CN117903263A - 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117903263A CN117903263A CN202311283785.3A CN202311283785A CN117903263A CN 117903263 A CN117903263 A CN 117903263A CN 202311283785 A CN202311283785 A CN 202311283785A CN 117903263 A CN117903263 A CN 117903263A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- sequence
- mutant
- acid encoding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 23
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 182
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 175
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 175
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 153
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 90
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 35
- -1 cytosine nucleoside Chemical class 0.000 claims description 34
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 20
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 20
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 claims description 18
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 18
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 16
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 claims description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 10
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 9
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 8
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 8
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 7
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 7
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 claims description 6
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 6
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 claims description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 5-methoxyuridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 5
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 53
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 52
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 41
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 39
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 39
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 38
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 33
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 31
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 31
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 31
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 25
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 24
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 24
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 24
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 18
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 17
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 12
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 12
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 12
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 11
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 11
- 241000566242 Ochrotomys Species 0.000 description 11
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 10
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 10
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 6
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 6
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 5
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 3
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102100034013 Gamma-glutamyl phosphate reductase Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerol Natural products OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 101001133924 Homo sapiens Gamma-glutamyl phosphate reductase Proteins 0.000 description 2
- 241000566236 Ochrotomys nuttalli Species 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 102220599406 Spindlin-1_N501Y_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108091046915 Threose nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102220510809 Toll-like receptor 3_P681H_mutation Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 125000005265 dialkylamine group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 102200128238 rs201124247 Human genes 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- ZXSBHXZKWRIEIA-JTQLQIEISA-N (2s)-3-(4-acetylphenyl)-2-azaniumylpropanoate Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 ZXSBHXZKWRIEIA-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- WFZFMHDDZRBTFH-CZEFNJPISA-N 2-[(e)-2-(5-carbamimidoyl-1-benzofuran-2-yl)ethenyl]-1-benzofuran-5-carboximidamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.NC(=N)C1=CC=C2OC(/C=C/C=3OC4=CC=C(C=C4C=3)C(=N)N)=CC2=C1 WFZFMHDDZRBTFH-CZEFNJPISA-N 0.000 description 1
- MSKSQCLPULZWNO-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanamine Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCN MSKSQCLPULZWNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220579649 ATP-dependent RNA helicase A_K417N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241000213948 Astragalus sinicus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102220585969 Claspin_S982A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000270288 Gekko Species 0.000 description 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 1
- 241001109669 Human coronavirus HKU1 Species 0.000 description 1
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 1
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940026233 Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229940025291 Sinovac-CoronaVac COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 102220599400 Spindlin-1_D1118H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599659 Spindlin-1_E484A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599652 Spindlin-1_F490S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220590696 Spindlin-1_G142D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599654 Spindlin-1_G446S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220590604 Spindlin-1_K417N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220590546 Spindlin-1_N440K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599613 Spindlin-1_N679K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599606 Spindlin-1_N764K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599633 Spindlin-1_N969K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220590606 Spindlin-1_S373P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220590601 Spindlin-1_S375F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599655 Spindlin-1_S477N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599660 Spindlin-1_T478K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599683 Spindlin-1_Y505H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091061763 Triple-stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010042365 Virus-Like Particle Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102220354726 c.2282C>T Human genes 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001985 dialkylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008103 phosphatidic acids Chemical class 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 102200056390 rs12204826 Human genes 0.000 description 1
- 102220249089 rs1553970560 Human genes 0.000 description 1
- 102200110418 rs570878629 Human genes 0.000 description 1
- 102220098936 rs763547482 Human genes 0.000 description 1
- 102220029076 rs78775072 Human genes 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用。所述抗新冠病毒的蛋白为S蛋白突变体的组合，所述组合包括第一突变体和第二突变体；所述第一突变体与所述第二突变体不同；其中，所述第一突变体具有如SEQ ID NO:19或其变体所示的氨基酸序列；所述第二突变体具有如SEQ ID NO:20或其变体所示的氨基酸序列。所述核酸编码所述的S蛋白突变体。临床前动物试验数据表明本发明的mRNA疫苗对目前新冠病毒主流变异株(variants of concern，VOC)均具有良好保护效果，具有广泛的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒(coronavirus，CoV)是一类有包膜的单股正链RNA病毒，宿主范围广泛，人和多种动物普遍易感，并且与许多疾病有关。已知的冠状病毒包括HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和/或MERS-CoV，研究表明，SARS-CoV-2病毒的基因序列(GenBank accession:MN908947)与SARS冠状病毒相比具有超过85％的序列相似度。
针对冠状病毒表面刺突蛋白抗原(S蛋白)，主要研发了重组蛋白疫苗、mRNA疫苗、DNA疫苗、非复制型病毒载体疫苗、复制型病毒载体疫苗、多肽疫苗、病毒样颗粒疫苗、减毒疫苗和灭活疫苗。但是现有疫苗存在对细胞的转染率低，表达效率低，刺激的免疫应答弱，临床需要的剂量高的问题，一方面导致生产成本高、病人用药费用高、经济负担重，另一方面高剂量用药会引入更多的杂质，可能会导致毒副作用增大，从而增加临床风险。
在新冠病毒感染的防治中，采用脂质纳米颗粒(LNP)递送系统的mRNA疫苗取得了前所未有的成功。来自Moderna(mRNA-1273)和Pfizer-BioNTech(BNT162b2)的两种mRNA疫苗(编码新型冠状病毒的融合前稳定全长刺突S蛋白)目前正在广泛使用，其他几种候选mRNA疫苗正在临床试验中。然而，随着病毒的不断进化，产生了新的变体，这两种mRNA疫苗的效力正在显著减弱。因此亟待制备新型广谱的mRNA疫苗。
发明内容
为解决现有技术中缺乏有效或广谱性的预防和/或治疗SARS-CoV-2的疫苗的技术问题，本发明提供了一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用。
本发明的第一方面提供一种S蛋白突变体的组合，所述组合包括第一突变体和第二突变体；所述第一突变体与所述第二突变体不同；
其中，所述第一突变体具有如SEQ ID NO:19或其变体所示的氨基酸序列；所述第二突变体具有如SEQ ID NO:20或其变体所示的氨基酸序列；
所述变体为与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，并且保留具有如SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的S蛋白突变体的功能。
在一些优选的实施例中，所述第一突变体和/或第二突变体还包括信号肽。
优选地，所述信号肽位于所述第一突变体和/或第二突变体的N末端。
更优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码如第一方面所述的S蛋白突变体的组合。
在一些优选的实施例中，编码所述组合的核酸中，编码第一突变体的核酸与编码第二突变体核酸包含在同一或不同的核酸分子中。
在一些优选的实施例中，所述核酸为RNA，例如mRNA。
优选地，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21-23任一所示或与如SEQ IDNO:21-23任一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
优选地，编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:15-18任一所示或与如SEQ IDNO:15-18任一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:23所示或与如SEQ ID NO:23具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:15所示或与如SEQ IDNO:15具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:23所示或与如SEQ ID NO:23具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:16所示或与如SEQ IDNO:16具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:23所示或与如SEQ ID NO:23具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:17所示或与如SEQ IDNO:17具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:23所示或与如SEQ ID NO:23具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:18所示或与如SEQ IDNO:18具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:22所示或与如SEQ ID NO:22具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:18所示或与如SEQ IDNO:18具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:22所示或与如SEQ ID NO:22具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:15所示或与如SEQ IDNO:15具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:22所示或与如SEQ ID NO:22具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:16所示或与如SEQ IDNO:16具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:22所示或与如SEQ ID NO:22具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:17所示或与如SEQ IDNO:17具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21所示或与如SEQ ID NO:21具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:18所示或与如SEQ IDNO:18具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21所示或与如SEQ ID NO:21具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:16所示或与如SEQ IDNO:16具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21所示或与如SEQ ID NO:21具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:17所示或与如SEQ IDNO:17具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21所示或与如SEQ ID NO:21具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:15所示或与如SEQ IDNO:15具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
本发明中，编码第一突变体的mRNA和编码第二突变体的mRNA在相同的mRNA链上或者不同的mRNA链上。
优选地，当编码第一突变体的mRNA和编码第二突变体的mRNA在不同的mRNA链上时，在编码第一突变体的mRNA的5’端包括5’UTR；和/或，在编码第一突变体的mRNA的3’端包括3’UTR和/或3’poly(A)。
优选地，当编码第一突变体的mRNA和编码第二突变体的mRNA在不同的mRNA链上时，在编码第二突变体的mRNA的5’端包括5’UTR；和/或，在编码第二突变体的mRNA的3’端包括3’UTR和/或3’poly(A)。
优选地，当编码第一突变体的mRNA和编码第二突变体的mRNA在相同的mRNA链上时，所述mRNA链的5’端包括5’UTR；和/或，3’端包括3’UTR和/或3’poly(A)。
优选地，所述5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
优选地，所述3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在一些优选的实施例中，所述核酸在选自下组的一个或多个位置处包含修饰：5’UTR、开放阅读框、3’UTR和3’poly(A)。
优选地，所述修饰包括胞嘧啶核苷(cytidine，C)转换为5甲基胞苷(m5C)，尿嘧啶核苷(uridine，U)转换为假尿苷(pseudouridine，Ψ)、N1甲基假尿苷(m1Ψ)、5-甲氧基尿苷(mo5U)或5甲基胞苷和假尿苷的整合(m5C/Ψ)。
更优选地，所述修饰为假尿苷修饰或N1甲基假尿苷修饰。
在一些优选的实施例中，所述3’poly(A)的序列如SEQ ID NO:12所示。
在一些优选的实施例中，所述核酸为DNA。
优选地，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2-4任一所示或与如SEQ IDNO:2-4任一具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
优选地，编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:5-8任一所示或与如SEQ IDNO:5-8任一具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:4所示或与如SEQ ID NO:4具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:5所示或与如SEQ ID NO:5具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示或与如SEQ ID NO:2具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:5所示或与如SEQ ID NO:5具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示或与如SEQ ID NO:2具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:6所示或与如SEQ ID NO:6具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示或与如SEQ ID NO:2具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:7所示或与如SEQ ID NO:7具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示或与如SEQ ID NO:2具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:8所示或与如SEQ ID NO:8具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:3所示或与如SEQ ID NO:3具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:5所示或与如SEQ ID NO:5具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:3所示或与如SEQ ID NO:3具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:6所示或与如SEQ ID NO:6具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:3所示或与如SEQ ID NO:3具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:7所示或与如SEQ ID NO:7具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:3所示或与如SEQ ID NO:3具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:8所示或与如SEQ ID NO:8具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:4所示或与如SEQ ID NO:4具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:6所示或与如SEQ ID NO:6具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:4所示或与如SEQ ID NO:4具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:7所示或与如SEQ ID NO:7具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些优选的实施例中，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:4所示或与如SEQ ID NO:4具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:8所示或与如SEQ ID NO:8具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
本发明的第三方面提供一种重组表达载体，其包含第二方面所述的核酸。
优选地，所述重组表达载体的骨架为质粒或病毒。
在一些优选的实施例中，编码所述第一突变体的核酸和编码所述第二突变体的核酸包含在相同或不同的重组表达载体中。
本发明的第四方面提供一种转化体，其包含如上所述的核酸，或如上所述的重组表达载体。所述质粒例如为pcDNA3.1。
在一些优选的实施例中，包含编码所述第一突变体的核酸的重组表达载体的转化体与包含编码所述第二突变体的核酸的重组表达载体的转化体相同或不同。
优选地，所述的转化体的出发细胞为真核细胞，优选哺乳动物细胞，例如HEK 293T细胞。
本发明的第五方面提供一种制备S蛋白突变体的组合的方法，所述方法包括在适合S蛋白突变体表达的条件下，培养如第四方面所述的转化体。
本发明的第六方面提供一种组合物，其包含(1)如上所述的核酸，或如上所述的重组表达载体，或如上所述的转化体，和(2)递送载体。
在一些优选的实施例中，所述递送载体包括脂质体。
在一些优选的实施例中，所述递送载体包括脂质纳米颗粒(LNP)。
优选地，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质和非阳离子脂质。
更优选地，所述阳离子脂质包括RL151和/或Dlin-MC3。
所述阳离子脂质的摩尔比例如为45％至55％。
所述非阳离子脂质的摩尔比例如为55％至45％。
优选地，所述非阳离子脂质包括磷脂和/或脂质缀合物。
更优选地，所述磷脂包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
更优选地，在所述递送载体中，所述磷脂的摩尔比为9％至10％。
更优选地，所述脂质缀合物包括聚乙二醇修饰的脂分子。
进一步更优选地，所述聚乙二醇修饰的脂分子包括DMG-PEG2000。
在一些优选的实施例中，在所述递送载体中，所述脂质缀合物的摩尔比为1％至2％。
在一些优选的实施例中，所述递送载体包括胆固醇。
优选地，在所述递送载体中，所述胆固醇的摩尔比为35％至40％。
在一些优选的实施例中，所述递送载体包含阳离子脂质、胆固醇、磷脂和脂质缀合物。
优选地，所述递送载体包含RL151、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000；且所述RL151、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000的摩尔比为50:38.5:10:1.5。即以RL151、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000的总摩尔数为100％计，含有50％的RL151、38.5mol％的胆固醇、10mol％的DSPC以及1.5mol％的DMG-PEG2000。
在一些优选的实施例中，所述的组合物中，所述核酸为mRNA，且包载在所述递送载体中。
本发明的第七方面提供一种药物组合物，其包含如第六方面所述的组合物，以及任选地药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的第八方面提供一种疫苗，其包含如第一方面所述的S蛋白突变体的组合、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的重组表达载体、如第四方面所述的转化体、如第六方面所述的组合物和/或如第七方面所述的药物组合物，以及药学上可接受的佐剂。
优选地，所述的疫苗，其为蛋白疫苗。
优选地，所述的疫苗，其为核酸疫苗。
优选地，所述的疫苗，其为DNA疫苗或mRNA疫苗。
本发明中，当所述的疫苗为mRNA疫苗时，编码第一突变体的第一mRNA和编码第二突变体的第二mRNA在相同的mRNA链上或不同的mRNA链上。
本发明的第九方面提供一种试剂盒或药盒，所述试剂盒或药盒包含如第一方面所述的S蛋白突变体的组合、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的重组表达载体、如第四方面所述的转化体、如第六方面所述的组合物、如第七方面所述的药物组合物和/或如第八方面所述的疫苗。
本发明的第十方面提供一种如第一方面所述的S蛋白突变体的组合、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的重组表达载体、如第四方面所述的转化体、如第六方面所述的组合物、如第七方面所述的药物组合物、如第八方面所述的疫苗、和/或如第九方面所述的试剂盒或药盒在制备用于缓解、预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
优选地，所述药物为疫苗。
更优选地，所述疫苗为蛋白疫苗。
更优选地，所述疫苗为核酸疫苗。
更优选地，所述疫苗为DNA疫苗或mRNA疫苗。
本发明的第十一方面提供一种如第一方面所述的S蛋白突变体的组合、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的重组表达载体、如第四方面所述的转化体、如第六方面所述的组合物、如第七方面所述的药物组合物、如第八方面所述的疫苗、和/或如第九方面所述的试剂盒或药盒用于缓解、预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病。
本发明的第十二方面提供一种缓解、预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的方法，即向有需要的受试者施用有效量的如第一方面所述的S蛋白突变体的组合、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的重组表达载体、如第四方面所述的转化体、如第六方面所述的组合物、如第七方面所述的药物组合物、如第八方面所述的疫苗、和/或如第九方面所述的试剂盒或药盒。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的新冠病毒变异株mRNA疫苗临床前动物试验数据表明其对目前新冠病毒主流变异株(variants of concern，VOC)均具有长期、良好保护效果，具有广泛的临床应用前景。
附图说明
图1显示了嵌合体A表达抗原的结构表征。
图2显示了本发明提供的对编码S蛋白抗原mRNA密码子和修饰核苷酸的筛选；其中，S codon(44)至S codon(62)表示序列中的GC含量从44％到62％。
图3显示了本发明对假尿苷修饰后密码子的最终优化方案；其中，S(44)至S(62)表示序列中的GC含量从44％到62％。
图4显示了嵌合体A的三款mRNA的表达水平。
图5显示了western blot检测细胞裂解液中S蛋白的含量；NC代表阴性对照。
图6显示了嵌合体A的原型株LNP和嵌合体ALNP的蛋白表达水平。
图7显示了嵌合体A的原型株和嵌合体A(1μg)免疫小鼠的血清中针对不同新冠病毒突变株的假病毒中和抗体水平。
图8为嵌合体A(5μg和25μg剂量)在金黄地鼠中针对原型株和突变株B.1.617.2的IgG抗体滴度。
图9为嵌合体A在金黄地鼠中针对原型株和突变株(B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.2和B.1.1.529)的假病毒中和抗体滴度。
图10为嵌合体A(30μg和100μg剂量)在恒河猴中对原型株S蛋白和突变株(B.1.1.7、B.1.351和B.1.617.2)S蛋白产生了特异性IgG抗体。
图11的假病毒检测结果显示了嵌合体A疫苗在恒河猴中产生针对原型株和不同突变株(B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.2和B.1.1.529)的中和抗体，具有广谱中和能力。
图12为嵌合体A(60μg和240μg剂量)在食蟹猴中对原型株S蛋白和突变株(BA.5)的S蛋白产生了特异性IgG抗体。
图13的假病毒检测结果显示了嵌合体A疫苗在食蟹猴中产生针对原型株和不同突变株(B.1.351、B.1.1.529、BA.2、BA.2.3.20、BA.2.38、BA.2.75、BA.4/5和BF.7)的中和抗体，具有广谱中和能力。
图14显示了嵌合体A疫苗免疫SD大鼠后的安全性评价。
图15显示了嵌合体E mRNA疫苗的序列设计。
图16显示了嵌合体E疫苗(2μg和5μg剂量)在BALB/c小鼠中针对原型株和OmicronXBB.1.5株S蛋白的IgG抗体滴度。
图17显示了嵌合体E疫苗在BALB/c小鼠中针对Omicron突变株(BA.4/5、BQ.1.1、XBB.1.5、CH.1.1和XBB.1.16)的假病毒中和抗体滴度。
图18显示了嵌合体E疫苗(2μg和5μg剂量)在K18-hACE2小鼠中对原型株和OmicronXBB.1.5株S蛋白都产生了特异性IgG抗体。
图19显示了嵌合体E疫苗在K18-hACE2小鼠中针对Omicron不同突变株(XBB.1.5和XBB.1.16)都产生了高滴度的中和抗体。
图20显示了嵌合体E疫苗在K18-hACE2小鼠中针对Omicron XBB.1.5株产生了高滴度的中和抗体。
图21显示了嵌合体E疫苗(5μg和25μg剂量)在金黄地鼠中对原型株S蛋白和Omicron XBB.1.5株S蛋白都产生了特异性IgG抗体。
图22显示了嵌合体E疫苗在金黄地鼠中针对Omicron不同突变株(XBB.1.5和XBB.1.16)都产生了高滴度的中和抗体。
图23显示了嵌合体E疫苗在金黄地鼠中针对Omicron XBB.1.5株产生了高滴度的中和抗体。
图24显示了嵌合体E疫苗免疫新西兰兔后的组织病理变化。
图25显示了BALB/c小鼠序贯后血清IgG抗体滴度。
图26显示了BALB/c小鼠序贯后血清假病毒中和抗体滴度。
图27显示了BALB/c小鼠序贯后血清真病毒中和抗体滴度。
图28显示了BALB/c小鼠二免后36天及75天脾脏抗原特异性T细胞免疫应答结果。
图29显示了嵌合体E疫苗-20℃保存条件下的长期稳定性。
图30显示了嵌合体E疫苗的长期免疫原性评价结果。
图31显示了嵌合体A、嵌合体E以及组合疫苗C在BALB/c小鼠中针对原型株和Omicron XBB.1.5株S蛋白的IgG抗体滴度。
图32显示了嵌合体A、嵌合体E以及组合疫苗C在BALB/c小鼠中针对Beta株和Omicron突变株(BA.4/5、BQ.1.1、XBB.1.5、CH.1.1和XBB.1.16)的假病毒中和抗体滴度。
图33显示了免疫后6-14周BALB/c小鼠的中和抗体滴度。
图34显示了免疫后6-14周BALB/c小鼠的IgG抗体滴度。
图35显示了BALB/c小鼠序贯后血清IgG抗体滴度。
图36显示了BALB/c小鼠序贯后血清假病毒中和抗体滴度。
图37显示了嵌合体E疫苗以及组合疫苗C在K18-hACE2小鼠上二免后70天脾脏抗原特异性T细胞免疫应答结果示意图。
图38显示了组合疫苗C免疫新西兰兔后的组织病理变化示意图。
图39显示了组合疫苗C在-20℃保存条件下的长期稳定性。
图40的真病毒中和抗体检测结果显示了组合疫苗C在BALB/c小鼠中针对Beta株和Omicron XBB.1.5株均产生了高滴度的中和抗体。
具体实施方式
如无特殊指出，本发明的术语如下文定义。
本文中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以包括改性氨基酸。这些术语还包括已经自然或通过干预进行修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记成分的结合。例如，定义中还包括含有一种或多种氨基酸类似物的多肽(例如包括非天然氨基酸，如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰苯丙氨酸、D-氨基酸和肌氨酸)，以及本领域已知的其他修饰。
术语“多肽”是指任何大小、结构或功能的蛋白质和肽。多肽包括编码的多核苷酸产物、天然的多肽、合成的多肽、同源物、正源物、旁系物、片段和其他等价物、变体以及前述的类似物。多肽可以是一个单体，也可以是一个多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们也可以包括单链或多链的多肽。最常见的是在多链多肽中发现二硫化物连接。术语多肽也可适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的自然发生的氨基酸的人工化学模拟物。在一些实施方案中，“多肽”的长度可以小于或等于50个氨基酸，例如，大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。
术语“信号肽”包括蛋白质的N端15-60个氨基酸，通常需要在分泌途径上进行跨膜转运，因此，在真核生物和原核生物中普遍控制大多数蛋白质进入分泌途径。信号肽通常包括三个区域：一个不同长度的N端区域，通常包括带正电的氨基酸；一个疏水区域；和一个短的羧基端肽区域。在真核生物中，新生前体蛋白的信号肽将核糖体引导到粗糙的内质网(ER)膜上，并将生长中的肽链输送到膜上进行加工，产生成熟的蛋白质后信号肽从前体蛋白中被裂解。信号肽也可以促进蛋白质在细胞膜上的定位。然而，信号肽不负责成熟蛋白的最终目的地。在其序列中没有额外地址标签的分泌性蛋白被默认为分泌到外部环境中。
术语“序列优化”是指一个过程或一系列过程，通过这些过程，参考核酸序列中的碱基被替换成替代碱基，从而产生具有改进特性的核酸序列，例如，改进蛋白质表达或降低免疫原性。一般来说，序列优化的目标是产生一个同义的核苷酸序列，与编码参考核苷酸序列所编码的多肽序列相同。因此，在由密码子优化的核苷酸序列编码的多肽中，相对于由参考核苷酸序列编码的多肽而言，没有氨基酸的取代。
在序列优化的背景下，术语“密码子替换”是指用另一个密码子替换参考核酸序列中的密码子。一个密码子可以在参考核酸序列中被替换，例如，通过化学肽合成或通过本领域已知的重组方法。因此，提及在核酸序列(如mRNA)的某一位置或在核酸序列(如mRNA)的某一区域或子序列中的“替换”或“取代”是指在该位置或区域的密码子被替代。如本文所用，术语“编码区”，是指多核苷酸中的开放阅读框(ORF)，其在表达时产生多肽或蛋白质。
如本文所使用的，术语“分离的”是指已经从与之相关的至少一些成分中分离出来的物质或实体(无论是在自然界还是在实验环境中)。分离的物质(如多核苷酸或多肽)相对于它们被分离出来的物质，可以有不同程度的纯度。分离的物质和/或实体可以与最初与之相关的其他成分中的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％，或更多的成分分离。在一些实施方案中，分离的物质纯度超过约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或超过约99％。如本文所用，如果物质基本上不含其他成分，则为“纯"。
如本文所使用的，术语“分离的”多核苷酸、载体、多肽、细胞或任何组合物是指多核苷酸、载体、多肽、细胞或组合物，其形式在自然界中没有发现。分离的多核苷酸、载体、多肽或组合物包括那些已经被纯化到不再以自然界中的形式存在的多核苷酸、载体、多肽或组合物。在某些方面，被分离的多核苷酸、载体、多肽或组合物基本上是纯的。
术语“核酸”包括任何由核苷酸聚合物组成的化合物和/或物质。这些聚合物通常被称为多核苷酸。示例性的核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、糖核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己基核酸(CeNA)或其混合体或组合。“多核苷酸”包括三链、双链和单链的DNA或RNA。它还包括改性的，例如通过烷基化，和/或通过盖帽，以及未改性形式的多核苷酸。更具体地说，术语“多核苷酸”包括多脱氧核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)，多核苷酸(含D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA。
在特定方面，“多核苷酸”包括mRNA。在一个方面，该mRNA是一种合成mRNA。在某些方面，合成的mRNA包括至少一个非天然碱基。在某些方面，某一类的所有核碱基都被替换为非天然碱基(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷可以被替换为非天然碱基，例如，5-甲氧基尿苷)。在某些方面，多核苷酸(例如，合成RNA或合成DNA)仅包括天然碱基，即在合成DNA的情况下为A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞苷)和T(胸苷)，或者在合成RNA的情况下为A、C、G和U(尿苷)。
本领域技术人员将理解，本文披露的密码子图谱(codon map)中的T存在于DNA中，而T在相应的RNA中会被U取代。例如，本文披露的DNA形式的密码子核苷酸序列，如载体或体外翻译(IVT)模板，其T将在其相应的转录的mRNA中被转录为U。在这方面，密码子优化的DNA序列(包括T)和其相应的mRNA序列(包括U)都被视为密码子优化的核苷酸序列。此外，还可以通过用非天然碱基替换一个或多个碱基来产生等效的密码子图谱。因此，例如，TTC密码子(DNA图谱)对应于UUC密码子(RNA图谱)，而UUC密码子又对应于ΨΨC密码子(RNA图谱，其中U被替换为假尿苷)。
术语“核苷酸序列编码”是指编码多肽的核酸(例如mRNA或DNA分子)编码序列。编码序列可以进一步包括与调节元件可操作地连接的起始和终止信号，包括启动子和多腺苷酸化信号，能够指导在被施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中表达。编码序列可以进一步包括编码信号肽的序列。
此外，在mRNA的ORF(Open Reading Frame，开放阅读框)两端各存在一段非翻译区，分别称为5’UTR与3’UTR。“5’非翻译区”(5’UTR)是指从起始密码子(即由核糖体翻译的mRNA转录本的第一个密码子)直接上游(即5’)的mRNA区域，该区域不编码多肽。“3’非翻译区”(3’UTR)是指从终止密码子(即mRNA转录本中发出翻译终止信号的密码子)直接下游(即3’)的mRNA区域，该区域不编码多肽。“开放阅读框”是以起始密码子(例如甲硫氨酸(ATG))开始，以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束并编码多肽的一段连续的DNA。非翻译区不能翻译氨基酸，但是可以结合RNA结合蛋白，从而调控mRNA产品的降解和翻译效率。5’-UTR或3’UTR可以与多核苷酸中的开放阅读框同源或异源。多个5’-UTR或3’UTR可以包括在侧翼区域，可以是相同的或不同的序列。
“polyA”或“poly(A)”是mRNA的一个区域，它位于3’UTR的下游，例如，直接下游(即3’)，包含多个连续的腺苷单磷酸。一个polyA尾可以包含10到300个单磷酸腺苷。例如，一个polyA尾可以包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个腺苷单磷酸。在一些实施方案中，一个poly(A)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关的生物环境中(例如在细胞中，在体内)，poly(A)尾的功能是保护mRNA不被酶降解，例如在细胞质中，并帮助转录终止、mRNA从核中输出和翻译。
术语“阳离子脂质”在本领域具有普通意义，可指包含一个或多个带正电基团的脂质。如本文所用，“带正电基团”是指带有正电子电荷的化学基团，例如，一价(+1)、二价(+2)、三价(+3)，等等。正电子电荷基团的例子包括胺基、铵基、吡啶基、胍基和咪唑基。在某些实施方案中，可电离的脂质分子可包括一个胺基，并可称为可电离的氨基脂质。本发明中，阳离子脂质包括但不限于RL151和/或Dlin-MC3。
如本文所用，术语“聚乙二醇化脂质”或“PEG化脂质”是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质(PEG-脂质)。PEG-脂质的非限制性例子包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺共轭物(如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二氰氧丙烷-3胺。例如，PEG-脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC，或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG-脂质包括但不限于1,2-dimyristoyl-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-distearoyl-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-disteryl glycerol(PEG-DSG)、PEG-dipalmetoleyl、PEG-dioleyl、PEG-distearyl、PEG-diacylglycamide(PEG-DAG)、PEG-dipalmitoylphosphatidylethanolamine(PEG-DPPE)或PEG-1,2-dimyristyloxlpropyl-3amine(PEG-c-DMA)。
在一些实施方案中，PEG-脂质选自包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及其混合物的组。在一些实施方案中，PEG-脂质的脂质分子包括那些具有从约C14到约C22的长度，优选从约C14到约C16的长度。在一些实施方案中，PEG分子，例如mPEG-NH2，其大小约为1000、2000、5000、10000、15000或20000道尔顿。在一些实施方案中，PEG-脂质是PEG2000-DMG。
本文中，“脂质纳米颗粒”或“LNP”(lipid nanoparticle)用于mRNA的递送。在一些实施方案中，LNP基本上包括(i)至少一种阳离子脂质；(ii)选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质；(iii)甾醇，例如胆固醇；以及(iv)PEG-脂质，例如PEG2000-DMG，摩尔比为45-55％阳离子脂质:35-40％中性脂质:8-12％甾醇:1-2％PEG-脂质。
如本文所用，术语“合成”是指通过人工生产、准备和/或制造。多核苷酸或其他分子的合成可以是化学的或酶的。如本文所用，核酸序列的“表达"是指多核苷酸(如mRNA)翻译成多肽或蛋白质和/或多肽或蛋白质的翻译后修饰。转染的方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。
术语“转录”是指从DNA(例如，DNA模板或序列)产生mRNA(例如，mRNA序列或模板)的方法。“转染”则是指将多核苷酸(例如，外源核酸)引入细胞，其中多核苷酸编码的多肽被表达(例如，mRNA)或多肽调节细胞功能(例如，siRNA，miRNA)。例如，转染可在体外、体外或体内发生。
“修饰”是指以某种方式改变任何物质、化合物或分子。分子可以经历一系列的修饰，每个修饰的分子都可以作为后续修饰的“未修饰”起始分子。本文中，所述修饰包括将胞嘧啶核苷(cytidine，C)转换为5甲基胞苷(m5C)，尿嘧啶核苷(uridine，U)转换为假尿苷(pseudouridine，Ψ)、N1甲基假尿苷(m1Ψ)、5-甲氧基尿苷(mo5U)或5甲基胞苷和假尿苷的整合(m5C/Ψ)。
术语“变体”或“突变体”包括天然变体(如多态性、异构体等)和人工变体，其中本地或起始序列(如野生型序列)中的至少一个氨基酸残基已被移除，并在相同位置插入不同的氨基酸。这些变体可以被描述为“替换性变体”。替换可以是单一的，即分子中只有一个氨基酸被替换，也可以是多个，即同一分子中有两个或多个氨基酸被替换。如果氨基酸被插入或删除，产生的变体将分别是“插入性变体”或“删除性变体”。
如本文所用，术语“免疫反应”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其结果是对入侵的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞，或在自身免疫或病理性炎症的情况下对正常人的细胞或组织进行选择性损伤、破坏或从人体内排除。在某些情况下，服用由脂质成分和封装的治疗剂组成的纳米粒子可以引发免疫反应，这可以由(i)封装的治疗剂(如mRNA)，(ii)这种封装的治疗剂的表达产物(如mRNA编码的多肽)，(iii)纳米粒子的脂质成分，或(iv)其组合引起。
如本文所用，术语“疫苗”是一种生物制剂，可激发免疫系统对某种制剂或抗原产生反应，通常是一种传染性病原体或其一部分，以非传染性或非致病性的形式进入人体或动物体内。一旦免疫系统被激发，以后免疫系统接触到该病原体，就会产生快速和强大的免疫反应，在该病原体能够繁殖和感染宿主生物体中的足够细胞以引起疾病症状之前将其消灭。用于激发免疫系统的制剂或抗原可以是传染性较低的整个生物体，即所谓的减毒生物体，或者在某些情况下是生物体的组成部分，如代表生物体各种结构成分的碳水化合物、蛋白质或肽。因此根据本发明，疫苗可以是蛋白疫苗，也可以是核酸疫苗。所述核酸疫苗可以是DNA疫苗，也可以为mRNA疫苗。当为蛋白疫苗时，所述疫苗可以由本发明的多核苷酸或mRNA编码。
单一剂量的疫苗(初次免疫)所引起的免疫反应往往不足以有效和/或持续地提供有效的保护。反复给药(加强)可以大大增强对疫苗抗原的体液和细胞反应(例如，Estcoat等人，见2002年)。本发明所述的“加强”均是指在第一次免疫过后的某天，对相应的动物采用与第一次免疫接种完全相同的样品进行第二次免疫接种。
本发明中使用的“组合”是指包含本发明的成分，即S蛋白突变体和/或编码S蛋白突变体的核酸、编码S蛋白突变体的DNA和/或mRNA的任何物质组成。应理解的是，所述组合可以配制成单一组分，或者，它可以作为分离的制剂，然后可以组合以联合给药。所述组合可以作为组合物的有效活性成分(或者有效成分、活性成分)。本发明的所述组合在用于制备药物组合物时，所述药物组合物中还可包含本领域技术人员熟知的药学上可接受的辅料和/或载体。本发明的组合或药物组合物也可以以成套试剂盒的形式提供，其中各组分分别配制但包装在单个容器中。
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全减轻、改善、改进、缓解、推迟发病、抑制进展、降低严重程度和/或减少特定感染、疾病、紊乱和/或条件的一个或多个症状或特征的发生率。例如，“治疗”癌症可能是指抑制肿瘤的生存、生长和/或扩散。可以对没有表现出疾病、紊乱和/或病症迹象的受试者和/或仅表现出疾病、紊乱和/或病症早期迹象的受试者进行治疗，以降低与疾病、紊乱和/或病症相关的病理发展风险。
术语“治疗剂”或“预防剂”是指任何在对受试者施用时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引起所需生物和/或药理学效应的药剂。治疗剂包括但不限于细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、小分子药物、蛋白质和核酸。
在一些实施方案中，治疗剂是一种多核苷酸或核酸(例如，核糖核酸或脱氧核糖核酸)。根据本公开内容使用的示例性多核苷酸包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)包括信使mRNA(mRNA)或其杂交物、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适配体和载体等的一种或多种。在一些实施方案中，治疗性和/或预防性药物是一种RNA。在本文所述的组合物和方法中有用的RNA包括但不限于核酶、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、microRNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)，以及它们的混合物。在某些实施方案中，该RNA是mRNA。
在某些实施方案中，治疗和/或预防措施是一种mRNA。mRNA可以编码任何感兴趣的多肽，包括任何自然或非自然发生的或以其他方式修改的多肽。由mRNA编码的多肽可以是任何大小，可以有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，由mRNA编码的多肽在细胞中表达时可具有治疗效果。
本文使用的“和/或”应被视为具体披露两个特定特征或组件中的每一个，无论是否有另一个。因此，本文在诸如“A和/或B”这样的短语中使用的术语“和/或"旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，在诸如“A、B和/或C”这样的短语或“A、B和C中的一种或多种”中使用的术语“和/或”或“一种或多种”意在包括以下各方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
还应注意到，术语“包括”的目的是开放和允许的，但不要求包括额外的元件或步骤。当使用术语“包括”时，术语“基本由…组成”和“由…组成”也包括在内。当组合物被描述为具有、包括或包含特定的成分时，可以考虑组合物也基本上由或由所述的成分组成。同样，当方法或工艺被描述为具有、包括或包含特定的步骤时，该方法或工艺也基本上包括或由所述的步骤组成。此外，应该理解的是，只要本发明保持可操作性，步骤的顺序或执行某些行动的顺序是不重要的。此外，两个或多个步骤或行动可以同时进行。
术语“同一性”是指两个或多个多肽或多核苷酸的序列之间的相似性或一致性，通过比较这些序列确定。适用于多肽或多核苷酸序列的“同一性百分比”被定义为一氨基酸或核酸序列中与另一氨基酸序列或核酸序列中的残基(氨基酸残基或核酸残基)相同的百分比，通过对准序列并引入间隙(如有必要)以达到最大的同一性百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域是众所周知的。同一性取决于对同一性百分比的计算，但由于计算中引入的间隙和惩罚，其数值可能不同。“同一性”是由本领域技术人员使用比对工具和特定的参数确定的。这样的比对工具包括BLAST套件中的工具(Stephen F.Altschul，等(1997)，特定的参数设置为本领域技术人员所熟知。
如果其它多肽或多核苷酸分子与本文中的多肽或多核苷酸分子具有一定程度的同一性，则也属于本发明的保护范围。具体地，其它多核苷酸或多肽的变体与本发明所保护的特定多核苷酸或多肽具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或在核心序列或氨基酸残基相同的基础上具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，则可以视为与本发明保护的特定多肽或多核苷酸分子等同或相同。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：mRNA的序列设计
本发明嵌合体A(即第一突变体的一个示例)的mRNA序列编码一种接近全长的S蛋白，去除了Furin酶切位点与C末端18个氨基酸，保留了跨膜区，稳定抗原构象。在NTD区具有△H69、△V70、△Y144(△表示该位点被敲除)突变，在RBD区具有K417N、E484K和N501Y突变，在SD1区具有A570D突变，SD2区具有D614G和P681H突变，及其他区域的A701V、T761I、S982A和D1118H突变等。与BNT162b2和mRNA-1273中使用的S2P设计不同，嵌合体A的mRNA序列中突变了Furin蛋白酶识别位点，将RRAR突变至GSAS(图1)，从而保持了mRNA疫苗在体内表达S蛋白的完整性，提高了抗原表位的稳定性和疫苗免疫原性。
本发明嵌合体E(即第二突变体的一个示例)用于制备针对奥密克戎亚变种XBB.1、XBB.1.5和XBB.1.5.1序列设计的单链mRNA嵌合体疫苗。如图15所示，嵌合体E在NTD区具有△Y144(△表示该位点被敲除)突变，在NTD区还具有T19I、LPPA24S、V83A、G142D、H146Q、Q183E、V213E、G252V突变，在RBD区具有G339H、R346T、L368I、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、V445P、G446S、N460K、S477N、T478K、E484A、F486P、F490S、Q498R、N501Y、Y505H突变，在SD2区具有D614G、H655Y、N679K、P681H突变，在其他区域具有N764K、D796Y、Q954H和N969K突变；此外，嵌合体E的序列中突变了Furin蛋白酶识别位点，将RRAR突变至GSAS；去除了C末端18个氨基酸，保留了跨膜区，稳定抗原构象；从而保持了mRNA疫苗在体内表达S蛋白的完整性，提高了抗原表位的稳定性和疫苗免疫原性。
本发明的组合疫苗C，包括嵌合体A与嵌合体E。
实施例2：mRNA的深度优化与筛选
本实施例对所用S蛋白的mRNA序列进行了密码子和修饰核苷酸的深度优化，以期降低体内的免疫原性及达到最强的体内抗原表达效果。
具体地，本发明设计了10种不同密码子的S蛋白编码序列，测试了6种不同的修饰核苷酸，包括胞嘧啶核苷(cytidine，C)转换为5甲基胞苷(m5C)，尿嘧啶核苷(uridine，U)转换为假尿苷(pseudouridine，Ψ)、N1甲基假尿苷(m1Ψ)、5-甲氧基尿苷(mo5U)或5甲基胞苷和假尿苷的整合(m5C/Ψ)。
图2显示了在HEK293细胞中转入具有不同GC含量与修饰的mRNA的表达量。其中：SCodon后面括号里的数字表示编码的GC含量(本发明所述的GC含量是指在DNA的4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率)，WT表示原型株(wild type，未经密码子优化和核苷酸修饰)，数字1至6分别表示：1表示尿苷U，2表示m5C/Ψ，3表示Ψ，4表示mo5U，5表示m1Ψ，6表示m5C。图2的结果表明Ψ和m1Ψ修饰的mRNA表达量最高。
因此本发明测定了从GC含量44％(即图3中的“S(44)”)至62％(即图3中的“S(62)”)的假尿苷修饰，图3的结果说明无论使用的密码子序列的GC含量，假尿苷修饰均可改善S蛋白的表达；其中含有60％GC含量的S蛋白序列为最优序列，能得到最优的体外表达效果。因此确定嵌合体E的序列使用假尿苷的修饰，并将S(60)的密码子基本确定为最优的密码子序列。由此本发明针对嵌合体A，设计了60％GC含量的多条mRNA序列；针对嵌合体E的mRNA序列例如SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18所示。其中四条mRNA表达的western结果如图4所示：其中三条mRNA(SEQ ID NO:15-17，分别对应密码子不同的v1、v2和v3)的表达都满足mRNA疫苗的表达标准。
本发明的mRNA还包括5’UTR与3’UTR，例如分别如SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14所示。数据表明本发明选择的UTR序列有利于提高S蛋白表达效率。
为提高mRNA的翻译效率和稳定性，本发明的mRNA的3’端还具有poly(A)尾，其核苷酸序列例如SEQ ID NO:12所示。
在此基础上，对原型株、Alpha突变株、Beta突变株和嵌合体A的四款mRNA分子进行了体外转录制备，分别转染到293T细胞中，19hr后收集细胞，用western blot方法检测细胞裂解液中S蛋白的含量(图5)。
实施例3：脂质纳米颗粒制备
将实施例2的嵌合体A、嵌合体E的mRNA分别在低pH下离子化(阳离子)，由两种辅助脂质DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱，货号：B90536，厂家：日本精化株式会社)和胆固醇(货号：C00373，厂家：日本精化株式会社)，以及聚乙二醇化脂质(DMG-PEG2000，货号：M-DMG-2000，购自：JenKem)包被成纳米颗粒。通过将溶解在超纯水中的mRNA，与pH 4.0的100mM(毫摩尔每升，或记作mmol/L)的柠檬酸盐缓冲液按1:1的体积比混合，制备了mRNA的水溶液。调节四种脂质组分比例(例如，阳离子脂质RL151(货号：W211-YB211202，购自：浙江神州药业):胆固醇:DSPC:DMG-PEG2000＝50:38.5:10:1.5)，在99.5％的乙醇中溶解为脂质溶液。将mRNA和脂质溶液在NanoAssemblr(厂家：Precision Nanosystems)微流体混合系统中以H2O:EtOH＝3:1的体积混合比和恒定的12mL/min的总流速混合，得到包含mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)。脂纳米颗粒经过透析、浓缩、过滤后保存，即得到嵌合体A疫苗和嵌合体E疫苗。
将实施例2的嵌合体A和嵌合体E的mRNA在低pH下离子化(阳离子)，参照上述方法制备得到嵌合体A和嵌合体E的组合疫苗C。
实施例4：LNP的蛋白表达以及动物学实验
1.mRNA和LNP的表达检测
以嵌合体A为例，在HEK293A细胞中测试了LNP的蛋白表达水平(图6)。将5μg LNP与HEK293A细胞在12孔板的一个孔中孵育18小时，收集细胞通过蛋白质印迹检测蛋白质表达。简而言之，收集细胞并用PBS(磷酸盐平衡生理盐水)洗一遍，并用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(pH为7.4的20mM的Tris-HCl、150mM的NaCl、3mM的MgCl2、1％的Triton X-100)裂解细胞。所有样品与SDS(十二烷基硫酸钠)上样缓冲液混合，在4～20％梯度SDS凝胶中分离，并通过Trans-Blot Turbo转移系统(全能型蛋白转印系统，购自BioRad)转移到PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)。将PVDF膜用含有5％脱脂奶粉的PBST(磷酸缓冲液)封闭，然后与一抗(厂家：义翘神州；货号40589-T62)孵育。使用HRP偶联二抗和增强化学发光(ECL)检测系统检测信号。
2.动物疫苗接种和血清采集
BALB/c小鼠：对于小鼠疫苗接种，使用原型株A或嵌合体A疫苗对6至8周龄雌性BALB/c小鼠(购自：杭州子源实验动物科技有限公司)进行肌内免疫接种(以下简称为“免疫”)，并在接种后的第21天给予第二剂以增强免疫反应。各组BALB/c小鼠数量为8(n＝8)。
金黄地鼠：6至8周龄的雌性金黄地鼠(购自：北京维通利华实验动物技术有限公司)在第0周(指第一剂免疫的7天内)用嵌合体A疫苗或安慰剂(PBS)进行肌内免疫。在第3周，所有金黄地鼠都接受了加强。各组金黄地鼠数量为10(n＝10)。
恒河猴：对于恒河猴(购自：湖北天勤生物科技有限公司)的疫苗接种，对三组6至8岁的雄性或雌性恒河猴分别用两种不同剂量的嵌合体A疫苗或PBS间隔三周免疫两次。各组恒河猴数量为4(n＝4)，均各自采用2只雌性和2只雄性恒河猴。
食蟹猴：对于食蟹猴(购自：云南英茂生物科技有限公司)的疫苗接种，对三组2至4岁的雄性或雌性食蟹猴分别用两种不同剂量的嵌合体A疫苗或PBS间隔三周免疫两次。各组食蟹猴数量为4(n＝4)，均各自采用2只雌性和2只雄性食蟹猴。
新西兰兔：对于新西兰兔(购自：青岛康大爱博生物科技有限公司)的疫苗接种，对8只7-8月的雄性或雌性新西兰兔，雌雄各半，4只/性别，左侧均给予安慰剂(氯化钠注射液)，右侧给予组合疫苗C，单点注射，间隔两周免疫两次。新西兰兔总数为8(n＝8)。
收集上述经过免疫的小鼠、金黄地鼠、恒河猴、食蟹猴以及新西兰兔的血清，并在56℃下灭活0.5小时，以检测SARS-CoV-2S蛋白特异性IgG和中和抗体，如下所述。
3.特异性IgG酶联免疫吸附试验
通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定免疫血清中的SARS-CoV-2S蛋白特异性抗体反应。简言之，96孔板在4℃下用50μL的包被缓冲液包被，该包被缓冲液含有100ng(纳克)/孔的重组SARS-CoV-2刺突蛋白或RBD抗原(厂家：Sino Biological，Arco)过夜。在室温下用含有2％牛血清白蛋白的PBST溶液将板封闭1小时。将免疫小鼠血清稀释100倍作为初始浓度，然后在PBS缓冲液中进行5倍连续稀释，一共稀释11个梯度。PBST洗涤板与连续稀释的血清在室温下孵育2小时。为了确定S特异性抗体反应，将板与山羊抗小鼠IgG HRP(用于小鼠血清，货号：SA00001-1，购自：Proteintech)或山羊抗叙利亚仓鼠IgG HRP(用于仓鼠血清，货号：ab6892，购自abcam)或山羊抗猴IgG HRP(用于NHP血清，货号：PA1-84631，购自：Invitrogen)在37℃下孵育1小时，然后使用底物四甲基联苯胺(TMB)溶液(货号：00-4201-56，购自：Invitrogen)显色。约10分钟后，用1M的硫酸终止显色反应，并通过酶标仪(型号：VARIOSKAN LUX，购自赛默飞)在450nm波长下测量吸光值。
4.假病毒中和试验
用细胞培养基连续稀释从本实施例第3项所述的免疫动物收集的血清样品。将稀释的血清与假病毒悬浮液以按1:1的比例混合在96孔板中，然后将Opti-HEK293/ACE2细胞添加到前述96孔板中的血清与假病毒的混合物中，并将板在37℃的环境下在含有5％CO2的培养箱(即培养箱中含有5％的CO2和95％的空气)中培养。48小时后，使用荧光素酶检测试剂盒测量反映SARS-CoV-2假病毒转染程度的荧光素酶活性。NT50定义为稀释倍数，与对照组相比，其对假病毒感染的抑制超过50％。
5真病毒中和实验
使用空斑形成分析方法(Focus forming assay，FFA)对本实施例第3项所述的免疫动物收集的血清样品进行真病毒中和抗体检测。用不含FBS的DMEM将抗体自1：8开始进行2倍系列稀释，之后加入真病毒稀释液均匀混合，37℃5％CO2培养箱中孵育。然后将抗体-病毒孵育混合物对应转移至预先铺好的Vero E6细胞板中，在37℃、5％CO2孵育。之后加入PFA对细胞进行灭活固定。BSA封闭后清洗细胞，然后加入稀释好的一抗，37℃孵育。清洗细胞后加入稀释好的二抗，37℃孵育。清洗细胞，加入KPL True-blue显色液，室温避光孵育。清水冲洗细胞后晾干，用酶联免疫斑点分析仪扫板斑点计数。计算抑制率＝100％×(1-样品斑点数/阳性孔斑点数)。FRNT50＝高于50％抑制率病毒稀释度的对数+比距×(低于50％抑制率病毒稀释度的对数-高于50％抑制率病毒稀释度的对数)。其中：比距＝(对照阳性孔50％抑制率斑点数-高于50％抑制率病毒稀释度斑点数)/低于50％抑制率病毒稀释度斑点数-高于50％抑制率病毒稀释度斑点数)，查对应反对数，即为FRNT50。
6.疫苗安全性评价
嵌合体A的安全性在SD大鼠(购自：浙江维通利华实验动物技术有限公司)中进行了评估。三组SD大鼠，每组各自分别采用5只雌性和5只雄性SD大鼠，分别用高剂量嵌合体A(40μg/剂)、空白脂质体高剂量组(1.293mg/剂)和PBS分别在第0天、第14天和第28天进行免疫。在免疫接种期间和之后收集肺、脑、心脏、肝脏、脾脏和肾脏的器官用于病理分析。
组合疫苗C的安全性在新西兰兔中进行了评估。8只新西兰兔雌雄各半，4只/性别/组。采用同体左右侧自身对比法，每只动物左右侧股四头肌进行肌肉注射给药，所有动物左侧注射阴性对照品，右侧注射组合疫苗C，剂量为30μg/只，单点注射。间隔14天进行两次免疫。前2只/性别动物于末次药后48h(D16)实施安乐死，剩余动物于末次药后14天(D28)实施安乐死。收集所有给药动物的给药部位进行组织病理学分析和安全性评估。
7.统计分析
使用GraphPad Prism8.0执行所有统计数据并绘制图表。EC50(半最大效应浓度，concentration for50％of maximal effect)值通过非线性回归计算。当分析数量为两组时通过t检验(Student's t test)进行统计分析，当分析数量为两组以上时通过方差分析进行统计分析。
实施例5：原型株和嵌合体A疫苗在BALB/c小鼠中的免疫原性评价
评估原型株和嵌合体A疫苗在BALB/c小鼠中的免疫原性和广谱性。将小鼠分为两组小鼠，每组有8只小鼠，于第0天分别用1μg的原型株或嵌合体A疫苗通过肌肉注射给药。所有组在第21天都进行加强免疫。整个实验过程中未观察到局部炎症或其他不良反应。我们用假病毒中和实对第42天采集的血清的中和抗体(Nab，neutralizing antibody)水平进行了评估。结果显示，嵌合体A疫苗的小鼠针对各变异株的几何平均滴度(B.1.1.7(GMT为2046)、B.1.351(GMT为1553)和B.1.617.2(GMT为1258)的NAb水平分别为原型株A疫苗免疫小鼠的5、8、2倍(图7)。由此可见，嵌合体A疫苗的广谱性优于原型株。
实施例6：嵌合体A疫苗在金黄地鼠中的免疫原性评价
具有ACE2受体的金黄地鼠对SARS-CoV-2高度敏感，并发展出与COVID-19患者相似的症状，使其成为评估疫苗的合适模型。三组金黄地鼠分别在第0天和第21天接种PBS(安慰剂)、5μg的嵌合体A疫苗或25μg的嵌合体A疫苗，并在第28天收集血清并评估免疫原性，结果显示实验组产生了高滴度的针对原型株S蛋白和B.1.617.2突变株S蛋白的高滴度结合抗体(图8)。假病毒中和实验表明，在接种疫苗的金黄地鼠中可以产生针对野生型、B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.2和B.1.1.529的高滴度NAb，并具有剂量依赖效应(图9)。
实施例7：嵌合体A疫苗在恒河猴中的免疫原性评价
接下来评估了嵌合体A疫苗在恒河猴中的免疫原性和广谱性，恒河猴是一种易受SARS-CoV-2感染的NHP模型(非人灵长类动物，non-human primates)。分别对两组恒河猴(每组4只，即n＝4，年龄6至8岁)通过肌内注射30μg或100μg的嵌合体A疫苗进行免疫，并在第21天加强免疫。第三组(安慰剂组)(n＝4)采用PBS进行免疫，以作为对照。所有免疫嵌合体A疫苗的恒河猴在第28天(Wk4)或第35天(Wk5)收集的血清中都检测到了高水平的针对原型株S蛋白和S突变体的特异性IgG抗体(图10)。假病毒检测结果显示出免疫嵌合体A疫苗的恒河猴中能够产生针对SARS-CoV-2突变体(包括B.1.1.529)的中和抗体，显示出广谱的中和能力，这与小鼠和金黄地鼠模型的数据一致(图11)。
实施例8：嵌合体A疫苗在食蟹猴中的免疫原性评价
评估了嵌合体A在食蟹猴NHP中的免疫原性和广谱性。将12只食蟹猴分成三组，每组4只，各组在第0天分别肌内注射一剂PBS、60μg的嵌合体A疫苗、240μg的嵌合体A疫苗。并且，所有组均各自在第14天和第28天进行两次加强免疫，并在两次免疫后的第14天分别检测血清中的IgG抗体。
所有免疫嵌合体A疫苗的食蟹猴在第28天(Wk4)或第42天(Wk6)收集的血清中都检测到了高水平的针对原型株S蛋白和BA.5突变株S蛋白的特异性IgG抗体(图12)。假病毒检测结果显示出免疫嵌合体A疫苗的食蟹猴中能够产生针对原型株和SARS-CoV-2突变株(包括B.1.351、B.1.1.529、BA.2、BA.2.3.20、BA.2.38、BA.2.75、BA.4/5、BF.7)的中和抗体，显示出广谱的中和能力(图13)。
实施例9：嵌合体A疫苗在SD大鼠中的安全性评价
评估了嵌合体A疫苗在SD大鼠中的免疫原性和广谱性。将30只SD大鼠分成3组，每组10只，各组在第0天分别肌内注射一剂PBS、40μg的嵌合体A疫苗或0.86mg总脂质的空LNP。并且，所有组均各自在第14天和第28天进行两次加强免疫。在第31天对采用PBS、40μg的嵌合体A疫苗和0.86mg总脂组质的空LNP进行免疫的三组动物实施安乐死。收集肺、脑、心脏、肝脏、脾脏和肾脏用于嵌合体A疫苗的组织病理学分析和安全性评估。在所有动物的这些组织中检查的任何切片中均未观察到疫苗相关的免疫病理学变化(图14)。总之，这些数据提供了证据表明嵌合体A疫苗的高剂量应用在SD大鼠中是安全的，为临床试验提供了数据支撑。
实施例10：嵌合体E疫苗在BALB/c小鼠中的免疫原性评价
本实施例评估嵌合体E疫苗在BALB/c小鼠中的免疫原性。将小鼠分为三组，每组有10只小鼠，于第0天分别用2μg或5μg的嵌合体E疫苗或者PBS通过肌肉注射给药。所有组在第21天都进行加强免疫。整个实验过程中未观察到局部炎症或其他不良反应。对第28天采集的血清的结合抗体和中和抗体(Nab，neutralizing antibody)水平进行了评估。结果显示嵌合体E疫苗免疫的小鼠血清中产生了高滴度的针对原型株S蛋白和XBB.1.5突变株S蛋白的高滴度结合抗体(图16)。假病毒中和实验表明，在接种疫苗的BALB/c小鼠中可以产生针对Omicron突变株(BA.4/5、BQ.1.1、XBB.1.5、CH.1.1和XBB.1.16)的高滴度NAb(图17)。
实施例11：嵌合体E疫苗在K18-hACE2小鼠中的免疫原性评价
本实施例评估嵌合体E疫苗在K18-hACE2小鼠中的免疫原性。将小鼠分为三组，每组有10只小鼠，于第0天分别用2μg或5μg的嵌合体E疫苗或者PBS通过肌肉注射给药。所有组在第21天都进行加强免疫。对小鼠血清中的针对原型株S蛋白和Omicron XBB.1.5株S蛋白的结合抗体水平进行了评估。如图18所示，嵌合体E疫苗免疫的小鼠针对S蛋白产生了高滴度的结合抗体。用假病毒中和实验对第28天采集的血清的中和抗体水平进行了评估。结果显示，嵌合体E疫苗的小鼠针对Omicron各变异株(XBB.1.5和XBB.1.16)均产生了高滴度的中和抗体(图19)。在二免后三周对血清进行真病毒中和检测，结果显示(图20)，低剂量组嵌合体E疫苗即可产生针对XBB.1.5毒株的有效的真病毒中和抗体，且具有剂量效应。以上结果均表明嵌合体E疫苗具备针对当前流行奥密克戎变异株的较好的保护效果。
实施例12：嵌合体E疫苗在金黄地鼠中的免疫原性评价
具有ACE2受体的金黄地鼠对SARS-CoV-2高度敏感，并发展出与COVID-19患者相似的症状，使其成为评估疫苗的合适模型。三组金黄地鼠分别在第0天和第21天接种PBS(安慰剂)、5μg嵌合体E疫苗或25μg的嵌合体E疫苗，在二免后收集血清并评估免疫原性，结果显示实验组产生了高滴度的针对原型株S蛋白和Omicron XBB.1.5株S蛋白的高滴度结合抗体(图21)。假病毒中和实验表明，在接种疫苗的金黄地鼠中可以产生针对Omicron各变异株(XBB.1.5和XBB.1.16)的高滴度NAb，并具有剂量依赖效应(图22)。在二免后三周对血清进行真病毒中和检测，结果显示(图23)，低剂量组嵌合体E疫苗即可产生针对XBB.1.5毒株的有效的真病毒中和抗体，表明嵌合体E疫苗具备针对当前流行奥密克戎变异株的较好的保护效果。
实施例13：嵌合体E疫苗在新西兰兔中的安全性评价
本实施例评估了嵌合体E疫苗在新西兰兔中的肌肉刺激反应。8只新西兰兔雌雄各半，4只/性别/组。采用同体左右侧自身对比法，每只动物左右侧股四头肌进行肌肉注射给药，所有动物左侧注射阴性对照品，右侧注射嵌合体E疫苗，供试品剂量为30μg/只，单点注射。间隔14天进行两次免疫。前2只/性别动物于末次药后48h(D16)实施安乐死，剩余动物于末次药后14天(D28)实施安乐死。收集所有给药动物的给药部位进行组织病理学分析和安全性评估。在末次药后48小时(±2小时)(D16)及末次药后14天(D28)安乐死动物给药部位大体观察均未见异常病理改变。这些数据表明了嵌合体E疫苗在新西兰兔中肌肉注射是安全的，为临床试验提供了数据支撑(图24)。
实施例14：安慰剂、嵌合体E疫苗在BALB/c小鼠中序贯免疫后血清的IgG抗体滴度
考虑到灭活疫苗等新冠病毒疫苗广泛完成基础免疫的背景(本发明的实施例主要考虑灭活疫苗已接种2剂的情况)，我们在BALB/c小鼠模型上进行了灭活疫苗基础免疫的序贯研究。按照实施例10对小鼠血清中的针对原型株S蛋白和Omicron XBB.1.5株S蛋白的结合抗体水平进行了评估。如图25所示，嵌合体E疫苗免疫的小鼠针对S蛋白产生了高滴度的结合抗体。
实施例15：安慰剂、嵌合体E疫苗在BALB/c小鼠中序贯免疫后血清的中和抗体滴度
按照实施例5对小鼠血清中针对Omicron各亚型突变株的假病毒和真病毒中和抗体水平进行了评估。如图26所示，嵌合体E疫苗免疫的小鼠针对各变异株产生了高滴度的假病毒中和抗体，能够产生较高的针对目前流行的Omicron株亚变种BA.4/5，XBB.1.5和XBB.1.16的高滴度中和抗体。同时，真病毒中和试验显示(图27)，实验组的小鼠血清针对Omicron XBB.1.5株也能产生高滴度的真病毒中和抗体。以上结果均显示出嵌合体E疫苗针对Omicron各流行变异株都具有优异的中和能力。
实施例16：嵌合体E疫苗激发的细胞免疫应答的时效性评价
本实施例评估了嵌合体E疫苗二次免疫BALB/c小鼠后36天和75天的细胞免疫应答水平。将36只小鼠随机分为3组，每组12只小鼠。3组小鼠分别在第0天和第21天接种安慰剂或嵌合体E疫苗。二免后分别于第36天和第75天每组取6只小鼠测脾脏抗原特异性T细胞应答。结果显示嵌合体E疫苗在二免后36天和75天均产生了高水平的CD4+及CD8+T细胞应答(图28)。以上结果表明嵌合体E疫苗能激发高水平的细胞免疫应答，且具有长效性。
实施例17：嵌合体E疫苗的长期稳定性评价
本实施例评估了嵌合体E疫苗在-20℃保存条件(PBS缓冲液：氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、氯化钾、蔗糖、注射用水)下的长期稳定性。嵌合体E疫苗-20℃保存0、1、3个月后对疫苗的粒径、包封率、抗原表达进行评估。结果显示0-3个月间，包封率没有明显改变，保存3个月后包封率维持在90％水平；抗原表达在0-3个月没有明显变化(图29，横坐标M表示自然月)。以上结果表明嵌合体E疫苗在-20℃保存条件下具有长期稳定性。
实施例18：嵌合体E疫苗的长期免疫原性评价
本实施例对嵌合体E疫苗免疫BALB/c小鼠后针对XBB.1.5的长期中和抗体水平以及结合抗体水平进行了监测，结果显示，嵌合体E疫苗免疫BALB/c小鼠后6-14周中和抗体仍处在较高水平，其中高剂量组针对XBB.1.5的假病毒中和抗体滴度在免疫后14周仍高达34330。结合抗体在免疫后6-10周略有下降，10-14周保持稳定，免疫后14周嵌合体E疫苗高低剂量结合抗体滴度分别为242515和160000，表明嵌合体E疫苗具有长效的保护能力(图30)。
实施例19：安慰剂、嵌合体A疫苗、嵌合体E疫苗以及组合疫苗C在BALB/c小鼠中免疫后血清的IgG抗体滴度
按照实施例10对小鼠血清中的针对原型株S蛋白和Omicron株S蛋白的结合抗体水平进行了评估。如图31所示，嵌合体A疫苗、嵌合体E疫苗和组合疫苗C免疫的小鼠针对S蛋白产生了高滴度的结合抗体。
实施例20：安慰剂、嵌合体A疫苗、嵌合体E疫苗以及组合疫苗C在BALB/c小鼠中免疫后血清的中和抗体滴度
按照实施例10对小鼠血清中针对Beta株和Omicron各亚型突变株的假病毒中和抗体水平进行了评估。如图32所示，组合疫苗C免疫的小鼠针对各变异株产生了高滴度的抗体，能够产生较高的针对目前流行的Omicron株亚变种BA.4/5、BQ.1.1、XBB.1.5、CH.1.1和XBB.1.16的高滴度中和抗体，针对Beta株也能产生有效的中和抗体。图40的真病毒中和抗体检测结果显示了组合疫苗C在BALB/c小鼠中针对Beta株和Omicron XBB.1.5株都产生了高滴度的中和抗体。以上结果显示出组合疫苗C具有广谱的中和能力。
实施例21：组合疫苗C的长期免疫原性评价
本实施例对组合疫苗C免疫BALB/c小鼠后针对Beta和XBB.1.5的长期中和抗体水平以及结合抗体水平进行了监测。结果显示，组合疫苗C免疫BALB/c小鼠后6-14周中和抗体滴度仍处于较高水平。具体而言，在免后14周，高低剂量组针对Beta中和抗体滴度分别为2612和2498；针对XBB.1.5中和抗体滴度在免后第6-10周略有下降，在第10-14周保持稳定，免后第14周高低剂量组的中和抗体滴度分别为25429和14932(图33)。结合抗体检测结果显示，在免疫后6-14周小鼠体内的结合抗体水平整体保持稳定。具体而言，在免后第14周，高低剂量组针对Beta株S蛋白的结合抗体滴度分别98492和64980，针对XBB.1.5的结合抗体滴度分别为121257和105561(图34)。以上结果表明，组合疫苗C具有长效的保护能力。
实施例22：嵌合体A疫苗、嵌合体E疫苗和组合疫苗C序贯后免疫原性及广谱性评价
考虑到灭活疫苗等新冠病毒疫苗已广泛完成基础免疫的背景(本实施例主要考虑灭活疫苗已接种2剂的情况)，我们在BALB/c小鼠模型上进行了灭活疫苗基础免疫的序贯研究，比较了序贯嵌合体A疫苗、嵌合体E疫苗和组合疫苗C和新冠病毒灭活疫苗后的免疫反应。将56只小鼠随机分为7组，每组8只小鼠。7组小鼠分别在第0天和第21天接种安慰剂或2μg的灭活疫苗(CoronaVac，克尔来福)。序贯组在二免后31天序贯免疫灭活疫苗、嵌合体A疫苗、嵌合体疫苗E或组合疫苗C。收集序贯后5周(第87天)的血清评估免疫原性，结果显示序贯嵌合体A疫苗、嵌合体E疫苗或组合疫苗C的组别均产生了针对原型株以及OmicronXBB.1.5株S蛋白的高滴度结合抗体(图35)。我们用假病毒中和实验对序贯后5周(第87天)采集的血清的中和抗体水平进行评估。结果显示，序贯组合疫苗C组能够产生针对Beta毒株的高滴度中和抗体，并且能产生针对目前流行的Omicron株亚变种BA.4/5、XBB.1.5和XBB.1.16的高滴度中和抗体，显示出广谱的中和能力(图36)。
实施例23：嵌合体E疫苗和组合疫苗C激发的细胞免疫应答的评价
评估了组合疫苗C二次免疫K18-hACE2小鼠后70天的细胞免疫应答水平。将30只小鼠随机分为5组，每组6只小鼠。5组小鼠分别在第0天和第21天接种安慰剂、组合疫苗C(2μg，5μg)或嵌合体E疫苗(2μg，5μg)。二免后70天每组取6只小鼠测脾脏抗原特异性T细胞应答。结果显示组合疫苗C和嵌合体E疫苗在二免后70天均产生了高水平的CD4+及CD8+T细胞应答(图37)。以上结果表明组合疫苗C和嵌合体E疫苗均能激发高水平的细胞免疫应答并具有长效性。
实施例24：组合疫苗C在新西兰兔中的安全性评价
评估了组合疫苗C在新西兰兔中的肌肉刺激反应。8只新西兰兔雌雄各半，4只/性别/组。采用同体左右侧自身对比法，每只动物左右侧股四头肌进行肌肉注射给药，所有动物左侧注射阴性对照品，右侧注射组合疫苗C，剂量为30μg/只，单点注射。间隔14天进行两次免疫。前2只/性别动物于末次药后48h(D16)实施安乐死，剩余动物于末次药后14天(D28)实施安乐死。收集所有给药动物的给药部位进行组织病理学分析和安全性评估。在末次药后48小时(±2小时)(D16)及末次药后14天(D28)安乐死动物给药部位大体观察均未见异常病理改变(图38)。这些数据表明了组合疫苗C在新西兰兔中肌肉注射是安全的，为临床试验提供了数据支撑。
实施例25：组合疫苗C的长期稳定性评价
本实施例评估了组合疫苗C在-20℃保存条件(三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液，包含三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、醋酸、醋酸钠、蔗糖、注射用水)下的长期稳定性。组合疫苗C疫苗-20℃保存0、1、3个月后对疫苗的粒径、包封率、抗原表达进行评估。结果显示0-3个月间，包封率没有明显改变，保存3个月后包封率维持在90％水平；在0-3个月之内粒径数据变化范围不超过10nm；抗原表达在0-3个月没有明显变化(图39)。以上结果表明组合疫苗C在-20℃保存条件下具有长期稳定性。
以下为本发明涉及的序列：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，故但凡依本发明的权利要求和说明书所做的变化或修饰，皆应属于本发明专利涵盖的范围之内。
Claims (24)
1.一种S蛋白突变体的组合，其特征在于，所述组合包括第一突变体和第二突变体；所述第一突变体与所述第二突变体不同；
其中，所述第一突变体具有如SEQ ID NO:19或其变体所示的氨基酸序列；所述第二突变体具有如SEQ ID NO:20或其变体所示的氨基酸序列；
所述变体为与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，并且保留具有如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的S蛋白突变体的功能。
2.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述第一突变体和/或第二突变体还包括信号肽；
较佳地，所述信号肽位于所述第一突变体和/或第二突变体的N末端；和/或，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1或2所述的S蛋白突变体的组合。
4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，编码所述组合的核酸中，编码第一突变体的核酸与编码第二突变体核酸包含在同一或不同的核酸分子中。
5.如权利要求3或4所述的核酸，其特征在于，所述核酸为DNA；
较佳地，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2-4任一所示或与如SEQ ID NO:2-4任一具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；和/或，编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:5-8任一所示或与如SEQ IDNO:5-8任一具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
更佳地：
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:4所示或与如SEQ ID NO:4具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:5所示或与如SEQ ID NO:5具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示或与如SEQ ID NO:2具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:5所示或与如SEQ ID NO:5具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示或与如SEQ ID NO:2具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:6所示或与如SEQ ID NO:6具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示或与如SEQ ID NO:2具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:7所示或与如SEQ ID NO:7具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:2所示或与如SEQ ID NO:2具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:8所示或与如SEQ ID NO:8具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:3所示或与如SEQ ID NO:3具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:5所示或与如SEQ ID NO:5具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:3所示或与如SEQ ID NO:3具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:6所示或与如SEQ ID NO:6具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:3所示或与如SEQ ID NO:3具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:7所示或与如SEQ ID NO:7具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:3所示或与如SEQ ID NO:3具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:8所示或与如SEQ ID NO:8具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:4所示或与如SEQ ID NO:4具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:6所示或与如SEQ ID NO:6具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:4所示或与如SEQ ID NO:4具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:7所示或与如SEQ ID NO:7具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:4所示或与如SEQ ID NO:4具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:8所示或与如SEQ ID NO:8具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
6.如权利要求3或4所述的核酸，其特征在于，所述核酸为RNA，例如mRNA；
较佳地，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21-23任一所示或与如SEQ ID NO:21-23任一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；和/或，编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:15-18任一所示或与如SEQ ID NO:15-18任一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
更佳地，编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:23所示或与如SEQ ID NO:23具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:15所示或与如SEQ ID NO:15具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:23所示或与如SEQ ID NO:23具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:16所示或与如SEQ ID NO:16具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:23所示或与如SEQ ID NO:23具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:17所示或与如SEQ ID NO:17具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:23所示或与如SEQ ID NO:23具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:18所示或与如SEQ ID NO:18具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:22所示或与如SEQ ID NO:22具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:18所示或与如SEQ ID NO:18具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:22所示或与如SEQ ID NO:22具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:15所示或与如SEQ ID NO:15具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:22所示或与如SEQ ID NO:22具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:16所示或与如SEQ ID NO:16具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:22所示或与如SEQ ID NO:22具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:17所示或与如SEQ ID NO:17具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21所示或与如SEQ ID NO:21具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:18所示或与如SEQ ID NO:18具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21所示或与如SEQ ID NO:21具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:16所示或与如SEQ ID NO:16具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21所示或与如SEQ ID NO:21具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:17所示或与如SEQ ID NO:17具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；或者，
编码第一突变体的核酸具有如SEQ ID NO:21所示或与如SEQ ID NO:21具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；编码第二突变体的核酸具有如SEQ ID NO:15所示或与如SEQ ID NO:15具有少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
7.如权利要求6所述的核酸，其特征在于，当所述核酸为mRNA时，所述mRNA的5’端包括5’UTR；和/或，所述mRNA的3’端包括3’UTR和/或3’poly(A)；
较佳地，所述5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；和/或，所述3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；和/或，所述3’poly(A)的序列如SEQ ID NO:12所示。
8.如权利要求6或7所述的核酸，其特征在于，其在选自下组的一个或多个位置包含修饰：5’UTR、开放阅读框、3’UTR和3’poly(A)；
较佳地，所述修饰包括胞嘧啶核苷转换为5甲基胞苷，尿嘧啶核苷转换为假尿苷、N1甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷或5甲基胞苷和假尿苷的组合；和/或，所述修饰为假尿苷修饰或N1甲基假尿苷修饰。
9.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求3-8任一项所述的核酸；
较佳地，所述重组表达载体的骨架为质粒或病毒，所述质粒例如为pcDNA3.1。
10.一种转化体，其特征在于，其包含权利要求3-8任一项所述的核酸，或权利要求9所述的重组表达载体；
较佳地，所述转化体的出发细胞为真核细胞，优选哺乳动物细胞例如HEK293 T细胞。
11.一种制备S蛋白突变体的组合的方法，其特征在于，所述方法包括在适合S蛋白突变体表达的条件下，培养如权利要求10所述的转化体。
12.一种组合物，其特征在于，其包含(1)如权利要求3-8任一项所述的核酸，或如权利要求9所述的重组表达载体，或如权利要求10所述的转化体，和(2)递送载体；
较佳地，所述递送载体包括脂质体；和/或，所述递送载体包括脂质纳米颗粒(LNP)。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质和非阳离子脂质；
较佳地，所述阳离子脂质包括RL151和/或Dlin-MC3，所述阳离子脂质的摩尔比例如为45％至55％；和/或，所述非阳离子脂质包括磷脂和/或脂质缀合物，所述非阳离子脂质的摩尔比例如为8％至12％；
更佳地，所述磷脂包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)；和/或，在所述递送载体中，所述磷脂的摩尔比为9％至10％；和/或，所述脂质缀合物包括聚乙二醇修饰的脂分子，例如DMG-PEG2000；和/或，在所述递送载体中，所述脂质缀合物的摩尔比为1％至2％。
14.如权利要求12或13所述的组合物，其特征在于，所述递送载体还包括胆固醇；
较佳地，在所述递送载体中，所述胆固醇的摩尔比为35％至40％。
15.如权利要求12-14任一项所述的组合物，其特征在于，所述递送载体包含阳离子脂质、胆固醇、磷脂和脂质缀合物；
和/或，所述递送载体包含RL151、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000；且所述RL151、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000的摩尔比为50:38.5:10:1.5。
16.如权利要求12-15任一项所述的组合物，其特征在于，所述核酸为mRNA，且包载在所述递送载体中。
17.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求12-16任一项所述的组合物，以及
任选地药学上可接受的载体和/或辅料。
18.一种疫苗，其特征在于，其包含如权利要求1或2所述的S蛋白突变体的组合、如权利要求3-8任一项所述的核酸、如权利要求9所述的重组表达载体、如权利要求10所述的转化体、如权利要求12-16任一项所述的组合物和/或如权利要求17所述的药物组合物，以及药学上可接受的佐剂。
19.如权利要求18所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为蛋白疫苗；
和/或，所述疫苗为核酸疫苗；
和/或，所述疫苗为DNA疫苗或mRNA疫苗。
20.一种试剂盒或药盒，其特征在于，所述试剂盒或药盒包含如权利要求1或2所述的S蛋白突变体的组合、如权利要求3-8任一项所述的核酸、如权利要求9所述的重组表达载体、如权利要求10所述的转化体、如权利要求12-16任一项所述的组合物、如权利要求17所述的药物组合物和/或如权利要求18或19所述的疫苗。
21.一种如权利要求1或2所述的S蛋白突变体的组合、如权利要求3-8任一项所述的核酸、如权利要求9所述的重组表达载体、如权利要求10所述的转化体、如权利要求12-16任一项所述的组合物、如权利要求17所述的药物组合物、如权利要求18或19所述的疫苗和/或权利要求20所述的试剂盒或药盒在制备用于缓解、预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述药物为疫苗；
较佳地，所述疫苗为蛋白疫苗；和/或，所述疫苗为核酸疫苗；和/或，所述疫苗为DNA疫苗或mRNA疫苗。
23.一种如权利要求1或2所述的S蛋白突变体的组合、如权利要求3-8任一项所述的核酸、如权利要求9所述的重组表达载体、如权利要求10所述的转化体、如权利要求12-16任一项所述的组合物、如权利要求17所述的药物组合物、如权利要求18或19所述的疫苗和/或权利要求20所述的试剂盒或药盒用于缓解、预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病。
24.一种缓解、预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求1或2所述的S蛋白突变体的组合、如权利要求3-8任一项所述的核酸、如权利要求9所述的重组表达载体、如权利要求10所述的转化体、如权利要求12-16任一项所述的组合物、如权利要求17所述的药物组合物、如权利要求18或19所述的疫苗和/或权利要求20所述的试剂盒或药盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311283785.3A CN117903263A (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311283785.3A CN117903263A (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117903263A true CN117903263A (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=90682541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311283785.3A Pending CN117903263A (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117903263A (zh) |
-
2023
- 2023-09-28 CN CN202311283785.3A patent/CN117903263A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE112021000012B4 (de) | Coronavirus-Vakzine | |
| US11241493B2 (en) | Coronavirus vaccine | |
| US20210170017A1 (en) | Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination | |
| CN110381994B (zh) | 用于诱导针对寨卡病毒的免疫应答的核苷修饰的rna | |
| US11576966B2 (en) | Coronavirus vaccine | |
| CN113874507A (zh) | 冠状病毒的核酸疫苗 | |
| TW202216739A (zh) | 一種mRNA及包含其的新型冠狀病毒mRNA疫苗 | |
| WO2023051701A1 (zh) | 抗SARS-CoV-2感染的mRNA、蛋白以及抗SARS-CoV-2感染的疫苗 | |
| CN116617382B (zh) | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 | |
| WO2023098679A1 (zh) | 预防突变株的新型冠状病毒mRNA疫苗 | |
| WO2023280220A1 (zh) | 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用 | |
| CN117903263A (zh) | 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN115960180A (zh) | 2019-nCoV S蛋白的突变体及其基因工程化的mRNA和疫苗组合物 | |
| CN117567571A (zh) | 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 | |
| TW202313967A (zh) | Ｒｎａ疫苗 | |
| CN117886904A (zh) | 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN117886903A (zh) | 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN115957187A (zh) | 一种脂质纳米颗粒组合物以及由其制备的药物递送系统 | |
| CN116926087A (zh) | 冠状病毒mRNA疫苗及其应用 | |
| CN117625651A (zh) | 狂犬病毒mRNA疫苗及其应用 | |
| WO2024044108A1 (en) | Vaccines against coronaviruses | |
| CN117625652A (zh) | 新型冠状病毒变异株mRNA疫苗及其应用 | |
| CN116236565A (zh) | 适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒、制剂及其应用 | |
| WO2023056045A1 (en) | Covid19 mrna vaccine | |
| CA3132191A1 (en) | Compositions and methods for the prevention and/or treatment of covid-19 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |