CN117625651A - 狂犬病毒mRNA疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸疫苗领域。发明人通过对狂犬病毒HEP‑Flury毒株G蛋白编码区进行优化，转录后获得优化的RABV病毒G抗原mRNA序列。转录优化后的mRNA结构更稳定，递送至哺乳动物和人体内的S糖蛋白翻译效率更高，且能够在体内诱导免疫应答。本发明的mRNA核酸分子可制备成脂质体药物组合物，用于控制、预防和治疗狂犬病毒感染疾病。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗研制技术领域，具体涉及用于控制、预防和治疗狂犬病的mRNA核酸分子、包含所述mRNA核酸分子的脂质组合物及其用途。
背景技术
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的动物源性传染病，病毒主要通过破损的皮肤或粘膜侵入人体，嗜神经性是狂犬病病毒感染的主要特征，临床大多表现为特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等症状。临床上对于狂犬病尚无有效的治疗办法，死亡率接近95％。在暴露后接种狂犬疫苗是预防狂犬病发病的关键。目前我国正在使用的人用狂犬病疫苗包括冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)、人用狂犬病疫苗(Vero细胞)、精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗和人二倍体细胞狂犬病疫苗。
当前上市的疫苗制备工艺复杂，表现在：1)需要用细胞培养的方法生产病毒，存在一定的安全性隐患。2)质量控制和工艺放大要求高，控制不好会引发产品质量事故。3)病毒产生的有效抗原量低，为了保证效果，要求提高病毒滴度，从而增加了生产成本。
狂犬病毒为单链负股RNA病毒，具有两种主要抗原：一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体，中和抗体具有保护作用；另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。理论上可通过接种具有功能的糖蛋白抗原，产生特异性免疫，和降低生产成本。但目前，重组亚单位疫苗在生产的过程中，在如何选择合适的表达系统及表达产物的纯化工艺等方面存在无法逾越的技术瓶颈，因此，目前市场尚未见到此类疫苗。
目前市场上使用的冻干Vero细胞狂犬病疫苗具有宿主DNA残留导致肿瘤形成的潜在风险，且需要多次免疫接种成本高，同时又面临狂犬疫苗供应不足，采购转运需时间，短期无法供应接种点使用。因此，急需一种成本低、生产高效的创新型疫苗来满足当前以及未来的市场需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明概述
本发明提供了可用于预防、控制和治疗狂犬病毒的核酸分子。发明人对狂犬病毒HEP-Flury毒株G蛋白(RABV G)进行了优化，经优化的核酸分子包含编码区，其中所述编码区包含一个或多个开放阅读框(open reading frame，ORF)，且其中至少一个ORF编码RABV病毒G抗原，所述的RABV病毒G抗原的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。该核苷酸序列使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高。
在一些实施方案中，所述的包含编码RABV病毒G抗原的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。在一些实施方案中，本发明提供了包含编码编码RABV病毒G抗原的优化后的核酸分子，其中所述编码区包含一个或多个开放阅读框(ORF)，且其中至少一个ORF编码序列如SEQ ID NO:1所示的RABV病毒G抗原，但其核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％,至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性。
在另一实施方案中，本发明提供了包含编码RABV病毒G抗原的优化后的核酸分子，序列优化包括针对在人体内表达时的密码子偏好性进行调整、提高序列的GC含量等，优化后序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5所示。
在另一实施方案中，以优化后的DNA编码基因为模板进行转录，获得编码RABV病毒G抗原的mRNA序列，其序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示。优化后的核苷酸序列使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高，能够解决现有技术中mRNA翻译效率差，稳定性有待提高等技术问题，并能高效诱使机体产生免疫应答。
在另一实施方案中，本公开提供了mRNA核酸分子，其包括：
(i)5'非翻译区(5’-UTR)；
(ii)CDS，其中CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，其包括如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(iii)3’非翻译区(3’-UTR)。
在另一实施方案中，所述mRNA核酸分子还包含5'非翻译区(5'UTR)。任选地,其中5'UTR包含SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:11所示的序列。
在另一实施方案中,所述mRNA核酸分子还包含3’非翻译区(3’UTR)。任选地,其中3’UTR包含SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:14所示的序列。
在另一实施方案中,本发明所述的mRNA核酸分子还包含天然5’-帽结构或其类似物。对5’-帽的修饰可以增加核酸分子的稳定性，增加其半衰期并且可以提高翻译效率。对天然5’-帽结构的修饰包括多核苷酸的5’-末端和/或5’-末端核酸的核糖2’-羟基上的2’-O-甲基化。5’-帽类似物可任选地选自m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G等。
在另一实施方案中,所述mRNA核酸分子还包含聚A尾(poly-A tail)或多聚腺苷酸化信号,任选地具有80至180个核苷酸的长度。在优选地实施方式中，3’-多聚腺苷酸序列(polyA)优选为80-180个A，中间有linker序列，如SEQ ID NO:15所示；更优选为80-160个A，进一步优选为130个A，如SEQ ID NO:16所示：
在另一实施方案中，所述mRNA核酸分子还包含一种或多种选自假尿苷(ψ)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基胞嘧啶(m5C)的功能性核苷酸类似物修饰。在一些实施方案中,本发明公开的mRNA包括在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷取代。
在另一实施方案中，本发明提供了一种mRNA核酸分子,所述mRNA核酸分子包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-多聚腺苷酸序列(polyA)，其中CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原。优选的，所述的5’-UTR进一步包括Kozak序列。5’-帽结构、5’-UTR、Kozak、3’-聚腺苷酸序列(polyA)和3’-UTR序列元件的添加均可以进一步提高序列的稳定性，避免降解。在另一优选的实施方案中，所述的CDS包含信号肽序列和成熟肽序列，优选的信号肽序列如SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:19所示。
在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种mRNA分子，所述的mRNA包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)，其中所述的5’-UTR包括Kozak序列，其序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22所示。
在一些实施方案中，发明人通过降低mRNA分子中U(尿苷酸)的含量来实现降低mRNA免疫原性，对核酸序列SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22中的一个或多个或所有尿嘧啶采用假尿苷(ψ)取代。在特别优选的实施方案中，对核酸序列SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22中的所有尿嘧啶采用假尿苷(ψ)取代，加帽取代后的序列如SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:25所示。
在另一实施方案中，本文提供了用于诱导受试者对RABV病毒G抗原产生中和抗体反应的药物组合物，本文所述的药物组合物包含序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合所示的mRNA分子，所述的mRNA分子包裹在脂质壳中配制成脂质纳米颗粒形式，其中脂质纳米颗粒通常包括可电离的阳离子脂质,非阳离子脂质,甾醇和PEG脂质组分。
在另一实施方案中，本文提供了如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25所示的mRNA可用于诱导受试者对RABV病毒G抗原产生中和抗体反应，本文提供的mRNA可以在施用对象中控制、预防或治疗由狂犬病毒引起的感染性疾病。
在另一实施方案中，本发明所述的施用对象是人类或非人类哺乳动物。在另一实施方案中，所述施用对象是成人、人类儿童或人类幼儿。在另一实施方案中，所述施用对象处于狂犬病毒感染的风险中或对其有易感性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中流式细胞仪检测不同RABV G mRNA转染293细胞后的表达效果；
图2为本发明实施例3中间接免疫荧光检测不同RABV G mRNA转染293细胞后的表达效果；
图3为本发明实施例4中FAVN检测不同RABV G抗原mRNA制剂免疫动物后的血清中和抗体；
图4为mRNA帽子结构示意图。
发明详述
本发明提供了可用于预防、管理和治狂犬病毒引起的动物源性传染病的治疗性核酸分子。发明人对狂犬病毒HEP-Flury毒株G蛋白(RABV G)进行了优化，通过优化编码RABV病毒G抗原的核苷酸序列，使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高。本文提供了用于诱导受试者对RABV病毒G抗原产生中和抗体反应的药物组合物，本文所述的药物组合物包含了编码RABV病毒G抗原的mRNA分子以及相关的治疗方法和用途，以用于预防、管理和治疗狂犬病毒引起的感染性疾病，以克服现有技术中冻干Vero细胞狂犬病疫苗具有宿主DNA残留导致肿瘤形成的潜在风险，以及需要多次免疫接种成本高且供应不足的缺点。
为使本发明更易于理解，首先定义某些术语。别的定义将在整个详述中阐明。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内，这些技术在本领域的技术文献和通用教科书中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)等。
抗原(antigen，缩写Ag)是指能引起抗体生成的物质，是任何可诱发免疫反应的物质。外来分子可经过B细胞上免疫球蛋白的辨识或经抗原呈现细胞的处理并与主要组织相容性复合体结合成复合物再活化T细胞，引发连续的免疫反应。一般情况下，抗原可以是能够诱导免疫应答的蛋白质(例如,导致免疫系统产生针对抗原的抗体)。
核酸，是一类由核苷酸构成的生物大分子，主要分为脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)和核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)两类。除朊病毒外，核酸是构成生命所必需的生物大分子，它在生命系统中主要起到作为遗传信息载体的作用。
开放阅读框(open reading frame，ORF)：是指结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。
信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)是指导合成蛋白质的模板，是把遗传信息从DNA传递到蛋白质的信使。成熟mRNA的主体序列是编码区，在其上游5’侧和下游都有非编码区。真核生物mRNA分子两端还有5’帽子和3’尾部结构。
5’-帽结构：是在真核生物中信使RNA(mRNA)的5’端经修改后形成的的双核苷酸端点。它是在mRNA转录后，由甲基化的鸟苷酸(m7G)经焦磷酸化与mRNA的5'端核苷酸相连。5'端帽子结构在mRNA许多生物学功能中起到重要的作用，这包括：mRNA的剪切、稳定、转运和核糖体的募集等。由于5'端帽子结构的重要生物学功能，在mRNA疫苗研发过程中需要优化5'端帽子结构，并利用合适的工艺对mRNA原料进行“加帽”。
非翻译区(UTR)：指任意一个位于mRNA链编码序列两端的片段。如果其位于5’端，则称为5’非翻译区(或“前导序列”),反之若位于3’端，则称为3’非翻译区(或“尾随序列”)。非翻译区序列不是密码子，不能翻译成氨基酸，但是可以通过RNA结合蛋白控制mRNA产品的降解和转录效率。因此，每一种mRNA疫苗都需要考虑如何设计产品的UTR组件，进而提高在目的细胞中mRNA疫苗的稳定性和转录效率。
Poly(A)：大多数真核生物的mRNA的3’端都有由100～200个腺苷酸聚合形成的Poly(A)尾巴，可以防止外切酶降解，也可以作为核孔转运系统的标志，与成熟的mRNA通过核孔转运到胞浆有关。在设计mRNA疫苗产品的序列时，Poly(A)的长度也是非常重要的优化指标。
Kozak序列：真核翻译起始序列通常被称为“Kozak”共有序列。Kozak序列是位于真核生物mRNA 5’-UTR后面和起始密码子AUG之间的一段核酸序列,通常是ACCACCAUGG、GCCAUGAUGG等，其中AUG表示位置+1的甲硫氨酸密码子的翻译起始位点。mRNA分子上的Kozak序列被核糖体识别为翻译起始位点，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。Kozak序列可以用来增强真核基因的翻译效率。可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同的kozak序列或将其删除，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN等，其中N指代A、T/U、C或G。
转录：是在RNA聚合酶的催化下，遗传信息由DNA复制到RNA(尤其是mRNA)的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是合成mRNA以及非编码RNA(tRNA、rRNA等)的途径。
多聚腺苷酸化：指多聚腺苷酸与信使RNA(mRNA)分子的共价链结。在蛋白质生物合成的过程中，这是产生准备作翻译的成熟mRNA的方式的一部份。
抗体滴度：用来衡量某种抗体(antibody)识别特定抗原表位(epitope)所需要的最低浓度(也即最大稀释度)。
中和抗体：是一种用于防止细胞被某种抗原或感染原侵害而具有保护力的抗体。
分离的多肽,抗体,多核苷酸,载体,细胞,或组合物包括那些已被纯化的程度,即它们不再以它们在自然界中发现的形式存在。
术语"受试者”是指任何动物，包括但不限于人类，非人类的灵长类动物，犬，猫，啮齿动物等，其是为特定治疗的接受者。典型地,术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用在参照本发明的人类受试者。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗作用”是指治疗有效的量治疗受试者的疾病或病症。药物的治疗有效量具有治疗效果,因此可以防止、减缓或减轻疾病或病症的发展，降低发病率和死亡率，提高生活质量。
核酸分子
本发明提供了可用于预防、控制和治疗狂犬病毒的核酸分子。发明人对狂犬病毒HEP-Flury毒株G蛋白(RABV G)进行了优化，经优化的核酸分子包含编码区，其中所述编码区包含一个或多个开放阅读框(open reading frame，ORF)，且其中至少一个ORF编码RABV病毒G抗原，所述的RABV病毒G抗原的蛋白序列如SEQ ID NO:1(第1-19位氨基酸为信号肽，第20-524位氨基酸为成熟肽)所示。
MVPQVLLFAPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDLHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYISAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVTDLDPYDKSLHSRVFPGGNCSGITVSSTYCSTNHDYTIWMPENLRLGTSCDIFTHSRGKRASKGDKTCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSDETKWCPPGQLVNLHDFRSDEIEHLVEEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVQTWNEIIPSKGCLRVGERCHPHVNGVFFNGIILGSDGHVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLMHPLADPSTVFKDGDEVEDFVEVHLPDVHKQVSGVDLGLPKWGKYVLMIAGALIALMLIIFLMTCCRRVNRPESTQSNLGGTGRNVSVPSQSGKVISSWESYKSGGETRL(SEQ ID NO:1)
在一些实施方案中，所述的包含编码RABV病毒G抗原的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
ATGGTTCCTCAGGTTCTTTTGTTTGCACCCCTCCTGGTTTTTCCATTGTGTTTCGGGAAGTTCCCCATTTACACGATACCAGACAAACTTGGTCCCTGGAGCCCTATTGACTTACACCATCTCAGCTGTCCAAATAACCTGGTTGTGGAGGACGAAGGATGTACCAACCTGTCCGGGTTCTCTTACATGGAACTTAAAGTGGGATACATCTCAGCCATAAAAGTGAACGGGTTCACTTGCACAGGTGTTGTGACAGAGGCAGAAACCTACACCAACTTTGTTGGTTATGTCACAACCACATTCAAGAGAAAGCATTTCCGCCCCACCCCAGACGCATGTAGAGCCGCGTATAACTGGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCTCTACACAATCCGTACCCCGACTACCATTGGCTTCGAACTGTAAAAACCACCAAAGAGTCTCTCGTTATCATATCCCCAAGTGTGACAGATTTGGACCCATATGACAAATCCCTTCACTCAAGGGTCTTCCCTGGCGGAAATTGCTCAGGAATAACGGTGTCCTCGACCTACTGCTCAACTAATCATGATTACACCATCTGGATGCCTGAGAATCTGAGACTAGGGACATCTTGTGACATTTTTACCCATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAAAGGAGACAAGACTTGCGGCTTTGTGGATGAAAGAGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCATGCAAACTCAAGTTATGTGGAGTTCTCGGACTTAGACTTATGGATGGAACATGGGTCGCGATGCAAACATCAGATGAGACCAAATGGTGCCCTCCAGGTCAGTTGGTGAATTTGCACGACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGAGGAAGAGTTAGTCAAGAAAAGAGAGGAGTGTCTGGATGCACTAGAGTCCATCATGACCACCAAGTCAGTGAGTTTCAGACGTCTCAGTCACCTGAGAAAACTTGTCCCTGGGTTTGGAAAAGCATATACCATATTCAACAAAACCTTGATGGAGGCTGATGCTCACTACAAGTCTGTCCAGACCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGAGAGTTGGGGAGAGGTGTCATCCCCATGTGAACGGGGTGTTTTTCAATGGTATAATATTAGGGTCTGACGGCCATGTTCTAATCCCAGAGATGCAGTCATCCCTCCTCCAGCAACATATGGAGTTGTTGGAATCTTCAGTTATCCCCCTGATGCACCCCTTGGCAGACCCTTCTACAGTTTTCAAAGACGGTGATGAGGTTGAGGATTTTGTTGAAGTTCACCTCCCCGATGTGCATAAACAGGTCTCAGGAGTTGACCTGGGTCTCCCGAAATGGGGGAAGTATGTATTGATGATTGCAGGGGCCTTGATTGCCCTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGCAGAAGAGTCAATCGACCAGAATCTACACAAAGCAATCTTGGAGGGACAGGGAGAAATGTGTCAGTCCCTTCCCAAAGCGGAAAAGTCATATCTTCATGGGAGTCATATAAGA GTGGAGGCGAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:2)
本发明对编码RABV病毒G抗原(SEQ ID NO:1)的密码子进行优化，序列优化包括：针对在人体内表达时的GC含量进行优化、常用密码子的使用频率进行优化、密码子偏好性进行优化等以获得对应的DNA编码基因。在一些实施方案中，本发明提供了包含编码RABV病毒G抗原的优化后的核酸分子，其中所述编码区包含一个或多个开放阅读框(ORF)，且其中至少一个ORF编码序列如SEQ ID NO:1所示的RABV病毒G抗原，但其核苷酸序列与SEQ IDNO:2所示的序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％,至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性。优化后的核苷酸序列使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高。
在另一优选的实施方案中，本发明提供了包含编码RABV病毒G抗原的优化后的核酸分子，其序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5所示。提高GC含量并且对密码子进行优化得到所述核苷酸序列使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高。将DNA编码基因克隆至载体并转化宿主，所述的宿主为原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞，优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌等。
ATGGTCCCGCAAGTCCTACTATTCGCGCCGCTACTAGTCTTCCCGCTATGCTTCGGGAAGTTCCCGATATACACCATACCGGACAAGCTAGGGCCGTGGTCGCCGATAGACCTACACCACCTATCGTGCCCGAACAACCTAGTCGTCGAGGACGAGGGGTGCACCAACCTATCGGGGTTCTCGTACATGGAGCTAAAGGTCGGGTACATATCGGCGATAAAGGTCAACGGGTTCACCTGCACCGGGGTCGTCACCGAGGCGGAGACCTACACCAACTTCGTCGGGTACGTCACCACCACCTTCAAGCGTAAGCACTTCCGTCCTACTCCTGACGCTTGCCGTGCTGCTTACAACTGGAAGATGGCTGGCGACCCTCGTTACGAGGAGTCTCTGCACAACCCTTACCCTGACTACCACTGGCTGCGTACTGTGAAGACTACTAAGGAGTCTCTGGTGATTATTTCTCCTTCTGTGACTGACCTGGACCCTTACGACAAGTCTCTGCACTCTCGTGTGTTCCCTGGCGGCAACTGCTCTGGCATTACTGTGTCTTCTACTTACTGCTCTACTAACCACGACTACACTATTTGGATGCCTGAGAACCTGCGTCTGGGCACTTCTTGCGACATTTTCACTCACTCTCGTGGCAAGCGTGCTTCTAAGGGCGACAAGACTTGCGGCTTCGTGGACGAGCGTGGCCTGTACAAGTCTCTGAAGGGCGCTTGCAAGCTGAAGCTGTGCGGCGTGCTGGGCCTGCGTCTGATGGACGGCACTTGGGTGGCTATGCAGACTTCTGACGAGACTAAGTGGTGCCCTCCTGGCCAGCTGGTGAACCTGCACGACTTCCGTTCTGACGAGATTGAGCACCTGGTGGAGGAGGAGCTGGTGAAGAAGCGTGAGGAGTGCCTGGACGCTCTGGAGTCTATTATGACTACTAAGTCTGTGTCTTTCCGTCGTCTGTCTCACCTGCGTAAGCTGGTGCCTGGCTTCGGCAAGGCTTACACTATTTTCAACAAGACTCTGATGGAGGCTGACGCTCACTACAAGTCTGTGCAGACTTGGAACGAGATTATTCCTTCTAAGGGCTGCCTGCGTGTGGGCGAGCGTTGCCACCCTCACGTGAACGGCGTGTTCTTCAACGGCATTATTCTGGGCTCTGACGGCCACGTGCTGATTCCTGAGATGCAGTCTTCTCTGCTGCAGCAGCACATGGAGCTGCTGGAGTCTTCTGTGATTCCTCTGATGCACCCTCTGGCTGACCCTTCTACTGTGTTCAAGGACGGCGACGAGGTGGAGGACTTCGTGGAGGTGCACCTGCCTGACGTGCACAAGCAGGTGTCTGGCGTGGACCTGGGCCTGCCTAAGTGGGGCAAGTACGTGCTGATGATTGCTGGCGCTCTGATTGCTCTGATGCTGATTATTTTCCTGATGACTTGCTGCCGTCGTGTGAACCGTCCTGAGTCTACTCAGTCTAACCTGGGCGGCACTGGCCGTAACGTGTCTGTGCCTTCTCAGTCTGGCAAGGTGATTTCTTCTTGGGAGTCTTACAAGTCTGGCGGCGAGACTCGTCTGTGA(SEQ ID NO:3)
ATGGTGCCTCAGGTGCTGCTGTTCGCTCCTCTGCTGGTGTTCCCTCTGTGCTTCGGCAAGTTCCCTATTTACACTATTCCTGACAAGCTGGGCCCTTGGTCTCCTATTGACCTGCACCACCTGTCTTGCCCTAACAACCTGGTGGTGGAGGACGAGGGCTGCACTAACCTGTCTGGCTTCTCTTACATGGAGCTGAAGGTGGGCTACATTTCTGCTATTAAGGTGAACGGCTTCACTTGCACTGGCGTGGTGACTGAGGCTGAGACTTACACTAACTTCGTGGGCTACGTGACTACTACTTTCAAGCGTAAGCACTTCCGTCCTACTCCTGACGCTTGCCGTGCTGCTTACAACTGGAAGATGGCTGGCGACCCTCGTTACGAGGAGTCTCTGCACAACCCTTACCCTGACTACCACTGGCTGCGTACTGTGAAGACTACTAAGGAGTCTCTGGTGATTATTTCTCCTTCTGTGACTGACCTGGACCCTTACGACAAGTCTCTGCACTCTCGTGTGTTCCCTGGCGGCAACTGCTCTGGCATTACTGTGTCTTCTACTTACTGCTCTACTAACCACGACTACACTATTTGGATGCCTGAGAACCTGCGTCTGGGCACTTCTTGCGACATTTTCACTCACTCTCGTGGCAAGCGTGCTTCTAAGGGCGACAAGACTTGCGGCTTCGTGGACGAGCGTGGCCTGTACAAGTCTCTGAAGGGCGCTTGCAAGCTGAAGCTGTGCGGCGTGCTGGGCCTGCGTCTGATGGACGGCACTTGGGTGGCTATGCAGACTTCTGACGAGACTAAGTGGTGCCCTCCTGGCCAGCTGGTGAACCTGCACGACTTCCGTTCTGACGAGATTGAGCACCTGGTGGAGGAGGAGCTGGTGAAGAAGCGTGAGGAGTGCCTGGACGCTCTGGAGTCTATTATGACTACTAAGTCTGTGTCTTTCCGTCGTCTGTCTCACCTGCGTAAGCTGGTGCCTGGCTTCGGCAAGGCTTACACTATTTTCAACAAGACTCTGATGGAGGCTGACGCTCACTACAAGTCTGTGCAGACTTGGAACGAGATTATTCCTTCTAAGGGCTGCCTGCGTGTGGGCGAGCGTTGCCACCCTCACGTGAACGGCGTGTTCTTCAACGGCATTATTCTGGGCTCTGACGGCCACGTGCTGATTCCTGAGATGCAGTCTTCTCTGCTGCAGCAGCACATGGAGCTGCTGGAGTCTTCTGTGATTCCTCTGATGCACCCTCTGGCTGACCCTTCTACTGTGTTCAAGGACGGCGACGAGGTGGAGGACTTCGTGGAGGTGCACCTGCCTGACGTGCACAAGCAGGTGTCTGGCGTGGACCTGGGCCTGCCTAAGTGGGGCAAGTACGTGCTGATGATTGCTGGCGCTCTGATTGCTCTGATGCTGATTATTTTCCTGATGACTTGCTGCCGTCGTGTGAACCGTCCTGAGTCTACTCAGTCTAACCTGGGCGGCACTGGCCGTAACGTGTCTGTGCCTTCTCAGTCTGGCAAGGTGATTTCTTCTTGGGAGTCTTACAAGTCTGGCGGCGAGACTCGTCTGTGA(SEQ ID NO:4)
ATGGTGCCCCAGGTGCTGCTGTTCGCCCCCCTGCTGGTGTTCCCCCTGTGCTTCGGCAAGTTCCCCATCTACACGATCCCCGACAAGCTGGGCCCCTGGAGCCCCATCGACCTGCACCACCTGAGCTGCCCCAACAACCTGGTGGTGGAGGACGAGGGCTGCACGAACCTGAGCGGCTTCAGCTACATGGAGCTGAAGGTGGGCTACATCAGCGCCATCAAGGTGAACGGCTTCACGTGCACGGGCGTGGTGACGGAGGCCGAGACGTACACGAACTTCGTGGGCTACGTGACGACGACGTTCAAGCGGAAGCACTTCCGGCCCACGCCCGACGCCTGCCGGGCCGCCTACAACTGGAAGATGGCCGGCGACCCCCGGTACGAGGAGAGCCTGCACAACCCCTACCCCGACTACCACTGGCTGCGGACGGTGAAGACGACGAAGGAGAGCCTGGTGATCATCAGCCCCAGCGTGACGGACCTGGACCCCTACGACAAGAGCCTGCACAGCCGGGTGTTCCCCGGCGGCAACTGCAGCGGCATCACGGTGAGCAGCACGTACTGCAGCACGAACCACGACTACACGATCTGGATGCCCGAGAACCTGCGGCTGGGCACGAGCTGCGACATCTTCACGCACAGCCGGGGCAAGCGGGCCAGCAAGGGCGACAAGACGTGCGGCTTCGTGGACGAGCGGGGCCTGTACAAGAGCCTGAAGGGCGCCTGCAAGCTGAAGCTGTGCGGCGTGCTGGGCCTGCGGCTGATGGACGGCACGTGGGTGGCCATGCAGACGAGCGACGAGACGAAGTGGTGCCCCCCCGGCCAGCTGGTGAACCTGCACGACTTCCGGAGCGACGAGATCGAGCACCTGGTGGAGGAGGAGCTGGTGAAGAAGCGGGAGGAGTGCCTGGACGCCCTGGAGAGCATCATGACGACGAAGAGCGTGAGCTTCCGGCGGCTGAGCCACCTGCGGAAGCTGGTGCCCGGCTTCGGCAAGGCCTACACGATCTTCAACAAGACGCTGATGGAGGCCGACGCCCACTACAAGAGCGTGCAGACGTGGAACGAGATCATCCCCAGCAAGGGCTGCCTGCGGGTGGGCGAGCGGTGCCACCCCCACGTGAACGGCGTGTTCTTCAACGGCATCATCCTGGGCAGCGACGGCCACGTGCTGATCCCCGAGATGCAGAGCAGCCTGCTGCAGCAGCACATGGAGCTGCTGGAGAGCAGCGTGATCCCCCTGATGCACCCCCTGGCCGACCCCAGCACGGTGTTCAAGGACGGCGACGAGGTGGAGGACTTCGTGGAGGTGCACCTGCCCGACGTGCACAAGCAGGTGAGCGGCGTGGACCTGGGCCTGCCCAAGTGGGGCAAGTACGTGCTGATGATCGCCGGCGCCCTGATCGCCCTGATGCTGATCATCTTCCTGATGACGTGCTGCCGGCGGGTGAACCGGCCCGAGAGCACGCAGAGCAACCTGGGCGGCACGGGCCGGAACGTGAGCGTGCCCAGCCAGAGCGGCAAGGTGATCAGCAGCTGGGAGAGCTACAAGAGCGGCGGCGAGACGCGGCTGTGA(SEQ ID NO:5)
在另一实施方案中，本发明提供了包含编码RABV病毒G抗原的mRNA核酸分子。以所述的DNA编码基因为模板转录获得编码RABV病毒G抗原的mRNA核酸分子，其序列如SEQ IDNO:6-SEQ ID NO:8所示。以优化后的DNA编码基因为模板进行转录，该核苷酸序列使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高，能够解决现有技术中mRNA翻译效率差，稳定性有待提高等技术问题，并能高效诱使机体产生免疫应答，以提高现有技术中狂犬病毒疫苗免疫后抗体滴度低，有效抗原量少，生产成本高的问题。
AUGGUCCCGCAAGUCCUACUAUUCGCGCCGCUACUAGUCUUCCCGCUAUGCUUCGGGAAGUUCCCGAUAUACACCAUACCGGACAAGCUAGGGCCGUGGUCGCCGAUAGACCUACACCACCUAUCGUGCCCGAACAACCUAGUCGUCGAGGACGAGGGGUGCACCAACCUAUCGGGGUUCUCGUACAUGGAGCUAAAGGUCGGGUACAUAUCGGCGAUAAAGGUCAACGGGUUCACCUGCACCGGGGUCGUCACCGAGGCGGAGACCUACACCAACUUCGUCGGGUACGUCACCACCACCUUCAAGCGUAAGCACUUCCGUCCUACUCCUGACGCUUGCCGUGCUGCUUACAACUGGAAGAUGGCUGGCGACCCUCGUUACGAGGAGUCUCUGCACAACCCUUACCCUGACUACCACUGGCUGCGUACUGUGAAGACUACUAAGGAGUCUCUGGUGAUUAUUUCUCCUUCUGUGACUGACCUGGACCCUUACGACAAGUCUCUGCACUCUCGUGUGUUCCCUGGCGGCAACUGCUCUGGCAUUACUGUGUCUUCUACUUACUGCUCUACUAACCACGACUACACUAUUUGGAUGCCUGAGAACCUGCGUCUGGGCACUUCUUGCGACAUUUUCACUCACUCUCGUGGCAAGCGUGCUUCUAAGGGCGACAAGACUUGCGGCUUCGUGGACGAGCGUGGCCUGUACAAGUCUCUGAAGGGCGCUUGCAAGCUGAAGCUGUGCGGCGUGCUGGGCCUGCGUCUGAUGGACGGCACUUGGGUGGCUAUGCAGACUUCUGACGAGACUAAGUGGUGCCCUCCUGGCCAGCUGGUGAACCUGCACGACUUCCGUUCUGACGAGAUUGAGCACCUGGUGGAGGAGGAGCUGGUGAAGAAGCGUGAGGAGUGCCUGGACGCUCUGGAGUCUAUUAUGACUACUAAGUCUGUGUCUUUCCGUCGUCUGUCUCACCUGCGUAAGCUGGUGCCUGGCUUCGGCAAGGCUUACACUAUUUUCAACAAGACUCUGAUGGAGGCUGACGCUCACUACAAGUCUGUGCAGACUUGGAACGAGAUUAUUCCUUCUAAGGGCUGCCUGCGUGUGGGCGAGCGUUGCCACCCUCACGUGAACGGCGUGUUCUUCAACGGCAUUAUUCUGGGCUCUGACGGCCACGUGCUGAUUCCUGAGAUGCAGUCUUCUCUGCUGCAGCAGCACAUGGAGCUGCUGGAGUCUUCUGUGAUUCCUCUGAUGCACCCUCUGGCUGACCCUUCUACUGUGUUCAAGGACGGCGACGAGGUGGAGGACUUCGUGGAGGUGCACCUGCCUGACGUGCACAAGCAGGUGUCUGGCGUGGACCUGGGCCUGCCUAAGUGGGGCAAGUACGUGCUGAUGAUUGCUGGCGCUCUGAUUGCUCUGAUGCUGAUUAUUUUCCUGAUGACUUGCUGCCGUCGUGUGAACCGUCCUGAGUCUACUCAGUCUAACCUGGGCGGCACUGGCCGUAACGUGUCUGUGCCUUCUCAGUCUGGCAAGGUGAUUUCUUCUUGGGAGUCUUACAAGUCUGGCGGCGAGACUCGUCUGUGA(SEQ ID NO:6)
AUGGUGCCUCAGGUGCUGCUGUUCGCUCCUCUGCUGGUGUUCCCUCUGUGCUUCGGCAAGUUCCCUAUUUACACUAUUCCUGACAAGCUGGGCCCUUGGUCUCCUAUUGACCUGCACCACCUGUCUUGCCCUAACAACCUGGUGGUGGAGGACGAGGGCUGCACUAACCUGUCUGGCUUCUCUUACAUGGAGCUGAAGGUGGGCUACAUUUCUGCUAUUAAGGUGAACGGCUUCACUUGCACUGGCGUGGUGACUGAGGCUGAGACUUACACUAACUUCGUGGGCUACGUGACUACUACUUUCAAGCGUAAGCACUUCCGUCCUACUCCUGACGCUUGCCGUGCUGCUUACAACUGGAAGAUGGCUGGCGACCCUCGUUACGAGGAGUCUCUGCACAACCCUUACCCUGACUACCACUGGCUGCGUACUGUGAAGACUACUAAGGAGUCUCUGGUGAUUAUUUCUCCUUCUGUGACUGACCUGGACCCUUACGACAAGUCUCUGCACUCUCGUGUGUUCCCUGGCGGCAACUGCUCUGGCAUUACUGUGUCUUCUACUUACUGCUCUACUAACCACGACUACACUAUUUGGAUGCCUGAGAACCUGCGUCUGGGCACUUCUUGCGACAUUUUCACUCACUCUCGUGGCAAGCGUGCUUCUAAGGGCGACAAGACUUGCGGCUUCGUGGACGAGCGUGGCCUGUACAAGUCUCUGAAGGGCGCUUGCAAGCUGAAGCUGUGCGGCGUGCUGGGCCUGCGUCUGAUGGACGGCACUUGGGUGGCUAUGCAGACUUCUGACGAGACUAAGUGGUGCCCUCCUGGCCAGCUGGUGAACCUGCACGACUUCCGUUCUGACGAGAUUGAGCACCUGGUGGAGGAGGAGCUGGUGAAGAAGCGUGAGGAGUGCCUGGACGCUCUGGAGUCUAUUAUGACUACUAAGUCUGUGUCUUUCCGUCGUCUGUCUCACCUGCGUAAGCUGGUGCCUGGCUUCGGCAAGGCUUACACUAUUUUCAACAAGACUCUGAUGGAGGCUGACGCUCACUACAAGUCUGUGCAGACUUGGAACGAGAUUAUUCCUUCUAAGGGCUGCCUGCGUGUGGGCGAGCGUUGCCACCCUCACGUGAACGGCGUGUUCUUCAACGGCAUUAUUCUGGGCUCUGACGGCCACGUGCUGAUUCCUGAGAUGCAGUCUUCUCUGCUGCAGCAGCACAUGGAGCUGCUGGAGUCUUCUGUGAUUCCUCUGAUGCACCCUCUGGCUGACCCUUCUACUGUGUUCAAGGACGGCGACGAGGUGGAGGACUUCGUGGAGGUGCACCUGCCUGACGUGCACAAGCAGGUGUCUGGCGUGGACCUGGGCCUGCCUAAGUGGGGCAAGUACGUGCUGAUGAUUGCUGGCGCUCUGAUUGCUCUGAUGCUGAUUAUUUUCCUGAUGACUUGCUGCCGUCGUGUGAACCGUCCUGAGUCUACUCAGUCUAACCUGGGCGGCACUGGCCGUAACGUGUCUGUGCCUUCUCAGUCUGGCAAGGUGAUUUCUUCUUGGGAGUCUUACAAGUCUGGCGGCGAGACUCGUCUGUGA(SEQ ID NO:7)
AUGGUGCCCCAGGUGCUGCUGUUCGCCCCCCUGCUGGUGUUCCCCCUGUGCUUCGGCAAGUUCCCCAUCUACACGAUCCCCGACAAGCUGGGCCCCUGGAGCCCCAUCGACCUGCACCACCUGAGCUGCCCCAACAACCUGGUGGUGGAGGACGAGGGCUGCACGAACCUGAGCGGCUUCAGCUACAUGGAGCUGAAGGUGGGCUACAUCAGCGCCAUCAAGGUGAACGGCUUCACGUGCACGGGCGUGGUGACGGAGGCCGAGACGUACACGAACUUCGUGGGCUACGUGACGACGACGUUCAAGCGGAAGCACUUCCGGCCCACGCCCGACGCCUGCCGGGCCGCCUACAACUGGAAGAUGGCCGGCGACCCCCGGUACGAGGAGAGCCUGCACAACCCCUACCCCGACUACCACUGGCUGCGGACGGUGAAGACGACGAAGGAGAGCCUGGUGAUCAUCAGCCCCAGCGUGACGGACCUGGACCCCUACGACAAGAGCCUGCACAGCCGGGUGUUCCCCGGCGGCAACUGCAGCGGCAUCACGGUGAGCAGCACGUACUGCAGCACGAACCACGACUACACGAUCUGGAUGCCCGAGAACCUGCGGCUGGGCACGAGCUGCGACAUCUUCACGCACAGCCGGGGCAAGCGGGCCAGCAAGGGCGACAAGACGUGCGGCUUCGUGGACGAGCGGGGCCUGUACAAGAGCCUGAAGGGCGCCUGCAAGCUGAAGCUGUGCGGCGUGCUGGGCCUGCGGCUGAUGGACGGCACGUGGGUGGCCAUGCAGACGAGCGACGAGACGAAGUGGUGCCCCCCCGGCCAGCUGGUGAACCUGCACGACUUCCGGAGCGACGAGAUCGAGCACCUGGUGGAGGAGGAGCUGGUGAAGAAGCGGGAGGAGUGCCUGGACGCCCUGGAGAGCAUCAUGACGACGAAGAGCGUGAGCUUCCGGCGGCUGAGCCACCUGCGGAAGCUGGUGCCCGGCUUCGGCAAGGCCUACACGAUCUUCAACAAGACGCUGAUGGAGGCCGACGCCCACUACAAGAGCGUGCAGACGUGGAACGAGAUCAUCCCCAGCAAGGGCUGCCUGCGGGUGGGCGAGCGGUGCCACCCCCACGUGAACGGCGUGUUCUUCAACGGCAUCAUCCUGGGCAGCGACGGCCACGUGCUGAUCCCCGAGAUGCAGAGCAGCCUGCUGCAGCAGCACAUGGAGCUGCUGGAGAGCAGCGUGAUCCCCCUGAUGCACCCCCUGGCCGACCCCAGCACGGUGUUCAAGGACGGCGACGAGGUGGAGGACUUCGUGGAGGUGCACCUGCCCGACGUGCACAAGCAGGUGAGCGGCGUGGACCUGGGCCUGCCCAAGUGGGGCAAGUACGUGCUGAUGAUCGCCGGCGCCCUGAUCGCCCUGAUGCUGAUCAUCUUCCUGAUGACGUGCUGCCGGCGGGUGAACCGGCCCGAGAGCACGCAGAGCAACCUGGGCGGCACGGGCCGGAACGUGAGCGUGCCCAGCCAGAGCGGCAAGGUGAUCAGCAGCUGGGAGAGCUACAAGAGCGGCGGCGAGACGCGGCUGUGA(SEQ ID NO:8)
在另一实施方案中，本发明提供了mRNA核酸分子，其包括：
(iv)5'非翻译区(5’-UTR)；
(v)CDS，其中CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，其包括如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(vi)3’非翻译区(3’-UTR)。
在另一实施方案中，本发明所述的核酸分子还包含5'非翻译区(5'UTR)。任选地,其中5'UTR包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列。具体地，5’-UTR序列可包含或不包含Kozak序列。在另一优选的实施方案中，其中5'UTR可包括kozak序列，例如GCCACC或GCCANN等，其中N指代A、T/U、C或G。
GGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACC(SEQ ID NO:9)
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACC(SEQ ID NO:10)
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(SEQ IDNO:11)
在另一实施方案中,本发明所述的核酸分子还包含3’非翻译区(3’UTR)。任选地,其中3’UTR包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的序列。
UAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:12)
UAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:13)
GCUGGAGCCUCGGUAGCCGUUCCUCCUGCC CGCUGGGCCU CCCAACGGGCCCUCCUCCCCUCCUUGCACC GGCCCUUCCU GGUCUUUGAA UAAAGUCUGA GUGGGCAGC(SEQ ID NO:14)
在另一实施方案中,本发明所述的核酸分子还包含天然5’-帽结构或其类似物。对5’-帽的修饰可以增加核酸分子的稳定性，增加其半衰期并且可以提高翻译效率。对天然5'-帽结构的修饰包括多核苷酸的5'-末端和/或5'-末端核酸的核糖2'-羟基上的2'-O-甲基化。5’-帽类似物可任选地选自m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G等。帽类似物可以化学(即非酶促地)或酶促合成和/或连接至RNA分子5’端。转录后产生的mRNA分子可以通过牛痘病毒加帽酶修饰生成由三磷酸桥接的7-甲基鸟苷(m7G)帽(m7G(5')PPP(5')G)，这种结构被称为Cap 0。可以使用牛痘病毒加帽酶和2'-O甲基转移酶产生Cap 1结构(m7GpppmN)和Cap 2结构(m7GpppmNmN)。可以与本公开结合使用的5’-帽结构可参考国际专利公开号WO2008127688，WO2008016473和WO2011015347中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。在一个优选的实施方案中，本发明选用的用于mRNA共转录加帽的5’-帽类似选自市售的Reagent AG-(N-7113)，其为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG，在mRNA的体外转录加帽时可产生Cap 1结构。CleanCap具有高达98％的加帽效率。与传统加帽方法(如mCap或anti-reverse cap analog(ARCA))产生的Cap 0 mRNA相比，Cap 1 mRNA具有更高的体内活性。
在另一实施方案中,RNA还包含聚A尾(poly-A tail)或聚腺苷酸化信号,任选地具有80至180个核苷酸的长度。在优选地实施方式中，3’-聚腺苷酸序列(polyA)优选为80-180个A，中间有linker序列，如SEQ ID NO:15所示；更优选为80-160个A，进一步优选为130个A，如SEQ ID NO:16所示：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:15)
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:16)
在另一实施方案中，RNA还包含一种或多种选自假尿苷(ψ)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基胞嘧啶(m5C)的功能性核苷酸类似物修饰。人体对mRNA 的免疫反应主要和尿苷(部分由尿嘧啶组成)有关，而利用假尿嘧啶替代尿嘧啶就能够减少免疫系统对mRNA的识别。利用假尿嘧啶替换尿嘧啶的方法，可参考美国专利授权US8278036B2、US9750824B2、US8835108B2、US8748089B2、US8691966B2等；利用1-甲基假尿嘧啶修饰方法可参考US9428535B2；通过降低mRNA分子中U(尿苷酸)的含量来实现降低mRNA免疫原性的效果可参考WO2017036889A1；相关技术内容在此全部引入作为参考。在一些实施方案中,本发明公开的mRNA包括在核酸的一个或多个或所有尿嘧啶位置处的假尿苷(ψ)取代。在特别优选的实施方案中，序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:25中所示的尿嘧啶(U)均被假尿苷(ψ)所取代。
在另一实施方案中，本发明提供了一种mRNA核酸分子,所述的mRNA包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)，其中CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，核苷酸序列如SEQ ID NO:6-SEQ IDNO:8所示。发明人对RABV病毒G抗原编码区(CDS)进行优化，序列优化包括针对在人体内表达时GC含量进行调整，提高序列的GC含量，使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高。优选的，其中的5’-UTR包含Kozak序列，Kozak序列可以用来增强mRNA的翻译效率。5’-帽结构、5’-UTR、Kozak、3’-聚腺苷酸序列(polyA)和3’-UTR序列元件的添加均可以进一步提高序列的稳定性，避免降解。在另一优选的实施方案中，所述的CDS包含信号肽序列和成熟肽序列，优选的信号肽序列如SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:19所示。
AUGGUCCCGCAAGUCCUACUAUUCGCGCCGCUACUAGUCUUCCCGCUAUGCUUCGGG(SEQ ID NO:17)
AUGGUGCCUCAGGUGCUGCUGUUCGCUCCUCUGCUGGUGUUCCCUCUGUGCUUCGGC(SEQ ID NO:18)
AUGGUGCCCCAGGUGCUGCUGUUCGCCCCCCUGCUGGUGUUCCCCCUGUGCUUCGGC(SEQ ID NO:19)
在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种mRNA分子，所述的mRNA包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)；
其中，所述的5’-帽结构可任选地选自m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G等；
其中，所述的5’-UTR包含如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:11所示的序列；
其中，所述的CDS包含包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，RABV病毒G抗原的序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示；
其中，所述的3’-UTR包括如SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
其中，所述的3’-聚腺苷酸序列(polyA)任选地具有80至180个腺苷酸的长度。
在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种mRNA分子，所述的mRNA包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)，其中的5’-UTR包含Kozak序列，CDS包含信号肽和成熟肽，其序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22所示。
GAGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACCAUGGUCCCGCAAGUCCUACUAUUCGCGCCGCUACUAGUCUUCCCGCUAUGCUUCGGGAAGUUCCCGAUAUACACCAUACCGGACAAGCUAGGGCCGUGGUCGCCGAUAGACCUACACCACCUAUCGUGCCCGAACAACCUAGUCGUCGAGGACGAGGGGUGCACCAACCUAUCGGGGUUCUCGUACAUGGAGCUAAAGGUCGGGUACAUAUCGGCGAUAAAGGUCAACGGGUUCACCUGCACCGGGGUCGUCACCGAGGCGGAGACCUACACCAACUUCGUCGGGUACGUCACCACCACCUUCAAGCGUAAGCACUUCCGUCCUACUCCUGACGCUUGCCGUGCUGCUUACAACUGGAAGAUGGCUGGCGACCCUCGUUACGAGGAGUCUCUGCACAACCCUUACCCUGACUACCACUGGCUGCGUACUGUGAAGACUACUAAGGAGUCUCUGGUGAUUAUUUCUCCUUCUGUGACUGACCUGGACCCUUACGACAAGUCUCUGCACUCUCGUGUGUUCCCUGGCGGCAACUGCUCUGGCAUUACUGUGUCUUCUACUUACUGCUCUACUAACCACGACUACACUAUUUGGAUGCCUGAGAACCUGCGUCUGGGCACUUCUUGCGACAUUUUCACUCACUCUCGUGGCAAGCGUGCUUCUAAGGGCGACAAGACUUGCGGCUUCGUGGACGAGCGUGGCCUGUACAAGUCUCUGAAGGGCGCUUGCAAGCUGAAGCUGUGCGGCGUGCUGGGCCUGCGUCUGAUGGACGGCACUUGGGUGGCUAUGCAGACUUCUGACGAGACUAAGUGGUGCCCUCCUGGCCAGCUGGUGAACCUGCACGACUUCCGUUCUGACGAGAUUGAGCACCUGGUGGAGGAGGAGCUGGUGAAGAAGCGUGAGGAGUGCCUGGACGCUCUGGAGUCUAUUAUGACUACUAAGUCUGUGUCUUUCCGUCGUCUGUCUCACCUGCGUAAGCUGGUGCCUGGCUUCGGCAAGGCUUACACUAUUUUCAACAAGACUCUGAUGGAGGCUGACGCUCACUACAAGUCUGUGCAGACUUGGAACGAGAUUAUUCCUUCUAAGGGCUGCCUGCGUGUGGGCGAGCGUUGCCACCCUCACGUGAACGGCGUGUUCUUCAACGGCAUUAUUCUGGGCUCUGACGGCCACGUGCUGAUUCCUGAGAUGCAGUCUUCUCUGCUGCAGCAGCACAUGGAGCUGCUGGAGUCUUCUGUGAUUCCUCUGAUGCACCCUCUGGCUGACCCUUCUACUGUGUUCAAGGACGGCGACGAGGUGGAGGACUUCGUGGAGGUGCACCUGCCUGACGUGCACAAGCAGGUGUCUGGCGUGGACCUGGGCCUGCCUAAGUGGGGCAAGUACGUGCUGAUGAUUGCUGGCGCUCUGAUUGCUCUGAUGCUGAUUAUUUUCCUGAUGACUUGCUGCCGUCGUGUGAACCGUCCUGAGUCUACUCAGUCUAACCUGGGCGGCACUGGCCGUAACGUGUCUGUGCCUUCUCAGUCUGGCAAGGUGAUUUCUUCUUGGGAGUCUUACAAGUCUGGCGGCGAGACUCGUCUGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:20)
GAGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACCAUGGUGCCUCAGGUGCUGCUGUUCGCUCCUCUGCUGGUGUUCCCUCUGUGCUUCGGCAAGUUCCCUAUUUACACUAUUCCUGACAAGCUGGGCCCUUGGUCUCCUAUUGACCUGCACCACCUGUCUUGCCCUAACAACCUGGUGGUGGAGGACGAGGGCUGCACUAACCUGUCUGGCUUCUCUUACAUGGAGCUGAAGGUGGGCUACAUUUCUGCUAUUAAGGUGAACGGCUUCACUUGCACUGGCGUGGUGACUGAGGCUGAGACUUACACUAACUUCGUGGGCUACGUGACUACUACUUUCAAGCGUAAGCACUUCCGUCCUACUCCUGACGCUUGCCGUGCUGCUUACAACUGGAAGAUGGCUGGCGACCCUCGUUACGAGGAGUCUCUGCACAACCCUUACCCUGACUACCACUGGCUGCGUACUGUGAAGACUACUAAGGAGUCUCUGGUGAUUAUUUCUCCUUCUGUGACUGACCUGGACCCUUACGACAAGUCUCUGCACUCUCGUGUGUUCCCUGGCGGCAACUGCUCUGGCAUUACUGUGUCUUCUACUUACUGCUCUACUAACCACGACUACACUAUUUGGAUGCCUGAGAACCUGCGUCUGGGCACUUCUUGCGACAUUUUCACUCACUCUCGUGGCAAGCGUGCUUCUAAGGGCGACAAGACUUGCGGCUUCGUGGACGAGCGUGGCCUGUACAAGUCUCUGAAGGGCGCUUGCAAGCUGAAGCUGUGCGGCGUGCUGGGCCUGCGUCUGAUGGACGGCACUUGGGUGGCUAUGCAGACUUCUGACGAGACUAAGUGGUGCCCUCCUGGCCAGCUGGUGAACCUGCACGACUUCCGUUCUGACGAGAUUGAGCACCUGGUGGAGGAGGAGCUGGUGAAGAAGCGUGAGGAGUGCCUGGACGCUCUGGAGUCUAUUAUGACUACUAAGUCUGUGUCUUUCCGUCGUCUGUCUCACCUGCGUAAGCUGGUGCCUGGCUUCGGCAAGGCUUACACUAUUUUCAACAAGACUCUGAUGGAGGCUGACGCUCACUACAAGUCUGUGCAGACUUGGAACGAGAUUAUUCCUUCUAAGGGCUGCCUGCGUGUGGGCGAGCGUUGCCACCCUCACGUGAACGGCGUGUUCUUCAACGGCAUUAUUCUGGGCUCUGACGGCCACGUGCUGAUUCCUGAGAUGCAGUCUUCUCUGCUGCAGCAGCACAUGGAGCUGCUGGAGUCUUCUGUGAUUCCUCUGAUGCACCCUCUGGCUGACCCUUCUACUGUGUUCAAGGACGGCGACGAGGUGGAGGACUUCGUGGAGGUGCACCUGCCUGACGUGCACAAGCAGGUGUCUGGCGUGGACCUGGGCCUGCCUAAGUGGGGCAAGUACGUGCUGAUGAUUGCUGGCGCUCUGAUUGCUCUGAUGCUGAUUAUUUUCCUGAUGACUUGCUGCCGUCGUGUGAACCGUCCUGAGUCUACUCAGUCUAACCUGGGCGGCACUGGCCGUAACGUGUCUGUGCCUUCUCAGUCUGGCAAGGUGAUUUCUUCUUGGGAGUCUUACAAGUCUGGCGGCGAGACUCGUCUGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:21)
GAGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACCAUGGUGCCCCAGGUGCUGCUGUUCGCCCCCCUGCUGGUGUUCCCCCUGUGCUUCGGCAAGUUCCCCAUCUACACGAUCCCCGACAAGCUGGGCCCCUGGAGCCCCAUCGACCUGCACCACCUGAGCUGCCCCAACAACCUGGUGGUGGAGGACGAGGGCUGCACGAACCUGAGCGGCUUCAGCUACAUGGAGCUGAAGGUGGGCUACAUCAGCGCCAUCAAGGUGAACGGCUUCACGUGCACGGGCGUGGUGACGGAGGCCGAGACGUACACGAACUUCGUGGGCUACGUGACGACGACGUUCAAGCGGAAGCACUUCCGGCCCACGCCCGACGCCUGCCGGGCCGCCUACAACUGGAAGAUGGCCGGCGACCCCCGGUACGAGGAGAGCCUGCACAACCCCUACCCCGACUACCACUGGCUGCGGACGGUGAAGACGACGAAGGAGAGCCUGGUGAUCAUCAGCCCCAGCGUGACGGACCUGGACCCCUACGACAAGAGCCUGCACAGCCGGGUGUUCCCCGGCGGCAACUGCAGCGGCAUCACGGUGAGCAGCACGUACUGCAGCACGAACCACGACUACACGAUCUGGAUGCCCGAGAACCUGCGGCUGGGCACGAGCUGCGACAUCUUCACGCACAGCCGGGGCAAGCGGGCCAGCAAGGGCGACAAGACGUGCGGCUUCGUGGACGAGCGGGGCCUGUACAAGAGCCUGAAGGGCGCCUGCAAGCUGAAGCUGUGCGGCGUGCUGGGCCUGCGGCUGAUGGACGGCACGUGGGUGGCCAUGCAGACGAGCGACGAGACGAAGUGGUGCCCCCCCGGCCAGCUGGUGAACCUGCACGACUUCCGGAGCGACGAGAUCGAGCACCUGGUGGAGGAGGAGCUGGUGAAGAAGCGGGAGGAGUGCCUGGACGCCCUGGAGAGCAUCAUGACGACGAAGAGCGUGAGCUUCCGGCGGCUGAGCCACCUGCGGAAGCUGGUGCCCGGCUUCGGCAAGGCCUACACGAUCUUCAACAAGACGCUGAUGGAGGCCGACGCCCACUACAAGAGCGUGCAGACGUGGAACGAGAUCAUCCCCAGCAAGGGCUGCCUGCGGGUGGGCGAGCGGUGCCACCCCCACGUGAACGGCGUGUUCUUCAACGGCAUCAUCCUGGGCAGCGACGGCCACGUGCUGAUCCCCGAGAUGCAGAGCAGCCUGCUGCAGCAGCACAUGGAGCUGCUGGAGAGCAGCGUGAUCCCCCUGAUGCACCCCCUGGCCGACCCCAGCACGGUGUUCAAGGACGGCGACGAGGUGGAGGACUUCGUGGAGGUGCACCUGCCCGACGUGCACAAGCAGGUGAGCGGCGUGGACCUGGGCCUGCCCAAGUGGGGCAAGUACGUGCUGAUGAUCGCCGGCGCCCUGAUCGCCCUGAUGCUGAUCAUCUUCCUGAUGACGUGCUGCCGGCGGGUGAACCGGCCCGAGAGCACGCAGAGCAACCUGGGCGGCACGGGCCGGAACGUGAGCGUGCCCAGCCAGAGCGGCAAGGUGAUCAGCAGCUGGGAGAGCUACAAGAGCGGCGGCGAGACGCGGCUGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:22)
在另一优选的实施方案中，所述的mRNA核酸分子还包含一种或多种选自假尿苷(ψ)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基胞嘧啶(m5C)的功能性核苷酸类似物修饰，优选所述的mRNA核酸分子的一个或多个或所有尿嘧啶被假尿苷(ψ)取代。在特别优选的实施方案中，发明人通过降低mRNA分子中U(尿苷酸)的含量来实现降低mRNA免疫原性，对核酸序列SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22中的所有尿嘧啶采用假尿苷(ψ)取代，加帽取代后的序列如SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:25(序列中n表示假尿苷(ψ))所示。对核酸序列SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8中的所有尿嘧啶采用假尿苷(ψ)取代，取代后的序列如SEQ ID NO:26-SEQ ID NO:28所示(序列中n表示假尿苷(ψ))。
/>
/>
/>
/>
/>
/>
药物组合物
在另一实施方案中，本文提供了用于诱导受试者对RABV病毒G抗原产生中和抗体反应的药物组合物，本文所述的药物组合物包含序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合所示的mRNA分子，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中,本公开内容的mRNA在脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle,LNP)中配制，形成脂质纳米颗粒形式。因此，在另一方面，本发明提供包含mRNA的药物组合物，其包含如下的组分：
(1)序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合mRNA分子；
(2)20-60％摩尔比的可电离阳离子脂质(ionizable lipids)；
(3)5-25％摩尔比的非阳离子脂质；
(4)25-55％摩尔比的甾醇；和
(5)0.5-15％摩尔比的PEG改性脂质。
在另一实施方案中，可电离阳离子脂质整体结构可分为头部、连接片段和尾部三个部分。LNP配方中，生理pH下可电离脂质表现为中性，而在内体的酸性环境中则带正电荷。由于有效性和毒性特征的大程度改善，pH依赖性的电离能力使可电离脂质成为核酸递送的合适材料。优选的，可电离脂质在配方中的占比通常为总脂质的30％-50％摩尔比。临床上已经使用的优选可电离阳离子脂质包括DLin-MC3-DMA,SM-102,ALC-0315等。如ALC-0315和SM-102的头部基团含有一个末端羟基，可以减少头部基团的水化作用，提高与核酸的氢键相互作用，从而可能提高转染能力。
在另一实施方案中，非阳离子脂质通常为中性辅助磷脂。磷脂通常作为LNP配方的结构脂质，因为它们可以自发地组织成脂质双层，且较高的相变温度增强LNP的膜稳定性。优选的，磷脂在配方中的占比为总脂质的10％-20％摩尔比。临床上已经使用的磷脂优选可为DSPC、DOPE和DGTS。其中，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)结构由磷脂酰胆碱头部基团和两个饱和的18碳尾部组成，两个尾巴形成紧密堆积的脂质双层。DSPC是优选的经临床验证的mRNA疫苗LNP中的结构脂质。
在另一实施方案中，甾醇可选自胆固醇、β-谷甾醇和氧化胆固醇衍生物等。胆固醇是一种天然丰富的细胞膜成分，常作为LNP配方的结构脂质。LNP配方中胆固醇占比优选可为30-50％摩尔比。
在另一实施方案中，PEG修饰的脂质(PEG-脂质)是LNP中调控半衰期和细胞摄取的一个重要组分。优选的，PEG修饰的脂质在配方中的占比为总脂质的0.5-2.5％摩尔比。PEG为LNP提供了一个外部聚合层，以阻止血清蛋白吸附和单核吞噬细胞系统的摄取，延长了体内的循环时间。PEG还可以防止纳米颗粒在储存过程和血液中的聚集。在一些实施例中，本发明公开的PEG修饰脂质包括PEG修饰的磷脂乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。在一些实例中，PEG修饰的脂质为DMG-PEG、PEG-DOMG、PEG-DSG和/或PEG-DPG等。更优选的PEG修饰的脂质ALC0159。
在另一实施方案中，本发明公开的LNP包含可电离的阳离子脂质组分与mRNA约10:1-约100:1的质量比。在另一实施方案中，本发明公开的LNP包含可电离的阳离子脂质组分与mRNA约20:1-约40:1的质量比。
在另一实施方案中，本发明公开的药物组合物，所述的mRNA分子包裹在脂质壳中配制成脂质纳米颗粒形式，其中脂质纳米颗粒通常包括ALC0315，DSPC，胆固醇和ALC0159等四个脂质组分。
在另一优选实施方案中，本发明提供包含mRNA的药物组合物，其包含如下的组分：
(1)序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合的mRNA分子；
(2)20-60％摩尔比的可电离阳离子脂质ALC0315；
(3)5-25％摩尔比的DSPC；
(4)25-55％摩尔比的胆固醇；和
(5)0.5-15％摩尔比的PEG改性脂质ALC0159；
其中，可电离的阳离子脂质组分与mRNA约10:1-约100:1的质量比。
在另一优选实施方案中，本发明提供包含mRNA的药物组合物，其包含如下的组分：
(1)序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合的mRNA分子；
(2)30-50％摩尔比的可电离阳离子脂质ALC0315；
(3)10-20％摩尔比的DSPC；
(4)23-50％摩尔比的胆固醇；和
(5)0.5-2.5％摩尔比的PEG改性脂质ALC0159；
其中，可电离的阳离子脂质组分与mRNA约20:1-约40:1的质量比。
LNP的平均粒径和粒径分布是LNP质量和各种应用适宜性的重要初始决定因素。这些特征通常通过动态光散射(DLS)进行表征。在一些实施方案中,本发明公开的LNP具有约20-200nm的平均直径。在另一些实施方案中,本公开的LNP具有约50nm-150nm的平均直径。在另一些实施方案中,本公开的LNP具有约70nm-120nm的平均直径。
LNP的表面电荷负责与细胞膜和生物环境发生相互作用，通常通过Zeta电位测量来评估LNP的表面电荷。调节LNP表面总电荷的一种常用方法是调节N/P比值，即可电离脂质(N，代表阳离子胺)与核酸(P，代表阴离子磷酸)的比值。在一些实施方案中,本发明公开的LNP包含N:P比为约2:1-30:1。在另一些实施方案中,本公开公开的LNP包括N:P比为约6:1。在另一些实施方案中,本公开公开的LNP包括N:P比为约3:1。
用途
在另一实施方案中，本文提供了如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25所示的mRNA可用于诱导受试者对RABV病毒G抗原产生中和抗体反应，本文提供的mRNA可以在施用对象中控制、预防或治疗由狂犬病毒引起的动物源性感染性疾病。
在一些实施方案中，本发明公开了如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25所示的mRNA在制备治疗或预防狂犬病毒感染的药物或疫苗中的用途。在一些实施方案中,根据本公开内容的组合物(包含mRNA及其编码的多肽)可用于治疗或预防狂犬病毒感染。药物组合物可以作为活性免疫方案的一部分或治疗上的药物组合物给予施用对象。在一些实施方案中,提供给受试者的mRNA的量可以是对免疫预防有效的剂量。
在另一实施方案中，本发明所述的施用对象是人类或非人类哺乳动物。在另一实施方案中，所述施用对象是成人、人类儿童或人类幼儿。在另一实施方案中，所述施用对象处于狂犬病毒感染的风险中。
狂犬病毒通过损伤的皮肤或粘膜进入人体内，在内部繁殖后进入神经系统，并向脊髓、脑部蔓延。狂犬病潜伏期从5天至数年(通常2～3个月，极少超过1年)，潜伏期长短与病毒的毒力、侵入部位的神经分布等因素相关。病毒数量越多、毒力越强、侵入部位神经越丰富、越靠近中枢神经系统，潜伏期就越短。人主要通过以下方式感染狂犬病毒：
(1)通过伤口或皮肤粘膜传染，如被疯狗咬伤、抓伤、宰杀疯动物、剥疯动物皮、接触疯动物污染的物品、肛门粘膜、伤口被狗舔过；
(2)通过口腔粘膜传染；
(3)通过病人唾液感染；
当被狂犬或可疑动物咬伤后或其他因素有暴露狂犬病毒的风险时，注射狂犬疫苗是最重要的预防措施。注射的时间越早越好，并要进行全程免疫。本文提供的mRNA疫苗或药物可以在施用对象中控制、预防或治疗由狂犬病毒引起的感染性疾病。目前，WHO推荐的暴露后免疫肌内注射程序包括「5针法」(Essen法)、「2-1-1」程序(Zagreb法)以及ACIP推荐的「简易4针法」。推荐的暴露前免疫肌内注射方案为3剂疫苗，分别在0、7和21或28天接种。其中，Essen法的给药程序为：在0天(第一天即注射当天)、3天(第四天，以下类推)、7、14、28天各注射狂犬病毒mRNA疫苗疫苗1支；Zagreb法的给药程序为：第0天左右上臂三角肌各接种1剂，7、21天再分别接种1剂；简易4针法的给药程序为：在0、3、7、14天各注射1次。若为严重咬伤如头、面、颈、手指一处或多处咬伤，咬穿皮肤或舔触粘膜等，应加倍注射并和抗狂犬病血清或免疫球蛋白联合应用，并于全程免疫后15、75天或10、20、90天加强。
本文所述的mRNA可以配制成本文所述的剂型,例如鼻内、腹腔内、静脉内,眼内、玻璃体内、肌肉内、皮内、心内腹膜内或皮下给药，优选为皮下或肌肉内给药。
本文提供的mRNA可以在施用对象中控制、预防或治疗由狂犬病毒引起的感染性疾病，mRNA的有效剂量范围可以是10μg-5mg，更优选的有效剂量范围为10μg-1mg，10μg-500μg，20μg-300μg或40μg-200μg等。在治疗、预防和/或治疗传染性疾病中有效的治疗性核酸或其组合物的量将取决于所治疗疾病的性质、给药途径、施用对象的总体健康状况等，通常应根据医生的判断决定。可以可选地采用标准临床技术，例如体外测定法，以帮助确定最佳剂量范围。
本发明提供了用于控制、预防和治疗狂犬病毒感染的mRNA核酸分子、包含所述mRNA核酸分子的药物组合物及其用途。兹将本发明的技术方案总结如下：
1、包含编码RABV病毒G抗原的核酸分子，其中所述编码区包含一个或多个开放阅读框(ORF)，且其中至少一个ORF编码序列如SEQ ID NO:1所示的RABV病毒G抗原，但其核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％,至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性。2、根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于：所述的包含编码RABV病毒G抗原的核酸分子，其序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5所示。
3、包含编码RABV病毒G抗原的mRNA核酸分子，其序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示。
4、mRNA核酸分子，其包括：
(i)5’非翻译区(5’-UTR)；
(ii)CDS，其中CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，其包括如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(iii)3’非翻译区(3’-UTR)。
5、根据权利要求4所述的mRNA核酸分子，其特征在于：其中5'UTR包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列。
6、根据权利要求4所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的5’-UTR序列可包含或不包含Kozak序列。
7、根据权利要求6所述的mRNA核酸分子，其特征在于：其中5'UTR可包括kozak序列GCCACC或GCCANN等，其中N指代A、T/U、C或G。
8、根据权利要求4所述的mRNA核酸分子，其特征在于：其中3’UTR包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的序列。
9、根据权利要求4所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的mRNA核酸分子还包含天然5’-帽结构或其类似物。
10、根据权利要求9所述的mRNA核酸分子，其特征在于：5’-帽类似物可任选地选自m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G等。
11、根据权利要求4所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的mRNA核酸分子还包含聚A尾(poly-A tail)或聚腺苷酸化信号,任选地具有80至180个核苷酸的长度。
12、根据权利要求11所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的聚A尾(poly-Atail)为80-180个A，中间有linker序列。
13、根据权利要求12所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的聚A尾(poly-Atail)为80-160个A。
14、根据权利要求11所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的聚A尾(poly-Atail)如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示。
15、根据权利要求3-11任一项所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的mRNA核酸分子还包含一种或多种选自假尿苷(ψ)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基胞嘧啶(m5C)的功能性核苷酸类似物修饰。
16、根据权利要求15所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的mRNA包括在核酸的一个或多个或所有尿嘧啶位置处的假尿苷(ψ)取代。
17、根据权利要求16所述的mRNA核酸分子，其特征在于：如SEQ ID NO:6-SEQ IDNO:25中任一项序列所示的尿嘧啶(U)均被假尿苷(ψ)所取代。
18、一种mRNA核酸分子，所述的mRNA分子包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)，其中CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，核苷酸序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示。
19、根据权利要求18所述的mRNA核酸分子，其特征在于：其中的5’-UTR包含Kozak序列。
20、根据权利要求18所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的CDS包含信号肽序列和成熟肽序列。
21、根据权利要求20所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的信号肽序列如SEQID NO:17-SEQ ID NO:19所示。
22、一种mRNA分子，所述的mRNA包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)；
其中，所述的5’-帽结构可任选地选自m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G等；
其中，所述的5’-UTR包含如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:11所示的序列；
其中，所述的CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，RABV病毒G抗原的序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示；
其中，所述的3’-UTR包括如SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
其中，所述的3’-聚腺苷酸序列(polyA)任选地具有80至180个腺苷酸的长度。
23、根据权利要求22所述的mRNA核酸分子，其特征在于：其序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22所示。
24、根据权利要求18-23任一项所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的mRNA核酸分子还包含一种或多种选自假尿苷(ψ)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基胞嘧啶(m5C)的功能性核苷酸类似物修饰。
25、根据权利要求24所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的mRNA核酸分子的一个或多个或所有尿嘧啶被假尿苷(ψ)取代。
26、根据权利要求24所述的mRNA核酸分子，其特征在于：对核酸序列SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22中的所有尿嘧啶采用假尿苷(ψ)取代，取代后的序列如SEQ ID NO:23-SEQID NO:25所示。
27、用于诱导受试者对RABV病毒G抗原产生中和抗体反应的药物组合物，包含如权利要求4-26任一项所述的mRNA核酸分子以及药学上可接受的载体。
28、根据权利要求27所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物包含如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合所示的mRNA分子，以及药学上可接受的载体。
29、包含mRNA的药物组合物，其包含如下的组分：
(1)序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合的mRNA分子；
(2)20-60％摩尔比的可电离阳离子脂质(ionizable lipids)；
(3)5-25％摩尔比的非阳离子脂质；
(4)25-55％摩尔比的甾醇；和
(5)0.5-15％摩尔比的PEG改性脂质。
30、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的可电离阳离子脂质摩尔比为30％-50％。
31、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的可电离阳离子脂质包括DLin-MC3-DMA,SM-102,ALC-0315等。
32、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的非阳离子脂质的摩尔比为10％-20％。
33、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的非阳离子脂质为DSPC、DOPE或DGTS。
34、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的甾醇选自胆固醇、β-谷甾醇和氧化胆固醇衍生物等。
35、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的甾醇的摩尔比为30-50％。
35、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的PEG改性脂质的摩尔比为0.5-2.5％。
36、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的PEG改性脂质包括PEG修饰的磷脂乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。
37、根据权利要求36所述的药物组合物，其特征在于：所述的PEG改性脂质为DMG-PEG、PEG-DOMG、PEG-DSG和/或PEG-DPG等。
38、根据权利要求37所述的药物组合物，其特征在于：所述的PEG改性脂质为ALC0159。
39、根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物中可电离的阳离子脂质组分与mRNA约10:1-约100:1的质量比。
40、根据权利要求39所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物中可电离的阳离子脂质组分与mRNA约20:1-约40:1的质量比。
41、包含mRNA的药物组合物，其包含如下的组分：
(1)序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合的mRNA分子；
(2)20-60％摩尔比的可电离阳离子脂质ALC0315；
(3)5-25％摩尔比的DSPC；
(4)25-55％摩尔比的胆固醇；和
(5)0.5-15％摩尔比的PEG改性脂质ALC0159；
其中，可电离的阳离子脂质组分与mRNA约10:1-约100:1的质量比。
42、包含mRNA的药物组合物，其包含如下的组分：
(1)序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合的mRNA分子；
(2)30-50％摩尔比的可电离阳离子脂质ALC0315；
(3)10-20％摩尔比的DSPC；
(4)23-50％摩尔比的胆固醇；和
(5)0.5-2.5％摩尔比的PEG改性脂质ALC0159；
其中，可电离的阳离子脂质组分与mRNA约20:1-约40:1的质量比。
43、根据权利要求29-42任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物形成脂质纳米颗粒(LNP),所述的LNP具有约20-200nm的平均直径。
44、根据权利要求43所述的药物组合物，其特征在于：所述的LNP具有约50nm-150nm的平均直径。
45、根据权利要求44所述的药物组合物，其特征在于：所述的LNP具有约70nm-120nm的平均直径。
46、根据权利要求43所述的药物组合物，其特征在于：所述的的LNP包含N:P比为约2:1-30:1，其中N/P比值为可电离脂质(N，代表阳离子胺)与核酸(P，代表阴离子磷酸)的比值。
47、根据权利要求46所述的药物组合物，其特征在于：所述的LNP包括N:P比为约6:1。
48、根据权利要求46所述的药物组合物，其特征在于：所述的LNP包括N:P比为约3:1。
49、根据权利要求4-26任一项所述的mRNA核酸分子或27-48任一项所述的药物组合物在制备治疗或预防狂犬病毒感染的药物或疫苗中的用途。
50、根据权利要求49所述的用途，其特征在于：所述的mRNA具有如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项所示的序列或为其组合。
51、根据权利要求49所述的用途，其特征在于：所述mRNA药物或疫苗的施用对象是人类或非人类哺乳动物。
52、根据权利要求51所述的用途，其特征在于：所述mRNA药物或疫苗的施用对象是成人、人类儿童或人类幼儿。
53、根据权利要求52所述的用途，其特征在于：所述mRNA药物或疫苗的施用对象处于狂犬病毒感染的风险中。
54、根据权利要求53所述的用途，其特征在于：当被狂犬或可疑动物咬伤后或其他因素有暴露狂犬病毒的风险时，给药程序包括「5针法」(Essen法)、「2-1-1」程序(Zagreb法)以及ACIP推荐的「简易4针法」。
55、根据权利要求53所述的用途，其特征在于：处于狂犬病毒暴露前免疫预防的肌内注射方案为3剂疫苗，分别在0、7和21或28天接种。
56、根据权利要求54所述的用途，其特征在于：若为严重咬伤如头、面、颈、手指一处或多处咬伤，咬穿皮肤或舔触粘膜等，应加倍注射并和抗狂犬病血清或免疫球蛋白联合应用，并于全程免疫后15、75天或10、20、90天加强。
57、根据权利要求49所述的用途，其特征在于：所述的mRNA疫苗配制成鼻内、腹腔内、静脉内、眼内、玻璃体内、肌肉内、皮内、心内腹膜内或皮下给药。
58、根据权利要求57所述的用途，其特征在于：所述的mRNA疫苗为皮下或肌肉内给药。
59、根据权利要求49所述的用途，其特征在于：所述mRNA药物或疫苗的有效剂量范围是10μg-5mg。
60、根据权利要求59所述的用途，其特征在于：所述mRNA药物或疫苗的有效剂量范围为10μg-1mg，10μg-500μg，20μg-300μg或40μg-200μg等。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
实施例1 mRNA的制备
发明人对狂犬病毒HEP-Flury毒株G蛋白(RABV G)编码区(SEQ ID NO:2)进行优化，序列优化包括：针对在人体内表达时GC含量进行调整，提高序列的GC含量，优化后得到核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的转录优化RABV病毒G抗原DNA序列；优化密码子得到核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的转录优化RABV病毒G抗原DNA序列；提高GC含量并且对密码子进行优化得到核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的转录优化RABV病毒G抗原DNA序列。该核苷酸序列使得转录后的mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高。根据SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5序列转录得到的mRNA序列分别如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示。发明人通过降低mRNA分子中U(尿苷酸)的含量来实现降低mRNA免疫原性，对核酸序列SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8中的所有尿嘧啶采用假尿苷(ψ)取代，取代后的序列如SEQ IDNO:26-SEQ ID NO:28所示。
AΨGGΨCCCGCAAGΨCCΨACΨAΨΨCGCGCCGCΨACΨAGΨCΨΨCCCGCΨAΨGCΨΨCGGGAAGΨΨCCCGAΨAΨACACCAΨACCGGACAAGCΨAGGGCCGΨGGΨCGCCGAΨAGACCΨACACCACCΨAΨCGΨGCCCGAACAACCΨAGΨCGΨCGAGGACGAGGGGΨGCACCAACCΨAΨCGGGGΨΨCΨCGΨACAΨGGAGCΨAAAGGΨCGGGΨACAΨAΨCGGCGAΨAAAGGΨCAACGGGΨΨCACCΨGCACCGGGGΨCGΨCACCGAGGCGGAGACCΨACACCAACΨΨCGΨCGGGΨACGΨCACCACCACCΨΨCAAGCGΨAAGCACΨΨCCGΨCCΨACΨCCΨGACGCΨΨGCCGΨGCΨGCΨΨACAACΨGGAAGAΨGGCΨGGCGACCCΨCGΨΨACGAGGAGΨCΨCΨGCACAACCCΨΨACCCΨGACΨACCACΨGGCΨGCGΨACΨGΨGAAGACΨACΨAAGGAGΨCΨCΨGGΨGAΨΨAΨΨΨCΨCCΨΨCΨGΨGACΨGACCΨGGACCCΨΨACGACAAGΨCΨCΨGCACΨCΨCGΨGΨGΨΨCCCΨGGCGGCAACΨGCΨCΨGGCAΨΨACΨGΨGΨCΨΨCΨACΨΨACΨGCΨCΨACΨAACCACGACΨACACΨAΨΨΨGGAΨGCCΨGAGAACCΨGCGΨCΨGGGCACΨΨCΨΨGCGACAΨΨΨΨCACΨCACΨCΨCGΨGGCAAGCGΨGCΨΨCΨAAGGGCGACAAGACΨΨGCGGCΨΨCGΨGGACGAGCGΨGGCCΨGΨACAAGΨCΨCΨGAAGGGCGCΨΨGCAAGCΨGAAGCΨGΨGCGGCGΨGCΨGGGCCΨGCGΨCΨGAΨGGACGGCACΨΨGGGΨGGCΨAΨGCAGACΨΨCΨGACGAGACΨAAGΨGGΨGCCCΨCCΨGGCCAGCΨGGΨGAACCΨGCACGACΨΨCCGΨΨCΨGACGAGAΨΨGAGCACCΨGGΨGGAGGAGGAGCΨGGΨGAAGAAGCGΨGAGGAGΨGCCΨGGACGCΨCΨGGAGΨCΨAΨΨAΨGACΨACΨAAGΨCΨGΨGΨCΨΨΨCCGΨCGΨCΨGΨCΨCACCΨGCGΨAAGCΨGGΨGCCΨGGCΨΨCGGCAAGGCΨΨACACΨAΨΨΨΨCAACAAGACΨCΨGAΨGGAGGCΨGACGCΨCACΨACAAGΨCΨGΨGCAGACΨΨGGAACGAGAΨΨAΨΨCCΨΨCΨAAGGGCΨGCCΨGCGΨGΨGGGCGAGCGΨΨGCCACCCΨCACGΨGAACGGCGΨGΨΨCΨΨCAACGGCAΨΨAΨΨCΨGGGCΨCΨGACGGCCACGΨGCΨGAΨΨCCΨGAGAΨGCAGΨCΨΨCΨCΨGCΨGCAGCAGCACAΨGGAGCΨGCΨGGAGΨCΨΨCΨGΨGAΨΨCCΨCΨGAΨGCACCCΨCΨGGCΨGACCCΨΨCΨACΨGΨGΨΨCAAGGACGGCGACGAGGΨGGAGGACΨΨCGΨGGAGGΨGCACCΨGCCΨGACGΨGCACAAGCAGGΨGΨCΨGGCGΨGGACCΨGGGCCΨGCCΨAAGΨGGGGCAAGΨACGΨGCΨGAΨGAΨΨGCΨGGCGCΨCΨGAΨΨGCΨCΨGAΨGCΨGAΨΨAΨΨΨΨCCΨGAΨGACΨΨGCΨGCCGΨCGΨGΨGAACCGΨCCΨGAGΨCΨACΨCAGΨCΨAACCΨGGGCGGCACΨGGCCGΨAACGΨGΨCΨGΨGCCΨΨCΨCAGΨCΨGGCAAGGΨGAΨΨΨCΨΨCΨΨGGGAGΨCΨΨACAAGΨCΨGGCGGCGAGACΨCGΨCΨGΨGA(SEQ ID NO:26)
AΨGGΨGCCΨCAGGΨGCΨGCΨGΨΨCGCΨCCΨCΨGCΨGGΨGΨΨCCCΨCΨGΨGCΨΨCGGCAAGΨΨCCCΨAΨΨΨACACΨAΨΨCCΨGACAAGCΨGGGCCCΨΨGGΨCΨCCΨAΨΨGACCΨGCACCACCΨGΨCΨΨGCCCΨAACAACCΨGGΨGGΨGGAGGACGAGGGCΨGCACΨAACCΨGΨCΨGGCΨΨCΨCΨΨACAΨGGAGCΨGAAGGΨGGGCΨACAΨΨΨCΨGCΨAΨΨAAGGΨGAACGGCΨΨCACΨΨGCACΨGGCGΨGGΨGACΨGAGGCΨGAGACΨΨACACΨAACΨΨCGΨGGGCΨACGΨGACΨACΨACΨΨΨCAAGCGΨAAGCACΨΨCCGΨCCΨACΨCCΨGACGCΨΨGCCGΨGCΨGCΨΨACAACΨGGAAGAΨGGCΨGGCGACCCΨCGΨΨACGAGGAGΨCΨCΨGCACAACCCΨΨACCCΨGACΨACCACΨGGCΨGCGΨACΨGΨGAAGACΨACΨAAGGAGΨCΨCΨGGΨGAΨΨAΨΨΨCΨCCΨΨCΨGΨGACΨGACCΨGGACCCΨΨACGACAAGΨCΨCΨGCACΨCΨCGΨGΨGΨΨCCCΨGGCGGCAACΨGCΨCΨGGCAΨΨACΨGΨGΨCΨΨCΨACΨΨACΨGCΨCΨACΨAACCACGACΨACACΨAΨΨΨGGAΨGCCΨGAGAACCΨGCGΨCΨGGGCACΨΨCΨΨGCGACAΨΨΨΨCACΨCACΨCΨCGΨGGCAAGCGΨGCΨΨCΨAAGGGCGACAAGACΨΨGCGGCΨΨCGΨGGACGAGCGΨGGCCΨGΨACAAGΨCΨCΨGAAGGGCGCΨΨGCAAGCΨGAAGCΨGΨGCGGCGΨGCΨGGGCCΨGCGΨCΨGAΨGGACGGCACΨΨGGGΨGGCΨAΨGCAGACΨΨCΨGACGAGACΨAAGΨGGΨGCCCΨCCΨGGCCAGCΨGGΨGAACCΨGCACGACΨΨCCGΨΨCΨGACGAGAΨΨGAGCACCΨGGΨGGAGGAGGAGCΨGGΨGAAGAAGCGΨGAGGAGΨGCCΨGGACGCΨCΨGGAGΨCΨAΨΨAΨGACΨACΨAAGΨCΨGΨGΨCΨΨΨCCGΨCGΨCΨGΨCΨCACCΨGCGΨAAGCΨGGΨGCCΨGGCΨΨCGGCAAGGCΨΨACACΨAΨΨΨΨCAACAAGACΨCΨGAΨGGAGGCΨGACGCΨCACΨACAAGΨCΨGΨGCAGACΨΨGGAACGAGAΨΨAΨΨCCΨΨCΨAAGGGCΨGCCΨGCGΨGΨGGGCGAGCGΨΨGCCACCCΨCACGΨGAACGGCGΨGΨΨCΨΨCAACGGCAΨΨAΨΨCΨGGGCΨCΨGACGGCCACGΨGCΨGAΨΨCCΨGAGAΨGCAGΨCΨΨCΨCΨGCΨGCAGCAGCACAΨGGAGCΨGCΨGGAGΨCΨΨCΨGΨGAΨΨCCΨCΨGAΨGCACCCΨCΨGGCΨGACCCΨΨCΨACΨGΨGΨΨCAAGGACGGCGACGAGGΨGGAGGACΨΨCGΨGGAGGΨGCACCΨGCCΨGACGΨGCACAAGCAGGΨGΨCΨGGCGΨGGACCΨGGGCCΨGCCΨAAGΨGGGGCAAGΨACGΨGCΨGAΨGAΨΨGCΨGGCGCΨCΨGAΨΨGCΨCΨGAΨGCΨGAΨΨAΨΨΨΨCCΨGAΨGACΨΨGCΨGCCGΨCGΨGΨGAACCGΨCCΨGAGΨCΨACΨCAGΨCΨAACCΨGGGCGGCACΨGGCCGΨAACGΨGΨCΨGΨGCCΨΨCΨCAGΨCΨGGCAAGGΨGAΨΨΨCΨΨCΨΨGGGAGΨCΨΨACAAGΨCΨGGCGGCGAGACΨCGΨCΨGΨGA(SEQ ID NO:27)
AΨGGΨGCCCCAGGΨGCΨGCΨGΨΨCGCCCCCCΨGCΨGGΨGΨΨCCCCCΨGΨGCΨΨCGGCAAGΨΨCCCCAΨCΨACACGAΨCCCCGACAAGCΨGGGCCCCΨGGAGCCCCAΨCGACCΨGCACCACCΨGAGCΨGCCCCAACAACCΨGGΨGGΨGGAGGACGAGGGCΨGCACGAACCΨGAGCGGCΨΨCAGCΨACAΨGGAGCΨGAAGGΨGGGCΨACAΨCAGCGCCAΨCAAGGΨGAACGGCΨΨCACGΨGCACGGGCGΨGGΨGACGGAGGCCGAGACGΨACACGAACΨΨCGΨGGGCΨACGΨGACGACGACGΨΨCAAGCGGAAGCACΨΨCCGGCCCACGCCCGACGCCΨGCCGGGCCGCCΨACAACΨGGAAGAΨGGCCGGCGACCCCCGGΨACGAGGAGAGCCΨGCACAACCCCΨACCCCGACΨACCACΨGGCΨGCGGACGGΨGAAGACGACGAAGGAGAGCCΨGGΨGAΨCAΨCAGCCCCAGCGΨGACGGACCΨGGACCCCΨACGACAAGAGCCΨGCACAGCCGGGΨGΨΨCCCCGGCGGCAACΨGCAGCGGCAΨCACGGΨGAGCAGCACGΨACΨGCAGCACGAACCACGACΨACACGAΨCΨGGAΨGCCCGAGAACCΨGCGGCΨGGGCACGAGCΨGCGACAΨCΨΨCACGCACAGCCGGGGCAAGCGGGCCAGCAAGGGCGACAAGACGΨGCGGCΨΨCGΨGGACGAGCGGGGCCΨGΨACAAGAGCCΨGAAGGGCGCCΨGCAAGCΨGAAGCΨGΨGCGGCGΨGCΨGGGCCΨGCGGCΨGAΨGGACGGCACGΨGGGΨGGCCAΨGCAGACGAGCGACGAGACGAAGΨGGΨGCCCCCCCGGCCAGCΨGGΨGAACCΨGCACGACΨΨCCGGAGCGACGAGAΨCGAGCACCΨGGΨGGAGGAGGAGCΨGGΨGAAGAAGCGGGAGGAGΨGCCΨGGACGCCCΨGGAGAGCAΨCAΨGACGACGAAGAGCGΨGAGCΨΨCCGGCGGCΨGAGCCACCΨGCGGAAGCΨGGΨGCCCGGCΨΨCGGCAAGGCCΨACACGAΨCΨΨCAACAAGACGCΨGAΨGGAGGCCGACGCCCACΨACAAGAGCGΨGCAGACGΨGGAACGAGAΨCAΨCCCCAGCAAGGGCΨGCCΨGCGGGΨGGGCGAGCGGΨGCCACCCCCACGΨGAACGGCGΨGΨΨCΨΨCAACGGCAΨCAΨCCΨGGGCAGCGACGGCCACGΨGCΨGAΨCCCCGAGAΨGCAGAGCAGCCΨGCΨGCAGCAGCACAΨGGAGCΨGCΨGGAGAGCAGCGΨGAΨCCCCCΨGAΨGCACCCCCΨGGCCGACCCCAGCACGGΨGΨΨCAAGGACGGCGACGAGGΨGGAGGACΨΨCGΨGGAGGΨGCACCΨGCCCGACGΨGCACAAGCAGGΨGAGCGGCGΨGGACCΨGGGCCΨGCCCAAGΨGGGGCAAGΨACGΨGCΨGAΨGAΨCGCCGGCGCCCΨGAΨCGCCCΨGAΨGCΨGAΨCAΨCΨΨCCΨGAΨGACGΨGCΨGCCGGCGGGΨGAACCGGCCCGAGAGCACGCAGAGCAACCΨGGGCGGCACGGGCCGGAACGΨGAGCGΨGCCCAGCCAGAGCGGCAAGGΨGAΨCAGCAGCΨGGGAGAGCΨACAAGAGCGGCGGCGAGACGCGGCΨGΨGA(SEQ ID NO:28)
转录优化RABV病毒G抗原mRNA的序列还包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR(包含Kozak序列)、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)，其中5’-UTR包括Kozak序列GCCACC。5’-帽结构、5’-UTR、Kozak、3’-聚腺苷酸序列(polyA)和3’-UTR序列元件的添加均可以进一步提高序列的稳定性，避免降解。CDS包含信号肽序列和成熟肽序列，优选的信号肽序列如SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:19所示。RABV病毒G抗原mRNA序列关键元件是采用HBA1 5’UTR、Kozak、RABV病毒G抗原的编码区核苷酸、HBA13’UTR和polyA序列。G-1、G-3mRNA序列在G蛋白编码区做了调整，相比天然的GmRNA，GC含量均有提高，而G-2则是对密码子进行了优化。其他非编码区域保持一致，序列信息如表1所示。完整mRNA分子序列如SEQ ID NO:20-SEQ IDNO:22所示。
表1 RABV病毒G抗原mRNA
本实施例中的RABV病毒G抗原mRNA的具体制备过程如下：包含SEQ ID NO:3-SEQID NO:5 DNA序列的质粒体外转录制备gcH seq G-1 mRNA、opt seq G-2 mRNA和gcH+optseq G-3 mRNA原液。质粒体外转录制备原液委托诺唯赞公司制备完成，共分成四步：
第一步，包含SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5 DNA序列的基础质粒模板用限制性核酸内切酶Bsa I线性化。将PCR产物分别通过同源重组的方式分别连到基础质粒模板上，分别转化到E.coli Stable菌株中，并进行测序确认序列正确，转录模板构建成功。用摇瓶发酵菌株，用无内毒素质粒大提试剂盒纯化获得转录模板。
第二步，将转录模板用限制性核酸内切酶Bsa I进行酶切并纯化得到线性化质粒。使用商业化mRNA IVT试剂盒T7 High Yield RNA Transcription Kit(N1-Me-PseudoUTP)-DD4202将得到的线性化质粒按照Kit说明书加入相应的T7 RNA Polymerase Mix、10×Reaction buffer、N1-Me-Pseudo UTP Solution(100mM)、ATP(100mM)、GTP(100mM)、CTP(100mM)、N1-Me-Pseudo UTP，使用RNase-free H2O补足到相应反应体系，配制反应体系，37℃反应16h，再向反应体系中加入DNase I，37℃反应15min(PCR仪中)，消化转录的DNA模板。反应体系为：
▲配置体系时T7 RNA Polymerase Mix可以最后加入。
第三步，按照Oligo(dT)磁珠纯化试剂盒将第二步中合成的mRNA原液使用磁珠进行纯化操作，分别用DNaseI消化转录模板，并用沉淀法纯化mRNA，得到纯化产物mRNA。
第四步，向上述得到的mRNA原液中加入10×Capping buffer、GTP(10mM)、SAM(硫腺苷甲硫氨酸)、Vaccinia Capping Enzyme、mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase，使用RNase-free H2O补足到相应反应体系，37℃反应60-100min，再按照第三步的操作进行mRNA原液纯化。将纯化后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待用。
反应条件：37℃反应60min
发明人通过降低mRNA分子中U(尿苷酸)的含量来实现降低mRNA免疫原性，对核酸序列SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22中的所有尿嘧啶采用假尿苷(ψ)取代，制备过程同上，加帽(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG)取代后的序列最终如SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:25所示。
一种优化的RABV病毒G抗原mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示：
GAGGAAAΨAAGAGAGAAAAGAAGAGΨAAGAAGAAAΨAΨAAGACCCCGGCGCCGCCACCAΨGGΨCCCGCAAGΨCCΨACΨAΨΨCGCGCCGCΨACΨAGΨCΨΨCCCGCΨAΨGCΨΨCGGGAAGΨΨCCCGAΨAΨACACCAΨACCGGACAAGCΨAGGGCCGΨGGΨCGCCGAΨAGACCΨACACCACCΨAΨCGΨGCCCGAACAACCΨAGΨCGΨCGAGGACGAGGGGΨGCACCAACCΨAΨCGGGGΨΨCΨCGΨACAΨGGAGCΨAAAGGΨCGGGΨACAΨAΨCGGCGAΨAAAGGΨCAACGGGΨΨCACCΨGCACCGGGGΨCGΨCACCGAGGCGGAGACCΨACACCAACΨΨCGΨCGGGΨACGΨCACCACCACCΨΨCAAGCGΨAAGCACΨΨCCGΨCCΨACΨCCΨGACGCΨΨGCCGΨGCΨGCΨΨACAACΨGGAAGAΨGGCΨGGCGACCCΨCGΨΨACGAGGAGΨCΨCΨGCACAACCCΨΨACCCΨGACΨACCACΨGGCΨGCGΨACΨGΨGAAGACΨACΨAAGGAGΨCΨCΨGGΨGAΨΨAΨΨΨCΨCCΨΨCΨGΨGACΨGACCΨGGACCCΨΨACGACAAGΨCΨCΨGCACΨCΨCGΨGΨGΨΨCCCΨGGCGGCAACΨGCΨCΨGGCAΨΨACΨGΨGΨCΨΨCΨACΨΨACΨGCΨCΨACΨAACCACGACΨACACΨAΨΨΨGGAΨGCCΨGAGAACCΨGCGΨCΨGGGCACΨΨCΨΨGCGACAΨΨΨΨCACΨCACΨCΨCGΨGGCAAGCGΨGCΨΨCΨAAGGGCGACAAGACΨΨGCGGCΨΨCGΨGGACGAGCGΨGGCCΨGΨACAAGΨCΨCΨGAAGGGCGCΨΨGCAAGCΨGAAGCΨGΨGCGGCGΨGCΨGGGCCΨGCGΨCΨGAΨGGACGGCACΨΨGGGΨGGCΨAΨGCAGACΨΨCΨGACGAGACΨAAGΨGGΨGCCCΨCCΨGGCCAGCΨGGΨGAACCΨGCACGACΨΨCCGΨΨCΨGACGAGAΨΨGAGCACCΨGGΨGGAGGAGGAGCΨGGΨGAAGAAGCGΨGAGGAGΨGCCΨGGACGCΨCΨGGAGΨCΨAΨΨAΨGACΨACΨAAGΨCΨGΨGΨCΨΨΨCCGΨCGΨCΨGΨCΨCACCΨGCGΨAAGCΨGGΨGCCΨGGCΨΨCGGCAAGGCΨΨACACΨAΨΨΨΨCAACAAGACΨCΨGAΨGGAGGCΨGACGCΨCACΨACAAGΨCΨGΨGCAGACΨΨGGAACGAGAΨΨAΨΨCCΨΨCΨAAGGGCΨGCCΨGCGΨGΨGGGCGAGCGΨΨGCCACCCΨCACGΨGAACGGCGΨGΨΨCΨΨCAACGGCAΨΨAΨΨCΨGGGCΨCΨGACGGCCACGΨGCΨGAΨΨCCΨGAGAΨGCAGΨCΨΨCΨCΨGCΨGCAGCAGCACAΨGGAGCΨGCΨGGAGΨCΨΨCΨGΨGAΨΨCCΨCΨGAΨGCACCCΨCΨGGCΨGACCCΨΨCΨACΨGΨGΨΨCAAGGACGGCGACGAGGΨGGAGGACΨΨCGΨGGAGGΨGCACCΨGCCΨGACGΨGCACAAGCAGGΨGΨCΨGGCGΨGGACCΨGGGCCΨGCCΨAAGΨGGGGCAAGΨACGΨGCΨGAΨGAΨΨGCΨGGCGCΨCΨGAΨΨGCΨCΨGAΨGCΨGAΨΨAΨΨΨΨCCΨGAΨGACΨΨGCΨGCCGΨCGΨGΨGAACCGΨCCΨGAGΨCΨACΨCAGΨCΨAACCΨGGGCGGCACΨGGCCGΨAACGΨGΨCΨGΨGCCΨΨCΨCAGΨCΨGGCAAGGΨGAΨΨΨCΨΨCΨΨGGGAGΨCΨΨACAAGΨCΨGGCGGCGAGACΨCGΨCΨGΨGAΨAAΨAGGCΨGGAGCCΨCGGΨGGCCΨAGCΨΨCΨΨGCCCCΨΨGGGCCΨCCCCCCAGCCCCΨCCΨCCCCΨΨCCΨGCACCCGΨACCCCCGΨGGΨCΨΨΨGAAΨAAAGΨCΨGAGΨGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAΨAΨGACΨAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQID NO:23)。
另一种优化的RABV病毒G抗原mRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示：GAGGAAAΨAAGAGAGAAAAGAAGAGΨAAGAAGAAAΨAΨAAGACCCCGGCGCCGCCACCAΨGGΨGCCΨCAGGΨGCΨGCΨGΨΨCGCΨCCΨCΨGCΨGGΨGΨΨCCCΨCΨGΨGCΨΨCGGCAAGΨΨCCCΨAΨΨΨACACΨAΨΨCCΨGACAAGCΨGGGCCCΨΨGGΨCΨCCΨAΨΨGACCΨGCACCACCΨGΨCΨΨGCCCΨAACAACCΨGGΨGGΨGGAGGACGAGGGCΨGCACΨAACCΨGΨCΨGGCΨΨCΨCΨΨACAΨGGAGCΨGAAGGΨGGGCΨACAΨΨΨCΨGCΨAΨΨAAGGΨGAACGGCΨΨCACΨΨGCACΨGGCGΨGGΨGACΨGAGGCΨGAGACΨΨACACΨAACΨΨCGΨGGGCΨACGΨGACΨACΨACΨΨΨCAAGCGΨAAGCACΨΨCCGΨCCΨACΨCCΨGACGCΨΨGCCGΨGCΨGCΨΨACAACΨGGAAGAΨGGCΨGGCGACCCΨCGΨΨACGAGGAGΨCΨCΨGCACAACCCΨΨACCCΨGACΨACCACΨGGCΨGCGΨACΨGΨGAAGACΨACΨAAGGAGΨCΨCΨGGΨGAΨΨAΨΨΨCΨCCΨΨCΨGΨGACΨGACCΨGGACCCΨΨACGACAAGΨCΨCΨGCACΨCΨCGΨGΨGΨΨCCCΨGGCGGCAACΨGCΨCΨGGCAΨΨACΨGΨGΨCΨΨCΨACΨΨACΨGCΨCΨACΨAACCACGACΨACACΨAΨΨΨGGAΨGCCΨGAGAACCΨGCGΨCΨGGGCACΨΨCΨΨGCGACAΨΨΨΨCACΨCACΨCΨCGΨGGCAAGCGΨGCΨΨCΨAAGGGCGACAAGACΨΨGCGGCΨΨCGΨGGACGAGCGΨGGCCΨGΨACAAGΨCΨCΨGAAGGGCGCΨΨGCAAGCΨGAAGCΨGΨGCGGCGΨGCΨGGGCCΨGCGΨCΨGAΨGGACGGCACΨΨGGGΨGGCΨAΨGCAGACΨΨCΨGACGAGACΨAAGΨGGΨGCCCΨCCΨGGCCAGCΨGGΨGAACCΨGCACGACΨΨCCGΨΨCΨGACGAGAΨΨGAGCACCΨGGΨGGAGGAGGAGCΨGGΨGAAGAAGCGΨGAGGAGΨGCCΨGGACGCΨCΨGGAGΨCΨAΨΨAΨGACΨACΨAAGΨCΨGΨGΨCΨΨΨCCGΨCGΨCΨGΨCΨCACCΨGCGΨAAGCΨGGΨGCCΨGGCΨΨCGGCAAGGCΨΨACACΨAΨΨΨΨCAACAAGACΨCΨGAΨGGAGGCΨGACGCΨCACΨACAAGΨCΨGΨGCAGACΨΨGGAACGAGAΨΨAΨΨCCΨΨCΨAAGGGCΨGCCΨGCGΨGΨGGGCGAGCGΨΨGCCACCCΨCACGΨGAACGGCGΨGΨΨCΨΨCAACGGCAΨΨAΨΨCΨGGGCΨCΨGACGGCCACGΨGCΨGAΨΨCCΨGAGAΨGCAGΨCΨΨCΨCΨGCΨGCAGCAGCACAΨGGAGCΨGCΨGGAGΨCΨΨCΨGΨGAΨΨCCΨCΨGAΨGCACCCΨCΨGGCΨGACCCΨΨCΨACΨGΨGΨΨCAAGGACGGCGACGAGGΨGGAGGACΨΨCGΨGGAGGΨGCACCΨGCCΨGACGΨGCACAAGCAGGΨGΨCΨGGCGΨGGACCΨGGGCCΨGCCΨAAGΨGGGGCAAGΨACGΨGCΨGAΨGAΨΨGCΨGGCGCΨCΨGAΨΨGCΨCΨGAΨGCΨGAΨΨAΨΨΨΨCCΨGAΨGACΨΨGCΨGCCGΨCGΨGΨGAACCGΨCCΨGAGΨCΨACΨCAGΨCΨAACCΨGGGCGGCACΨGGCCGΨAACGΨGΨCΨGΨGCCΨΨCΨCAGΨCΨGGCAAGGΨGAΨΨΨCΨΨCΨΨGGGAGΨCΨΨACAAGΨCΨGGCGGCGAGACΨCGΨCΨGΨGAΨAAΨAGGCΨGGAGCCΨCGGΨGGCCΨAGCΨΨCΨΨGCCCCΨΨGGGCCΨCCCCCCAGCCCCΨCCΨCCCCΨΨCCΨGCACCCGΨACCCCCGΨGGΨCΨΨΨGAAΨAAAGΨCΨGAGΨGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAΨAΨGACΨAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQID NO:24)。
另一种优化的RABV病毒G抗原mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示：GAGGAAAΨAAGAGAGAAAAGAAGAGΨAAGAAGAAAΨAΨAAGACCCCGGCGCCGCCACCAΨGGΨGCCCCAGGΨGCΨGCΨGΨΨCGCCCCCCΨGCΨGGΨGΨΨCCCCCΨGΨGCΨΨCGGCAAGΨΨCCCCAΨCΨACACGAΨCCCCGACAAGCΨGGGCCCCΨGGAGCCCCAΨCGACCΨGCACCACCΨGAGCΨGCCCCAACAACCΨGGΨGGΨGGAGGACGAGGGCΨGCACGAACCΨGAGCGGCΨΨCAGCΨACAΨGGAGCΨGAAGGΨGGGCΨACAΨCAGCGCCAΨCAAGGΨGAACGGCΨΨCACGΨGCACGGGCGΨGGΨGACGGAGGCCGAGACGΨACACGAACΨΨCGΨGGGCΨACGΨGACGACGACGΨΨCAAGCGGAAGCACΨΨCCGGCCCACGCCCGACGCCΨGCCGGGCCGCCΨACAACΨGGAAGAΨGGCCGGCGACCCCCGGΨACGAGGAGAGCCΨGCACAACCCCΨACCCCGACΨACCACΨGGCΨGCGGACGGΨGAAGACGACGAAGGAGAGCCΨGGΨGAΨCAΨCAGCCCCAGCGΨGACGGACCΨGGACCCCΨACGACAAGAGCCΨGCACAGCCGGGΨGΨΨCCCCGGCGGCAACΨGCAGCGGCAΨCACGGΨGAGCAGCACGΨACΨGCAGCACGAACCACGACΨACACGAΨCΨGGAΨGCCCGAGAACCΨGCGGCΨGGGCACGAGCΨGCGACAΨCΨΨCACGCACAGCCGGGGCAAGCGGGCCAGCAAGGGCGACAAGACGΨGCGGCΨΨCGΨGGACGAGCGGGGCCΨGΨACAAGAGCCΨGAAGGGCGCCΨGCAAGCΨGAAGCΨGΨGCGGCGΨGCΨGGGCCΨGCGGCΨGAΨGGACGGCACGΨGGGΨGGCCAΨGCAGACGAGCGACGAGACGAAGΨGGΨGCCCCCCCGGCCAGCΨGGΨGAACCΨGCACGACΨΨCCGGAGCGACGAGAΨCGAGCACCΨGGΨGGAGGAGGAGCΨGGΨGAAGAAGCGGGAGGAGΨGCCΨGGACGCCCΨGGAGAGCAΨCAΨGACGACGAAGAGCGΨGAGCΨΨCCGGCGGCΨGAGCCACCΨGCGGAAGCΨGGΨGCCCGGCΨΨCGGCAAGGCCΨACACGAΨCΨΨCAACAAGACGCΨGAΨGGAGGCCGACGCCCACΨACAAGAGCGΨGCAGACGΨGGAACGAGAΨCAΨCCCCAGCAAGGGCΨGCCΨGCGGGΨGGGCGAGCGGΨGCCACCCCCACGΨGAACGGCGΨGΨΨCΨΨCAACGGCAΨCAΨCCΨGGGCAGCGACGGCCACGΨGCΨGAΨCCCCGAGAΨGCAGAGCAGCCΨGCΨGCAGCAGCACAΨGGAGCΨGCΨGGAGAGCAGCGΨGAΨCCCCCΨGAΨGCACCCCCΨGGCCGACCCCAGCACGGΨGΨΨCAAGGACGGCGACGAGGΨGGAGGACΨΨCGΨGGAGGΨGCACCΨGCCCGACGΨGCACAAGCAGGΨGAGCGGCGΨGGACCΨGGGCCΨGCCCAAGΨGGGGCAAGΨACGΨGCΨGAΨGAΨCGCCGGCGCCCΨGAΨCGCCCΨGAΨGCΨGAΨCAΨCΨΨCCΨGAΨGACGΨGCΨGCCGGCGGGΨGAACCGGCCCGAGAGCACGCAGAGCAACCΨGGGCGGCACGGGCCGGAACGΨGAGCGΨGCCCAGCCAGAGCGGCAAGGΨGAΨCAGCAGCΨGGGAGAGCΨACAAGAGCGGCGGCGAGACGCGGCΨGΨGAΨAAΨAGGCΨGGAGCCΨCGGΨGGCCΨAGCΨΨCΨΨGCCCCΨΨGGGCCΨCCCCCCAGCCCCΨCCΨCCCCΨΨCCΨGCACCCGΨACCCCCGΨGGΨCΨΨΨGAAΨAAAGΨCΨGAGΨGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAΨAΨGACΨAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:25)。
实施例2流式细胞仪检测G蛋白抗原
为检测RABV病毒G蛋白mRNA在人类细胞中的表达及细胞膜上的定位，本实施例将培养24h以上的293细胞消化并种入6孔板中，将细胞密度控制在4×105cells/孔。
将六孔板于37℃孵育24h后利用显微镜观察细胞状态。细胞汇合度达到80％左右即可进行mRNA转染。
按照lipofectamine3000试剂盒的说明，将相应mRNA(SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8)转染到293细胞中(转染2μg的mRNA/孔)，并于37℃分别继续培养12h、24h、72h。
待mRNA持续表达以上不同时间点后将细胞上清液除去，利用PBS清洗一次，加入0.5ml胰蛋白酶消化细胞，并用0.5ml含有10％FBS的DMEM培养基中和胰酶。
将细胞悬浮液移入1.5ml离心管中，1,200rpm离心5min，弃去上清液，加入含有2％FBS的PBS溶液稀释的抗狂犬病毒抗体(RV1C5)(1:100稀释)100μL重悬细胞，使用vortex混悬仪混匀，并于4℃冰上孵育30min。
加入1ml含有2％FBS的PBS溶液重悬细胞，1,200rpm离心5min，弃去上清液，加入含有2％FBS的PBS溶液稀释的FITC荧光标记羊抗鼠二抗(1:100稀释)100μL重悬细胞，使用vortex混悬仪混匀，并于4℃冰上避光孵育30min。
加入1ml的含有2％FBS的PBS溶液，1,200rpm离心5min，弃去上清液，加入0.5ml含有2％FBS的PBS重悬细胞。按照1:1000加入1mg/mL DAPI，充分混匀。
流式细胞检测：将没有转染mRNA的细胞设为阴性对照组，利用流式细胞仪检测阴性对照细胞并在点状图上圈出目的细胞信号，利用直方图读取PE荧光信号，并调整检测器灵敏度及电压在直方图上确定阳性细胞荧光信号的范围，以此圈门。
依次检测各样本记录阳性细胞百分比，每个样本读取1×104个信号。
结果如图1所示，三个RABV病毒G抗原mRNA转染细胞后，不同时间点细胞均可结合G蛋白抗体，尤其是在12h，提高GC含量或密码子优化可优化抗原表达，提高抗原-抗体结合信号。
实施例3间接免疫荧光IFA法检测G蛋白抗原
铺293细胞至96孔板，待细胞长满单层70％-90％左右，将编码G蛋白全长的mRNA(包含如SEQ ID NO:6-8)所示序列)转染细胞，不转染的细胞作为阴性对照。转染24h后收获细胞，加入80％丙酮固定液，-20℃固定20min，弃去固定液晾干，获得细胞板，进行IFA实验。
将固定好的细胞板，加入5％脱脂奶封闭30min，弃去脱脂奶，PBS洗涤3次，10min/次。
室温加入抗狂犬病毒G蛋白单克隆抗体作为一抗孵育1h，PBS洗涤3次，10min/次。
加入二抗A546驴抗鼠二抗，室温孵育1h；去除二抗，PBS洗涤3次，10min/次，完毕后置于荧光显微镜下观察结果并拍照。
结果如图2所示，三个RABV病毒G抗原mRNA转染细胞后，细胞内均可检测出mRNA荧光信号，相比于gcH+opt mRNA序列，gcH和opt mRNA在体内的荧光信号更强，表明其表达水平更高。
实施例4 FAVN检测不同RABV G抗原mRNA制剂免疫动物后的血清中和抗体
选用SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22所示序列的mRNA进行小鼠免疫实验，疫苗递送系统配方为：mRNA的含量1mg，可电离阳离子脂质ALC0315 14.00mg，DSPC 2.93mg，胆固醇6.52mg和PEG改性脂质ALC0159 1.55mg。制备成的mRNA-LNP(Lipid nanoparticles))即可用于小鼠给药实验，其中RABV G mRNA(opt)mRNA试验组分为5组，分别为1.25μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg等双剂量组、另外还设RABV G mRNA(opt)、RABV G mRNA(gcH_nonopt)和RABVG mRNA(gcH_global_opt)均为10μg单剂量组，同时设生理盐水对照组。每组小鼠3只，按照指示剂量进行给药。按照D1和D15两次给药，于D36天采集血清进行中和抗体测定，血清狂犬病中和抗体水平检测采用狂犬病荧光抗体病毒中和试验法(FAVN)。检测基本步骤参照相关SOP进行：(1)对待检血清按31,32,33,...312进行稀释；(2)加入100TCID50的CVS-11感作一定时间；(3)加入BHK-21细胞，培养48h；(4)丙酮固定后，加荧光标记抗体染色，荧光显微镜下读取结果。以100TCID50 CVS-11的复制完全被抑制(即没有一个荧光细胞)作为最终抑制效价判定结果。结果如图3所示，RABV G mRNA(opt)没有明显的剂量依赖效应，但都能诱导大量病毒中和抗体的产生(WHO规定超过狂犬病中和抗体滴度超过0.5IU/mL就能提供保护)，三个单剂量组均能产生显著的中和抗体，单个高GC含量和单个密码子优化相比于高GC+密码子优化产生的抗体滴度更高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.包含编码RABV病毒G抗原的核酸分子，其中所述编码区包含一个或多个开放阅读框(ORF)，且其中至少一个ORF编码序列如SEQ ID NO:1所示的RABV病毒G抗原，但其核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％,至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于：所述的包含编码RABV病毒G抗原的核酸分子，其序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5所示。
3.包含编码RABV病毒G抗原的mRNA核酸分子，其序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示。
4.mRNA核酸分子，其包括：
(i)5’非翻译区(5’-UTR)；
(ii)CDS，其中CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，其包括如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(iii)3’非翻译区(3’-UTR)。
5.一种mRNA核酸分子，所述的mRNA分子包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)，其中CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，核苷酸序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示。
6.一种mRNA分子，所述的mRNA包括如下元件：5’-帽结构、5’-UTR、CDS、3’-UTR和3’-聚腺苷酸序列(polyA)；
其中，所述的5’-帽结构可任选地选自m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G等；
其中，所述的5’-UTR包含如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:11所示的序列；
其中，所述的CDS包含开放阅读框(ORF),其编码能够诱导免疫应答的RABV病毒G抗原，RABV病毒G抗原的序列如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8所示；
其中，所述的3’-UTR包括如SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
其中，所述的3’-聚腺苷酸序列(polyA)任选地具有80至180个腺苷酸的长度。
7.根据权利要求3-6任一项所述的mRNA核酸分子，其特征在于：所述的mRNA核酸分子还包含一种或多种选自假尿苷(ψ)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基胞嘧啶(m5C)的功能性核苷酸类似物修饰。
8.用于诱导受试者对RABV病毒G抗原产生中和抗体反应的药物组合物，包含如权利要求3-7任一项所述的mRNA核酸分子以及药学上可接受的载体。
9.包含mRNA的药物组合物，其包含如下的组分：
(1)序列如SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:25任一项或其组合的mRNA分子；
(2)20-60％摩尔比的可电离阳离子脂质(ionizable lipids)；
(3)5-25％摩尔比的非阳离子脂质；
(4)25-55％摩尔比的甾醇；和
(5)0.5-15％摩尔比的PEG改性脂质。
10.根据权利要求3-7任一项所述的mRNA核酸分子或8所述的药物组合物在制备治疗或预防狂犬病毒感染的药物或疫苗中的用途。
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