CN116236565A - 适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒、制剂及其应用 - Google Patents

适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒、制剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116236565A
CN116236565A CN202310004812.2A CN202310004812A CN116236565A CN 116236565 A CN116236565 A CN 116236565A CN 202310004812 A CN202310004812 A CN 202310004812A CN 116236565 A CN116236565 A CN 116236565A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
mol
nucleic acid
total
intramuscular administration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310004812.2A
Other languages
English (en)
Inventor
徐凯
任东升
周裕程
吴秀锦
雷颖雪
张艳
陈亮
何晨
张耀艺
杨建�
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Nuon Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Nuon Gene Technology Co ltd
Tibet Rhodiola Pharmaceutical Holding Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Nuon Gene Technology Co ltd, Tibet Rhodiola Pharmaceutical Holding Co filed Critical Chengdu Nuon Gene Technology Co ltd
Publication of CN116236565A publication Critical patent/CN116236565A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005Vertebrate antigens
    • A61K39/0011Cancer antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53DNA (RNA) vaccination
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/20011Coronaviridae
    • C12N2770/20034Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种适合于肌注给药的核酸‑脂质纳米颗粒、制剂及其应用,属于生物医药领域,本发明的核酸‑脂质纳米颗粒其由下述组分组成:(a)至少一种核酸;(b)至少一种可电离脂质,占总脂质的20 mol%至35 mol%;(c)至少一种非电离阳离子脂质,占总脂质的15 mol%至30 mol%;(d)中性磷脂或其衍生物的脂质混合物,占总脂质的0 mol%至10 mol%;(e)胆固醇或其衍生物的混合物,占总脂质的40 mol%至56 mol%;(f)PEG或其衍生物的混合物,占总脂质的1.5 mol%至3 mol%;本发明的核酸脂质纳米颗粒能够包裹mRNA或质粒DNA,尤其适于肌注给药,能在注射部位长时间表达,产生高滴度专一性中和抗体并减少毒副作用,还能够显著提高制剂热稳定性,从而利于核酸疫苗等的运输和分发。

Description

适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒、制剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒、制剂及其应用。
背景技术
基于脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle,LNP)技术的mRNA疫苗,能够同时激发体液免疫和细胞免疫,比其他类型疫苗更具保护效能和成本效益,以及更大生产规模。mRNA疫苗接种后,引起发烧、过敏、炎症风暴、肝毒性等副作用,其发生率高于传统疫苗。虽然均为轻度、一过性副反应,但是这种体验对核酸疫苗技术在更多应用场景的推广带来不确定性。
目前mRNA疫苗的组成及有效成分:
首批获得市场准入的mRNA疫苗脂质配方,均由包含一种可电离阳离子脂质、中性磷脂(DSPC)、胆固醇,以及PEG或其衍生脂质构成,四者的摩尔数比遵从美国专利US8058069所覆盖的比例范围,即:阳离子脂质、中性磷脂、胆固醇或其衍生物、PEG或其衍生脂质分别占总脂质的50-65mol%、4-10mol%、30-40mol%、0.5-2mol%。又比如国内康希诺生物最近申请的专利202210336875.3、一种新型冠状病毒mRNA疫苗及其制备方法和用途,其公开的脂质成分为:阳离子脂质:中性磷脂:甾族脂质:聚乙二醇-脂质摩尔比为30-60:5-20:20-50:0.1-10。
mRNA疫苗同时激活体液免疫和细胞免疫:
如前所述的,同传统疫苗相比,新冠病毒mRNA疫苗具备保护力,主要是能同时激活体液免疫和细胞免疫。细胞免疫产生更为久远的记忆细胞和T-细胞免疫,这个不仅有益于预防性疫苗发挥作用,更是肿瘤疫苗主要依赖的作用机制。
抗体阴性而中和抗体阳性的新冠病毒mRNA疫苗(如,mRNA-1273疫苗)接种者同样受到疫苗保护。据Gilbert,P.B等人估计,中和抗体贡献了mRNA疫苗约三分之二的功效。接种疫苗58天后的中和抗体滴度NT50为10,100和1000与疫苗接种保护力对应值为78%,91%和96%。临床Ⅱ期疫苗中和抗体滴度作为“免疫桥接”的方式已被用于疫苗获批的依据,被多个国家和地区采用。
LNP载体系统性表达是核酸疫苗急性副作用来源之一:
据Patone,M.等人、Hassett,K.J.等人、Pardi,N.等人的报道,mRNA-LNP制剂静脉注射给药后,核酸脂质纳米颗粒主要攻击肝脏组织,同时也对肺、脑组织、心脏、及血管末梢等主要器官及组织有转染,引起的发烧、寒颤和其他不良反应的风险。在使用Onpattro(MC3-LNP,Alnylam)之前需要预先服用对乙酰氨基酚,以应对潜在的全身性炎症及神经毒副反应。
另据Ndeupen,S.等人报道,LNP以鼻吸入方式给药,也导致毒性大增。鼻吸递送相同剂量LNP会导致肺部出现类似的炎症反应,并导致高死亡率。
肌肉注射给药允许注射部位拥有相对较大的体积,因此可能引起较少的不良注射部位反应,是疫苗的最佳用药方式之一。通过肌注给药、及皮下注射给药,组织中表达出比静脉给药更为持久的蛋白质表达。尽管如此,研究证实肌注给药后,仍有相当数量核酸脂质纳米颗粒经循环系统向全身系统性递送,靶向肝组织、肺组织、脑组织、及心肌组织,并在短时间内刺激生成大量外源蛋白质。这种系统性递送的脂质纳米颗粒及大量脱靶表达的外源蛋白质,刺激组织损伤、神经毒性、以及对细胞因子及补体的激活,产生一过性毒副作用。
可电离脂质本质上是一种强效免疫佐剂–引发系统性毒副作用:
脂质纳米颗粒自身具有佐剂活性。研究人员利用流感病毒和SARS-CoV-2mRNA和蛋白亚基疫苗,证明了空脂质纳米颗粒(不含生物活性物,如核酸)配方本质上具有佐剂活性,可以促进诱导小鼠体内强大的滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞、长寿浆细胞和记忆B细胞反应,并与生成持久保护性抗体有关。脂质纳米颗粒刺激极强体液免疫,短时间内产生过量抗体,增加机体免疫系统负担。
程等在LNP体系中添加第五种带电荷脂质,用来调节脂质纳米颗粒内部电荷。在不破坏原有四种组分比例(5A2-SC8:DOPE:Chol:PEG=15:15:30:3)的前提下,调节DOTAP的比例从0变到100%,制成一系列不同DOTAP含量的LNPs。通过静脉注射脂粒,递送的基因表现出器官选择性。保持LNP中可电离脂质的剂量,是提供足够佐剂效应的保障,尤其是肌注给药下,才能产出足够多的疫苗。上述程等的报道利用Dotap改变LNP表面电荷,从而改变递送靶向性,因为是静脉注射给药,为了降低可电离脂质带来的炎症反应和系统毒性,不得不降低其用量,从而降低了LNP的佐剂效应。
可电离脂质为LNP佐剂活性的关键因子,具有明显的剂量效应。而非电离阳离子脂质没有佐剂效应,无法诱导出足够的抗体滴度。值得注意的是,上述所用电荷介导的脂质纳米颗粒靶向选择方式均使用静脉注射给药方式。为避免静脉给药带来的毒性反应,可电离脂质浓度被迫降低,因此LNP的免疫佐剂效能也随之降低,不再适用于核酸疫苗。
另外,现有的LNP制剂还存在稳定性差的问题,mRNA-LNP制成品需要在-20℃至-40℃下低温保存,给疫苗分发带来不便。为解决该问题,目前有在研的mRNA-LNP冻干粉剂,但这种方式增加了疫苗制作难度和成本。此外,也有专利报道通过合成的热稳定性咪唑修饰的可电离阳离子LNP来解决现有mRNA疫苗的超低温保存及冷链运输问题,但是,这种方法也会造成制作难度和成本的增加。
发明内容
本发明的目的之一,就在于提供一种适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,以解决上述问题。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是这样的:一种适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其由下述组分组成:(a)至少一种核酸;(b)至少一种可电离脂质,占总脂质的20mol%至35mol%;(c)至少一种非电离阳离子脂质,占总脂质的15mol%至30mol%;(d)中性磷脂或其衍生物的脂质混合物,占总脂质的0mol%至10mol%;(e)胆固醇或其衍生物的混合物,占总脂质的40mol%至56mol%;(f)PEG或其衍生物的混合物,占总脂质的1.5mol%至3mol%;所述(a)的核酸分子被包封在由所述(b)、(c)、(d)、(e)和(f)组成的脂质纳米颗粒内部。本发明的脂质层保护核酸免受生物体内酶促降解作用。
本申请的发明人通过试验证实:在传统的LNP中,加入适量的非电离阳离子脂质,高浓度非电离阳离子脂质能够改变脂质纳米颗粒的递送靶向性、减少核酸脂质纳米颗粒的系统性递送能力,并增加其稳定性。其特点为以肌注给药时,可以在注射部位长时间表达,并且目标基因主要在注射部位表达,产生特异性抗体及中和抗体,并减少在肝脏、肺、脑及脾脏转染和基因表达。
如前所述的,目前虽然已经有报道通过对LNP表面电荷的修饰,可以改变LNP的组织靶向性,但是,目前的报道都只能用于静脉注射给药,并且LNP的佐剂效应明显降低,不能用于核酸疫苗,而本发明通过补充适量非电离阳离子脂质而非取代可电离脂质,本发明的
Figure SMS_1
制剂的佐剂效应仍然由可电离脂质提供,适用于肌肉注射。
另外,本发明揭示:掺入适量非电离阳离子脂质后的脂粒稳定性增强;其表现特点之一为:增加了对非离子型表面活性剂的耐受度,需要浓度为10vol%及以上的Triton X-100才能完全解析分离。
作为优选的技术方案:其由下述组分组成:(a)mRNA;(b)一种可电离脂质,占总脂质的23.01mol%至24.17mol%;(c)一种非电离阳离子脂质,占总脂质的23.01mol%至24.17mol%;(d)中性磷脂,占总脂质的4.91mol%至9.35mol%;(e)胆固醇,占总脂质的42.43mol%至44.56mol%;(f)PEG脂质,占总脂质的2.20mol%。在本申请中称为“
Figure SMS_2
45”(中性磷脂含量4.91mol%时)、及“/>
Figure SMS_3
46”制剂(中性磷脂含量9.35mol%时)。
作为优选的技术方案,其由下述组分组成:(a)至少一种核酸;(b)至少一种可电离脂质,占总脂质的20mol%至35mol%;(c)至少一种非电离阳离子脂质,占总脂质的15mol%至30mol%;(d)胆固醇或其衍生物的混合物,占总脂质的40mol%至56mol%;(e)PEG或其衍生物的混合物,占总脂质的1.5mol%至3mol%;所述(a)的核酸分子被包封在由所述(b)、(c)、(d)和(e)组成的脂质纳米颗粒内部。
作为进一步优选的技术方案:其由下述组分组成:(a)mRNA或DNA;(b)一种可电离脂质,占总脂质的25.45mol%;(c)一种非电离阳离子脂质,占总脂质的25.45mol%;(d)胆固醇,占总脂质的46.90mol%;(e)PEG脂质,占总脂质的2.20mol%。本方案中,不含有中性磷脂,除了递送mRNA外,还可以递送DNA。在本申请中称为“
Figure SMS_4
25”制剂。
另一个优选的实施方案中,核酸-脂质纳米颗粒包含:(a)mRNA或DNA;(b)一种可电离脂质,占总脂质的30.88mol%;(c)一种非电离阳离子脂质,占总脂质的15.35mol%;(d)胆固醇,占总脂质的42.42mol%;(e)中性磷脂,占总脂质的4.8mol%至9.4mol%;(f)PEG脂质,占总脂质的2.20mol%。该优选实施方案中的核酸-脂质纳米颗粒也不包含中性磷脂,除了递送mRNA外,还可以递送DNA,在本申请中通常称为“
Figure SMS_5
74”制剂。
作为进一步优选的技术方案,所述可电离脂质与非电离阳离子脂质摩尔浓度相等。
作为进一步优选的技术方案,所述核酸包含至少一个编码多肽的mRNA或带有修饰核苷酸的mRNA。
作为进一步优选的技术方案,所述核酸包含DNA。
作为进一步优选的技术方案,所述非电离阳离子脂质选自DOTAP、DOTMA、DC-chol和DOSPA或其衍生物中的至少一种。
作为进一步优选的技术方案,所述非电离阳离子脂质与胆固醇的摩尔比为10:9至10:11。
试验证实:LNP制剂中阳离子脂质与胆固醇的摩尔数比为10:9至10:11时,LNP制剂对小鼠的基因递送转染效率达到最佳。
本发明证实:中性磷脂成分在LNP制剂中对mRNA和DNA的表达作用完全不同,具体而言,中性磷脂组份增强mRNA-
Figure SMS_6
制剂的表达能力,而中性磷脂组份抑制DNA-/>
Figure SMS_7
制剂的表达能力。因此,本发明在用于递送DNA时,不加入中性磷脂。
同时,DOTAP等非电离阳离子脂质能够明显增强DNA-
Figure SMS_8
制剂中示踪基因在小鼠肌注部位的表达水平。
本发明的目的之二,在于提供上述的核酸-脂质纳米颗粒制成的制剂,采用的技术方案为:所述制剂包括所述核酸-脂质纳米颗粒和药学上可接受的载体。
作为优选的技术方案:所述制剂为注射剂。本发明的制成核酸-脂质纳米颗粒注射剂,在肌注给药下,LNP中的可电离脂质组份与肌注部位示踪基因的递送及持续性表达呈明显剂量关系。示踪基因表达强度及表达时长随可电离脂质剂量增大而增加。非电离阳离子脂质在肌注部位递送示踪基因的能力远低于同等剂量的可电离脂质,而且缺乏对示踪基因长期表达的维持能力。由此而论,维持足量的可电离脂浓度及剂量对于肌注给药的LNP疫苗制剂而言,是刺激高滴度专一性抗体产生的前提。
本发明证实:肌注给药下,多种可电离脂质,包括ALC-0315、MC3、DHA-1、L319、SM-102等组成的脂粒中掺入DOTAP等非电离阳离子脂质,均可以平衡可电离脂质的佐剂效应,减少核酸-脂粒在小鼠内脏组织中脱靶表达。结合掺入另一种非电离阳离子脂质DOTMA对LNP制剂表达模式的类似影响,以此类推,验证了非电离阳离子脂质调节LNP制剂脱靶表达和维持肌注部位持续表达的能力具有普适性,适用于多种LNP类型和不同非电离阳离子脂质分子的组合,如DC-Chol、DOSPA或其衍生物等非电离阳离子脂质,具有可控性和可预测性,成为实现肌注给药的一种模块化通用策略。
本发明的目的之三,在于提供上述的核酸-脂质纳米颗粒在制备生物疫苗中的应用。
作为优选的技术方案:所述生物疫苗为新冠疫苗、流感疫苗、或肿瘤疫苗。
具体的,本发明通过试验证实,在上述脂粒配方所限定的范围内,进行脂质摩尔比例调整,可以改变肌注给药下,外源基因在肌注部位和内脏组织中表达量比,进而调整制剂产生体液免疫和细胞免疫的比重,以适应不同的需求,增加对病人免疫系统的有效利用。如,治疗性肿瘤疫苗制剂需要激活细胞免疫反应,而非体液免疫应答。对于预防性疫苗比如新冠疫苗、流感疫苗而言,中和抗体滴度是减少重症的主要指标,但细胞免疫起效时间长,需要对体液免疫和细胞免疫进行平衡,适当增加体液免疫,利用体液免疫产生专一性IgG抗体以应对急性病原体感染。
本发明利用肌注给药的荧光素基因转染实验证实,相比对应的LNP制剂,
Figure SMS_9
制剂减少了内脏组织中标记基因转染和表达,尤其是在肝脏组织及脑组织。血液肝脏生化指标可以客观、实时、精准地衡量肝脏状态,本发明通过肌注新冠病毒S蛋白mRNA-LNP,检测血液中肝损伤相关ALT、AST、TBIL等指标,结果证实传统mRNA-LNP肌注48小时内对小鼠造成显著肝脏损伤,而/>
Figure SMS_10
制剂组小鼠则没有检测到血液肝损伤指标明显改变。IVIS结果显示,LNP制剂除了靶向转染肝细胞外,对心肌、脑组织、及四肢末梢均有不同程度的转染,据此推测,LNP制剂也可能对内脏组织造成了不同程度的组织损害,成为mRNA疫苗产生多种副作用不可忽视的原因。/>
Figure SMS_11
制剂肌注下肝脏组织基因转染水平明显降低,从而避免了对肝脏组织造成损伤;同时,/>
Figure SMS_12
制剂也显著降低了在脑组织、呼吸道、四肢末梢等内在组织的基因转染水平,据此推测,/>
Figure SMS_13
制剂对其它内脏组织带来的损伤作用也可能进一步减少,使得制备更为安全的mRNA-LNP制剂成为可能。
本发明提供一种治疗癌症、预防癌症或延缓癌症的发病或进展,或缓解与癌症相关的症状的制剂,向个体施以根据以上方面和实施例所论述的组合物。在某些实施例中,多肽可能编码治疗增强因子,如免疫调节分子或如先前所描述的其它因子。
本发明还提供了包含本文所述的脂质纳米颗粒稳定性的衡量方法,具体地,本发明的核酸脂质纳米颗粒对表面去污剂的耐受度增加,需要浓度为10vol%以上浓度的Triton X-100溶液才能完全解析分离脂质纳米颗粒与其包裹的核酸。更具体地,本发明的核酸脂质纳米颗粒在浓度小于2vol%的Triton X-100溶液中基本保持完整;在10%及以上浓度的Triton X-100溶液中,完全解离。
本发明还提供用于体内递送制剂的方法,该方法包括利用肌注给药以及皮下注射的方式向哺乳动物及受试者施用本文所述的脂质纳米颗粒,例如核酸脂粒疫苗。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明的核酸-脂质纳米颗粒,其脂质作为核酸LNP递送载体能够包裹mRNA或质粒DNA,其尤其适于为肌注给药,能在注射部位长时间表达,产生高滴度专一性中和抗体、并减少在肝脏及脾脏等内脏组织中的脱靶表达,并且能够显著提高核酸-脂质纳米颗粒的温度稳定性,利于mRNA疫苗等的运输和分发。
附图说明
图1为可电离脂质MC3及非电离阳离子脂质DOTAP成分对肌注部位示踪基因表达的影响;
图2为可电离脂ALC-0315组成的LNP脂粒中加入非电离阳离子脂DOTAP后肌注给药下示踪基因表达模式;
图3加入非电离阳离子脂DOTAP增强LNP脂粒肌注部位示踪基因表达量和表达时长;
图4可电离脂ALC-0315组成的LNP脂粒中加入非电离阳离子脂DOTMA后肌注给药下示踪基因表达模式;
图5-8分别为可电离脂MC3、DHA-1、L319、SM-102组成的LNP脂粒中加入非电离阳离子脂DOTAP后肌注给药下示踪基因表达模式;
图9肌注给药下mRNA-LNP制剂中中性磷脂浓度对示踪基因表达的影响;
图10肌注给药下
Figure SMS_14
制剂在肌注部位及腹腔中表达水平比较;
图11肌注给药下DNA-LNP制剂中中性磷脂浓度对示踪基因表达的影响;
图12肌注给药下mRNA-LNP制剂中胆固醇浓度对示踪基因表达的影响;
图13肌注给药下mRNA-LNP制剂中PEG浓度对示踪基因表达的影响;
图14为第一次免疫后21天(3wp1)及第二次免疫后7天(1wp2)、14天(2wp2)、及21天(3wp2)的小鼠血清S蛋白专一性IgG抗体ELISA检测结果;
图15为第一次免疫后21天(3wp1)及第二次免疫后7天(1wp2)、14天(2wp2)、及21天(3wp2)的小鼠血清RBD-ACE2竞争结合中和抗体ELISA检测结果;
图16nCovS2P@LNP制剂肌注给药下Balb/C小鼠肝脏相关血清学指标;
图17为本发明的
Figure SMS_15
46脂粒的结构图。
具体实施方式
在阐述本发明之前,提供将帮助理解本发明的下述定义。除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
可电离脂质:也称为可电离阳离子脂质,其具有亲水基团和疏水基团的双性分子,由极性头部(亲水基团)、连接键、疏水尾部组成。可电离脂质的亲水头部由叔胺构成,在不同pH值下,质子化程度不同,呈可电离状态。本发明所使用的可电离脂质包括但不限于:ALC-0315、Dlin-MC3-DMA(MC3)、Lipid L319、SM-102、DHA-1。
非电离阳离子脂质:具有亲水基团和疏水基团的双性分子,由极性头部(亲水基团)、连接键、疏水尾部组成。亲水头部为季铵盐,为永久性阳离子,不具可电离特征。本发明所使用的非电离脂质包括但不限于:DOTAP((2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐);DOTMA(氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DC-Chol(3β-[N-(N,N-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇);DOSPA;或其衍生物中的一种。
中性磷脂:具有亲水头部和疏水尾巴的双性磷脂酰胆碱。常用的人工合成修饰磷脂有:DSPC、DOPE、DOPC、ePC、及其衍生物等。
胆固醇:天然脂质小分子,细胞膜主要构成成分。
LNP:Lipid Nanoparticle,脂质纳米颗粒。由至少一种可电离脂质及至少一种中性磷脂组成的、包裹核酸等具有生物活性分子的脂质纳米颗粒。生物活性分子可以为RNA、DNA、siRNA、miRNA、蛋白质、以及多肽等。
Figure SMS_16
同时含有至少一种非电离阳离子脂质和至少一种可电离脂质的LNP,其包裹递送的生物活性分子与上述的LNP制剂相同。
核酸:指含有至少两个单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物,包括DNA和RNA。RNA可以是siRNA、微小RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、环状RNA及其组合的形式。核酸可以是合成的、天然存在的和非天然存在的。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和肽核酸(PNA),并包括含有已知的天然核苷酸类似物以及人工修饰核苷酸,如假尿嘧啶、甲基化、甲基假脲嘧啶修饰的核酸。DNA可以是双链DNA、单链DNA、及质粒DNA等。
nCovS:新冠病毒Spike蛋白基因。
nCovS2P:用点突变K986P、V987P修饰的新冠病毒Spike蛋白融合前构象锁定重组基因。
mRNA疫苗:基于LNP配方包裹mRNA的mRNA-LNP制剂,一般通过肌注接种,在受试者体内产生特殊抗原,诱导产生专一抗体,从而产生免疫保护能力。
Fluc:Firefly luciferase gene,萤火虫荧光素酶基因。
IV:静脉注射给药,本发明为小鼠尾静脉注射。
IM:肌肉注射给药,本发明为小鼠下肢肌肉组织给药。
mRNA:真核生物信使RNA,由5′-m7G帽、5′-UTR、翻译起始密码、编码区、终止密码、3′-UTR、多聚腺苷酸组成的单链RNA,提供蛋白质序列翻译模板。
BNT162b2:辉瑞/BioNTech新冠病毒mRNA疫苗使用的Covid-19 S蛋白的mRNA重组序列,经S2P突变。
IVT:体外转录反应(In vitro transcription)。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明而非限制本发明。
实施例1
原材料及制剂生产
1.1RNA制备
本发明实施例中所使用的mRNA均由IVT反应生产获得。大致过程为质粒DNA模板的酶切处理,及柱纯化得到线性化质粒DNA。RNA的IVT转录生产(赛默飞,
Figure SMS_17
Kit)。转录完成后,用/>
Figure SMS_18
RNA Cleanup Kit纯化RNA。除非特殊说明,转录反应底物UTP用N1甲基化假脲苷酸(m1ψ)代替。
mRNA的加帽修饰反应用近岸蛋白的加帽酶(Vaccinia Capping Enzyme)完成。mRNA加帽修饰反应遵照试剂盒推荐的反应体系设置,反应条件为37℃1小时。反应完成后,加帽产物用
Figure SMS_19
RNA Cleanup Kit进行纯化。纯化后的mRNA溶解于无菌注射用水,经RNA凝胶电泳分析及Qubit浓度鉴定。
1.2质粒DNA制备
在本发明实施例中所使用质粒DNA,均由Qiagen EndoFree Plasmid Maxi Kit生产获得。
1.3LNP、
Figure SMS_20
制剂的制备
LNP、
Figure SMS_21
制剂由可电离脂、非电离阳离子脂质、DSPC、胆固醇及PEG2000-DMG以一定的摩尔比组成,具体配方分别在实施例中列出,除非特殊说明,各脂质组分以mmol为单位。脂质物料溶解于无水乙醇,核酸溶解于柠檬酸水溶液(10mM,pH 4.0)。水溶液同有机溶液以3:1体积比通过微流控芯片进行混合,总流速大于3毫升/分钟。LNP制剂经1xPBS溶液透析过夜,完毕后转移至玻璃瓶,4℃或-20℃保存。mRNA终浓度:0.1–0.375μg/μl。所制得的
Figure SMS_22
制剂的结构如图16所示。
实施例2
LNP、
Figure SMS_23
的包封率测定
常规LNP包封率检测方法中使用的Triton浓度无法解析
Figure SMS_24
制剂。
2.1Triton X-100浓度对RNA/DNA荧光定量检测的影响
实验说明:用Qubit 2.0的Qubit HS RNA assay测定RNA含量,可能受到Triton X-100影响。为了探明不同浓度Triton对RNA定量结果的影响,本发明首先检测了在不同浓度Triton X-100的溶液中RNA定量检测结果。具体做法为,将不同浓度Triton X-100同含有270ng RNA的检测稀释液进行混合,制备含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.002%、及0.001%Triton(这里均为体积百分浓度)终浓度的检测样本,用Qubit 2.0进行定量检测,检测结果见表1。
表1:Triton X-100对Qubit HS RNA Kit检测结果的影响
Figure SMS_25
结论:RNA浓度的标定值为267.0ng/ml。终浓度为0.001%至0.1%的Triton X-100对Qubit HS RNA Kit的RNA定量检测结果没有显著影响,检测变动偏差小于3%。鉴于稀释因素,可用于RNA检测样本的Triton浓度范围为0%至20%。同样的结果也在Qubit HSdsDNA Kit对质粒DNA的定量检测结果中得到重复和验证。
2.210%Triton X-100完全解析
Figure SMS_26
中的核酸和脂质组份
LNP、及
Figure SMS_27
制剂包封率测定方法
本发明中,LNP及
Figure SMS_28
包封率测定方法利用Qubit RNA HS Assay Kit(Invitrogen,Q32852)、及Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen,Q32851)进行。使用Qubit 2.0荧光计对核酸脂质纳米颗粒中的RNA或DNA含量进行定量检测,操作步骤如下:
a)测定裂解样本核酸含量,取待检测LNP、或
Figure SMS_29
制剂样本加入等体积用1×TE配制的20%Triton X-100溶液中,混匀离心,常温避光放置5分钟。样本稀释200倍,上样检测,获得裂解样本中总核酸浓度(A);
b)不加入Triton去污剂的情形下,检测LNP、或
Figure SMS_30
样本中未结合游离核酸含量,获得未裂解样本核酸浓度(B);
c)计算公式:包封率(%)=((A-B)/A)×100
上述计算公式中,A:在终浓度10%Triton中测定的核酸量值;B:在不含Triton的测定液中测得的核酸量值。
通常情形下,由可电离脂质组成的LNP制剂在1%的Triton溶液中完全解析,总核酸含量及游离核酸含量分别用核酸荧光染料比色法进行检测、比较,得出LNP包封率。参入非电离阳离子脂质后,
Figure SMS_31
制剂稳定性提升,1%的Triton不能解析/>
Figure SMS_32
制剂中的核酸和脂质组份。
LNP包封率检测方法中,2%的Triton浓度是目前为止文献报道中最高使用浓度,但仍然不能完全解离
Figure SMS_33
中的核酸和脂质。本发明测试了0%、1%、5%、7.5%、及10%的Triton溶液对RNA浓度为0.1μg/μl的/>
Figure SMS_34
制剂的解析能力,对不同成分/>
Figure SMS_35
制剂核酸含量检测结果见表2。
表2:经不同浓度Triton解离的RNA-LNP、RNA-
Figure SMS_36
样本中RNA含量/>
Figure SMS_37
表2中脂质组份浓度单位为mmol;A浓度及B浓度分别为
Figure SMS_38
(或LNP)中离析前后的RNA浓度:μg/μl。
需要说明的是:表2中,只有一个B值和一个可用的A值(即,10%Triton中测定得到的A值,对所有配方都有效;1%Triton只对传统的、仅含有可电离脂质的LNP有效。
结论:1%的Triton溶液可以完全裂解由可电离脂质(ALC-0315)组成的LNP(即表2中的LNP17),但不能离解参入阳离子脂质(例如DOTAP)的
Figure SMS_39
制剂(即表2中除LNP17外的
Figure SMS_40
)。/>
Figure SMS_41
制剂裂解率呈现随Triton浓度升高而增大的趋势。10%的Triton溶液完全裂解含DOTAP的/>
Figure SMS_42
测出的总核酸含量与样本中核酸总量相当。升高PEG浓度至5.5mmol,胆固醇浓度至111.1mmol,或DOTAP浓度至69.44mmol,对10%Triton溶液的解析能力没有影响。10%的Triton溶液可以用于完全裂解/>
Figure SMS_43
中的核酸和脂质组份,不影响Qubit HS RNA Kit检测方法对RNA的定量检测。
用质粒DNA-
Figure SMS_44
进行对比实验,得出类似结果,如表3所示,10%的Triton溶液不影响Qubit HS dsDNA Kit检测方法对质粒DNA的定量检测。
表3:经不同浓度Triton解离的DNA-LNP、DNA-
Figure SMS_45
制剂中DNA含量
Figure SMS_46
表3中A浓度及B浓度分别为
Figure SMS_47
(或LNP)中离析前后的DNA浓度:μg/μl。
本实施例结果中也观察到,加入高浓度非电离阳离子脂质,提升了
Figure SMS_48
制剂的包封率,见表2。
实施例3
肌注给药下,可电离脂质浓度对基因表达及分布的影响
本实施例中,在图1中所列脂粒配方LNP1含一个可电离脂质MC3,为已上市核酸药物配方之一。在不破坏原有四种组分比例(MC3:DSPC:Chol:PEG=50:10:38.5:1.5)的前提下,本实施例把MC3摩尔比例从50%调节到0%,并以DOTAP进行补偿调节,脂质配方中MC3和DOTAP脂质浓度总浓度维持不变。并用这些脂质配方包裹荧光素酶mRNA,制成一系列的具有不同MC3摩尔浓度的LNPs。
本实施例将7周龄雌性Balb/c小鼠分为六组,每组2只,通过右下肢肌肉注射的方式给药,给药剂量为7.5μg/50μl。分别测试LNP1、
Figure SMS_49
2、/>
Figure SMS_50
3、/>
Figure SMS_51
4、/>
Figure SMS_52
5、及/>
Figure SMS_53
6等六种脂质纳米制剂在肌注给药后不同时间内小鼠体内荧光素酶的表达水平。给药6、24、48、72小时后,进行活体IVIS成像分析,其中6、24、48小时的成像结果见图1,图1中,LNP组分摩尔比:(MC3+DOTAP):DSPC:Chol:PEG=50:10:38.5:1.5。表4中配方为包裹30μg mRNA的脂质用量,脂质单位为mmol。
表4:MC3浓度影响示踪基因表达水平,单位:荧光强度/p/s。
Figure SMS_54
本实验发现,随着LNP制剂中MC3摩尔百分比的减少,肌注部位荧光素酶蛋白表达逐渐减少,表现出明显剂量依赖的递送趋势。DOTAP浓度没有能够补偿MC3诱导的荧光素酶蛋白表达量。MC3摩尔百分比低于10%的LNP制剂在肌注部位示踪基因的表达时长上明显降低。
结论:肌注给药下,LNP中的可电离脂质组份与肌注部位示踪基因的递送及持续性表达呈明显剂量关系。示踪基因表达强度及表达时长随可电离脂质剂量增大而增加。非电离阳离子脂质在肌注部位递送示踪基因的能力远低于同等剂量的可电离脂质,而且缺乏对示踪基因长期表达的维持能力。由此而论,维持足量的可电离脂浓度及剂量对于肌注给药的LNP疫苗、及
Figure SMS_55
疫苗而言,是维持外源基因表达的前提,直接影响专一性抗体刺激和生成量。
实施例4
肌注给药下,非电离阳离子脂质对
Figure SMS_56
制剂递送模式、基因表达水平的影响:
本发明探讨了在可电离脂质组成的LNP制剂中加入额外的非电离阳离子脂质后肌注给药下示踪基因表达及分布的改变。
4.1非电离阳离子脂DOTAP改变LNP脂粒的表达模式
在本实施例中,图2中所示脂粒配方LNP17为已上市mRNA疫苗配方之一,含一个可电离脂质ALC-0315。用非电离阳离子脂DOTAP置换LNP17配方中的ALC-0315,形成仅含DOTAP脂的
Figure SMS_57
57。另外,LNP17配方中加入DOTAP,形成由可电离脂质和非电离阳离子脂质共同组成的/>
Figure SMS_58
25、/>
Figure SMS_59
46、及/>
Figure SMS_60
74。
将7周龄的雌性Balb/c小鼠分为7组,每组3只,通过右下肢肌肉注射的方式给药,给药剂量为7.5μg/50μl。分别测试LNP17、
Figure SMS_61
57、/>
Figure SMS_62
25等脂质纳米颗粒制剂。给药6、24、48、72、96小时后,进行活体IVIS成像分析。给药6、24小时后,小鼠活体IVIS成像结果见图2,图2的表中的配方为包裹30μg核酸的脂质用量,脂质单位为mmol,需要说明的是,后面的图中的配方和脂质单位,除非特别说明书,均是如此。
实验结果显示,肌注给药下,LNP17给药组小鼠中示踪基因在给药部位高水平且持续性表达,给药5天后仍检测到表达信号。给药6小时后,小鼠内脏组织中出现瞬时高表达,表达部位包括肝脏、胸腔、脑部组织,表达信号在24小时内消失。
Figure SMS_63
57给药组小鼠体内示踪基因表达水平显著下降,仅在肌注位点有微弱表达。72小时后,没有观察到示踪基因表达。/>
Figure SMS_64
25给药组小鼠注射部位的示踪基因表达水平得到部分恢复,48小时后,肌注部位的示踪基因表达信号恢复到与LNP17一致的水平。肌注6小时后的IVIS成像记录显示,参入DOTAP的/>
Figure SMS_65
57或/>
Figure SMS_66
25给药组小鼠的腹部、肺部及主要内部器官中均未观察到示踪基因表达。
实验结论:肌注给药下,LNP制剂诱导的给药部位示踪基因持续性高表达,及小鼠内脏组织中的瞬时表达,取决于可电离脂质组份。可电离阳离子脂质ALC-0315同时引发强烈的佐剂效应。非电离阳离子脂质DOTAP诱导炎症的佐剂效应弱,其组成的LNP在小鼠内脏组织中表达水平低。非电离阳离子脂质DOTAP可以平衡可电离阳离子脂质ALC-0315的佐剂效应,降低循环
Figure SMS_67
制剂在小鼠腹腔部位示踪基因表达水平,同时不同程度的增强肌注部位示踪基因的持续表达能力,见图3。DOTAP组成的/>
Figure SMS_68
制剂适合肌注给药的核酸疫苗配方。
4.2非电离阳离子脂DOTMA改变LNP脂粒的表达模式
在本实施例中,图4中用非电离阳离子脂DOTMA置换LNP17配方中的ALC-0315,形成仅含DOTMA阳离子脂的
Figure SMS_69
56。另外,LNP17配方中加入DOTMA,形成由可电离脂质和非电离阳离子脂质共同组成的/>
Figure SMS_70
61。经现有的微流控工艺包裹FLuc mRNA,制备mRNA-LNP制剂。
将7周龄的雌性Balb/c小鼠分为两组,每组3只,通过右下肢肌肉注射的方式给药,给药剂量为7.5μg/50μl。分别测试
Figure SMS_71
56、/>
Figure SMS_72
61等三种脂质纳米颗粒制剂。给药6、24、48、72小时后,进行活体IVIS成像分析。给药6、24小时后,小鼠活体IVIS成像结果见图4。为了缩减动物数量,该组实验与DOTAP组的实施同时进行,共享LNP17阳性对照组。
实验结果显示,肌注给药下,
Figure SMS_73
56给药组小鼠体内示踪基因表达水平显著下降,仅在肌注位点有微弱表达,表达水平下降622.5倍。72小时后,已经没有观察到示踪基因表达。/>
Figure SMS_74
61给药组小鼠注射部位的示踪基因表达水平得到部分恢复,24小时后,肌注部位的示踪基因表达信号恢复到与LNP17一致的水平,并维持。肌注6小时后的IVIS成像记录显示,参入DOTMA的/>
Figure SMS_75
56或/>
Figure SMS_76
61给药组小鼠的腹部、肺部及主要内部器官中均未观察到示踪基因表达。
实验结论:肌注给药下,非电离阳离子脂质DOTMA诱导炎症的佐剂效应弱,其组成的
Figure SMS_77
制剂在小鼠内脏组织中表达水平低,安全性更好。DOTMA可以平衡可电离阳离子脂质ALC-0315的佐剂效应,降低循环/>
Figure SMS_78
制剂在小鼠内脏组织中的表达水平,提升制剂安全性,同时不影响脂粒制剂在肌注给药部位的持续表达能力。DOTMA组成的/>
Figure SMS_79
制剂是适合肌注给药的核酸疫苗配方。
4.3非电离阳离子脂粒的表达模式具有普适性
在本实施例中,分别用不同种类可电离脂质MC3、DHA-1、L319、SM-102置换LNP17及
Figure SMS_80
25配方中的ALC-0315,形成不同LNP、及/>
Figure SMS_81
制剂。DHA-1为分枝状可电离阳离子脂质,由赛诺邦格提供(货号:06040009300)。进一步的,经脂粒包裹荧光素酶mRNA,制备mRNA-LNP制剂。/>
将7周龄雌性Balb/c小鼠分为六组,每组3只,通过右下肢肌肉注射的方式给药,给药剂量为7.5μg/50μl。分别测试LNP53、
Figure SMS_82
58、LNP55、/>
Figure SMS_83
60、LNP68、/>
Figure SMS_84
69、LNP72、/>
Figure SMS_85
73等六种脂质纳米颗粒制剂。给药6、24、48、72小时后,进行活体IVIS成像分析。给药6、24小时后,小鼠活体IVIS成像结果见图5-8图;
实验结果显示,肌注给药下,LNP53、LNP55、LNP68、LNP73等四种可电离脂质纳米颗粒制剂给药组小鼠中示踪基因在给药部位高水平且持续性表达,给药3天后仍检测到表达信号。给药6小时后,小鼠内脏组织中出现瞬时高表达,表达部位包括肝脏、胸腔、脑部组织,表达信号在24小时内消失。同时伴有红肿结块的炎症反应。参入非电离阳离子脂质的
Figure SMS_88
58、/>
Figure SMS_92
60、/>
Figure SMS_93
69、/>
Figure SMS_87
73等四种脂质纳米颗粒制剂给药组中,小鼠注射部位的示踪基因表达水平得到部分恢复,48小时后,肌注部位的示踪基因表达信号恢复到与其相应阳性对照组小鼠的示踪基因表达信号一致的水平,并一直同步维持。肌注6小时后的IVIS成像记录显示,参入DOTAP的/>
Figure SMS_89
58、/>
Figure SMS_90
60、/>
Figure SMS_91
69、/>
Figure SMS_86
73给药组小鼠腹部、肺部及主要内部器官中均未观察到示踪基因表达。
实验结论:肌注给药下,可电离脂质MC3、DHA-1、L319、SM-102等组成的脂粒中参入DOTAP,可以平衡可电离脂质的佐剂效应,减少系统性脱靶表达水平,其结果与ALC-0315组实验结果相似。结合参入DOTMA后
Figure SMS_94
制剂的相似结果,以此类推,本实验结果验证了由非电离阳离子脂质和可电离脂质共同组成的/>
Figure SMS_95
制剂具有降低目的基因在内脏组织中系统性脱靶表达水平,同时维持在肌注给药部位持续表达能力。
实施例5
肌注给药下,
Figure SMS_96
制剂中胆固醇、磷脂及PEG成份对基因递送和表达模式的影响:本实施例探讨了在肌注给药下,LNP制剂主要成分对示踪基因表达的影响。
5.1中性磷脂微调mRNA-
Figure SMS_97
表达模式
本实施例使用脂粒配方LNP17、
Figure SMS_98
25、/>
Figure SMS_99
45、和/>
Figure SMS_100
46,对FLuc mRNA进行包裹。
Figure SMS_101
制剂所含中性磷脂DSPC含量分别为:0、9.4、及18.8mmol。经包裹荧光素酶mRNA,制备mRNA-LNP制剂。
将7周龄的雌性Balb/c小鼠分为三组,每组3只,通过右下肢肌肉注射的方式给药,给药剂量为7.5μg/50μl。分别测试LNP17、
Figure SMS_102
25、/>
Figure SMS_103
45、/>
Figure SMS_104
46、及eLNP17(空脂粒)等五种脂质纳米颗粒制剂。给药6、24、48、72、96、及120小时后,进行活体IVIS成像分析。给药6、24、48、及72小时后,小鼠活体IVIS成像结果见图9。
实验结果显示,肌注给药下,LNP17给药组小鼠中示踪基因在给药部位高水平且持续性表达,给药5天后仍检测到表达信号。给药6小时后,小鼠内脏组织中出现瞬时高表达,表达部位包括肝脏、胸腔、脑部组织,表达信号在24小时内消失。同时伴有红肿结块的炎症反应。掺入DOTAP的
Figure SMS_105
25给药组小鼠,仅在肌注位点有相对较弱的表达,24小时内在小鼠内脏组织中未观察到示踪基因表达。/>
Figure SMS_106
45及/>
Figure SMS_107
46给药组小鼠在给药6小时后,注射部位及内脏组织的表达信号随中性磷脂浓度增加而有所增强,但同LNP17组小鼠腹腔表达信号相比,肌注部位表达水平分别降低2.42倍和1.78倍,而内脏组织中表达水平分别降低16.12倍和10.4倍。48小时后,所有/>
Figure SMS_108
制剂给药组小鼠肌注部位的示踪基因表达信号恢复到与LNP17一致的水平,更长时间段观察到的表达信号水平维持同LNP17组小鼠表达水平,甚至有部分超越,如图10所示。
实验结论:同LNP制剂相比,肌注给药的
Figure SMS_109
制剂抑制示踪基因在小鼠内脏组织中的瞬时表达水平,但不影响其在肌注部位的长期表达水平。这种现象同时受到中性磷脂组份进一步调节。中性磷脂浓度减小引起/>
Figure SMS_110
制剂引起小鼠内脏组织及肌注部位的瞬时表达量进一步降低,但对24小时或更长时间段肌注部位的示踪基因表达水平没有直接影响。
5.2中性磷脂抑制DNA-
Figure SMS_111
递送的基因表达
本实施例中使用脂粒配方LNP17、
Figure SMS_112
25、/>
Figure SMS_113
45、和/>
Figure SMS_114
46,对FLuc质粒DNA进行包裹,如图11所示,DNA-/>
Figure SMS_115
制剂所含中性磷脂DSPC含量分别为:9.4、0、9.4、及18.8mmol。经微流控芯片工艺包裹荧光素酶质粒DNA,制备DNA-LNP制剂。
将7周龄的雌性Balb/c小鼠分为三组,每组3只,通过右下肢肌肉注射的方式给药,给药剂量为11.5μg质粒DNA/50μl。分别测试DNA-LNP17、DNA-
Figure SMS_116
25、DNA-/>
Figure SMS_117
45、DNA-/>
Figure SMS_118
46等四种脂质纳米颗粒制剂。给药6、24、48、72小时后,进行活体IVIS成像分析。给药6、24、及48小时后,小鼠活体IVIS成像结果见图11。
实验结果显示,肌注给药6小时后,DNA-LNP17给药组小鼠中示踪基因在给药部位表达水平低且持续性差。DNA-
Figure SMS_119
25给药组小鼠,在肌注位点表达水平最高,同LNP17组小鼠注射部位表达水平升高3.4倍。DNA-/>
Figure SMS_120
45及DNA-/>
Figure SMS_121
46给药组小鼠在注射部位的表达信号不及DNA-/>
Figure SMS_122
25组小鼠的表达水平,随中性磷脂浓度增加而减少。72小时后,仅在DNA-
Figure SMS_123
25给药组小鼠肌注部位观察到示踪基因的表达信号。在所有给药组小鼠内脏组织中均没有出现示踪基因的表达信号。
实验结论:同包裹mRNA的LNP制剂相比,DOTAP阳离子脂质增强DNA-
Figure SMS_124
制剂中示踪基因在小鼠肌注部位的表达水平,中性磷脂组份抑制DNA-/>
Figure SMS_125
制剂的表达能力。中性磷脂成分在LNP制剂中对mRNA和DNA的表达作用大相径庭。
5.3适合肌注给药
Figure SMS_126
的胆固醇浓度范围
本发明比较了胆固醇浓度对
Figure SMS_127
制剂基因递送能力的影响。本实施例中使用的mRNA-LNP制剂中,阳离子脂质(包括可电离脂质和非电离阳离子脂质)同胆固醇的摩尔比设计在10:7至10:12的范围之间。通过使用微流控工艺对荧光素酶mRNA进行包裹,制备mRNA-LNP制剂。
将7周龄的雌性Balb/c小鼠分为六组,每组三只,通过右下肢肌肉注射的方式给药,给药剂量为7.5μg/50μl。分别测试LNP17、
Figure SMS_128
29、/>
Figure SMS_129
25、/>
Figure SMS_130
33、/>
Figure SMS_131
34、及/>
Figure SMS_132
35等六种脂质纳米颗粒制剂。给药6、24、48、72、及96小时后,进行活体IVIS成像分析,结果见图12。
实验结果显示,肌注给药6小时后,相比LNP17组,胆固醇浓度变化对
Figure SMS_133
制剂的表达水平有一定影响。给药96小时后,胆固醇的摩尔比设计在10:9至10:11的范围内的/>
Figure SMS_134
制剂,在肌注位点仍有相对较高的表达。
实验结论:胆固醇浓度对
Figure SMS_135
制剂的表达持久性有影响,配方中阳离子脂质(包括可电离脂质和非电离阳离子脂质)同胆固醇的摩尔比在10:9至10:11的浓度范围内,有利于
Figure SMS_136
制剂递送的基因表达和维持。/>
5.4PEG浓度对
Figure SMS_137
表达模式的影响
本发明比较了PEG浓度对
Figure SMS_138
制剂基因递送能力的影响。本实施例中使用的mRNA-LNP制剂中,PEG浓度设计为总脂质摩尔数的0.23%、0.46%、0.91%、1.64%、1.66%、1.78%、1.93%、2.20%、2.47%、2.73%、及3.0%。经微流控工艺对荧光素酶mRNA进行包裹,制备mRNA-LNP制剂。
将7周龄的雌性Balb/c小鼠分为十二组,每组三只,通过右下肢肌肉注射的方式给药,给药剂量为7.5μg/50μl。分别测试LNP17、
Figure SMS_139
28、/>
Figure SMS_140
25、/>
Figure SMS_141
30、/>
Figure SMS_142
31、及/>
Figure SMS_143
32等十二种脂质纳米颗粒制剂。给药6、24、48、72、及96小时后,进行活体IVIS成像分析,结果见图13,图13中,PEG用量以PEG占总脂质摩尔百分比值表述。
实验结果显示,肌注给药6小时后,相比LNP17组,所有PEG浓度对
Figure SMS_144
制剂的表达水平没有明显影响。给药72小时后,占总脂质摩尔比为1.93%至3.0%的PEG继续维持/>
Figure SMS_145
制剂的表达水平,低于1.93%PEG浓度的/>
Figure SMS_146
制剂表达水平下降明显。
实验结论:摩尔比为2.20%至3.0%的PEG维持
Figure SMS_147
制剂的表达水平,有利于/>
Figure SMS_148
制剂递送的基因表达和维持。
实施例6
nCovS2P mRNA-
Figure SMS_149
肌注给药诱导Balb/C小鼠产生新冠病毒S蛋白专一抗体及中和抗体
6.1mRNA-
Figure SMS_150
制剂刺激高水平免疫反应,并协调体液免疫水平
本实施例中,将7周龄雌性BalB/C小鼠随机分为5组,以包裹编码新冠病毒S蛋白mRNA(融合前构象S2P锁定)的脂粒复合物为疫苗,进行肌注接种。nCovS2P mRNA编码序列与辉瑞/BioNTech新冠病毒S蛋白重组序列BNT162b2 mRNA编码序列一致,脂粒粒径及包裹率见表5。每组动物间隔3周分别注射给药2次。第一次免疫后的第21天(3wp1),及第二次免疫后的第7、14天、21天(1wp2、2wp2、3wp2),麻醉小鼠,采血,测定血清样本中IgG抗体和新冠病毒S蛋白中和抗体滴度。
表5:LNP、
Figure SMS_151
粒径、粒径分布、及EE%检测结果
Figure SMS_152
血清IgG抗体ELISA检测结果显示:第二次免疫后7天,同空白组相比,nCovS2P@LNP17给药组、nCovS2P@
Figure SMS_154
46、nCovS2P@/>
Figure SMS_156
25给药组、及nCovS2P@/>
Figure SMS_163
74给药组小鼠血清S蛋白专一性IgG抗体含量显著升高(p<0.001)。LNP17给药组IgG抗体水平达到文献报道的抗体滴度水平,并明显高于其它给药组(图14)。/>
Figure SMS_155
46、/>
Figure SMS_157
25、及/>
Figure SMS_159
74给药组小鼠血清抗体分别为LNP17组的1/20至1/100。值得一提的是,同传统疫苗免疫效果相比,所有/>
Figure SMS_161
制剂组小鼠血清S蛋白专一抗体水平均处于极高表达水平。第二次免疫14天后,LNP17给药组小鼠血清中专一抗体滴度开始下降,降低约5倍,而/>
Figure SMS_153
46、及/>
Figure SMS_158
74制剂组小鼠血清抗体持续升高,显示出稳定升高的趋势。第二次免疫21天后,/>
Figure SMS_160
46、及/>
Figure SMS_162
74给药组小鼠血清S蛋白专一性IgG抗体含量与LNP17给药组的差距显著缩小,为其含量的50%-75%之间。
6.2mRNA-
Figure SMS_164
制剂最大限度地提升中和抗体水平
对实验6.1获得的小鼠血清样本进行1000倍稀释,然后进行RBD竞争性中和抗体的ELISA检测,结果显示:第二次免疫后7天,同空白组相比,LNP17给药组、
Figure SMS_167
46、@/>
Figure SMS_169
25给药组、及/>
Figure SMS_170
74给药组小鼠血清中和抗体滴度显著升高(p<0.001)。nCovS2P@LNP17给药组中和抗体水平接近最高峰值(图15)。/>
Figure SMS_166
46、/>
Figure SMS_168
25、及/>
Figure SMS_172
74给药组小鼠血清中和抗体分别为LNP17组的79.17%至91.72%,表达水平极高。第二次免疫14天及21天,/>
Figure SMS_173
46、及/>
Figure SMS_165
74制剂组小鼠血清中和抗体显示出稳定升高的趋势,达到对照组小鼠峰值水平。/>
Figure SMS_171
25给药组小鼠血清中和抗体水平呈下降趋势,整体水平为最高峰值的40%。
结合S蛋白专一抗体及RBD-ACE2结合中和抗体结果分析,同对照LNP制剂相比,
Figure SMS_174
46和/>
Figure SMS_175
74制剂在刺激生成较低水平IgG抗体的情形下,诱导出同样水平的中和抗体。肌注部位表达的抗原有刺激中和抗体的作用,相较于/>
Figure SMS_176
46制剂,/>
Figure SMS_177
25制剂仅在肌注部位表达,刺激生成的抗体水平更低,而保持相对较高中和抗体滴度。因此,通过调整/>
Figure SMS_178
制剂配方,调节肌注部位及内脏组织中抗原基因表达动态,可以调节免疫系统生成抗体(体液免疫)及中和抗体的比例。
实施例7
nCovS2P mRNA-
Figure SMS_179
诱导Balb/C小鼠的急性毒理反应的血清学指标
本实施例中,将7周龄雌性BalB/C小鼠随机分为5组,以包裹nCovS2P的脂粒复合物为制剂,进行肌肉注射接种,给药剂量:20μg mRNA(或等量脂粒)。分组信息:1,空白对照(1xPBS);2,eLNP17;3,nCovS2P@LNP17;4,nCovS2P@
Figure SMS_180
25;5,nCovS2P@/>
Figure SMS_181
46。给药6小时、24小时、及48小时后,收集血清,检测血液样本中肝脏相关的生化指标。
检测结果见图16,结果分析如下:
1.ALB:四组小鼠ALB水平与阴性对照组一致,未见升高。
2.ALT:nCovS2P@
Figure SMS_182
25、nCovS2P@/>
Figure SMS_183
46及阴性对照等三组小鼠ALT水平与对照三个时间点基本一致,稍有波动,无显著差异。LNP17组小鼠ALT水平显著高于对照组,尤其是在24、48小时时,出现明显升高。
3.TBIL:整体来看,nCovS2P@
Figure SMS_184
25、nCovS2P@/>
Figure SMS_185
46及阴性对照等三组小鼠在24、48小时时,TBIL水平略高于阴性对照组,三组水平基本一致,但LNP17组在24小时时,血液中TBIL浓度明显升高。
4.AST:nCovS2P@
Figure SMS_186
25组小鼠AST水平在三个时间点与阴性对照组一致,没有明显变化。nCovS2P@/>
Figure SMS_187
46组小鼠AST水平在24小时时,有明显升高。LNP17组小鼠AST水平在24小时时有显著升高,在48H时有所降低,但表达明显。空白脂粒组在三个时间点均观察到AST水平明显升高。
结果分析:实验过程中可能会出现溶血和注射部位红肿炎症现象,主要会导致AST升高,对其他指标影响较小,不排除AST水平轻微升高与上述现象有关。但结合肝脏特异性较高的ALT、TBIL,LNP17组小鼠在这两个关键指标水平每个时间点均高于阴性对照组及
Figure SMS_188
制剂组,其中6小时时可能出现轻微肝损伤征象,24、48小时时出现了明显肝脏损伤情况,24小时时损伤情况最为严重,48小时时呈下降趋势。而空白对照组及nCovS2P@/>
Figure SMS_189
25、nCovS2P@/>
Figure SMS_190
46制剂组未见明确的肝损伤征象。
可能机制:荧光实验表明mRNA-LNP17制剂注射后6小时、24小时时在肝脏大量表达,48小时左右逐渐消退至阴性对照水平。肝脏损伤可能由于mRNA在肝脏表达引起强烈的免疫反应,致使细胞分泌大量免疫因子,过度活化免疫细胞,攻击肝脏正常细胞。因此在注射后24小时内损伤持续进行,导致肝酶不断上升,而当24小时后肝脏基因表达量逐步减少,48小时时仅在肌肉部位表达后,这种免疫活化造成的攻击停止,肝脏修复,肝酶被逐渐代谢,指标改善。而对照组及
Figure SMS_191
制剂组注射后免疫刺激仅在肌肉部位产生,少量扩散至下腹部,因此对肝脏基本不产生刺激,肝酶学变化不大,这也与本次实验所获得结论一致。/>

Claims (15)

1.一种适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,其由下述组分组成:(a)至少一种核酸;(b)至少一种可电离脂质,占总脂质的 20 mol% 至 35 mol%;(c)至少一种非电离阳离子脂质,占总脂质的 15 mol% 至 30 mol%;(d)中性磷脂或其衍生物的脂质混合物,占总脂质的0 mol%至10 mol%;(e)胆固醇或其衍生物的混合物,占总脂质的40 mol%至56 mol%; (f)PEG或其衍生物的混合物,占总脂质的1.5 mol%至3 mol%;所述(a)的核酸分子被包封在由所述(b)、(c)、(d)、(e)和(f)组成的脂质纳米颗粒内部。
2.根据权利要求1所述的适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,其由下述组分组成:(a) mRNA; (b)一种可电离脂质,占总脂质的 23.01 mol% 至 24.17 mol%;(c)一种非电离阳离子脂质,占总脂质的 23.01 mol% 至 24.17 mol%;(d)中性磷脂,占总脂质的4.91 mol%至9.35 mol%;(e)胆固醇,占总脂质的42.43 mol%至44.56 mol%;(f)PEG脂质,占总脂质的2.20 mol%。
3.根据权利要求1所述的适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,其由下述组分组成:(a)至少一种核酸;(b)至少一种可电离脂质,占总脂质的 20 mol% 至 35mol%;(c)至少一种非电离阳离子脂质,占总脂质的 15 mol% 至 30 mol%;(d)胆固醇或其衍生物的混合物,占总脂质的40 mol%至56 mol%; (e)PEG或其衍生物的混合物,占总脂质的1.5 mol%至3 mol%;所述(a)的核酸分子被包封在由所述(b)、(c)、(d)和(e)组成的脂质纳米颗粒内部。
4.根据权利要求3所述的适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,其由下述组分组成:(a) mRNA或DNA;(b)一种可电离脂质,占总脂质的 25.45 mol%;(c)一种非电离阳离子脂质,占总脂质的 25.45 mol%;(d)胆固醇,占总脂质的46.90 mol%;(e)PEG脂质,占总脂质的2.20 mol%。
5.根据权利要求1或3所述的适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,所述核酸包含至少一个编码多肽的mRNA或带有修饰核苷酸的mRNA。
6.根据权利要求1或3所述的适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,所述核酸包含DNA。
7.根据权利要求1或3所述的适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,所述非电离阳离子脂质选自DOTAP、DOTMA、DC-chol和DOSPA或其衍生物中的至少一种。
8.根据权利要求1或3所述的适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,所述可电离脂质和非电离阳离子脂质之总和与胆固醇的摩尔比为 10:9 至 10:11。
9.根据权利要求1或3所述的适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒,其特征在于,所述可电离脂质与非电离阳离子脂质摩尔浓度相等。
10.采用权利要求1或2所述的核酸-脂质纳米颗粒制成的制剂,其特征在于:所述制剂包括所述核酸-脂质纳米颗粒和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10所述的制剂,其特征在于:所述制剂为注射剂。
12.权利要求1或3所述的核酸-脂质纳米颗粒在制备生物疫苗中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于:所述生物疫苗为新冠疫苗、流感疫苗、或肿瘤疫苗。
14.权利要求1或3所述的核酸-脂质纳米颗粒中核酸含量的检测方法,其特征在于:所述方法为,所示核酸-脂质纳米颗粒在含10 vol %Triton及以上浓度的溶液中完全离析,并被荧光定量方式进行定量检测。
15.权利要求14所述的方法中所使用的试剂、溶液及检测试剂盒。
CN202310004812.2A 2022-11-21 2023-01-03 适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒、制剂及其应用 Pending CN116236565A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211452115 2022-11-21
CN2022114521155 2022-11-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116236565A true CN116236565A (zh) 2023-06-09

Family

ID=86634172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310004812.2A Pending CN116236565A (zh) 2022-11-21 2023-01-03 适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒、制剂及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116236565A (zh)
WO (1) WO2024108740A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108653750B (zh) * 2018-06-01 2022-04-22 成都诺恩基因科技有限公司 包裹质粒dna的阳离子脂质体复合物
GB2600800B (en) * 2018-09-04 2023-08-16 Univ Texas Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
GB2617430B (en) * 2018-09-04 2023-12-27 Univ Texas Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
WO2022216787A2 (en) * 2021-04-08 2022-10-13 City Of Hope Lipid nanoparticles and methods of use
CN115304756B (zh) * 2022-01-30 2023-05-09 上海科技大学 一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024108740A1 (zh) 2024-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6126072B2 (ja) 遺伝子発現を抑制する治療におけるリポソームによる効率的な送達のプロセスおよび組成物
US20200016274A1 (en) Messenger rna vaccines and uses thereof
CN106413811A (zh) 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
CN116063205B (zh) 一种含烷基化氨基甲酸酯键的脂质化合物及其应用
CN113908288B (zh) 一种mRNA递送系统及其制备方法和应用
CN115784920B (zh) 一种转染效率高的可电离脂质化合物及其应用
WO2024103728A1 (zh) 针对痘病毒的信使核糖核酸疫苗
CN116406299A (zh) 用于递送mRNA疫苗的脂质纳米颗粒
Gao et al. RNA interference-based osteoanabolic therapy for osteoporosis by a bone-formation surface targeting delivery system
CN114277039A (zh) 呼吸道合胞病毒mRNA疫苗及其制备方法和应用
WO2024022263A1 (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN116549667B (zh) 一种pas修饰的脂质纳米粒、包含其的药物制剂,及其制备方法和用途
CN116236565A (zh) 适合于肌注给药的核酸-脂质纳米颗粒、制剂及其应用
CN116407625A (zh) 一种用于增强核酸免疫效力的脂质纳米颗粒及其制备方法和用途
CN115947671A (zh) 一种含氨基甲酸酯键的脂质化合物及其应用
CN114848831A (zh) 包裹型纳米制剂及其载体的制备方法和应用
WO2023169506A1 (zh) 编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA疫苗
WO2023169500A1 (zh) 编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA疫苗
WO2023208076A1 (zh) 一种高转染效率的阳离子脂质纳米粒及其制备方法
CN116947669B (zh) 一种转染效率高的可电离脂质化合物及其应用
WO2024067639A1 (zh) 一种转染效率高的可电离脂质化合物及其应用
WO2024139848A1 (zh) 一种核酸递送载体及其制备方法和用途
WO2023037320A1 (en) Mucosal messenger rna vaccine
US20240091343A1 (en) Technology platform of uncapped-linear mrna with unmodified uridine
WO2024028785A1 (en) Multicomponent lipid nanoparticles with high cellular fusogenicity for the delivery of nucleic acids and related preparation process

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20240313

Address after: 610000 floor B6, No. 88, Keyuan South Road, high tech Zone, Chengdu, Sichuan

Applicant after: CHENGDU NUON GENE TECHNOLOGY CO.,LTD.

Country or region after: China

Address before: 850000 No. 93 middle Beijing Road, Tibet, Lhasa

Applicant before: TIBET RHODIOLA PHARMACEUTICAL HOLDING CO.

Country or region before: China

Applicant before: CHENGDU NUON GENE TECHNOLOGY CO.,LTD.

CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Country or region after: China

Address after: 610000 floor B6, No. 88, Keyuan South Road, high tech Zone, Chengdu, Sichuan

Applicant after: CHENGDU NUOEN BIOLOG TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 610000 floor B6, No. 88, Keyuan South Road, high tech Zone, Chengdu, Sichuan

Applicant before: CHENGDU NUON GENE TECHNOLOGY CO.,LTD.

Country or region before: China