CN105983102B - 基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域，具体提供了一种基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统及其制备方法，用于调控破骨细胞功能。本发明的破骨细胞靶向递送系统包括脂质体、破骨细胞靶向分子和具有调控破骨细胞功能的小核酸药物。本发明的递送系统针对破骨细胞进行靶向，具有较强的专属性；该递送系统不仅可防止小核酸药物被体内物质降解，还可将小核酸药物特异性传递到靶细胞中，有利于小核酸药物调控破骨细胞的功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种破骨细胞靶向递送系统及其制备方法，尤其涉及一种基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统及其制备方法。
背景技术
骨组织吸收是骨组织发生的基本过程，破骨细胞负责该功能。在破骨细胞中，异常表达的小核酸会引起破骨细胞功能异常，同时引发各种骨与关节疾病，如：骨质疏松症、骨坏死和骨硬化疾病等。
小核酸可以调节基因表达，从而影响细胞功能。近年来，一系列可调控破骨细胞功能的小核酸被发现，包括影响破骨细胞生成、迁移和成熟的miR-29家族、miR-148a和miR-503等。调控破骨细胞小核酸药物的发现，使得通过核糖核酸的阻断剂和模拟物等技术手段，实现小核酸药物调控破骨细胞功能，进行骨治疗成为可能。
然而，破骨样细胞主要分布在骨吸收表面，而且在使用小核酸药物进行治疗时，破骨样细胞是主要的作用靶点，所以特异性靶向骨破坏表面以及破骨样细胞尤为重要。
据报道，骨靶向药物递送系统通常由骨靶向分子、脂质体材料和小分子药物/高分子化合物组成。现有技术中，中国2012年12月19日公开的专利CN102824647A报道了基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统，该递送系统包括脂质体、骨靶向分子和具有促进骨形成功能的小核酸药物。但是，能够特异性靶向破骨细胞的药物递送系统目前还未见报道。
发明内容
为克服上述现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统，所述递送系统针破骨样细胞进行靶向，可利用小核酸药物调控破骨细胞功能，具有较强的专属性和特异性，
与此相应，本发明的另一目的在于提供一种基于小核酸药物的破骨细胞靶向系统的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统包括脂质体、破骨细胞靶向分子和具有调控破骨细胞功能的小核酸药物。
本发明的靶向递送系统中，破骨细胞靶向分子连接于脂质体表面，小核酸药物包封于脂质体内。小核酸药物包封在递送系统中，不仅可防止小核酸药物被体内物质降解，还可作用于靶向目标，调控破骨细胞生成、迁移和成熟。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的优选实施方式，
所述破骨细胞靶向分子为天门冬氨酸多肽重复序列。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的更优选实施方式，所述破骨细胞靶向分子为8个天门冬氨酸多肽重复序列。8个天门冬氨酸多肽重复序列如SEQ IDNO：1所示，具体为：Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp。8个天门冬氨酸多肽重复序列对骨吸收表面有较高的亲和性，因此可通过它来靶向破骨样细胞，将药物递送到破骨细胞并调控其功能。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的优选实施方式，所述小核酸药物为具有调控破骨细胞功能的微小核糖核酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂中的一种或几种。作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的更优选实施方式，所述微小核糖核酸的模拟物为miR-21mimic或miR-126-5p mimic；所述微小核糖核酸的阻断剂选自miR-29家族、miR-148a antagomir、miR-503、antagomir-214或antagomir-2861。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的优选实施方式，所述脂质体含有非阳离子脂质或者含有阳离子脂质与非阳离子脂质的混合物。
本发明模拟细胞膜的成分，脂质体为多种脂质的混合物，这样脂质体与细胞膜的亲和性更高，本发明的靶向递送系统更容易将药物递送到细胞内。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的更优选实施方式，所述脂质体中，阳离子脂质的质量百分比为20～50％，非阳离子脂质的质量百分比为50～80％。
阳离子脂质为一类带正电荷的磷脂，非阳离子脂质包括不带电荷和带负电荷的脂质。此外，脂质体中也可含有中性脂质胆固醇等辅助脂质和/或聚乙二醇(PEG)等修饰剂。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的优选实施方式，所述阳离子脂质类选自二油酰二甲基铵丙烷(DODAP)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、DLin-KC2-DMA(英文表示为2，2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1，3]-dioxolane，中文表示为：2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-(1，3)-二氧戊环)、1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N，-氯化三甲铵(DOTMA)中的至少一种；非阳离子脂质类选自DC-胆固醇(DC-Chol)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)中的至少一种。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的优选实施方式，所述脂质为带有甲氧基末端的PEG修饰脂质，例如，脂质体中的脂质为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的PEG化衍生物(DSPE-mPEG)。
PEG修饰脂质体具有水溶性好、毒性低、无免疫原性等优势；PEG末端可以进行羧酸、胺或马来酰亚胺基团等活性基团修饰，便于进一步与破骨细胞靶向分子连接，故PEG修饰脂质适合用作于连接反应的起始剂。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的优选实施方式，所述脂质体含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)，末端的活性马来酰亚胺基团有利于在脂质体表面进行修饰。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的优选实施方式，所述破骨细胞靶向递送系统中，脂质体中的脂质包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺，破骨细胞靶向分子末端进行巯基修饰。破骨细胞靶向递送系统中，通过巯基与马来酰亚胺键结合，靶向分子连接于脂质体表面上。破骨细胞靶向分子末端进行巯基修饰，巯基(-SH)可与脂质体中的马来酰亚胺基团直接反应，这样破骨细胞靶向分子不仅可靶向破骨细胞，还能直接连接于脂质体表面。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的优选实施方式，所述破骨细胞靶向递送系统中，破骨细胞靶向分子与脂质体的摩尔比为2∶100～10∶100，小核酸药物与脂质体的脂质质量比为2％～20％。本发明的破骨细胞靶向递送系统中，破骨细胞靶向分子与脂质体的摩尔比是通过HPLC(高效液相色谱)测试破骨细胞靶向分子与脂质体连接前、后，游离靶向分子的减少量，从而确定的。小核酸药物与脂质体脂质的质量比是经Quant-iTTM
RNA试剂盒检测，通过酶标仪检测(D-Asp8)-liposome-miR-148a antagomir中加入0.5％Triton X-100前后数值的区别，进行鉴定的；加入0.5％Triton X-100前(Cb)，加入0.5％Triton X-100后(Ca)，包封率为(Ca-Cb)/Ca×100％。
本发明提供的上述小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的制备方法包括以下步骤：
(1)制备空白脂质体：将脂质溶解于有机溶剂中，旋转蒸发除去有机溶剂后，加入綬冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：取破骨细胞靶向分子与空白脂质体混合，搅拌过夜进行连接反应；
(3)纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体；
(4)包封小核酸药物：将具有调控破骨细胞功能的小核酸药物溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入步骤(3)所得的冻干破骨细胞靶向空白脂质体进行水化处理，孵育破骨细胞靶向空白脂质体与小核酸药物，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统。
本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的制备方法中，步骤(1)的脂质溶解于有机溶剂中时完全溶解即可(每一毫克脂质约需要10ml体积的氯仿溶解)。步骤(3)中，纯化步骤(2)所得的含破骨细胞靶向分子的空白脂质体，分离出游离的破骨细胞靶向分子后，使用冷冻干燥机冷冻干燥纯化所得的破骨细胞靶向空白脂质体样品。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的制备方法的优选实施方式，所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的制备方法包括以下步骤：
(1)制备空白脂质体：将脂质溶解于氯仿中，旋转蒸发除去氯仿后，加入pH为7.0～9.0、浓度为10～50mM的磷酸盐綬冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：取破骨细胞靶向分子与空白脂质体混合，搅拌过夜进行连接反应；其中，破骨细胞靶向分子与空白脂质体的摩尔比为：2∶1～10∶1；
(3)采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体；
(4)包封小核酸药物：将具有调控破骨细胞功能的小核酸药物溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入步骤(3)所得的冻干破骨细胞靶向空白脂质体进行水化处理；其中，小核酸药物与破骨细胞靶向空白脂质体的比例为：每加入50g小核酸药物，加入1～1.2mol冻干破骨细胞靶向空白脂质体；孵育破骨细胞靶向空白脂质体与小核酸药物20～40分钟，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统。
作为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(1)中旋转蒸发于40℃水浴中进行；步骤(1)中每称取1mg脂质时，加入10mL缓冲溶液；所述步骤(2)中，破骨细胞靶向分子与空白脂质体的摩尔比为3∶1；步骤(2)中破骨细胞靶向分子与空白脂质体混合、进行连接反应的温度为4℃，搅拌的速度为60～120转/分钟；所述步骤(3)中，纯化过程中采用的流动相选用PH为7.0～9.0、浓度为10～50mM磷酸盐綬冲液，所述步骤(4)中，加入的小核酸药物与破骨细胞靶向空白脂质体的优选比例为：每加入50g小核酸药物，加入1mol冻干破骨细胞靶向空白脂质体；小核酸药物的包封率为80％以上；步骤(4)中孵育破骨细胞靶向空白脂质体与小核酸药物的优选方式为：于100转/分钟进行混匀，常温下反应40分钟。
本发明的有益效果为：本发明脂质体中含有多种脂质的混合物，脂质体与细胞膜的亲和性更高，本发明的靶向递送系统更容易被人吸收。本发明的破骨细胞靶向分子不仅可靶向破骨细胞，靶向分子上用基团进行修饰，还可有利于其连接于脂质体上。
本发明通过将破骨细胞的靶向分子、调控破骨细胞功能的小核酸药物和脂质体连接，提供了一种基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统及其制备方法。本发明主要针对破骨样细胞进行靶向，具有较强的专属性；本发明提供的基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统不仅可防止小核酸药物被体内物质降解，还可将小核酸药物特异性传递到靶细胞中，有利于小核酸药物调控破骨细胞的功能。
附图说明
图1：为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的制备过程示意图；
图2a-2b：为本发明验证破骨细胞靶向分子连接到脂质体表面的高效液相色谱图；
图3a-3c：为本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的粒径分布以及在体外血浆中稳定性测试的结果图；
图4：为在体内各器官骨靶向性验证实验中，携带FAM荧光标记的基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统以及对照组的荧光强度活体成像图；
图5a-5f：为FAM荧光标记的小核酸药物和相应抗体(OSCAR)标记破骨细胞的免疫组分析结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
实施例中，破骨细胞靶向递送系统的制备过程如图1所示。下述实施例制得的破骨细胞靶向递送系统中，破骨细胞靶向分子(D-Asp8)-SH与脂质体中的所含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺，通过巯基与马来酰亚胺键的结合，靶向分子连接于脂质体表面；小核酸药物均包封于脂质体内。
实施例的破骨细胞靶向递送系统中，破骨细胞靶向分子与脂质体的摩尔比是通过HPLC(高效液相色谱)测试破骨细胞靶向分子与脂质体连接前、后，游离靶向分子的减少量，从而确定的。小核酸药物与脂质体脂质的质量比是经Quant-iTTM
RNA试剂盒检测，通过酶标仪检测(D-Asp8)-liposome-miR-148a antagomir中加入0.5％Triton X-100前后数值的区别，进行鉴定的；加入0.5％Triton X-100前(Cb)，加入0.5％Triton X-100后(Ca)，包封率为(Ca-Cb)/Ca×100％。
实施例中，制备空白脂质体时，每称取1mg脂质(指脂质总量)时，加入10mL缓冲溶液进行水化。
实施例中，脂质体-(miR-148a antagomir)指的是由脂质体与微小核糖核酸阻断剂miR-148a antagomir按照本发明方法组成的系统，即先按照本发明方法制备空白脂质体，再按照本发明方法孵育空白脂质体与miR-148a antagomir，将miR-148a antagomir包封于脂质体内。
实施例1
本发明基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的一种实施例，本实施例所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统包括脂质体、末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)和微小核糖核酸的阻断剂miR-148a antagomir；其中，脂质体由以下质量百分比的脂质组成：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％、1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)15％、DC-胆固醇(DC-Chol)50％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)15％和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)15％。本实施例的靶向递送系统中，(D-Asp8)-SH与脂质体的摩尔比为2∶100，微小核糖核酸阻断剂miR-148a antagomir与脂质体的质量比为10％，miR-148a antagomir在含脂质体中的包封率达到80％。
本实施例所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统采用以下方法制备而成，制备过程示意图如图1所示：
(1)制备空白脂质体：将由以下质量百分比组成的脂质：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％、1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)15％、DC-胆固醇(DC-Chol)50％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)15％和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)15％，完全溶解于氯仿中，于40℃水浴中旋转蒸发除去氯仿后，加入PH为7.0、浓度为30mM的磷酸盐綬冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：于4℃温度下，将浓度为1mg/ml的末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)与步骤(1)所得空白脂质体以3∶1摩尔比混合，以60转/分钟的速度搅拌过夜，连接(D-Asp8)-SH与空白脂质体，得到(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体(表示为(D-Asp8)-脂质体)；
(3)纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体：以pH为7.0、浓度为30mM的磷酸盐綬冲液作流动相，用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化上述步骤(2)所得(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体，分离出游离的(D-Asp8)-SH，用冷冻干燥机冷冻干燥纯化所得的(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体；
(4)包封小核酸药物：称取微小核糖核酸阻断剂miR-148a antagomir，将miR-148aantagomir溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入冻干的(D-Asp8)-脂质体进行水化(miR-148aantagomir与(D-Asp8)-脂质体的比例为：每加入50g miR-148a antagomir，加入1.1mol(D-Asp8)-脂质体)，以100转/分钟的速度搅拌混匀，孵育35min，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统(该递送系统表示为：(D-Asp8)-脂质体-miR-148a antagomir)。
实施例2
本发明基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的一种实施例，本实施例所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统包括脂质体、末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)和微小核糖核酸的阻断剂。其中，脂质体由以下质量百分比的脂质组成：二油酰二甲基铵丙烷(DODAP)10％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)10％、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)15％、DC-胆固醇(DC-Chol)60％和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％；微小核糖核酸的阻断剂由miR-29a、miR-29b和miR-29c组成，miR-29a、miR-29b和miR-29c质量百分比分别为30％、30％、40％。本实施例的靶向递送系统中，(D-Asp8)-SH与脂质体的摩尔比为10∶100，微小核糖核酸阻断剂与脂质体的质量比为2％，微小核糖核酸阻断剂在脂质体中的包封率为80％。
本实施例所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统采用以下方法制备而成，制备过程示意图如图1所示：
(1)制备空白脂质体：将由以下质量百分比组成的脂质：二油酰二甲基铵丙烷(DODAP)10％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)10％、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)15％、DC-胆固醇(DC-Chol)60％、和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％，完全溶解于氯仿中，于40℃水浴中旋转蒸发除去氯仿后，加入PH为8.0、浓度为10mM的磷酸盐綬冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：于4℃温度下，将末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)与步骤(1)所得空白脂质体以10∶1摩尔比混合，以120转/分钟的速度搅拌过夜，连接(D-Asp8)-SH与空白脂质体，得到(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体(表示为(D-Asp8)-脂质体)；
(3)纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体：以pH为8.0、浓度为10mM的磷酸盐綬冲液作流动相，用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化上述步骤(2)所得(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体，分离出游离的(D-Asp8)-SH，用冷冻干燥机冷冻干燥纯化所得的(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体；
(4)包封小核酸药物：称取微小核糖核酸的阻断剂，微小核糖核酸的阻断剂由质量百分比分别为30％、30％、40％的miR-29a、miR-29b和miR-29c组成；将微小核糖核酸的阻断剂溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入冻干的(D-Asp8)-脂质体进行水化(微小核糖核酸的阻断剂与(D-Asp8)-脂质体的比例为：每加入50g微小核糖核酸的阻断剂，加入1.2mol(D-Asp8)-脂质体)，以100转/分钟的速度搅拌混匀，孵育20min，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统。
实施例3
本发明基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的一种实施例，本实施例所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统包括脂质体、末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)和微小核糖核酸的阻断剂。其中，脂质体由以下质量百分比的脂质组成：1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)5％、N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N，-氯化三甲铵(DOTMA)10％、磷脂酰胆碱(PC)50％、DC-胆固醇(DC-Chol)30％和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％；微小核糖核酸的阻断剂由质量百分比分别为50％、50％的antagomir-214和antagomir-2861组成。本实施例的靶向递送系统中，(D-Asp8)-SH与脂质体的摩尔比为5∶100，微小核糖核酸阻断剂与脂质体的质量比为20％，微小核糖核酸阻断剂在脂质体中的包封率为80％。
本实施例所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统采用以下方法制备而成，制备过程示意图如图1所示：
(1)制备空白脂质体：将由以下质量百分比组成的脂质：1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)5％、N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N，-氯化三甲铵(DOTMA)10％、磷脂酰胆碱(PC)50％、DC-胆固醇(DC-Chol)30％和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％，完全溶解于氯仿中，于40℃水浴中旋转蒸发除去氯仿后，加入PH为9.0、浓度为50mM的磷酸盐綬冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：于4℃温度下，将末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)与步骤(1)所得空白脂质体以6∶1摩尔比混合，以90转/分钟的速度搅拌过夜，连接(D-Asp8)-SH与空白脂质体，得到(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体(表示为(D-Asp8)-脂质体)；
(3)纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体：以pH为9.0、浓度为50mM的磷酸盐綬冲液作流动相，用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化上述步骤(2)所得(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体，分离出游离的(D-Asp8)-SH，用冷冻干燥机冷冻干燥纯化所得的(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体；
(4)包封小核酸药物：称取微小核糖核酸的阻断剂，微小核糖核酸的阻断剂由质量百分比分别为50％、50％的antagomir-214和antagomir-2861组成；将微小核糖核酸的阻断剂溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入冻干的(D-Asp8)-脂质体进行水化(微小核糖核酸的阻断剂与(D-Asp8)-脂质体的比例为：每加入50g微小核糖核酸的阻断剂，加入1mol(D-Asp8)-脂质体)，以100转/分钟的速度搅拌混匀，孵育40min，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统。
实施例4
本发明基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的一种实施例，本实施例所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统包括脂质体、末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)和微小核糖核酸的模拟物miR-21mimic。其中，脂质体由以下质量百分比的脂质组成：DC-胆固醇(DC-Chol)50％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)15％、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)15％、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)15％和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％。本实施例的靶向递送系统中，(D-Asp8)-SH与脂质体的摩尔比为3∶100，miR-21mimic与脂质体的质量比为8％，其在脂质体中的包封率为80％。
本实施例所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统采用以下方法制备而成，制备过程示意图如图1所示：
(1)制备空白脂质体：将由以下质量百分比组成的脂质：DC-胆固醇(DC-Chol)50％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)15％、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)15％、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)15％和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％，完全溶解于氯仿中，于40℃水浴中旋转蒸发除去氯仿后，加入PH为7.0、浓度为30mM的磷酸盐綬冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：于4℃温度下，将末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)与步骤(1)所得空白脂质体以2∶1摩尔比混合，以60转/分钟的速度搅拌过夜，连接(D-Asp8)-SH与空白脂质体，得到(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体(表示为(D-Asp8)-脂质体)；
(3)纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体：以pH为7.0、浓度为30mM的磷酸盐綬冲液作流动相，用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化上述步骤(2)所得(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体，分离出游离的(D-Asp8)-SH，用冷冻干燥机冷冻干燥纯化所得的(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体；
(4)包封小核酸药物：称取微小核糖核酸的模拟物miR-21mimic，将其溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入冻干的(D-Asp8)-脂质体进行水化(miR-21mimic与(D-Asp8)-脂质体的比例为：每加入50g miR-21mimic，加入1mol(D-Asp8)-脂质体)，以100转/分钟的速度搅拌混匀，孵育30min，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统。
实施例5
本实施例采用高效液相色谱法(HPLC)验证破骨细胞靶向分子连接到脂质体表面。
本实施例中，基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统按照本发明的方法制备，制备方法包括以下步骤(为方便定量检测，在反应前将D-Asp8-SH配制成1mg/ml)：
(1)制备空白脂质体：将脂质(所述脂质中阳离子脂质的质量百分比为20～50％，非阳离子脂质的质量百分比为50～80％；并且脂质中包含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL))完全溶解于有机溶剂中，旋转蒸发除去有机溶剂后，加入綬冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：将浓度为1mg/ml的末端进行巯基修饰的8个天门冬氨酸多肽重复序列((D-Asp8)-SH)与步骤(1)所得空白脂质体混合，搅拌过夜，连接(D-Asp8)-SH与空白脂质体；
(3)纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体：纯化上述步骤(2)所得(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体，分离出游离的(D-Asp8)-SH，用冷冻干燥机冷冻干燥纯化所得的(D-Asp8)-SH靶向空白脂质体(该脂质体表示为(D-Asp8)-脂质体)；
(4)包封小核酸药物：称取微小核糖核酸阻断剂miR-148a antagomir，将miR-148aantagomir溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入冻干的(D-Asp8)-脂质体进行水化，搅拌混匀，孵育，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统(该递送系统表示为：(D-Asp8)-脂质体-miR-148a antagomir)。
分别测试1mg/ml(D-Asp8)-SH与本发明的空白脂质体连接前、后的高效液相色谱色谱图。高效液相色谱的条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18色谱柱，规格：4.6mm×150mm，颗粒尺寸5μm；柱温：35℃；流动相为0.1％三氟乙酸水溶液与0.1％三氟乙酸乙腈溶液，0.1％三氟乙酸水溶液与0.1％三氟乙酸乙腈溶液的初始体积比为90∶10，十分钟后，0.1％三氟乙酸水溶液与0.1％三氟乙酸乙腈溶液的体积比为70∶30；洗脱方式：梯度洗脱；流速：流速1.0ml/min；检测波长：220nm。
高效液相色谱法验证破骨细胞靶向分子链接到脂质体表面的结果如图2所示。图2中，图2a表示浓度为1mg/ml的(D-Asp8)-SH与脂质体连接前的色谱图；图2b表示浓度为1mg/ml的(D-Asp8)-SH与脂质体连接后的色谱图。结果表明，(D-Asp8)-SH的出峰时间为t＝8.8min；连接反应后，(D-Asp8)-SH的峰面积减小，可见(D-Asp8)-SH浓度降低。-SH会与DSPE-PEG-MAL表面的马来酰亚胺键结合，故(D-Asp8)-SH连接在DSPE-PEG-MAL上，导致(D-Asp8)-SH浓度降低。
实施例6
测试本发明所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的的粒径分布以及其在体外血浆中的稳定性；其中，测试的递送系统中的小核酸药物为miR-148a antagomir，稳定性的测试方式为：采用琼脂糖胶进行检测是否存在miR-148a antagomir。实验结果如图3所示。图3中，图3a为所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的的粒径分布图；图3b为所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统在体外血浆中的稳定性测试结果图；图3c为游离的微小核糖核酸阻断剂miR-148a antagomir在体外血浆中的稳定性测试结果图。
结果表明，所述靶向递送系统粒径均值为150nm；所述靶向递送系统在血浆中24h后仍能测得miR-148a antagomir，但游离的miR-148a antagomir在血浆中1h后不能检测到。由此可见，递送系统能对miR-148a antagomir起到保护作用，免受血浆中降解酶的降解作用。
实施例7
测试在体内各器官骨靶向性验证实验中，携带FAM荧光标记的基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统和对照组的荧光强度活体成像图；其中，(D-Asp8)-脂质体-(miR-148a antagomir)为本发明的靶向递送系统，对照组为游离的miR-148a antagomir、Invivo jetPEI-(miR-148a antagomir)、脂质体-(miR-148a antagomir)系统。In vivojetPEI购买于Polyplus-transfection公司，In vivo jetPEI-(miR-148a antagomir)按照Polyplus-transfection公司提供的DNA&siRNA Delivery Protocol(in vivo-jetPEIDNA&RNA递送系统制备方法)制得。实验结果如图4所示。
结果表明，在心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中，对于FAM标记的基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统，其小核酸药物的荧光强度较FAM标记的对照组弱，而在骨组织中的荧光强度较其他组强。由此，可以表明(D-Asp8)-SH靶头的存在可帮助miR-148aantagomir递送到骨组织上，而规避其他组织，达到靶向骨组织的效果。
实施例8
测试分析FAM荧光标记的小核酸药物和相应抗体(OSCAR)标记破骨细胞的免疫组，实验结果如图5a-5f所示。图5a、5b、5c表示脂质-miR-148a antagomir组，图5d、5e、5f表示本发明的靶向递送系统：(D-Asp8)-脂质体-(miR-148a antagomir)。图5a、5d为OSCAR标记破骨细胞，图5b、5e为FAM荧光标记的小核酸药物；图5c、5f为OSCAR和FAM与DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)结合。
结果表明，(D-Asp8)-脂质体携带的miR-148a antagomir的绿色荧光与破骨样细胞的红色荧光有很好的重合，重合机率大于不含靶头的脂质体携带的miR-148aantagomir，因不含靶头的脂质体携带的miR-148a antagomir绿色荧光与破骨样细胞与破骨样细胞的红色荧光没有重合；由此可见，(D-Asp8)-脂质体具有细胞选择性，有利于小核酸靶向递送到破骨样细胞。DAPI荧光染色进一步证明miR-148a antagomir的绿色荧光与破骨样细胞的红色荧光出现的地方确实存在细胞，而非背景影响，证实含(D-Asp8)-SH靶头的脂质体具有细胞选择性，有利于小核酸靶向递送到破骨细胞。
Claims (6)
1.基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统，其特征在于：所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统包括脂质体、破骨细胞靶向分子和具有调控破骨细胞功能的小核酸药物，
所述破骨细胞靶向分子为8个天门冬氨酸多肽重复序列；
所述破骨细胞靶向分子与脂质体的摩尔比为2:100～10:100，小核酸药物与脂质体的脂质质量比为2％～20％；
所述脂质体由以下质量百分比的脂质组成：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％、1,2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)15％、DC-胆固醇(DC-Chol)50％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)15％和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)15％；
二油酰二甲基铵丙烷(DODAP)10％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)10％、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)15％、DC-胆固醇(DC-Chol)60％和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％；
1,2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)5％、N-[l-(2,3-二油基氧)丙基]-N,N,N,-氯化三甲铵(DOTMA)10％、磷脂酰胆碱(PC)50％、DC-胆固醇(DC-Chol)30％和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％；或
DC-胆固醇(DC-Chol)50％、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)15％、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)15％、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)15％和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)5％；
所述小核酸药物为具有调控破骨细胞功能的微小核糖核酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂中的一种或几种；所述微小核糖核酸的模拟物为miR-21mimic或miR-126-5pmimic；所述微小核糖核酸的阻断剂选自miR-29家族、miR-148a antagomir、miR-503、antagomir-214或antagomir-2861。
2.根据权利要求1所述的基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统，其特征在于：所述脂质体中，阳离子脂质的质量百分比为20～50％，非阳离子脂质的质量百分比为50～80％。
3.根据权利要求1所述的基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统，其特征在于：微小核糖核酸的阻断剂由miR-29a、miR-29b和miR-29c组成，miR-29a、miR-29b和miR-29c质量百分比分别为30％、30％、40％。
4.根据权利要求1所述的基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统，其特征在于：所述破骨细胞靶向递送系统中，脂质体中含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺，破骨细胞靶向分子末端进行巯基修饰。
5.一种如权利要求1所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的制备方法，其特征在于：所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的制备方法包括以下步骤：
(1)制备空白脂质体：将脂质溶解于有机溶剂中，旋转蒸发除去有机溶剂后，加入缓冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：取破骨细胞靶向分子与空白脂质体混合，搅拌过夜进行连接反应；
(3)纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体；
(4)包封小核酸药物：将具有调控破骨细胞功能的小核酸药物溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入步骤(3)所得的冻干破骨细胞靶向空白脂质体进行水化处理，孵育破骨细胞靶向空白脂质体与小核酸药物，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统。
6.如权利要求5所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的制备方法，其特征在于：所述基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统的制备方法包括以下步骤：
(1)制备空白脂质体：将脂质溶解于氯仿中，旋转蒸发除去氯仿后，加入pH为7.0～9.0、浓度为10～50mM的磷酸盐缓冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；
(2)连接破骨细胞靶向分子和空白脂质体：取破骨细胞靶向分子与空白脂质体混合，搅拌过夜进行连接反应；其中，破骨细胞靶向分子与空白脂质体的摩尔比为：2:1～10:1；
(3)采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化以及冻干破骨细胞靶向空白脂质体；
(4)包封小核酸药物：将具有调控破骨细胞功能的小核酸药物溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入步骤(3)所得的冻干破骨细胞靶向空白脂质体进行水化处理；其中，小核酸药物与破骨细胞靶向空白脂质体的比例为：每加入50g小核酸药物，加入1～1.2mol冻干破骨细胞靶向空白脂质体；孵育破骨细胞靶向空白脂质体与小核酸药物20～40分钟，制得破骨细胞靶向小核酸药物脂质体递送系统。
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| 雌激素类药物骨靶向性治疗骨质疏松的研究进展;胡燕等;《上海交通大学学报(医学版）》;20160330;第36卷(第3期);第437-441页 * |
| 骨靶向化合物天冬氨酸寡肽的研究及应用;仲利萍等;《齐鲁药事》;20111231;第30卷(第4期);对比文件2摘要、228-229页 * |
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