣的基因。
本实例中的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)是通过利用编码基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白基因(C、E3、E2、6K及E1基因)的表达质粒转染VRC293细胞(源自人类胚肾(human embryonic kidney，HEK)293细胞)所产生。所述表达的蛋白质自组装成病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，之后从细胞培养基中收获及纯化。蛋白质在CMV IE启动子的控制下进行表达。所述6K肽以少量并入甲病毒病病毒体(virion)中，但未通过低温电子显微镜在病毒体结构中进行鉴定。通过蛋白质印迹或其他的技术在纯化的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)中未检测到6K及E3蛋白。
通过超滤、渗滤及阴离子交换色谱法纯化病毒样颗粒(virus like particle，VLP)，之后进行无菌过滤。简而言之，最初的纯化步骤是超滤/渗滤(Ultrafiltration/Diafiltration，UF/DF)制程，以浓缩所述基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)，之后将浓缩的材料渗滤至1XSP缓冲液(10mM的磷酸钾，218mM的蔗糖，pH 7.0)中进行进一步纯化，同时从澄清的收获物中去除杂质。所述制程通过切向流过滤(tangential flow filtration，TFF)进行。
接下来，将经浓缩及渗滤的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)应用于阴离子交换色谱柱。此步骤去除宿主细胞蛋白及宿主细胞脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic，DNA)。在层析过程中，利用一洗涤步骤以减少产物中残留的宿主细胞DNA的尺寸及浓度。通过利用25mM的柠檬酸钠来增加缓冲液的离子强度，将基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKVVLP)从柱中洗脱。所述制程在室温下进行。
接下来，将从阴离子交换柱洗脱的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)对5至7倍体积的1XSP缓冲液进行渗滤。所述经渗滤的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)材料在无跨膜压力(transmembrane pressure，TMP)的情况下再循环3至15分钟，之后进行收集。此步骤用于去除任何剩余的残留洗涤溶液，并降低其他宿主细胞杂质的水平。最后，在渗滤之后，将基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)产品进行膜过滤至无菌的一次性容器中，以形成药物物质。收集样品以用于释放测试，并将基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)药物物质储存在≤-60℃。
实例2：基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的表征
根据实例1的方法所制备的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)的尺寸利用DLS进行确定，所述DLS亦称为光子相关光谱(photon correlation spectroscopy，PCS)或准弹性光散射(quasi-elastic lightscattering)，其是用于检测在亚微米尺寸范围内的分子及颗粒的尺寸的成熟技术。通过DLS检测的参数是流体动力学半径，且可被定义为与被检测粒子具有相同的扩散系数的球形粒子的半径。此等研究利用纳米粒度仪(Zetasizer Nano)(马尔文)(Malvern)进行。此仪器检测的颗粒直径范围为0.6nm至6μm。DLS检测是使用一次性小容量比色管进行。对于此等研究，来自六个批次的原料药的样品未经稀释直接加入比色管中。所述6个批次的平均直径结果如表2所示。对应于主峰的平均直径的z平均尺寸为63nm至67nm。低PDI表明经纯化的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)在尺寸上相对均匀。通过DLS所获得的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)的尺寸与在开发多个批次上进行的低温电子显微镜(40nm至60nm)及TEM(70nm)所获得的数值一致。此等结果亦与已知在60nm至70nm的范围内的甲病毒病毒体的尺寸一致。
表2.通过DLS对基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)的颗粒尺寸的评估
Figure BDA0003613305600000491
Figure BDA0003613305600000501
接下来，在还原及变性条件下，对基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)进行SDS-PAGE分析，并显示3个主要条带。使用MALDI-TOF质谱法确认在图2中显示为1、2及3的3个主要条带，所述条带分别对应于来自基孔肯雅病毒的3个结构蛋白：衣壳、E2及E1。如图2中的条带4所示，在SDS-PAGE中略大于E1(在E1上方流动)的次要污染物被确定为HSP70 1A。
从胰蛋白酶消化的衣壳、E1及E2条带所获得的MS光谱数据显示在图3A至图3C中。此外，针对宿主细胞蛋白(HSP70 1A)所获得的MS光谱数据显示在图3D中。通过将检测的质量与预期的质量相匹配，以实现针对衣壳、E1及E2结构蛋白所获得的片段的序列评估。
开发了一种RP-HPLC分析来确定在基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)中的结构蛋白E1、E2及衣壳的百分比。将100μL未稀释的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKVVLP)等分试样加载至Xbridge BEH300 C4 HPLC柱(3.5μm，4.6x 150mm)上。所述柱保持在60℃。所述HPLC的流动相A含有水及0.1％TFA，及流动相B含有30％乙腈、70％异丙醇及0.03％TFA。利用流动相B的梯度，从0％至100％在60分钟内以1mL/min的流速洗脱蛋白质。通过使用激发波长为280nm及发射波长为350nm的荧光检测器检测经洗脱的蛋白质。图4显示注射100μL的未经稀释的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)的RP-HPLC曲线。通过RP-HPLC分析所获得的3个主峰通过SDSPAGE被确认为衣壳、E1及E2(图5)。收集保留时间为23.6分钟(峰1)、40.0分钟(峰2)，及45.2分钟(峰3)的RP-HPLC峰。
证实三个峰是衣壳、E1及E2，且其构成>97％的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus，CHIKV)蛋白。通过将相应的蛋白质的峰面积除以C+E1+E2的总峰面积，以计算各个衣壳、E1及E2蛋白质的百分比。对于100μL未经稀释的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)，所观察到的C、E1及E2的百分比分别为35％、29％及36％。经计算的C、E1及E2的百分比来自在变性条件下的各种蛋白质组分的荧光信号。此等数值接近衣壳、E1及E2的1：1：1的比率。
使用负染色电子显微镜来分析经纯化的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)的形态。对于此等研究，通过将未经稀释的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKVVLP)与已知浓度的100nm乳胶珠粒进行混合，之后将混合物施用于硝酸纤维素支撑的400目铜网格，以制备样品。让所述样品附着在网格上，之后利用磷钨酸溶液(钠盐)进行染色。使用配备有FEI Eagle 4K x 4K CCD相机的FEI Tecnai T12电子显微镜，在120KeV下运行，通过电子显微镜分析网格。图像以15,000倍(0.71纳米/像素)的标称放大倍率进行拍摄。最显着的结构，占总颗粒的95％以上，对应于完整的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)，其形态类似于基孔肯雅病毒(图6A)。所述完整的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)呈现近似球形，具有刷状边框及实心的中心。所述基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunyavirus virus-like particle，CHIKV VLP)的尺寸与已知的甲病毒的尺寸密切相关，所述甲病毒的病毒体的范围为60nm至70nm。
使用低温电子显微镜，在不存在传统电子显微镜所需的染色剂或固定剂的情况下，以水合状态观察样品。基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)的样品通过在由400目碳上的多孔碳膜支撑的玻璃冰中快速冷冻，并储存在液态氮下直至成像为止，以制备用于低温电子显微镜检查。使用将网格保持在≤-170℃的载物台，将玻璃冰网格转移至电子显微镜(FEI Tecnai T12、120KeV、FEI Eagle 4Kx 4K CCD相机)。以52,000倍(0.21纳米/像素)及21,000倍(0.50纳米/像素)的标称放大倍率获取各个网格的图像。通过低温电子显微镜分析检验基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)(图6B)证实所述制剂包括尺寸及形状均一的具有刷状边界的病毒样颗粒，且似乎具有高度的对称性。根据病毒样颗粒(virus like particle，VLP)的结构，颗粒的直径估计为40nm至60nm。裸病毒样颗粒(viruslike particle，VLP)(无包膜刺突的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP))更小，即，≈40nm，及完全形成的成熟病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)为≈60nm。此等粒子的形态适用于2D平均，并可能适用于3D重建。所述E1及E2糖蛋白被组织成240个异二聚体，此等异二聚体又被组装成80个糖蛋白刺突。
所述基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)的N-聚糖谱通过利用2-氨基苯甲酰胺(2-aminobenzamide，2AB)衍生PNGase切割的聚糖，并在具有荧光检测的正相(normal-phase，NP)HPLC上分离所述衍生的聚糖来确定。LC-MS分析已确定在基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)中的寡甘露糖、杂合及复杂的N连接的聚糖结构。
开发一种夹心型ELISA，其检测基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)结构上的中和表位的浓度及/或确认，以用作效力分析。此分析使用两种不同的单克隆抗体进行捕获及检测。此等抗体、捕获及检测是通过利用经纯化的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)免疫小鼠，并在ELISA中针对经纯化的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)筛选杂交瘤而制备。随后在基于报告基因的中和分析中使用假型慢病毒载体分析通过ELISA在初步筛选中识别病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)的抗体中和基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)的能力。捕获及检测抗体皆为中和抗体。所述检测抗体偶联至HRP。通过ELISA确定参考标准批次及六个基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)样品的抗原性。使用Spectramax M5读取器在450nm处检测吸光度。将得到的光密度绘制为蛋白质浓度的函数，并产生标准曲线。
参考标准批次及两个GMP批次的结果显示在图中。当光密度被绘制为基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)浓度的函数时，所有的批次的稀释曲线具有相似的斜率，且观察到50％响应的稀释度。此等数据表明由当前的制备过程所生产的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)在抗原性方面展现良好的批次间的一致性。
类似地，对于参考标准批次所产生的剂量应答曲线是用于计算基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)的四个GMP批次中的各个的效力(CHIKV VLP免疫反应性)数值。对于各个批次，使用落在标准曲线呃线性范围内的单一稀释度，从标准曲线确定效力(免疫反应性)数值。此等结果连同各批的蛋白质浓度及通过ELISA得到的效力的比率(CHIKV VLP免疫反应性)列于表3中：通过BCATM得到的蛋白质浓度。参考标准批次的效力(免疫反应性)被指定为与通过BCATM所检测的蛋白质浓度相当的数值。ELISA的数值与蛋白质浓度的比率提供各单位质量的效力(免疫反应性)的量度。
表3.基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)药物物质批次的效力(免疫反应性)
Figure BDA0003613305600000541
实例3：基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)在食蟹猴中的功效
基孔肯雅热(Chikungunya)疾病的非人类灵长类(non-human primate，NHP)动物模型(利用用CHIKV病毒株LR2006-OPY刺激的食蟹猴)是用于评估基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)疫苗，例如免疫原性及功效。简而言之，非人类灵长类动物(non-human primate，NHP)受到三剂CHIKV LR2006-OPY1(106、107、108个噬菌斑形成单位(plaque forming unit，PFU))的刺激。所有的三种剂量皆在刺激后的10天内诱发临床症状，所述临床症状包括病毒血症、关节痛、发烧及厌食。每天在感染动物的血浆及组织中通过噬菌斑分析(用于检测传染性病毒)及qRT-PCR(用于检测病毒的RNA)，在刺激后7天及在安乐死当天，刺激后10天1检测病毒血症。虽然在10天的监控期间，受刺激的动物并无关节痛的外在迹象，但在组织学检验中，关节及周围组织的炎症很明显。开发一个评分系统来检测所观察到的炎症及退化程度(表4)。三种剂量之间检测的疾病参数并无显着差异。基于三个剂量之间病毒血症及关节积液的相似性，以及在最高剂量下对支持性护理的需求的增加，选择107个PFU的剂量用于未来的研究。
表4.经基孔肯雅热(Chikungunya)感染的食蟹猴关节及滑膜病理学评分系统
Figure BDA0003613305600000551
食蟹猴利用基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)(1.25μg、6μg或20μg)与明矾(300μg)、单独的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)(20μg)，或单独的明矾，之后利用CHIKV LR2006-OPY1(107个PFU)进行免疫两次。
结果显示，如通过藉由荧光素酶活性降低量化的感染性抑制分析(CHIKV-Luc)所检测，所有三种剂量的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，包括不含明矾的20μg，皆诱导免疫应答。单次免疫后观察到强烈的血清中和抗体(serum neutralizing antibody，SNA)应答(图8)。相较于不含明矾的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)疫苗(20μg剂量；参见图8)，明矾的添加增加刺激前SNA效价。此外，如通过对来自受刺激动物的血清的噬菌斑分析所检测，疫苗接种保护非人类灵长类动物(non-human primate，NHP)免于病毒血症(图9A至图9B)。在接种疫苗的动物中的任何时间点皆未观察到传染性病毒。
关节病理分数证明利用病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)接种疫苗，以剂量依赖性方式保护非人类灵长类动物(non-human primate，NHP)免受关节浸润(图10A至图10B)。通过RT-PCR分析，4个对照非人类灵长类动物(non-human primate，NHP)中的3个显示在所有分析的组织中具有可测量的RNA，而利用病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)接种的非人类灵长类动物(non-human primate，NHP)具有显着更少的病毒RNA(图11A至图11D及表5)。相较于疫苗接受者(1.25μg、6μg、20μg CHIKV-VLP+明矾、20μg CHIKV-VLP)，仅接受明矾(0μg CHIKV-VLP+明矾)的动物组织的vRNA/g显着更高。在此非人类灵长类动物(non-human primate，NHP)研究中，不同活性的CHIKV VLP疫苗组之间并未观察到差异。总之，此等数据表明疫苗接种诱导的血清中和抗体(serum neutralizing antibody，SNA)可保护非人类灵长类动物(non-human primate，NHP)在病毒刺激后免于产生基孔肯雅热疾病。
表5.个别的血清中和抗体(serum neutralizing antibody，SNA)效价关节病理分数级组织记录拷贝vRNA/g
Figure BDA0003613305600000561
实例4：人类基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)的安全性及免疫原性(第2阶段)
开发第2期临床试验，以检查基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)疫苗在人体中的安全性及免疫原性。选择400名年龄介于18与60岁之间的患者。所述试验是随机、双盲、安慰剂对照的，且各组进行平行研究。此等患者是CHIKV初始者，或是CHIKV暴露者，且来自加勒比地区(波多黎各、多米尼加共和国、海地、马提尼克岛及高德罗普岛)的CHIK流行地区。CHIKV初始者的患者被归类为第0周时效价<15的患者。患者在第0周及第4周接受肌肉注射20μg的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)。主要终点是第8周的血清转化(seroconversion)及第18个月的随访(通过两个CHIKV季节)。
对于此研究，在治疗组及安慰剂组中约30％的受试者中，检测到基线血清中和抗体(serum neutralizing antibody，SNA)。在基线无血清中和抗体(serum neutralizingantibody，SNA)的受试者中观察到高应答率。20μg的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)诱导的抗体应答与对天然抗原的应答相当。基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKVVLP)组在第8周时95％CI的效价与CHIKV暴露的基线效价的范围重叠。在第8周时，经基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)治疗的患者的应答率为99.5％，而安慰剂组的应答率为20.8％，p值<0.001。阳性免疫应答定义为SFV-OPY1-GFP EC50值大于或等于30。在第8周时，相较于GMT为42.8(31.7-57.9)，经基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)治疗的患者的GMT为2004.5(1680.1-2391.5)，p值<0.001。患者在接种疫苗后的第72周内保持免疫应答(图12及表6)。未观察到在CHIKV初治与CHIKV暴露之间存在明显的安全性差异。
表6.接受基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-likeparticle，CHIKV VLP)的CHIKV初治患者的效价。
Figure BDA0003613305600000581
实例5：基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)疫苗稳定性
将基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)疫苗制备为无菌水性缓冲溶液，将0.8mL的浓度为40+/-10μg/mL的疫苗充填入单次剂量3mL的玻璃小瓶中。制剂缓冲液包括218mM的蔗糖、10mM的磷酸钾、25mM的柠檬酸钠及水，以用于注射。将小瓶储存在-45℃至-10℃的非无霜冰箱中，并用于肌肉内给药。小瓶仅供一次性使用，且不含防腐剂。
进行的稳定性研究的结果显示疫苗在冷藏及室温下，在注射器中稳定8小时(数据未显示)。
亦得到储存在-45℃至-10℃下的毒理批次通过6个月的稳定性结果。通过外观、pH、蛋白质浓度、SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA及动态光散射对样品进行分析，并以3个月的间隔进行分析，最长1年，之后每6个月分析一次，最长2年，之后每年分析一次。此外，每年皆会分析容器密封完整性。在6个月的时间点并未观察到产品不稳定或降解的证据。
实例6：基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)疫苗在人体中诱导中和抗体应答
利用6μg至40μg剂量的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)且无明矾的第1剂量及第2剂量方案，设计另外的第2期临床研究。在此研究中，415名年龄介于18岁与45岁之间的患者被随机分配至八个治疗组中。亦包括进行血浆分离术及白细胞分离术的第9组(此处未显示数据，参见实例8)。
第1组：在第1天及第29天，按照标准2次剂量方案的无佐剂的20μg剂量
第2至7组：在标准或短(第15天及第29天)2次剂量方案上的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)的各种佐剂剂量(6μg、10μg及20μg)。
第8组：第29天的单次佐剂的40μg剂量。
为了维持跨治疗组的盲法，在第1天对短期及单次剂量方案的受试者施用安慰剂，在第15天对标准及单次剂量方案的受试者施用安慰剂。所有的受试者皆在第29天接受基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)。研究设计的总结显示在图13及表7中。
表7.使用及不使用明矾的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)剂量及时间表研究设计
Figure BDA0003613305600000591
Figure BDA0003613305600000601
unadj.＝无佐剂；adj.＝以300μg
Figure BDA0003613305600000602
作为佐剂施用
对改良的意向治疗(modified intent-to-treat，mITT)群体(n＝412)进行免疫原性分析，所述群体包括接受治疗，且对基线(第1天)及至少1个研究样本具有可评估的免疫原性结果的所有随机的受试者。
在第1、8、15、22、29、36、57、182及365天，使用基于CHIKV-Luc萤光素酶的微量中和分析在所有组中评估血清中和抗体(serum neutralizing antibodies，SNA)。使用80％中和(NT80)的截去值确定效价。在各个时间点计算几何平均效价(geometric mean titers，GMT)，以及在15、40、60、80、100、160及640的阈值或以上展现NT80的受试者的百分比。通过对几何平均效价(geometric mean titers，GMT)的方差分析及对达到各种阈值定义的受试者的分类百分比进行Fisher的精确测试，在第1天后的所有时间点，在第1组与所有的其他组之间进行统计比较。
在整个研究过程中，治疗耐受性良好，并未发现明显的疫苗相关的安全性问题。疫苗接种后患者的第二次中期分析显示，至第8天(在7天内)，高达98％的患者产生针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的中和抗体应答(图14)。一次给药后的7天内，74％至98％的受试者发生血清转化。在最后一次给药后28天，所有的受试者皆观察到血清转化。通过六个月的访问，此种免疫应答被证明是持久的。
还在接种后第365天分析血清中和作用。除了第5组中的一名受试者之外，所有的受试者在第1天注射前具有低于检测下限的CHIKV-Luc SNA效价(图15及表8)。在第一次主动注射后的7天(即第1至4组的第8天、第5至7组的第22天及第8组的第36天)在所有组中观察到免疫应答。此等早期时间点的GMT的范围从第2组的34.0至第8组的157.9。在第1至4组中，第一个峰值GMT出现在第22天(第一次主动注射后的21天)。第2、3及4组的GMT峰值分别为327.5、1286.7及2123.4，显示出剂量应答效应。此外，第4组的GMT峰值高于第1组的GMT峰值696.5
(p<0.0001)，表明明矾的辅助作用。在第5至7组中，第22天及第29天的GMT亦显示出剂量应答。此等GMT结果进一步总结在图17中。单次40μg剂量(第8组)具有最佳的应答持续时间。
表8.通过组及时间点的CHIKV-Luc SNA几何平均效价
Figure BDA0003613305600000621
在第二次给药后，第二个GMT峰值出现在第36天，再次证明剂量应答。第36天的GMT亦高于所有2剂组中的所有早期的GMT，表明对第二剂的记忆应答的强度。在第57天，即所有组最后一次主动注射后的28天，第1组的GMT为1946.0。佐剂组的GMT范围从第5组的914.0至第4组的1884.4，第8组具有第二高的GMT，为1711.8。从第57天至第182天，所有组的GMT皆下降，此时其范围从第2组的191.至第8组的462.5。在第365天，所有组的GMT进一步下降，除了第8组之外，其GMT为466.2，高于第1组的GMT为244.8(p＝0.0058)。所有组在第365天的效价的反向累积分布如图16所示。最高的效价出现在第8组。此等结果表明相较于第1至7组及第9组，第8组(单次剂量40μg/adj.)在365天的期间保持最高效价，其分别给药两次剂量。
使用40或更大的阈值NT80进行血清应答率(seroresponse rate，SR)的分析。此阈值是基于分析比较及流行病学数据而被选择。具有CHIK-Luc血清阳性≥40(表9)、≥160(表10)，及≥640(表11)的患者显示血清应答结果。计算得到的各组中的针对基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)中和效价(NT80)≥15及≥40的受试者的百分比分别显示在图18A及图18B中。
表9.通过组及时间点的血清应答率(NT80≥40)
Figure BDA0003613305600000631
表10.CHIKV-Luc血清阳性≥160的受试者的百分比
Figure BDA0003613305600000632
Figure BDA0003613305600000641
表11.CHIKV-Luc血清阳性≥640的受试者的百分比
Figure BDA0003613305600000642
在第一次主动注射后的7天，血清应答率(seroresponse rate，SR)范围从第2组的40.0％至第8组的86.0％。第4组的77.6％的血清应答率(seroresponse rate，SR)在数值上高于第1组的60.4％的血清应答率(seroresponse rate，SR)，与GMT结果显示的辅助作用一致，但缺少统计学意义(p＝0.0872)。第1组及第4组在第22天达到100％的血清应答率(seroresponse rate，SR)。第8组在第一次注射后并无类似的第21天的时间点进行比较。第8组在一次给药后的第7天的血清转化率最高。
在第57天，除了第1组(98.0％)及第3组(97.9％)之外，所有组的血清应答率(seroresponse rate，SR)皆为100％。到第182天，一些组的血清应答率(seroresponserate，SR)下降，范围从第2组的90.9％至第1、4及5组的100％。第8组的血清应答率(seroresponse rate，SR)为95.9％。从第182天至第365天，所有组的血清应答率(seroresponse rate，SR)皆下降，范围从第2组的85.0％至第5组的97.6％。第8组的血清应答率(seroresponse rate，SR)为95.6％，略低于第182天。
使用更严格的阈值640对血清应答率(seroresponse rate，SR)进行额外的分析。第一次注射后7天的血清应答率(seroresponse rate，SR)范围从第6组的3.8％至第8组的18％。在第57天，血清应答率(seroresponse rate，SR)范围从第5组的60.8％至第4组的91.8％。第8组的血清应答率(seroresponse rate，SR)为88.0％。到第182天，所有组的血清应答率(seroresponse rate，SR)皆下降，范围从第2组的11.4％至第8组的44.9％。到第365天，所有组血清应答率(seroresponse rate，SR)再次下降，但仅在第8组中最低，达到44.4％。第8组在第365天的GMT最高，从第182天的降幅最小。
总而言之，此等数据显示免疫应答持续至第365天。接种组在40的阈值处具有高(85％)的第365天血清阳性。
实例7：用于人体临床研究(第3阶段)的剂型
如实例1所述，通过用编码基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)结构蛋白基因的表达质粒转染HEK293细胞产生基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virusvirus-like particle，CHIKV VLP)。简而言之，经表达的蛋白质自组装成病毒样颗粒(virus virus-like particle，VLP)，之后从细胞培养物中收获及纯化。通过超滤、渗滤及阴离子交换色谱纯化病毒样颗粒(virus virus-like particle，VLP)，之后进行无菌过滤。将病毒样颗粒(virus virus-like particle，VLP)与适量的制剂缓冲液混合，之后吸附在无菌氢氧化铝佐剂(
Figure BDA0003613305600000661
2％)上。
将具有氢氧化铝佐剂的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)配制成用于肌肉内给药的无菌悬浮液，其可在0.8mL单次剂量预填充注射器中获得。各0.8mL的剂量包括约40μg的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒(Chikungunya virus virus-like particle，CHIKV VLP)、300μg的铝(作为氢氧化铝佐剂)、59.7mg的蔗糖、0.4mg的磷酸二氢钾、0.9mg的磷酸氢二钾、5.9mg的二水合柠檬酸钠、及水，以用于注射。所述疫苗不含防腐剂或抗生素。
对于此研究，所述疫苗将作为单次0.8mL剂量的肌肉内给药。疫苗应在上臂三角肌区域进行肌肉注射。
将在一随机、多中心、安慰剂对照临床研究中评估12岁至64岁的受试者的有效性，此研究是比较施用1剂的CHIKV-VLP+明矾疫苗或安慰剂后的血清中和抗体(serumneutralizing antibodies，SNA)应答。所述研究将在美国进行，并按年龄分层(12岁至17岁、18岁至45岁及46岁至64岁)。此研究将招募大约3150位参与者，其被随机分配接受一剂CHIKV-VLP+Alum疫苗(n＝2700)或安慰剂(n＝450)。
对于所有的年龄组，有效性将从CHIKV NT80血清中和抗体(serum neutralizingantibodies，SNA)的检测中推断。将通过比较血清中和抗体(serum neutralizingantibodies，SNA)对CHIKV-VLP+Alum免疫与安慰剂免疫后的应答来评估疫苗在受试者中的有效性。主要有效性终点可为疫苗接种后22天的血清中和抗体(serum neutralizingantibodies，SNA)血清应答。在一些方面，血清应答可被定义为接种后的血清中和抗体(serum neutralizing antibodies，SNA)效价≥40。次要终点包括血清中和抗体(serumneutralizing antibodies，SNA)的几何平均效价(geometric mean titer，GMT)。
实例8：来自CHIK VLP疫苗接种受试者的人类IgG保护食蟹猴免受刺激
从汇集的血浆中纯化IgG收集的血浆是在第42至56天从人类受试者(如实例6中所述的第2期临床试验的第9组)中收集，此等受试者在第1天及第29天已经接种2剂的20μgCHIK VLP及明矾。将纯化的IgG以100mg/kg、15mg/kg及5mg/kg的剂量施用给食蟹猴，每个剂量组有6个NHP。向6个非人类灵长类(non-human primate，NHP)的对照组施用非特异性纯化的IgG。非人类灵长类(non-human primate，NHP)在IgG给药24小时后，利用CHIKV LR2006-OPY1(107PFU)刺激。在刺激时，100mg/kg、15mg/kg及5mg/kg剂量组的平均循环的血清中和抗体(serum neutralizing antibody，SNA)效价分别为1：644、1：101及1：38。
如通过对来自受刺激动物的血清的噬菌斑分析所检测，由于在此等非人类灵长类(non-human primate，NHP)中的任何时间皆未观察到感染性病毒，因此结果显示来自CHKVLP接种的受试者的经纯化的IgG保护非人类灵长类(non-human primate，NHP)免受病毒血症。所有对照动物皆具有可检测到的传染性病毒。关节病理分数证实相较于对照动物相，施用IgG导致关节病理分数降低。关节组织的RT-PCR分析显示施用IgG可降低vRNA/g组织的量。
实例9：来自CHIK VLP疫苗接种的受试者的人类IgG在食蟹猴基孔肯雅热刺激中进行测试
IgG将从收集自已经接种一剂的40μg CHIK VLP及明矾的人类受试者的汇集的血浆中进行纯化。经纯化的IgG将以各种剂量施用于食蟹猴。对照组将施予非特异性纯化的IgG。非人类灵长类(non-human primate，NHP)将在IgG给药后24小时，利用CHIKV LR2006-OPY1(例如，105PFU)进行皮下刺激。将评估非人类灵长类(non-human primate，NHP)的病毒血症，例如，通过噬菌斑分析及/或血清/血浆样本的qPCR。
总结及摘要部分可阐述如发明人所设想的本公开的一或多个，但非所有的示例性实施例，因此，不旨在以任何方式限制本发明及所附的权利要求。
具体实施例的上述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以致其他人可通过应用本领域技术内的知识，容易地修改及/或适应诸如具体实施例的各种应用，而无需过度实验，不偏离本发明的一般概念。因此，基于本文所呈现的教导及指导，此种变更及修改旨在处于所公开实施例的等同物的含义及范围内。应理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据教导及指导来解释。
本发明的广度及范围不应受任何上述示例性实施例的限制，而应根据所附的权利要求及其等同物来定义。
序列表
<110> 伊美根特旅行健康公司(EMERGENT TRAVEL HEALTH INC.)
<120> 基孔肯雅病毒样颗粒疫苗及其使用方法
<130> 2479.215PC02
<150> US 62/993,563
<151> 2020-03-23
<150> US 62/926,357
<151> 2019-10-25
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCMV/R 基孔肯雅热 (病毒株 37997)
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcagattgg 240
ctattggcca ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg tacatttata ttggctcatg 300
tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt attggactag ttattaatag taatcaatta 360
cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 420
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 480
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 540
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 600
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 660
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 720
acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 780
acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 840
actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 900
gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc 960
atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc atcggctcgc atctctcctt cacgcgcccg 1020
ccgccctacc tgaggccgcc atccacgccg gttgagtcgc gttctgccgc ctcccgcctg 1080
tggtgcctcc tgaactgcgt ccgccgtcta ggtaagttta aagctcaggt cgagaccggg 1140
cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc tagactcagc cggctctcca cgctttgcct 1200
gaccctgctt gctcaactct agttaacggt ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt 1260
tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag ctgacagact aacagactgt tcctttccat 1320
gggtcttttc tgcagtcacc gtcgtcgaca cgtgtgatca gatatcgcgg ccgctctaga 1380
caccatggag ttcatcccga cgcaaacttt ctataacaga aggtaccaac cccgaccctg 1440
ggccccacgc cctacaattc aagtaattag acctagacca cgtccacaga ggcaggctgg 1500
gcaactcgcc cagctgatct ccgcagtcaa caaattgacc atgcgcgcgg tacctcaaca 1560
gaagcctcgc agaaatcgga aaaacaagaa gcaaaggcag aagaagcagg cgccgcaaaa 1620
cgacccaaag caaaagaagc aaccaccaca aaagaagccg gctcaaaaga agaagaaacc 1680
aggccgtagg gagagaatgt gcatgaaaat tgaaaatgat tgcatcttcg aagtcaagca 1740
tgaaggcaaa gtgatgggct acgcatgcct ggtgggggat aaagtaatga aaccagcaca 1800
tgtgaaggga actatcgaca atgccgatct ggctaaactg gcctttaagc ggtcgtctaa 1860
atacgatctt gaatgtgcac agataccggt gcacatgaag tctgatgcct cgaagtttac 1920
ccacgagaaa cccgaggggt actataactg gcatcacgga gcagtgcagt attcaggagg 1980
ccggttcact atcccgacgg gtgcaggcaa gccgggagac agcggcagac cgatcttcga 2040
caacaaagga cgggtggtgg ccatcgtcct aggaggggcc aacgaaggtg cccgcacggc 2100
cctctccgtg gtgacgtgga acaaagacat cgtcacaaaa attacccctg agggagccga 2160
agagtggagc ctcgccctcc cggtcttgtg cctgttggca aacactacat tcccctgctc 2220
tcagccgcct tgcacaccct gctgctacga aaaggaaccg gaaagcacct tgcgcatgct 2280
tgaggacaac gtgatgagac ccggatacta ccagctacta aaagcatcgc tgacttgctc 2340
tccccaccgc caaagacgca gtactaagga caattttaat gtctataaag ccacaagacc 2400
atatctagct cattgtcctg actgcggaga agggcattcg tgccacagcc ctatcgcatt 2460
ggagcgcatc agaaatgaag caacggacgg aacgctgaaa atccaggtct ctttgcagat 2520
cgggataaag acagatgaca gccacgattg gaccaagctg cgctatatgg atagccatac 2580
gccagcggac gcggagcgag ccggattgct tgtaaggact tcagcaccgt gcacgatcac 2640
cgggaccatg ggacacttta ttctcgcccg atgcccgaaa ggagagacgc tgacagtggg 2700
atttacggac agcagaaaga tcagccacac atgcacacac ccgttccatc atgaaccacc 2760
tgtgataggt agggagaggt tccactctcg accacaacat ggtaaagagt taccttgcag 2820
cacgtacgtg cagagcaccg ctgccactgc tgaggagata gaggtgcata tgcccccaga 2880
tactcctgac cgcacgctga tgacgcagca gtctggcaac gtgaagatca cagttaatgg 2940
gcagacggtg cggtacaagt gcaactgcgg tggctcaaac gagggactga caaccacaga 3000
caaagtgatc aataactgca aaattgatca gtgccatgct gcagtcacta atcacaagaa 3060
ttggcaatac aactcccctt tagtcccgcg caacgctgaa ctcggggacc gtaaaggaaa 3120
gatccacatc ccattcccat tggcaaacgt gacttgcaga gtgccaaaag caagaaaccc 3180
tacagtaact tacggaaaaa accaagtcac catgctgctg tatcctgacc atccgacact 3240
cttgtcttac cgtaacatgg gacaggaacc aaattaccac gaggagtggg tgacacacaa 3300
gaaggaggtt accttgaccg tgcctactga gggtctggag gtcacttggg gcaacaacga 3360
accatacaag tactggccgc agatgtctac gaacggtact gctcatggtc acccacatga 3420
gataatcttg tactattatg agctgtaccc cactatgact gtagtcattg tgtcggtggc 3480
ctcgttcgtg cttctgtcga tggtgggcac agcagtggga atgtgtgtgt gcgcacggcg 3540
cagatgcatt acaccatatg aattaacacc aggagccact gttcccttcc tgctcagcct 3600
gctatgctgc gtcagaacga ccaaggcggc cacatattac gaggctgcgg catatctatg 3660
gaacgaacag cagcccctgt tctggttgca ggctcttatc ccgctggccg ccttgatcgt 3720
cctgtgcaac tgtctgaaac tcttgccatg ctgctgtaag accctggctt ttttagccgt 3780
aatgagcatc ggtgcccaca ctgtgagcgc gtacgaacac gtaacagtga tcccgaacac 3840
ggtgggagta ccgtataaga ctcttgtcaa cagaccgggt tacagcccca tggtgttgga 3900
gatggagcta caatcagtca ccttggaacc aacactgtca cttgactaca tcacgtgcga 3960
gtacaaaact gtcatcccct ccccgtacgt gaagtgctgt ggtacagcag agtgcaagga 4020
caagagccta ccagactaca gctgcaaggt ctttactgga gtctacccat ttatgtgggg 4080
cggcgcctac tgcttttgcg acgccgaaaa tacgcaattg agcgaggcac atgtagagaa 4140
atctgaatct tgcaaaacag agtttgcatc ggcctacaga gcccacaccg catcggcgtc 4200
ggcgaagctc cgcgtccttt accaaggaaa caacattacc gtagctgcct acgctaacgg 4260
tgaccatgcc gtcacagtaa aggacgccaa gtttgtcgtg ggcccaatgt cctccgcctg 4320
gacacctttt gacaacaaaa tcgtggtgta caaaggcgac gtctacaaca tggactaccc 4380
accttttggc gcaggaagac caggacaatt tggtgacatt caaagtcgta caccggaaag 4440
taaagacgtt tatgccaaca ctcagttggt actacagagg ccagcagcag gcacggtaca 4500
tgtaccatac tctcaggcac catctggctt caagtattgg ctgaaggaac gaggagcatc 4560
gctacagcac acggcaccgt tcggttgcca gattgcgaca aacccggtaa gagctgtaaa 4620
ttgcgctgtg gggaacatac caatttccat cgacataccg gatgcggcct ttactagggt 4680
tgtcgatgca ccctctgtaa cggacatgtc atgcgaagta ccagcctgca ctcactcctc 4740
cgactttggg ggcgtcgcca tcatcaaata cacagctagc aagaaaggta aatgtgcagt 4800
acattcgatg accaacgccg ttaccattcg agaagccgac gtagaagtag aggggaactc 4860
ccagctgcaa atatccttct caacagccct ggcaagcgcc gagtttcgcg tgcaagtgtg 4920
ctccacacaa gtacactgcg cagccgcatg ccaccctcca aaggaccaca tagtcaatta 4980
cccagcatca cacaccaccc ttggggtcca ggatatatcc acaacggcaa tgtcttgggt 5040
gcagaagatt acgggaggag taggattaat tgttgctgtt gctgccttaa ttttaattgt 5100
ggtgctatgc gtgtcgttta gcaggcacta atgaggatcc agatctgctg tgccttctag 5160
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 5220
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 5280
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 5340
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat gggtacccag gtgctgaaga attgacccgg 5400
ttcctcctgg gccagaaaga agcaggcaca tccccttctc tgtgacacac cctgtccacg 5460
cccctggttc ttagttccag ccccactcat aggacactca tagctcagga gggctccgcc 5520
ttcaatccca cccgctaaag tacttggagc ggtctctccc tccctcatca gcccaccaaa 5580
ccaaacctag cctccaagag tgggaagaaa ttaaagcaag ataggctatt aagtgcagag 5640
ggagagaaaa tgcctccaac atgtgaggaa gtaatgagag aaatcataga attttaaggc 5700
catgatttaa ggccatcatg gccttaatct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 5760
tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 5820
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 5880
aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 5940
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 6000
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 6060
tacctgtccg ccttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 6120
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 6180
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 6240
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 6300
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 6360
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 6420
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 6480
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 6540
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 6600
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 6660
ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 6720
catccatagt tgcctgactc gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg 6780
ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac 6840
ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca 6900
cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc 6960
gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa 7020
ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt 7080
catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 7140
ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg 7200
tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 7260
atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agcttatgca tttctttcca 7320
gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 7380
gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca 7440
attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 7500
ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gttttcccgg ggatcgcagt 7560
ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 7620
aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc 7680
tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt 7740
cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat 7800
gttggaattt aatcgcggcc tcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc 7860
ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt catgatgata tatttttatc 7920
ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga cacaacgtgg ctttcccccc ccccccatta 7980
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 8040
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 8100
aaccattatt catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 8157
<210> 2
<211> 3744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)结构蛋白
<400> 2
atggagttca tcccgacgca aactttctat aacagaaggt accaaccccg accctgggcc 60
ccacgcccta caattcaagt aattagacct agaccacgtc cacagaggca ggctgggcaa 120
ctcgcccagc tgatctccgc agtcaacaaa ttgaccatgc gcgcggtacc tcaacagaag 180
cctcgcagaa atcggaaaaa caagaagcaa aggcagaaga agcaggcgcc gcaaaacgac 240
ccaaagcaaa agaagcaacc accacaaaag aagccggctc aaaagaagaa gaaaccaggc 300
cgtagggaga gaatgtgcat gaaaattgaa aatgattgca tcttcgaagt caagcatgaa 360
ggcaaagtga tgggctacgc atgcctggtg ggggataaag taatgaaacc agcacatgtg 420
aagggaacta tcgacaatgc cgatctggct aaactggcct ttaagcggtc gtctaaatac 480
gatcttgaat gtgcacagat accggtgcac atgaagtctg atgcctcgaa gtttacccac 540
gagaaacccg aggggtacta taactggcat cacggagcag tgcagtattc aggaggccgg 600
ttcactatcc cgacgggtgc aggcaagccg ggagacagcg gcagaccgat cttcgacaac 660
aaaggacggg tggtggccat cgtcctagga ggggccaacg aaggtgcccg cacggccctc 720
tccgtggtga cgtggaacaa agacatcgtc acaaaaatta cccctgaggg agccgaagag 780
tggagcctcg ccctcccggt cttgtgcctg ttggcaaaca ctacattccc ctgctctcag 840
ccgccttgca caccctgctg ctacgaaaag gaaccggaaa gcaccttgcg catgcttgag 900
gacaacgtga tgagacccgg atactaccag ctactaaaag catcgctgac ttgctctccc 960
caccgccaaa gacgcagtac taaggacaat tttaatgtct ataaagccac aagaccatat 1020
ctagctcatt gtcctgactg cggagaaggg cattcgtgcc acagccctat cgcattggag 1080
cgcatcagaa atgaagcaac ggacggaacg ctgaaaatcc aggtctcttt gcagatcggg 1140
ataaagacag atgacagcca cgattggacc aagctgcgct atatggatag ccatacgcca 1200
gcggacgcgg agcgagccgg attgcttgta aggacttcag caccgtgcac gatcaccggg 1260
accatgggac actttattct cgcccgatgc ccgaaaggag agacgctgac agtgggattt 1320
acggacagca gaaagatcag ccacacatgc acacacccgt tccatcatga accacctgtg 1380
ataggtaggg agaggttcca ctctcgacca caacatggta aagagttacc ttgcagcacg 1440
tacgtgcaga gcaccgctgc cactgctgag gagatagagg tgcatatgcc cccagatact 1500
cctgaccgca cgctgatgac gcagcagtct ggcaacgtga agatcacagt taatgggcag 1560
acggtgcggt acaagtgcaa ctgcggtggc tcaaacgagg gactgacaac cacagacaaa 1620
gtgatcaata actgcaaaat tgatcagtgc catgctgcag tcactaatca caagaattgg 1680
caatacaact cccctttagt cccgcgcaac gctgaactcg gggaccgtaa aggaaagatc 1740
cacatcccat tcccattggc aaacgtgact tgcagagtgc caaaagcaag aaaccctaca 1800
gtaacttacg gaaaaaacca agtcaccatg ctgctgtatc ctgaccatcc gacactcttg 1860
tcttaccgta acatgggaca ggaaccaaat taccacgagg agtgggtgac acacaagaag 1920
gaggttacct tgaccgtgcc tactgagggt ctggaggtca cttggggcaa caacgaacca 1980
tacaagtact ggccgcagat gtctacgaac ggtactgctc atggtcaccc acatgagata 2040
atcttgtact attatgagct gtaccccact atgactgtag tcattgtgtc ggtggcctcg 2100
ttcgtgcttc tgtcgatggt gggcacagca gtgggaatgt gtgtgtgcgc acggcgcaga 2160
tgcattacac catatgaatt aacaccagga gccactgttc ccttcctgct cagcctgcta 2220
tgctgcgtca gaacgaccaa ggcggccaca tattacgagg ctgcggcata tctatggaac 2280
gaacagcagc ccctgttctg gttgcaggct cttatcccgc tggccgcctt gatcgtcctg 2340
tgcaactgtc tgaaactctt gccatgctgc tgtaagaccc tggctttttt agccgtaatg 2400
agcatcggtg cccacactgt gagcgcgtac gaacacgtaa cagtgatccc gaacacggtg 2460
ggagtaccgt ataagactct tgtcaacaga ccgggttaca gccccatggt gttggagatg 2520
gagctacaat cagtcacctt ggaaccaaca ctgtcacttg actacatcac gtgcgagtac 2580
aaaactgtca tcccctcccc gtacgtgaag tgctgtggta cagcagagtg caaggacaag 2640
agcctaccag actacagctg caaggtcttt actggagtct acccatttat gtggggcggc 2700
gcctactgct tttgcgacgc cgaaaatacg caattgagcg aggcacatgt agagaaatct 2760
gaatcttgca aaacagagtt tgcatcggcc tacagagccc acaccgcatc ggcgtcggcg 2820
aagctccgcg tcctttacca aggaaacaac attaccgtag ctgcctacgc taacggtgac 2880
catgccgtca cagtaaagga cgccaagttt gtcgtgggcc caatgtcctc cgcctggaca 2940
ccttttgaca acaaaatcgt ggtgtacaaa ggcgacgtct acaacatgga ctacccacct 3000
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ccatactctc aggcaccatc tggcttcaag tattggctga aggaacgagg agcatcgcta 3180
cagcacacgg caccgttcgg ttgccagatt gcgacaaacc cggtaagagc tgtaaattgc 3240
gctgtgggga acataccaat ttccatcgac ataccggatg cggcctttac tagggttgtc 3300
gatgcaccct ctgtaacgga catgtcatgc gaagtaccag cctgcactca ctcctccgac 3360
tttgggggcg tcgccatcat caaatacaca gctagcaaga aaggtaaatg tgcagtacat 3420
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acacaagtac actgcgcagc cgcatgccac cctccaaagg accacatagt caattaccca 3600
gcatcacaca ccacccttgg ggtccaggat atatccacaa cggcaatgtc ttgggtgcag 3660
aagattacgg gaggagtagg attaattgtt gctgttgctg ccttaatttt aattgtggtg 3720
ctatgcgtgt cgtttagcag gcac 3744
<210> 3
<211> 1248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)
<400> 3
Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro
1 5 10 15
Arg Pro Trp Ala Pro Arg Pro Thr Ile Gln Val Ile Arg Pro Arg Pro
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Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val
35 40 45
Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn
50 55 60
Arg Lys Asn Lys Lys Gln Arg Gln Lys Lys Gln Ala Pro Gln Asn Asp
65 70 75 80
Pro Lys Gln Lys Lys Gln Pro Pro Gln Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys
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Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp
100 105 110
Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Met Gly Tyr Ala Cys
115 120 125
Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile
130 135 140
Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser
165 170 175
Lys Phe Thr His Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Trp His His Gly
180 185 190
Ala Val Gln Tyr Ser Gly Gly Arg Phe Thr Ile Pro Thr Gly Ala Gly
195 200 205
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210 215 220
Val Ala Ile Val Leu Gly Gly Ala Asn Glu Gly Ala Arg Thr Ala Leu
225 230 235 240
Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu
245 250 255
Gly Ala Glu Glu Trp Ser Leu Ala Leu Pro Val Leu Cys Leu Leu Ala
260 265 270
Asn Thr Thr Phe Pro Cys Ser Gln Pro Pro Cys Thr Pro Cys Cys Tyr
275 280 285
Glu Lys Glu Pro Glu Ser Thr Leu Arg Met Leu Glu Asp Asn Val Met
290 295 300
Arg Pro Gly Tyr Tyr Gln Leu Leu Lys Ala Ser Leu Thr Cys Ser Pro
305 310 315 320
His Arg Gln Arg Arg Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala
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Thr Arg Pro Tyr Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser
340 345 350
Cys His Ser Pro Ile Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp
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Gly Thr Leu Lys Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp
370 375 380
Asp Ser His Asp Trp Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Ser His Thr Pro
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Ala Asp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Leu Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys
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Arg Phe His Ser Arg Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr
465 470 475 480
Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met
485 490 495
Pro Pro Asp Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Thr Gln Gln Ser Gly Asn
500 505 510
Val Lys Ile Thr Val Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys
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Gly Gly Ser Asn Glu Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn
530 535 540
Cys Lys Ile Asp Gln Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Asn Trp
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Gln Tyr Asn Ser Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg
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Lys Gly Lys Ile His Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg
580 585 590
Val Pro Lys Ala Arg Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val
595 600 605
Thr Met Leu Leu Tyr Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn
610 615 620
Met Gly Gln Glu Pro Asn Tyr His Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys
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Glu Val Thr Leu Thr Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly
645 650 655
Asn Asn Glu Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro Gln Met Ser Thr Asn Gly Thr
660 665 670
Ala His Gly His Pro His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr
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Pro Thr Met Thr Val Val Ile Val Ser Val Ala Ser Phe Val Leu Leu
690 695 700
Ser Met Val Gly Thr Ala Val Gly Met Cys Val Cys Ala Arg Arg Arg
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Cys Ile Thr Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu
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Leu Ser Leu Leu Cys Cys Val Arg Thr Thr Lys Ala Ala Thr Tyr Tyr
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Glu Ala Ala Ala Tyr Leu Trp Asn Glu Gln Gln Pro Leu Phe Trp Leu
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Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile
850 855 860
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Ser Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe
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900 905 910
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His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys Phe Val Val Gly Pro Met Ser
965 970 975
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980 985 990
Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln
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1070 1075 1080
Asn Ile Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asp Ala Ala Phe Thr Arg
1085 1090 1095
Val Val Asp Ala Pro Ser Val Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro
1100 1105 1110
Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys
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Tyr Thr Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr
1130 1135 1140
Asn Ala Val Thr Ile Arg Glu Ala Asp Val Glu Val Glu Gly Asn
1145 1150 1155
Ser Gln Leu Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu
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Phe Arg Val Gln Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Ala
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Thr Thr Leu Gly Val Gln Asp Ile Ser Thr Thr Ala Met Ser Trp
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Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly Val Gly Leu Ile Val Ala Val Ala
1220 1225 1230
Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu Cys Val Ser Phe Ser Arg His
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<210> 4
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)衣壳蛋白
<400> 4
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Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val
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Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn
50 55 60
Arg Lys Asn Lys Lys Gln Arg Gln Lys Lys Gln Ala Pro Gln Asn Asp
65 70 75 80
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100 105 110
Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Met Gly Tyr Ala Cys
115 120 125
Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile
130 135 140
Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser
165 170 175
Lys Phe Thr His Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Trp His His Gly
180 185 190
Ala Val Gln Tyr Ser Gly Gly Arg Phe Thr Ile Pro Thr Gly Ala Gly
195 200 205
Lys Pro Gly Asp Ser Gly Arg Pro Ile Phe Asp Asn Lys Gly Arg Val
210 215 220
Val Ala Ile Val Leu Gly Gly Ala Asn Glu Gly Ala Arg Thr Ala Leu
225 230 235 240
Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu
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Gly Ala Glu Glu Trp
260
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)衣壳蛋白
<400> 5
atggagttca tcccgacgca aactttctat aacagaaggt accaaccccg accctgggcc 60
ccacgcccta caattcaagt aattagacct agaccacgtc cacagaggca ggctgggcaa 120
ctcgcccagc tgatctccgc agtcaacaaa ttgaccatgc gcgcggtacc tcaacagaag 180
cctcgcagaa atcggaaaaa caagaagcaa aggcagaaga agcaggcgcc gcaaaacgac 240
ccaaagcaaa agaagcaacc accacaaaag aagccggctc aaaagaagaa gaaaccaggc 300
cgtagggaga gaatgtgcat gaaaattgaa aatgattgca tcttcgaagt caagcatgaa 360
ggcaaagtga tgggctacgc atgcctggtg ggggataaag taatgaaacc agcacatgtg 420
aagggaacta tcgacaatgc cgatctggct aaactggcct ttaagcggtc gtctaaatac 480
gatcttgaat gtgcacagat accggtgcac atgaagtctg atgcctcgaa gtttacccac 540
gagaaacccg aggggtacta taactggcat cacggagcag tgcagtattc aggaggccgg 600
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aaaggacggg tggtggccat cgtcctagga ggggccaacg aaggtgcccg cacggccctc 720
tccgtggtga cgtggaacaa agacatcgtc acaaaaatta cccctgaggg agccgaagag 780
tgg 783
<210> 6
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株 37997)组装蛋白E3
<400> 6
Ser Leu Ala Leu Pro Val Leu Cys Leu Leu Ala Asn Thr Thr Phe Pro
1 5 10 15
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Ser Thr Leu Arg Met Leu Glu Asp Asn Val Met Arg Pro Gly Tyr Tyr
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Gln Leu Leu Lys Ala Ser Leu Thr Cys Ser Pro His Arg Gln Arg Arg
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<210> 7
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)组装蛋白E3
<400> 7
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<210> 8
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)刺突糖蛋白E2
<400> 8
Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu
1 5 10 15
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35 40 45
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Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro
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Asp Arg Thr Leu Met Thr Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val
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Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly Ser Asn Glu
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Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Ile Asp Gln
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Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Asn Trp Gln Tyr Asn Ser Pro
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Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His
245 250 255
Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg
260 265 270
Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Thr Met Leu Leu Tyr
275 280 285
Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Gln Glu Pro
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Asn Tyr His Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Val Thr Leu Thr
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Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr
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Lys Tyr Trp Pro Gln Met Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)刺突糖蛋白E2
<400> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997) 6k蛋白
<400> 10
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1 5 10 15
Leu Phe Trp Leu Gln Ala Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu Ile Val Leu
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Cys Asn Cys Leu Lys Leu Leu Pro Cys Cys Cys Lys Thr Leu Ala Phe
35 40 45
Leu Ala Val Met Ser Ile Gly Ala His Thr Val Ser Ala
50 55 60
<210> 11
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997) 6k蛋白
<400> 11
gccacatatt acgaggctgc ggcatatcta tggaacgaac agcagcccct gttctggttg 60
caggctctta tcccgctggc cgccttgatc gtcctgtgca actgtctgaa actcttgcca 120
tgctgctgta agaccctggc ttttttagcc gtaatgagca tcggtgccca cactgtgagc 180
gcg 183
<210> 12
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)刺突糖蛋白E1
<400> 12
Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu
20 25 30
Leu Gln Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr
35 40 45
Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly
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65 70 75 80
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85 90 95
Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu
100 105 110
Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser
115 120 125
Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val
130 135 140
Ala Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys
145 150 155 160
Phe Val Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe
180 185 190
Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro
195 200 205
Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro
210 215 220
Ala Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe
225 230 235 240
Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro
245 250 255
Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala
260 265 270
Val Gly Asn Ile Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asp Ala Ala Phe Thr
275 280 285
Arg Val Val Asp Ala Pro Ser Val Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro
290 295 300
Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr
305 310 315 320
Thr Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala
325 330 335
Val Thr Ile Arg Glu Ala Asp Val Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu
340 345 350
Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln
355 360 365
Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Ala Cys His Pro Pro Lys
370 375 380
Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln
385 390 395 400
Asp Ile Ser Thr Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly
405 410 415
Val Gly Leu Ile Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu
420 425 430
Cys Val Ser Phe Ser Arg His
435
<210> 13
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基孔肯雅热(病毒株37997)刺突糖蛋白E1
<400> 13
tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg gtgggagtac cgtataagac tcttgtcaac 60
agaccgggtt acagccccat ggtgttggag atggagctac aatcagtcac cttggaacca 120
acactgtcac ttgactacat cacgtgcgag tacaaaactg tcatcccctc cccgtacgtg 180
aagtgctgtg gtacagcaga gtgcaaggac aagagcctac cagactacag ctgcaaggtc 240
tttactggag tctacccatt tatgtggggc ggcgcctact gcttttgcga cgccgaaaat 300
acgcaattga gcgaggcaca tgtagagaaa tctgaatctt gcaaaacaga gtttgcatcg 360
gcctacagag cccacaccgc atcggcgtcg gcgaagctcc gcgtccttta ccaaggaaac 420
aacattaccg tagctgccta cgctaacggt gaccatgccg tcacagtaaa ggacgccaag 480
tttgtcgtgg gcccaatgtc ctccgcctgg acaccttttg acaacaaaat cgtggtgtac 540
aaaggcgacg tctacaacat ggactaccca ccttttggcg caggaagacc aggacaattt 600
ggtgacattc aaagtcgtac accggaaagt aaagacgttt atgccaacac tcagttggta 660
ctacagaggc cagcagcagg cacggtacat gtaccatact ctcaggcacc atctggcttc 720
aagtattggc tgaaggaacg aggagcatcg ctacagcaca cggcaccgtt cggttgccag 780
attgcgacaa acccggtaag agctgtaaat tgcgctgtgg ggaacatacc aatttccatc 840
gacataccgg atgcggcctt tactagggtt gtcgatgcac cctctgtaac ggacatgtca 900
tgcgaagtac cagcctgcac tcactcctcc gactttgggg gcgtcgccat catcaaatac 960
acagctagca agaaaggtaa atgtgcagta cattcgatga ccaacgccgt taccattcga 1020
gaagccgacg tagaagtaga ggggaactcc cagctgcaaa tatccttctc aacagccctg 1080
gcaagcgccg agtttcgcgt gcaagtgtgc tccacacaag tacactgcgc agccgcatgc 1140
caccctccaa aggaccacat agtcaattac ccagcatcac acaccaccct tggggtccag 1200
gatatatcca caacggcaat gtcttgggtg cagaagatta cgggaggagt aggattaatt 1260
gttgctgttg ctgccttaat tttaattgtg gtgctatgcg tgtcgtttag caggcac 1317

Claims (76)

1.一种组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗包括：(a)病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒的衣壳蛋白及包膜蛋白；(b)氢氧化铝佐剂；(c)糖；(d)缓冲剂及/或pH调节剂；及(e)载体。
2.一种组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗包括：病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒的衣壳蛋白及包膜蛋白，其中所述组合物或疫苗(i)在向一受试者施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后的7天内，在所述受试者体内诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答，及/或(ii)在向所述受试者施用单次剂量之后，诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。
3.如权利要求2所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗进一步包括佐剂。
4.如权利要求3所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述佐剂是氢氧化铝佐剂。
5.如权利要求1、3或4中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述佐剂是氢氧化铝凝胶。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述衣壳蛋白是基孔肯雅病毒蛋白。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述包膜蛋白是基孔肯雅病毒蛋白，所述基孔肯雅病毒蛋白是选自由以下所组成的群组：E3、E2、6K、E1及其任意组合。
8.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述病毒样颗粒包括基孔肯雅病毒包膜蛋白E2及E1。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述病毒样颗粒包括基孔肯雅病毒C、E2及E1蛋白。
10.如权利要求9所述的组合物或疫苗，其特征在于：在所述组合物或疫苗中，所述基孔肯雅病毒C、E2及E1蛋白占所述病毒样颗蛋白的至少95％。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述病毒样颗不包括基孔肯雅病毒E3及/或6K。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述衣壳蛋白及包膜蛋白是源自基孔肯雅病毒的病毒株37997。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗是适合肌肉注射的悬浮剂。
14.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括约6μg至200μg的病毒样颗粒。
15.如权利要求14所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括约20μg至100μg的病毒样颗粒。
16.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括约25μg/mL至75μg/mL的病毒样颗粒。
17.如权利要求14至16中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述单次剂量包括约40μg或约50μg/mL的病毒样颗粒。
18.如权利要求5至17中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括约30μg至3000μg的量的氢氧化铝凝胶。
19.如权利要求18所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括约100μg至500μg的量的氢氧化铝凝胶。
20.如权利要求18或19所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述单次剂量包括250μg/mL至625μg/mL的氢氧化铝凝胶。
21.如权利要求18至20中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述单次剂量包括约300μg或约375μg/mL的氢氧化铝凝胶。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括约0.5mL至2mL的体积。
23.如权利要求22所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括约0.5mL至1mL的体积。
24.如权利要求2至23中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗进一步包括糖。
25.如权利要求24所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述糖是选自由以下所组成的群组：蔗糖、乳糖及其任意组合。
26.如权利要求25所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述糖是蔗糖。
27.如权利要求2至26中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗进一步包括缓冲剂及/或pH调节剂。
28.如权利要求27所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述缓冲剂及/或pH调节剂是选自由以下所组成的群组：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、脱水柠檬酸钠及其任意组合。
29.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗不包括防腐剂或抗生素。
30.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括：(a)约6μg至60μg的所述病毒样颗粒及(b)约200μg至500μg的所述氢氧化铝，其中所述单次剂量体积是介于约0.5mL与1.0mL之间。
31.如权利要求30所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量包括：(a)约6μg至60μg的所述病毒样颗粒；(b)约200μg至500μg的所述氢氧化铝；(c)约20mg至80mg的蔗糖；(d)约0.2mg至1.0mg的磷酸二氢钾；(e)约0.2mg至1.5mg的磷酸氢二钾；(f)约2mg至10mg的脱水柠檬酸钠；及(g)水，其中所述单次剂量体积是介于约0.5mL与1.0mL之间。
32.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述组合物或疫苗的单次剂量是约0.8mL的体积。
33.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述病毒样颗粒诱导针对基孔肯雅病毒的同源或异源的病毒株的抗体。
34.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：所述病毒样颗粒诱导针对一或多种基孔肯雅病毒的谱系的抗体，所述基孔肯雅病毒的谱系的抗体是选自由东非/中非/南非、西非及亚洲所组成的群组。
35.如权利要求1及5至34中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：在向一受试者施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后的7天内，在所述受试者中诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答。
36.如权利要求2至35中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：在施用单次剂量之后，所述针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答持续至少28天。
37.如权利要求36所述的组合物或疫苗，其特征在于：在施用单次剂量之后，所述针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答持续至少六个月。
38.如权利要求37所述的组合物或疫苗，其特征在于：在施用单次剂量之后，所述针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答会持续至少一年、至少18个月或至少2年。
39.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：在施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后的7天内，所述血清中和抗体效价是≥30或≥40。
40.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：在施用单次剂量的所述组合物之后的7天内，所述组合物或疫苗在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答。
41.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：在向所述受试者施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后，所述组合物或疫苗诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答，所述中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。
42.如前述权利要求中任一项所述的组合物或疫苗，其特征在于：(i)在向一受试者施用单次剂量的所述组合物或疫苗之后的7天内，所述组合物或疫苗在所述受试者中诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答，以及在向所述受试者施用单次剂量之后，所述组合物或疫苗诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答，所述中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。
43.一种预填充注射器，其特征在于：所述预填充注射器包括单次剂量的如权利要求1至42中任一项所述的组合物或疫苗。
44.一种在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒的免疫应答及/或保护性免疫的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：向所述受试者施用如权利要求1至42中任一项所述的组合物或疫苗。
45.一种在一受试者中诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：向所述受试者施用如权利要求1至42中任一项所述的组合物或疫苗。
46.一种用于在一受试者中治疗、预防或降低基孔肯雅热感染的风险的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：向所述受试者施用有效量的如权利要求1至42中任一项所述的组合物或疫苗。
47.一种为一受试者接种针对基孔肯雅病毒感染的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：向所述受试者施用有效量的如权利要求1至42中任一项所述的组合物或疫苗。
48.一种在一受试者中引起针对基孔肯雅病毒的免疫应答及/或保护性免疫的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：向所述受试者施用组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括(a)病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病的衣壳蛋白及包膜蛋白，以及(b)佐剂，其中所述组合物或疫苗的单次剂量包括约6μg至200μg的病毒样颗，以及其中施用单次剂量的所述组合物或疫苗(i)在施用之后的7天内，在所述受试者内会引起基孔肯雅病特异性的中和抗体，及/或(ii)在向所述受试者施用单次剂量之后，会诱导针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答，所述中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。
49.一种在一群体中诱导针对基孔肯雅病的保护性免疫的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：向所述群体施用组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括(a)病毒样颗，所述病毒样颗粒包括源自基孔肯雅病毒的衣壳蛋白及包膜蛋白，以及(b)佐剂，其中所述组合物或疫苗的单次剂量包括约6μg至200μg的病毒样颗，以及其中至少60％的所述群体(i)在施用所述组合物或疫苗的单次剂量之后的7天内，产生针对基孔肯雅病的中和抗体应答，及/或(ii)在向所述受试者施用单次剂量之后，产生针对基孔肯雅病毒的中和抗体，所述中和抗体持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于：在施用所述组合物或疫苗的单次剂量之后的7天内，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％，或至少98％的所述群体发展为血清中和抗体效价≥30或≥40。
51.如权利要求49或50所述的方法，其特征在于：在施用所述组合物或疫苗的单次剂量之后，至少40％、至少50％，或至少60％的所述群体在至少28天、至少6个月、至少一年或至少两年内保持血清中和抗体效价≥30或≥40。
52.如权利要求44至51中任一项所述的方法，其特征在于：所述单次剂量包括20μg至200μg的病毒样颗粒。
53.如权利要求44至52中任一项所述的方法，其特征在于：所述单次剂量包括25μg/mL至75μg/mL的病毒样颗粒。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于：所述单次剂量包括约40μg或约50μg/mL的病毒样颗。
55.如权利要求44至54所述的方法，其特征在于：所述组合物或疫苗包括30μg至3000μg的氢氧化铝凝胶。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于：所述氢氧化铝凝胶的量为约250μg/mL至625μg/mL。
57.如权利要求44至56中任一项所述的方法，其特征在于：所述组合物或疫苗包括约300μg或约375μg/mL的氢氧化铝凝胶。
58.如权利要求44至57中任一项所述的方法，其特征在于：所述组合物或疫苗包括：(a)约6μg至40μg的病毒样颗粒；(b)约200μg至500μg的氢氧化铝；(c)糖；(d)缓冲剂及/或pH调节剂；及(e)水。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于：所述组合物或疫苗包括：(a)约6μg至40μg的病毒样颗粒；(b)约200μg至500μg的氢氧化铝；(c)约20μg至80mg的蔗糖；(d)0.2mg至1.0mg的磷酸二氢钾；(e)约0.2mg至1.5mg的磷酸氢二钾；(f)约2mg至10mg的脱水柠檬酸钠；及(g)水。
60.如权利要求44至59中任一项所述的方法，其特征在于：第一剂是以约0.5mL至1mL的量给药。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于：所述第一剂是以约0.8mL的量给药。
62.如权利要求44至61中任一项所述的方法，其特征在于：所述中和抗体应答为所述受试者接种针对基孔肯雅病毒的多种血清型的疫苗。
63.如权利要求44至62中任一项所述的方法，其特征在于：在施用所述单次剂量之后，针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答会持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。
64.如权利要求44至63中任一项所述的方法，其特征在于：在施用所述单次剂量之后的至少28天、至少6个月或至少1年，将第二剂的组合物或疫苗施用于所述受试者。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于：在施用所述第二剂之后，针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答会持续至少六个月。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于：在施用所述第二剂之后，针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答会持续至少一年。
67.如权利要求44至66中任一项所述的方法，其特征在于：在施用所述组合物或疫苗之后的7天，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或至少98％的所述受试者产生针对基孔肯雅病毒的中和抗体应答。
68.如权利要求44至67中任一项所述的方法，其特征在于：在施用所述组合物或疫苗之后的7天、28天、一年或两年，血清应答率是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％。
69.如权利要求44至68中任一项所述的方法，其特征在于：所述血清中和抗体效价是≥30或≥40。
70.如权利要求44至69中任一项所述的方法，其特征在于：所述组合物或疫苗是肌肉内给药。
71.如权利要求44至70中任一项所述的方法，其特征在于：所述组合物或疫苗是以有效量给药。
72.如权利要求44至71中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法在给药之后的7天内，在所述受试者内会引起基孔肯雅病毒特异性的中和抗体的产生，以及在向所述受试者施用单次剂量之后，会诱导针对基孔肯雅病的中和抗体应答，所述中和抗体应答持续至少28天、至少6个月、至少1年或至少2年。
73.如前述权利要求中任一项所述的组合物、疫苗或方法，其特征在于：所述受试者是人类。
74.如前述权利要求中任一项所述的组合物、疫苗或方法，其特征在于：所述受试者在施用所述组合物或疫苗之前并未暴露于基孔肯雅病毒抗原或基孔肯雅病毒疫苗。
75.如前述权利要求中任一项所述的组合物、疫苗或方法，其特征在于：所述受试者在施用所述组合物或疫苗之前不具有可检测的基孔肯雅病毒抗体效价。
76.如前述权利要求中任一项所述的组合物、疫苗或方法，其特征在于：所述受试者在施用所述组合物或疫苗之前具有可检测的基孔肯雅病毒抗体效价≤5。
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