CN113908288B - 一种mRNA递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种mRNA递送系统及其制备方法和应用，所述mRNA递送系统包括递送载体以及负载于所述递送载体上的mRNA；所述递送载体包括含有脂样分子和脂质分子的脂样纳米粒；所述脂样分子的结构与脂质分子的结构不同。所述mRNA递送系统能够高度特异性靶向递送mRNA至脾脏，并具有较高的递送效率；同时，通过配方的调整，可以实现靶向性的转变，使mRNA递送系统高效地、高度特异性地靶向递送至肺部。所述mRNA递送系统的组分简单，易于制备，批次之间的稳定性高，递送效率高，靶向特异性高，实现了肝脏之外器官的高度特异性的靶向递送，具有广阔的应用前景。

Description

一种mRNA递送系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种mRNA递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
mRNA属于带负电荷的生物大分子，极不稳定且难以入胞，长期以来被认为难以成药。体外转录的mRNA分子若要在生物体内发挥疗效，必须满足以下条件：(1)防止被循环系统中的核酸酶降解；(2)避免网状内皮系统的截留和肾小球滤过的清除；(3)突破生物膜屏障进入特定的细胞和器官；(4)内化的mRNA通过内体逃逸得到释放；(5)在细胞质内产生足够量的目的蛋白。基于此，开发安全有效的mRNA递送系统实现mRNA的胞内表达是mRNA药物应用于临床所面临的重大挑战，也是mRNA药物研究领域的重中之重。
目前常见的mRNA递送载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体存在整合到基因组的风险，因此在临床上的使用受到了限制。非病毒载体主要包括聚合物材料、多肽、脂质纳米粒等。其中，聚合物材料的典型示例包括聚乙烯亚胺、聚胺基聚合物等，这类材料一般毒性较强，难以在体内降解，目前大都处于临床前研究阶段。多肽类递送载体主要集中在细胞穿膜肽，但该技术尚未成熟，且无靶向选择性。
相对于前两者而言，脂质纳米粒是目前最为成熟的mRNA递送载体，在mRNA核酸药物中取得了一定的研究成果。例如CN110638759A公开了一种用于体外转染和体内递送mRNA的制剂，负载mRNA的载体为阳离子脂质体，其原料包括中性辅助脂质、第一阳离子脂质和第二阳离子脂质，中性辅助脂质包括DOPE、DOPC或cholesterol；第一阳离子脂质包括DOTAP、DOTMA或DOSPA，第二阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA、Dlin-KC2-DMA、DODMA或c12-200。CN111467321A公开了一种mRNA核酸类药物递送系统，包括负载一种或多种mRNA的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒由包括可电离的阳离子脂质、磷脂辅助脂质、胆固醇、磷脂聚乙二醇衍生物的原料制备而成，具有较好的mRNA药物胞内递送效率。从现有的研究结果来看，已有采用脂质纳米粒载体的mRNA药物实现了临床应用，例如目前两款新型的mRNA疫苗采用的递送载体均为脂质纳米粒。
mRNA药物在治疗领域的发展离不开递送技术的不断进步与创新。mRNA药物的疗效及安全性很大程度上取决于递送系统的制剂配方的递送效率和靶向性，并最终决定mRNA药物的生物分布和生物利用度。目前，国际上报道的mRNA脂质纳米粒递送系统静脉给药后绝大部分编码蛋白都在肝脏表达，这很大程度限制了mRNA药物的应用范围。因此，控制mRNA药物的摄取和内体释放以及药代动力学性质和靶向特异性分布，开发具有高递送效率和靶向性的mRNA递送系统，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种mRNA递送系统及其制备方法和应用，通过筛选和优化递送系统的配方，解决了目前大多脂质纳米粒在体内递送mRNA时主要靶向肝脏的问题，使所述mRNA递送系统具有更高的非肝脏靶器官递送效率，能够实现高效的脾脏靶向性，并通过配方的调整实现mRNA递送系统从脾脏靶向到肺部靶向的转变。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种mRNA递送系统，所述mRNA递送系统包括递送载体以及负载于所述递送载体上的mRNA；所述递送载体包括含有脂样分子和脂质分子的脂样纳米粒；所述脂样分子的结构与脂质分子的结构不同；
所述脂样分子具有如式I所示结构：
式I中，R1、R2、R3各自独立地选自C1～C50直链或支链烷基、C2～C50直链或支链不饱和烃基、C3～C50脂环烃基、C2～C50脂杂环基、C6～C50芳香烃基或C6～C50含芳香环的脂环烃基中的任意一种。
式I中，n代表亚甲基的个数，选自1～10的整数，例如可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本发明提供的mRNA递送系统中，以含有特定结构的脂样分子与脂质分子的脂样纳米粒作为递送载体，解决了目前大多脂质纳米粒在体内递送mRNA时主要靶向肝脏的问题，使所述mRNA递送系统能够高度特异性靶向递送mRNA至脾脏，并具有更高的递送效率；同时，通过配方的调整，可以实现靶向性的转变，使mRNA递送系统高效地、高度特异性地靶向递送至肺部。所述mRNA递送系统的组分简单，易于制备，批次之间的稳定性高，安全性好，递送效率高，实现了肝脏之外的不同器官的高度特异性的靶向递送，具有广阔的应用前景。
本发明中，所述C1～C50直链或支链烷基可以为C2、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的直链或支链烷基。
所述C2～C50直链或支链不饱和烃基可以为C3、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的直链或支链不饱和烃基，所述“不饱和烃基”意指基团中含有至少一个C＝C双键或至少一个C≡C三键。
所述C3～C50脂环烃基可以为C3、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的脂环烃基，所述“脂环烃基”意指非芳香性碳环基团，包括饱和脂环烃基或不饱和脂环烃基；所述饱和脂环烃基包含单环、多环(包含2个、3个或4个环的稠环)、螺环，示例性地包括但不限于：环己烷基、环庚烷基、金刚烷基等；所述“不饱和脂环烃基”意指脂环烃基团中含有至少一个C＝C双键或至少一个C≡C三键，示例性地包括但不限于：环己烯基、环庚烯基等。
所述C2～C50脂杂环基可以为C3、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的脂杂环基，即在脂环烃基中引入杂原子后形成的基团，所述脂环烃基的含义如前文所述，此处不再赘述。
所述C6～C50芳香烃基可以为C6、C9、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的芳香烃基，示例性地包括但不限于：苯基、萘基、联苯基、蒽基、菲基等。
所述C6～C50(例如C6、C9、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等)含芳香环的脂环烃基，即在脂环烃基上引入芳香环后形成的基团，所述脂环烃基的含义如前文所述，不再一一赘述。
本发明中，所述脂杂环基中的杂原子包括但不限于N、P、O或S。
优选地，所述mRNA包括但不限于萤火虫荧光素酶mRNA、增强型绿色荧光蛋白mRNA或β-半乳糖苷酶mRNA等。
优选地，所述R1、R2、R3各自独立地选自C6～C20(例如C8、C10、C12、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20等)直链烷基或C6～C20(例如C8、C10、C12、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20等)直链烯烃基中的任意一种；
优选地，所述R1、R2、R3各自独立地选自如下基团中的任意一种：
其中，波浪线标记处代表基团的连接键。
优选地，所述R1、R2、R3为相同的基团。
优选地，所述脂样分子具有如下结构中的任意一种：
优选地，所述所述脂样分子tB-UC18。
优选地，所述脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比(简称为氮磷比)为(0.1～10):1，例如可以为0.2:1、0.3:1、0.5:1、0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等，进一步优选为(1～3):1，更进一步优选为1.5:1。
优选地，所述脂样纳米粒中脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:(0.1～10)，例如可以为1:0.2、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9等，进一步优选为1:(1～7)。
优选地，所述脂质分子包括非阳离子脂质、阳离子脂质或聚乙二醇修饰脂质中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述非阳离子脂质包括1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1-棕榈酰-2-油酰基卵磷脂(POPC)、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰胆碱(SOPC)、1,2-肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DMPE)、1,2-二油烯-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DSPG)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、胆固醇(Chol)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、鞘磷脂、神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂或二酰基甘油中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述阳离子脂质包括N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、双十六烷基二甲基溴化铵(DDAB16)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB18)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙基胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代基-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)或2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述聚乙二醇修饰脂质包括PEG-磷脂酰乙醇胺、PEG-磷脂酸、PEG-神经酰胺、PEG-二烃基胺或PEG-甘油二酯中的任意一种或至少两种的组合；具有代表性地包括DMG-PEG、DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG或DSPE-PEG中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述聚乙二醇修饰脂质中聚乙二醇的重均分子量Mw为1000～10000，例如可以为2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000等。
优选地，所述脂质分子包括第一脂质分子与任选地第二脂质分子；所述第一脂质分子为非阳离子脂质，所述第二脂质分子为非阳离子脂质和/或阳离子脂质。
优选地，所述第二脂质分子为阳离子脂质。
作为本发明的优选技术方案，所述脂质分子包括第一脂质分子(非阳离子脂质)，其与所述脂样分子组成的双组份脂样纳米粒作为递送载体，使所述mRNA递送系统实现高度特异性的靶向脾脏，然后以递送载体在体内的递送效率和靶向性为导向，调整第一脂质分子单一组分即可提高所述mRNA递送系统在脾脏靶部位的递送效率。
作为本发明的另一优选技术方案，在前述mRNA递送系统的基础上对配方进行优化，脂质分子包括第一脂质分子(非阳离子脂质)与第二脂质分子(阳离子脂质)的组合，其与脂样分子组成三组分的脂样纳米粒作为递送载体，实现了所述mRNA递送系统从脾脏靶向到肺部靶向的转变。
优选地，所述第一脂质分子与第二脂质分子的摩尔比为1:(0.05～8)，例如可以为1:0.06、1:0.08、1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8等，进一步优选为1:(1～7)。
优选地，所述脂样分子与第一脂质分子的摩尔比为1:(0.1～10)，例如可以为1:0.2、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9等，进一步优选为1:1。
优选地，所述脂样分子与第二脂质分子的摩尔比为1:(0.05～8)，例如可以为1:0.06、1:0.08、1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8等，进一步优选为1:(0.06～5)。
本发明提供的mRNA递送系统具有如下优势：
(1)配方简单，有利于减小批次之间的差异
先前报道的用于体内递送mRNA的脂质纳米递送载体主要由4种或4种以上组分组成，配方复杂；本发明提供的mRNA递送系统中，作为递送载体的脂样纳米粒由双组分(脂样分子与第一脂质分子的组合)或三组分(脂样分子、第一脂质分子与第二脂质分子的组合)组成，配方简单，易于制备，有利于提高批次之间的稳定性。
(2)递送等量的mRNA所需的脂样分子用量少
先前报道的用于体内递送mRNA的脂质纳米粒，其递送载体主成分与mRNA的质量比通常维持在10:1；本发明提供的mRNA递送系统中，涉及的脂样分子与mRNA的质量比通常维持在1.5:1，表明递送等量的mRNA所需脂样分子的质量减少了83％或以上，这有利于减少递送载体的体内用量。
(3)高效高特异性脾脏靶向递送mRNA
本发明提供的mRNA递送系统中，双组分的脂样纳米粒递送载体可高度特异性靶向递送mRNA至脾脏；调整制剂配方，可进一步提高脾脏靶向递送的效率，为脾脏靶向递送mRNA提供了一种新型高效的递送系统。
(4)高效高特异性肺部靶向递送mRNA
本发明提供的mRNA递送系统中，在双组分脂样纳米粒递送载体的基础上引入第二脂质分子，可改变制剂的靶向性，实现mRNA高度特异性靶向递送至肺部，为肺部靶向递送mRNA提供了一种新型高效的递送系统。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的mRNA递送系统的制备方法，所述制备方法包括：将脂样分子、脂质分子与有机溶剂混合，得到有机相；将所述有机相与mRNA溶液混合，得到所述mRNA递送系统。
优选地，所述有机溶剂为与水互溶的有机溶剂，进一步优选为醇类溶剂。
优选地，所述有机溶剂包括甲醇和/或乙醇。
优选地，所述脂样分子与脂质分子的摩尔比为1:(0.1～10)，例如可以为1:0.2、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9等。
优选地，所述脂质分子包括第一脂质分子与任选地第二脂质分子；所述第一脂质分子为非阳离子脂质，所述第二脂质分子为非阳离子脂质和/或阳离子脂质。
优选地，所述第一脂质分子与第二脂质分子的摩尔比为1:(0.05～8)，例如可以为1:0.06、1:0.08、1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8等。
优选地，所述脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比(氮磷比)为(0.1～10):1，例如可以为0.2:1、0.3:1、0.5:1、0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等。
优选地，所述mRNA溶液的溶剂为水性溶剂，进一步优选为缓冲溶液，更进一步优选为PBS缓冲溶液。
优选地，所述mRNA溶液中mRNA的浓度为5～500ng/μL，例如可以为8ng/μL、10ng/μL、15ng/μL、20ng/μL、25ng/μL、30ng/μL、40ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、150ng/μL、200ng/μL、250ng/μL、300ng/μL、350ng/μL、400ng/μL或450ng/μL，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述有机相与mRNA溶液(水相)的体积比为1:(1～10)，例如可以为1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10等。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的mRNA递送系统在器官靶向药物中的应用。
优选地，所述器官靶向药物包括脾脏靶向药物或肺靶向药物。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的mRNA递送系统。
优选地，所述药物组合物的给药方式包括肌肉注射、皮内注射、静脉注射或动脉注射，进一步优选为肌肉注射或静脉注射。
优选地，所述药物组合物包括脾脏靶向药物和/或肺靶向药物。
优选地，所述药物组合物包括治疗脾脏疾病的药物组合物或治疗肺部疾病的药物组合物。
优选地，所述药物组合物还包括佐剂。
优选地，所述佐剂包括药用载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的mRNA递送系统以含有特定结构的脂样分子与脂质分子的脂样纳米粒作为递送载体，使所述mRNA递送系统能够高度特异性靶向递送mRNA至脾脏，并具有较高的递送效率；同时，通过配方的调整，可以实现靶向性的转变，使mRNA递送系统高效地、高度特异性地靶向递送至肺部。所述mRNA递送系统的组分简单，易于制备，批次之间的稳定性高，递送效率高，靶向特异性高，实现了肝脏之外的不同器官的高度特异性的靶向递送，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1～6提供的mRNA递送系统给药后的小鼠离体器官成像生物发光图；
图2为实施例1～6提供的mRNA递送系统给药后小鼠每克器官的总光子通量值结果图；
图3为实施例4、7～30提供的mRNA递送系统的体外递送效率测试结果；
图4为实施例4、8、15、23、28提供的mRNA递送系统给药后的小鼠离体器官成像生物发光图；
图5为实施例4、8、15、23、28提供的mRNA递送系统给药后小鼠每克器官的总光子通量值结果图；
图6为本发明所述mRNA递送系统的器官靶向性效果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种mRNA递送系统，包括递送载体以及负载于所述递送载体上的萤火虫荧光素酶mRNA(来自上海伟寰生物科技有限公司)；所述递送载体为含有脂样分子tB-UC18和脂质分子(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺，DOPE)的脂样纳米粒；tB-UC18中N原子与mRNA中P原子的摩尔比(以下简称为氮磷比)为1.5:1，tB-UC18与DOPE的摩尔比为1:1；其制备方法包括如下步骤：
(1)将mRNA溶解至pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为55ng/μL的mRNA溶液；
(2)将脂样分子tB-UC18和脂质分子DOPE以摩尔比1:1溶解于乙醇中，混合均匀得到有机相；
(3)将步骤(2)得到的有机相与步骤(1)得到的mRNA溶液以体积比1:9混合，使tB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1，静置，得到所述mRNA递送系统。
实施例2～6
一种mRNA递送系统，其与实施例1的区别仅在于，脂质分子的种类不同，分别为DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱)、DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、POPE(1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺)、Chol(胆固醇)、DC-Chol(3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇)，其他组分、用量、制备方法均与实施例1相同；具体配方如表1所示。
表1
对上述实施例1～6提供的mRNA递送系统进行体内靶向性评价，具体如下：
以C57BL/6J小鼠为实验对象，通过尾静脉注射给药的方式向小鼠体内注入实施例1～6提供的mRNA递送系统，每只小鼠按mRNA量为0.5mg/kg尾静脉给药；给药4h后，按150mg/kg剂量腹腔给底物荧光素，10min后通过小动物成像仪(珀金埃尔默，PerkinElmer)对小鼠进行整体成像；然后依次取出主要器官(心、肝、脾、肺、肾等)，进行离体成像，检测萤火虫荧光素酶的蛋白表达情况。
实施例1～6提供的mRNA递送系统给药后的小鼠离体器官成像生物发光图如图1所示；通过珀金埃尔默活体成像软件(Living Image Software)对图1的生物发光进行光子通量进行定量分析(Total flux)，获得小鼠每克器官的总光子通量值结果(单位为Totalflux/g)如图2所示；结合图1和图2可知，双组份(脂样分子与第一脂质分子)的脂样纳米粒作为递送载体，使所述mRNA递送系统实现了mRNA在脾脏的高效、高特异性的表达；而且，与实施例1中由tB-UC18与DOPE组成的递送载体相比，实施例4提供的mRNA递送系统以tB-UC18与POPE构建的脂样纳米粒递送载体，能够进一步将脾脏靶向递送效率提高4倍左右。
实施例7
一种mRNA递送系统，包括递送载体以及负载于所述递送载体上的萤火虫荧光素酶mRNA；所述递送载体为含有脂样分子tB-UC18、第一脂质分子POPE和第二脂质分子(双十八烷基二甲基溴化铵，DDAB18)的脂样纳米粒；tB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1，tB-UC18、DOPE、DDAB18三者的摩尔比为1:1:6；其制备方法包括如下步骤：
(1)将mRNA溶解至pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为55ng/μL的mRNA溶液；
(2)将脂样分子tB-UC18、第一脂质分子POPE和第二脂质分子DDAB18以摩尔比1:1:6溶解于乙醇中，混合均匀得到有机相；
(3)将步骤(2)得到的有机相与步骤(1)得到的mRNA溶液以体积比1:9混合，使tB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1，静置，得到所述mRNA递送系统。
实施例8～30
一种mRNA递送系统，其与实施例7的区别仅在于，第二脂质分子的种类和/或用量不同，其他组分、用量、制备方法均与实施例7相同；具体配方如表2所示。
表2
表2中，DDAB16表示双十六烷基二甲基溴化铵，DOPG表示二油酰磷脂酰甘油，DPPG表示1,2-棕榈酰磷脂酰甘油。
对上述实施例4、7～30提供的mRNA递送系统进行性能测试及分析，具体如下：
(1)制剂配方在细胞水平的优化，方法如下：
在96孔板中铺293T细胞，每孔含90μL的全细胞培养液，24h后，取10μL待测的mRNA递送系统(实施例4、7～30；用于细胞实验时，将实施例中的mRNA递送系统用PBS溶液稀释至原来体积的2.5倍)加入到孔中，置于细胞培养箱中培养，24h后加荧光素底物，检测荧光素酶的表达水平。
示例性地，实施例4、7～30提供的mRNA递送系统的体外递送效率测试结果如图3所示，从图中可知，在对照组实施例4所述双组分脂样纳米粒递送载体的mRNA递送系统基础上引入第二脂质分子，并通过第二脂质分子的配方优化，可得到具有更高体外递送效率的所述mRNA递送系统。
(2)mRNA递送系统的体内靶向性评价
以C57BL/6J小鼠为实验对象，通过尾静脉注射给药的方式向小鼠体内注入本发明提供的mRNA递送系统(简明起见，示例性提供实施例4、8、15、23、28的小鼠体内实验结果)，每只小鼠按mRNA量为0.5mg/kg尾静脉给药；给药4h后，按150mg/kg剂量腹腔给底物荧光素，10min后通过小动物成像仪对小鼠进行整体成像；然后依次取出主要器官(心、肝、脾、肺、肾等)，进行离体成像，检测萤火虫荧光素酶的蛋白表达情况。
实施例4、8、15、23、28提供的mRNA递送系统给药后的小鼠离体器官成像生物发光图如图4所示；通过珀金埃尔默活体成像软件对图4的生物发光进行光子通量进行定量分析(Total flux)，获得的小鼠每克器官的总光子通量值结果(单位为Total flux/g)如图5所示；结合图4和图5可知，在实施例4所述双组分脂样纳米粒递送载体的mRNA递送系统基础上，在脂样纳米粒中引入特定种类的第二脂质分子(阳离子脂质)，能够实现所述mRNA递送系统的器官靶向性的转变，使其由脾脏靶向转变为高效、高度特异性地肺部靶向。
综上所述，本发明提供的mRNA递送系统以含有特定结构的脂样分子与脂质分子的脂样纳米粒作为递送载体，使所述mRNA递送系统实现了肝脏之外器官的高度特异性的靶向递送；其中，双组分的脂样纳米粒递送载体可高度特异性靶向递送mRNA至脾脏，通过调整制剂配方、尤其是调整脂质分子的种类，可进一步提高脾脏靶向递送的效率；进一步地，通过在双组分脂样纳米粒递送载体的基础上引入第二脂质分子(阳离子脂质)，可改变制剂的器官靶向性，使mRNA高度特异性靶向递送至肺部；上述器官靶向性效果的示意图如图6所示。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的mRNA递送系统及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (35)

1.一种mRNA递送系统，其特征在于，所述mRNA递送系统包括递送载体以及负载于所述递送载体上的mRNA；所述递送载体包括含有脂样分子和脂质分子的脂样纳米粒；所述脂样分子的结构与脂质分子的结构不同；
所述脂样分子具有如式I所示结构：
其中，R1、R2、R3各自独立地选自C1～C50直链烷基或C2～C50直链不饱和烃基；
n选自1～10的整数；
所述脂质分子包括第一脂质分子与任选地第二脂质分子；所述第一脂质分子为1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺，所述第二脂质分子为非阳离子脂质和/或阳离子脂质。
2.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述R1、R2、R3各自独立地选自C6～C20直链烷基或C6～C20直链烯烃基中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述R1、R2、R3各自独立地选自如下基团中的任意一种：
其中，波浪线标记处代表基团的连接键。
4.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述R1、R2、R3为相同的基团。
5.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样分子具有如下结构中的任意一种：
6.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比为(0.1～10):1。
7.根据权利要求6所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比为(1～3):1。
8.根据权利要求7所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比为1.5:1。
9.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样纳米粒中脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:(0.1～10)。
10.根据权利要求9所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样纳米粒中脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:(1～7)。
11.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述非阳离子脂质包括1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰基卵磷脂、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1,2-肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二油烯-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、二油酰磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、胆固醇、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂或二酰基甘油中的任意一种或至少两种的组合。
12.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述阳离子脂质包括N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵、双十六烷基二甲基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、N-(1-(2,3-二油氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙基胺、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇、1,2-二亚油基氧代基-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷或2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环中的任意一种或至少两种的组合。
13.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述第二脂质分子为阳离子脂质。
14.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述第一脂质分子与第二脂质分子的摩尔比为1:(0.05～8)。
15.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样分子与第一脂质分子的摩尔比为1:(0.1～10)。
16.根据权利要求15所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样分子与第一脂质分子的摩尔比为1:1。
17.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样分子与第二脂质分子的摩尔比为1:(0.05～8)。
18.根据权利要求17所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样分子与第二脂质分子的摩尔比为1:(0.06～5)。
19.一种如权利要求1～18任一项所述的mRNA递送系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将脂样分子、脂质分子与有机溶剂混合，得到有机相；将所述有机相与mRNA溶液混合，得到所述mRNA递送系统。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为醇类溶剂。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇和/或乙醇。
22.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述脂样分子与脂质分子的摩尔比为1:(0.1～10)。
23.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述脂质分子包括第一脂质分子与任选地第二脂质分子；所述第一脂质分子为1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺，所述第二脂质分子为非阳离子脂质和/或阳离子脂质。
24.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述第一脂质分子与第二脂质分子的摩尔比为1:(0.05～8)。
25.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比为(0.1～10):1。
26.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述mRNA溶液的溶剂为缓冲溶液。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其特征在于，所述mRNA溶液的溶剂为PBS缓冲溶液。
28.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述mRNA溶液中mRNA的浓度为5～500ng/μL。
29.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述有机相与mRNA溶液的体积比为1:(1～10)。
30.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1～18任一项所述的mRNA递送系统。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式包括肌肉注射、皮内注射、静脉注射或动脉注射。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式为肌肉注射或静脉注射。
33.根据权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗脾脏疾病的药物组合物或治疗肺部疾病的药物组合物。
34.根据权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括佐剂。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其特征在于，所述佐剂包括赋形剂或稀释剂中的任意一种或两种的组合。
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