CN113842454A - 一种基于vsv载体的htnv疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疫苗制备技术领域，具体公开了一种基于VSV载体的HTNV疫苗及其制备方法和应用，通过将HTNV包膜糖蛋白的核苷酸序列插入到重组VSV载体质粒上构建重组质粒后，再进行包装、加工获得的具有免疫原性的HTNV重组VSV疫苗。本发明制备的HTNV疫苗为肾综合征出血热的防治提供新型候选疫苗。

Description

一种基于VSV载体的HTNV疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种基于VSV载体的HTNV疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)为布尼亚病毒目(Bunyavirales)汉坦病毒科(Hantaviridae)的有包膜、负链RNA病毒，基因组分为三节段S、M、L，分别编码核衣壳蛋白NP，包膜糖蛋白GPC(在细胞内翻译后切割成Gn和Gc)，以及RNA依赖的RNA聚合酶RdRp。HTNV感染造成肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)，临床表现为发热、出血和急性肾功能损害。约90％的HFRS病例发生在欧亚大陆，其中中国是受影响最严重的国家，该病在我国流行范围广、病死率高，危害极为严重。
目前，国内外已经研制出双价肾综合征出血热灭活疫苗(Vero细胞)，其推广使用对HFRS的发生和流行起到了积极作用，但该疫苗仍存在一些不足，主要是诱导中和抗体能力弱，激活细胞免疫能力低，全程需要接种3针，历时一年多，尤其是HFRS高发的农村地区，接种依从性低。因此，急需开发新型高效、单次接种即可获得足够保护效果的新型HFRS疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)载体的HTNV疫苗及其制备方法和应用，制备得到的HTNV疫苗为肾综合征出血热的防治提供新型候选疫苗，单次接种即可获得足够保护效果。
本发明提供了一种基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，具体包括如下步骤：
S1，pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒的构建：
以质粒pUC-opti GPC为模板，设计突变引物opti GPC-F-infu、GPC-R-infu、optiGPC-I532K seg1-R和opti GPC-I532K seg2-F，将532位异亮氨酸(I)点突变为赖氨酸(K)，获得pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒；分别以opti GPC-F-infu、opti GPC-I532K seg1-R；optiGPC-I532K seg2-F、opti GPC-R-infu为引物PCR扩增I532K seg1和I532K seg2，然后与经EcoR I和Kpn I双酶切后的pCAGGS-X-myc载体连接，构建获得单突变质粒pCAGGS-HTNV M(I532K)；所述质粒pUC-opti GPC中opti GPC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2，pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)质粒的构建：
以pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒为模板，设计突变引物opti GPC-S1094Lseg1-R和opti GPC-S1094L seg2-F，将1094位点丝氨酸(S)处点突变为亮氨酸(L)，获得pCAGGS-HTNVM(I532K/S1094L)质粒；分别以opti GPC-F-infu、opti GPC-S1094L seg1-R；opti GPC-S1094L seg2-F、opti GPC-R-infu为引物PCR扩增I532K/S1094L seg1和I532K/S1094Lseg2，然后与经EcoR I和Kpn I双酶切后的pCAGGS-X-myc载体连接，构建获得双突变质粒pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)；
S3，重组质粒rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP的构建：
以pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)质粒为模板，设计引物rVSV-Sph I-M-F和SphI-GPC-C6-R引物，扩增目的片段HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)，然后与经Sph I单酶切后的质粒pVSVΔG-GFP连接，连接产物转化Stbl 3感受态细胞并涂布在氨苄抗性的LB固体培养平板上培养，挑取单克隆菌落，接种于5ml氨苄抗性的2×YT培养液中，30℃恒温摇床中过夜摇菌，菌液小提，获得重组质粒rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP；
S4，rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗的的制备：
BHK-21细胞培养至细胞汇合度约90％时，VV-T7以MOI＝5感染BHK-21 2h，转染rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP质粒及辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-G和pBS-L，制备得到rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗。
进一步地，S1中，所述引物opti GPC-F-infu基因序列如SEQ ID NO.2所示；
所述引物GPC-R-infu基因序列如SEQ ID NO.3所示；
所述引物opti GPC-I532K seg1-R基因序列如SEQ ID NO.4所示；
所述引物opti GPC-I532K seg2-F基因序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，S1中，所述点突变过程为：先扩增得到扩增I532K seg1和I532Kseg2，然后与双酶切后的pCASSG载体连接，构建HTNV GPC单突变体pCAGGS-HTNV M(I532K)，然后将连接产物转化DH5α感受态细菌，菌液小提质粒进行双酶切验证，获得pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒。
进一步地，S1中，I532K seg1和I532K seg2与pCASSG载体连接体系为：pCAGGS载体50ng，I532K seg1 36ng，I532K seg2 32ng，5×In-Fusion Enzyme Premix 0.8μL，加余量ddH2O使得总体积为30μL。
进一步地，S2中，所述opti GPC-S1094L seg1-R引物的基因序列如SEQ ID NO.6所示，所述opti GPC-S1094L seg2-F引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，S3中，所述rVSV-Sph I-M-F引物的基因序列如SEQ ID NO.8所示，所述Sph I-GPC-C6-R引物的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地，S4中，所述rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP质粒和VSV辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L的用量比为5:3:5:8:1。
本发明还提供了由上述制备方法制备得到的HTNV疫苗。
本发明还提供了包含上述HTNV疫苗的疫苗注射剂。
本发明还提供了上述HTNV疫苗、或者疫苗注射剂在制备预防肾综合征出血热药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明中用作疫苗载体的VSV病毒具有以下优势：
(1)VSV为动物病毒，对人感染力低，安全性好；
(2)人群中没有预存抗体，不会因为针对载体的免疫而降低疫苗效用；
(3)基因组小，全长仅11knt，反向遗传学操作容易；
(4)可容纳近6kb的外源基因，且可同时表达一个或多个外源基因，通配性强；
(5)VSV疫苗只需单次接种即可诱导有效的保护作用。
2、本发明对于HTNV M序列改造中：
(1)胞膜糖蛋白(GPC)的密码子优化，获得一条在真核细胞中高水平表达GPC的M基因序列；
(2)HTNV的Gn和Gc在高尔基体中成熟，HTNV GPC上532位点和1094位点的突变以及Gc末端六个氨基酸的截短有助于其在质膜上出胞，进而有利于其包裹进VSV病毒中，提高rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP病毒的包装效率，并提高病毒滴度。
3、本发明制备得到的HTNV疫苗单次接种即可获得足够保护效果，是一种新型、高效的HFRS新型候选疫苗，为预防肾综合征出血热奠定了基础和提供了新的途径。
附图说明
图1为本发明中I532K seg1和I532K seg2的PCR结果；
其中，M表示Marker：DL 2000；1、2表示I532K seg1；3、4表示I532K seg2；
图2为本发明中pCAGGS-M(I532K)质粒酶切鉴定结果；
其中，M表示Marker：DL 5000；1表示pCAGGS-M(I532K)质粒；
图3为本发明中I532K/S1094L seg1的PCR扩增结果；
其中M表示Marker：DL 5000；1表示I532K/S1094L seg1；
图4为本发明中I532K/S1094L seg2的PCR扩增结果；
其中，M表示Marker：DL 2000；1表示I532K/S1094L seg2；
图5为本发明中pCAGGS-M(I532K/S1094L)双酶切鉴定结果；
其中M表示Marker：DL 10000；1表示pCAGGS-M(I532K/S1094L)；
图6为本发明中rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP质粒的PCR鉴定结果；
其中，M表示Marker：DL 10000；1、2表示rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP；
图7为本发明中VSV-GFP和rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP的WesternBlot检测结果；
其中，M表示Marker：245kD；1表示VSV-GFP；2表示rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP；
图8为本发明中TCID50检测rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP和VSV-GFP的滴度；
图9为本发明中FFA检测中和抗体结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明采用如下的技术方案：优化后的HTNV M基因序列全长为3408bp，质粒为pUC-opti GPC。以该质粒为模板，在532和1094氨基酸位点处进行点突变，构建突变质粒pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L),在此基础上，将HTNV M(I532K/S1094L)片段克隆至pVSVΔG-GFP载体中，同时进行M基因的截短，进而构建成rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP，将该质粒与VSV辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L共转染至瞬时表达T7聚合酶的BHK-21细胞中，包装出表达HTNV GPC的重组VSV病毒，该重组病毒应用于疫苗方面，检测其免疫Balb/C后诱导小鼠产生中和抗体的效价。
本发明中用到的产品来源如下：
大肠杆菌DH5α感受态和Stbl 3感受态购自上海唯地生物技术有限公司；pUC-optiGPC质粒由南京金斯瑞公司合成；pCAGGS-X-myc由中国农业科学院惠赠；pVSVΔG-GFP由南京金斯瑞公司合成；pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L、pCAGGS-VSV G质粒均由武汉病毒所惠赠；BHK-21细胞和Vero E6细胞均购自美国模式培养物保藏中心；
HTNV 76-118株病毒由本科室保存；表达T7聚合酶的痘病毒VV-T7由武汉病毒所惠赠；VSV-GFP病毒由本科室制备并保存。
抗体G2-8、3G1和1A8均由本科室制备并保存；抗体VSV G购自英国Abcam公司；抗体IRDye 680RD Goat anti-Mouse购自LI-COR公司；抗体HRP-Goat Anti mouse IgG购自生工生物工程(上海)股份有限公司；本发明使用的限制性内切酶购自TAKARA生物技术有限公司；Q5高保真DNA聚合酶购自NEB公司；5×In-Fusion Enzyme Premix购自TAKARA生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒小提试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；质粒大提试剂盒购自OMEGA公司；DNAmarker、4S RedNucleic Acid Stain、氨苄青霉素、50×TAE、20×TBS和Tween-20均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；LipofectamineTM 2000购自Thermo公司；蛋白marker购自YEASEN公司；4×sampling buffer由GenScript提供；10×loading buffer购自生工生物工程(上海)股份有限公司；BSA购自YEASEN公司；甲醇天津市富宇精细化工有限公司；沉淀型TMB膜底物溶液购自百智生物。
DMEM培养基、opti-MEM培养基购自gibco公司；FBS购自YEASEN公司；DPBS购自CORNING公司；青霉素-链霉素-庆大霉素混合液和胰蛋白酶-EDTA消化液购自Solarbio公司。
实施例1
一种基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，具体过程如下：
1、rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP质粒的构建(Δ表示为该部分基因缺失)：
(1)pCAGGS-HTNV M(I532K)载体的构建
本实验所使用的HTNV M为HTNV 76-118标准株病毒基因序列经南京金斯瑞公司进行密码子优化后合成，得质粒pUC-opti GPC，所述质粒pUC-opti GPC中opti GPC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
然后以pUC-opti GPC质粒为模板，在532和1094氨基酸位点处进行点突变，设计相应的突变引物，具体包括如下引物：
上游引物opti GPC-F-infu(基因序列如SEQ ID NO.2所示)，下游引物GPC-R-infu(基因序列如SEQ ID NO.3所示)，下游引物opti GPC-I532K seg1-R(基因序列如SEQ IDNO.4所示)，上游引物opti GPC-I532K seg2-F(基因序列如SEQ ID NO.5所示)；
SEQ ID NO.2：
CATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGGCATCTGGAAGTGGCTGGTGATGG；
SEQ ID NO.3：
GAGCCTCCACCCCCGGTACCAGACTTCTTGTGCTTCCTCACAGG；
SEQ ID NO.4：CTTCTTCCTCAGCACACACTTCAGGCGGTT；
SEQ ID NO.5：
CTGTGCTGAGGAAGAAGAAGGAGGAGTTCGAGAAGACCAAGGG；
利用Q5 DNA聚合酶PCR扩增I532K seg1和I532K seg2，PCR反应体系如下：模板(pUC-opti GPC)1μL，上游引物opti GPC-F-infu 0.5μL，下游引物opti GPC-I532K seg1-R0.5μL，Q5酶0.25μL，dNTP 0.5μL，5×buffer 5μL，ddH2O17.75μL，此反应体系扩增I532Kseg1；以相同的模板，上游引物opti GPC-I532Kseg2-F，下游引物GPC-R-infu扩增I532Kseg2；下列扩增I532K/S1094L seg1和I532K/S1094L seg2的方式与此相似；
反应条件为：98℃30s，(98℃15s、55℃10s、72℃90s)30个循环，72℃5min，10℃forever；
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳(TAE电泳液)验证，如图1为I532Kseg 1和I532Kseg2的PCR结果图，从图中可观察到与预期大小相符的条带；切胶并利用胶回收试剂盒回收目的条带；
质粒pCAGGS-X-myc用EcoR I和Kpn I进行双酶切，双酶切体系如下：
pCAGGS-X-myc 1μg，EcoR I 1μL，Kpn I 1μL，10×Buffer 3μL，加余量ddH2O使得总体积为30μL；
于37℃水浴酶切2h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确后，切胶并利用胶回收试剂盒回收目的条带；
上述扩增得到的PCR产物与双酶切后的pCASSG载体连接，构建HTNV GPC单突变体pCAGGS-HTNV M(I532K)，连接反应体系为：
pCAGGS载体50ng，I532K seg1 36ng，I532K seg2 32ng，5×In-Fusion EnzymePremix 0.8μL，加余量ddH2O使得总体积为30μL；连接条件为50℃水浴40min。
取5μL连接产物加入到DH5α感受态细菌中，轻柔混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴90s，加入无抗生素的LB培养液1mL，轻柔混匀，置于37℃摇床震荡培养1h，5000g离心3min，取上清200μL重悬沉淀菌体，均匀涂布在氨苄抗性的LB固体培养平板上，将平板倒置于37℃孵箱中过夜培养。从平板中挑取单克隆菌落，接种于5mL含氨苄抗性的2×YT培养液中，37℃恒温摇床中过夜摇菌，菌液小提质粒进行双酶切验证：
重组质粒pCAGGS-HTNV M(I532K)1ng，EcoR I 1μL，Kpn I 1μL，10×Buffer3μL，加余量ddH2O使得总体积为30μL；双酶切条件为37℃水浴3h。
双酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳验证，如图2为pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒的双酶切鉴定结果图，可观察到与预期大小相符合的条带，将相应的重组质粒送生工生物公司进行测序验证，获得pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒。
(2)双突变体pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)载体的构建
以上述构建成功的pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒为模板，设计相关上下游引物，包括基因序列如SEQ ID NO.6所示的opti GPC-S1094L seg1-R引物和基因序列如SEQ IDNO.7所示的opti GPC-S1094L seg2-F引物；然后分别以opti GPC-F-infu、opti GPC-S1094L seg1-R；opti GPC-S1094L seg2-F、opti GPC-R-infu为引物PCR扩增I532K/S1094Lseg1、I532K/S1094L seg2，具体的PCR反应体系及反应条件参考上述方法。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证(如图3、图4所示)，切胶并回收目的条带I532K/S1094L seg1和I532K/S1094L seg2。回收后的目的条带与经EcoR I和Kpn I双酶切后的pCAGGS-X-myc载体连接，构建获得双突变体pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)，连接反应及后续的转化实验如前已述，pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)质粒双酶切鉴定结果，如图5所示，可观察到与预期大小相符的条带，初步表明该质粒构建成功，送生工生物工程有限公司测序进一步表明该质粒构建成功，保存待用。
SEQ ID NO.6：GAGCTTCACGAACCAGCACTTGATACCGCACTG；
SEQ ID NO.7：
GCTGGTTCGTGAAGCTCGGCGAGTGGATCTCCGGTATCTTCTCT。
(3)重组质粒rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP的构建
以上述构建成功的双突变体质粒pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)为模板，设计基因序列如SEQ ID NO.8所示的rVSV-Sph I-M-F引物和基因序列如SEQ ID NO.9所示的SphI-GPC-C6-R引物；
SEQ ID NO.8：CTTAGCCTTTTTATGCATGCATGGGCATCTGGAAGTGGC；
SEQ ID NO.9：
CTATGTCGTACCGCATGCTTACACAGGGCACAGGATGGAC；
扩增目的片段HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)，并回收，质粒pVSVΔG-GFP(南京金斯瑞生物公司合成)经Sph I进行单酶切，酶切体系为：pVSVΔG-GFP1ng，Sph I 1μL，10×Buffer 3μL，加余量的ddH2O至总体积为30μL，酶切条件为37℃水浴3h，酶切产物经0.6％琼脂糖凝胶电泳验证并回收载体；
将回收的目的片段HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)和载体pVSVΔG-GFP进行连接，连接反应体系为：pVSVΔG-GFP载体50ng，HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)36ng，5×In-FusionEnzyme Premix 0.8μL，加余量ddH2O使得总体积为30μL；连接条件为50℃水浴40min，连接产物转化Stbl 3感受态细胞并涂布在氨苄抗性的LB固体培养平板上，平板置于室温下长单克隆。从平板中挑取单克隆菌落，接种于5ml氨苄抗性的2×YT培养液中，30℃恒温摇床中过夜摇菌，菌液小提，获得重组质粒rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP并PCR鉴定，0.6％琼脂糖凝胶电泳验证，如图6所示为rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP质粒的PCR鉴定图，表明该质粒构建成功，进一步将该质粒送生工生物工程进行测序分析，正确的质粒保存，该质粒将直接应用于下述rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗的制备；
2、rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗的的制备：
BHK-21细胞接种于六孔板，过夜培养至细胞汇合度约90％时，VV-T7(稳定表达T7聚合酶的痘病毒)以MOI＝5感染BHK-21 2h，转染rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP质粒及辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L，比例为5:3:5:8:1，用量为1.25μg、0.75μg、1.25μg、2μg、0.25μg，全部加入含500μL opti-MEM培养液的EP管中，记为A管，将11μL的转染试剂Lipofectamine2000加入另一个含500μLopti MEM培养液的EP管中，记为B管。分别室温孵育5min，然后将B管中的液体转移至A管中，混匀后室温孵育20min，获得质粒-转染试剂混合液。六孔板吸弃VV-T7，加入质粒-转染试剂混合液，6h后换液为10％FBS的DMEM，24h后观察GFP表达情况，48h后细胞有明显病变，收获上清，5000×g离心4min去除细胞碎片，用0.1μm的滤器过滤除去痘病毒后于-80℃冰箱保存备用。BHK-21细胞再次接种六孔板，过夜生长后转染质粒pCAGGS-VSV G 2μg/孔，6h后换液为10％FBS的DMEM，24h后将-80℃冰箱保存的滤液直接感染已转染pCAGGS-VSV G的BHK-21细胞，2h后换液，持续观察GFP的表达，如果观察到GFP的表达，则初步证明rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗制备成功，收获的上清于-80℃冰箱保存备用。
3、rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗的鉴定：
(1)Western Blot检测rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP和VSV-GFP病毒(表达绿色荧光蛋白GFP的VSV病毒，由本科室制备并保存，在疫苗鉴定过程中作对照使用，后期免疫中作载体对照)
rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP病毒和VSV-GFP病毒分别在Vero E6细胞中大量扩增后，收获细胞上清液中的病毒颗粒，分别取15μLrVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP和VSV-GFP病毒，加5μL4×sampling buffer，沸水浴10min使病毒蛋白变性，经10％SDS-PAGE分离目的条带，电压120V，2h。进行转膜，电流0.25A，90min。转好的PVDF膜用3％BSA室温封闭30min，水平摇床缓慢封闭。封闭好的膜孵育一抗G2-8(针对rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP中HTNV Gc蛋白)或者VSV G(针对VSV-GFP中的VSV G蛋白)，4℃过夜孵育。WB膜用TBST洗3次，10min/次，水平摇床快速洗涤。洗好的膜孵育二抗IRDye 680RD Goat anti-Mouse，室温1h。WB膜用TBST洗3次，10min/次，水平摇床快速洗涤。Odyssey上机扫膜。
对照组设为VSV-GFP病毒，结果如图7所示，通过糖蛋白HTNV Gc和VSV G的单克隆抗体，能检测到rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP中的Gc蛋白，同时VSV G的单克隆抗体可以检测到VSV-GFP病毒中的VSV G蛋白。
(2)TCID50检测rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP和VSV-GFP的滴度
VSV-GFP和rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP病毒均以MOI＝0.0001感染Vero E6细胞，分别在0h、3h、6h、12h、24h、48h收获细胞上清，并于-80℃保存。Vero E6接种于96孔板中过夜培养，待细胞汇合度大于90％时，上述收获的细胞上清分别10倍梯度稀释并感染Vero E6，每个稀释度设4个复孔，置于37℃孵箱感染2h，期间每隔15min轻轻晃动培养板，使病毒充分感染细胞，2h后吸弃病毒液，加入甲基纤维素覆盖液，继续培养，一周后用PBS洗去覆盖液，加结晶紫染液，室温染色30min，洗去结晶紫并晾干培养板，观察并记录96孔板中斑点数，利用Reed-Munch方法计算VSV-GFP和rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP的TCID50值。
结果如图8所示，对照组设为VSV-GFP病毒，结果显示，与VSV相比，插入HTNV密码子优化的包膜糖蛋白后，rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP病毒滴度明显下降。
4、免疫接种rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP可诱导出较强的特定中和反应
为了评估rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP在Balb/C小鼠中的免疫原性，腹腔注射单剂量的实验组rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP或载体对照组VSV-GFP以及HFRS灭活疫苗，免疫接种35天后，取小鼠免疫后血清通过斑点形成试验(FocusForming Assays，FFA)对中和抗体进行量化测定，具体实验剂量如表1所示。
表1小鼠中的免疫原性接种剂量
Figure BDA0003290196970000131
FFA检测rVSV-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP免疫Balb/C小鼠的中和抗体：
Vero E6接种于96孔板中过夜生长，待细胞汇合度大于90％，取小鼠免疫后的血清按1:10、1:20、1:40、1:80、1:160稀释至200μL，分别与等体积的100FFU HTNV混合，混匀后于37℃细胞培养箱中孵育1h，期间每隔15min再次混匀，使病毒与血清充分接触，96孔板弃去培养基，将病毒血清混合液按100μL/孔加入96孔板中，每个稀释度设4个复孔，同时设置阳性对照，即相同稀释倍数的抗体3G1与HTNV混合液感染细胞，此外设置HTNV感染孔。病毒血清混合液感染细胞2h，期间每隔15min轻轻晃动平板，使病毒充分感染细胞，2h后，弃去液体，覆盖液按100μL/孔加入96孔板中，将细胞培养板放于37℃，5％CO2的孵箱中培养5天。用DPBS洗去覆盖液，加4％的多聚甲醛固定细胞，室温固定30min后，弃去固定液，加0.5％Triton X-100，室温破膜15min，1A8抗体用3％FBS的DPBS稀释好后加入96孔板中，4℃过夜孵育，弃去1A8，DPBS将细胞漂洗两次，3％FBS的DPBS稀释二抗HRP-Goat Anti mouse IgG，并加入96孔板中，室温孵育1h，弃去二抗，DPBS将细胞漂洗两次，每孔加100μL沉淀型TMB膜底物溶液(百智生物)，避光室温显色15-30min，每孔加100μL DPBS终止显色，板底可见深色斑点，观察斑点并计数，利用斑点减少法计算血清的中和效价。
FFA检测中和抗体滴度结果如图9所示，与载体对照组VSV-GFP相比，rVSVΔG-HTNVM(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗诱导Balb/C小鼠产生较高的中和抗体滴度；同时rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗诱导产生的中和抗体滴度高于HFRS灭活疫苗。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 中国人民解放军空军军医大学
<120> 一种基于VSV载体的HTNV疫苗及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3408
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgggcatct ggaagtggct ggtgatggct tccctggtgt ggcctgtgct gaccctgaga 60
aacgtgtacg acatgaagat cgaatgccca cacaccgtga gcttcggcga aaactccgtg 120
atcggatacg tggagctgcc acctgtgccc ctggctgaca ccgctcagat ggtgcctgag 180
agctcctgca acatggacaa ccaccagagc ctgaacacca tcaccaagta cacccaggtg 240
tcttggcgtg gaaaggccga ccagagccag tctagccaga actctttcga gaccgtgagc 300
accgaagtgg acctgaaggg cacctgcgtg ctgaagcaca agatggtgga ggaaagctac 360
cgctccagga agtctgtgac ctgctacgac ctgagctgca actccaccta ctgcaagcca 420
accctgtaca tgatcgtgcc catccacgct tgcaacatga tgaagtcctg cctgatcgcc 480
ctgggccctt acagagtgca ggtggtgtac gaacgttctt actgcatgac cggagtgctg 540
atcgagggaa agtgcttcgt gccagaccag tctgtcgtga gcatcatcaa gcacggtatc 600
ttcgacatcg cttccgtgca catcgtgtgc ttcttcgtgg ccgtgaaggg caacacctac 660
aagatcttcg agcaggtgaa gaagtccttc gaatctacct gcaacgacac cgagaacaag 720
gtgcagggat actacatctg catcgtgggc ggaaacagcg ctcccatcta cgtgcctacc 780
ctggacgact tccgcagcat ggaagccttc accggcatct tcaggtcccc acacggagag 840
gaccacgacc tggctggaga ggaaatcgcc agctactcca tcgtgggccc tgctaacgcc 900
aaggtgccac acagcgcttc ctctgacacc ctgtccctga tcgcctacag cggaatccct 960
tcctacagct ccctgtccat cctgacctct agcaccgaag ctaagcacgt gttctctcca 1020
ggcctgttcc ccaagctgaa ccacaccaac tgcgacaagt ccgctatccc actgatctgg 1080
accggtatga tcgacctgcc tggctactac gaggccgtgc acccatgcac cgtgttctgc 1140
gtgctgtccg gccccggagc ttcttgcgag gccttcagcg aaggtggcat cttcaacatc 1200
acctctccta tgtgcctcgt gagcaagcag aacagattcc gtctgaccga gcagcaggtg 1260
aacttcgtgt gccagcgcgt ggacatggac atcgtggtgt actgcaacgg ccagaggaag 1320
gtgatcctga ccaagaccct ggtgatcgga cagtgcatct acaccatcac cagcctgttc 1380
tccctgctgc caggagtggc tcactccatc gctgtggagc tgtgcgtgcc cggattccac 1440
ggttgggcta ccgctgctct gctggtgacc ttctgcttcg gttgggtgct gatccctgct 1500
atcaccttca tcatcctgac cgtgctgaag ttcatcgcca acatcttcca cacctccaac 1560
caggaaaacc gcctgaagtc tgtgctgagg aagatcaagg aggagttcga gaagaccaag 1620
ggaagcatgg tgtgcgacgt gtgcaagtac gagtgcgaaa cctacaagga gctgaaggct 1680
cacggtgtgt cttgccccca gagccagtgc ccttactgct tcacccactg cgagccaacc 1740
gaagccgctt tccaggccca ctacaaggtg tgccaggtga cccaccgctt cagggacgac 1800
ctgaagaaga ccgtgacccc acagaacttc acccccggct gctacagaac cctgaacctg 1860
ttcagataca agtctcgttg ctacatcttc accatgtgga tcttcctgct ggtgctggaa 1920
agcatcctgt gggccgcttc tgctagcgag accccactga cccccgtgtg gaacgacaac 1980
gctcacggtg tgggcagcgt gccaatgcac accgacctgg aactggactt ctccctgacc 2040
tcctctagca agtacaccta ccgcaggaag ctgaccaacc ccctggagga agctcagtct 2100
atcgacctgc acatcgagat cgaggaacag accatcggag tggacgtgca cgctctgggt 2160
cactggttcg acggacgcct gaacctgaag accagcttcc actgctacgg tgcttgcacc 2220
aagtacgagt acccctggca caccgccaag tgccactacg agagggacta ccagtacgaa 2280
acctcctggg gctgcaaccc ttctgactgc ccaggagtgg gcaccggttg caccgcttgc 2340
ggactgtacc tggaccagct gaagcctgtg ggttctgcct acaagatcat caccatcaga 2400
tacagcagac gtgtgtgcgt gcagttcggc gaggaaaacc tgtgcaagat catcgacatg 2460
aacgactgct tcgtgtcccg tcacgtgaag gtgtgcatca tcggaaccgt gtctaagttc 2520
agccagggcg acaccctgct gttcttcgga ccactggagg gaggtggcct gatcttcaag 2580
cactggtgca cctctacctg ccagttcggc gaccccggag acatcatgag ccctagagac 2640
aagggcttcc tgtgccctga gttccccggc agcttccgta agaagtgcaa cttcgctacc 2700
acccccatct gcgagtacga cggtaacatg gtcagcggct acaagaaggt gatggccacc 2760
atcgactcct tccagtcttt caacacctcc accatgcact tcaccgacga gagaatcgaa 2820
tggaaggacc ccgacggcat gctgcgtgac cacatcaaca tcctggtgac caaggacatc 2880
gacttcgaca acctgggtga aaacccttgc aagatcggcc tgcagacctc ctctatcgag 2940
ggagcttggg gcagcggtgt gggcttcacc ctgacctgcc tggtgtccct gaccgaatgc 3000
cccaccttcc tgacctctat caaggcttgc gacaaggcca tctgctacgg tgctgagagc 3060
gtgaccctga cccgcggcca gaacaccgtg aaggtgtccg gaaagggagg tcactccggt 3120
tctaccttca ggtgctgcca cggagaagac tgcagccaga tcggtctgca cgctgctgct 3180
ccacacctgg acaaggtgaa cggtatctcc gagatcgaaa actctaaggt gtacgacgac 3240
ggagcccccc agtgcggtat caagtgctgg ttcgtgaagt ccggcgagtg gatctccggt 3300
atcttctctg gcaactggat cgtgctgatc gtgctgtgcg tgttcctgct gttcagcctg 3360
gtgctgctgt ccatcctgtg ccctgtgagg aagcacaaga agtcttaa 3408
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cattttggca aagaattcgc caccatgggc atctggaagt ggctggtgat gg 52
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gagcctccac ccccggtacc agacttcttg tgcttcctca cagg 44
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cttcttcctc agcacacact tcaggcggtt 30
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctgtgctgag gaagaagaag gaggagttcg agaagaccaa ggg 43
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gagcttcacg aaccagcact tgataccgca ctg 33
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gctggttcgt gaagctcggc gagtggatct ccggtatctt ctct 44
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
cttagccttt ttatgcatgc atgggcatct ggaagtggc 39
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ctatgtcgta ccgcatgctt acacagggca caggatggac 40

Claims (10)

1.一种基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒的构建：
以质粒pUC-opti GPC为模板，设计突变引物opti GPC-F-infu、GPC-R-infu、opti GPC-I532K seg1-R和opti GPC-I532K seg2-F，将532位异亮氨酸点突变为赖氨酸，获得pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒；分别以opti GPC-F-infu、opti GPC-I532K seg1-R；opti GPC-I532Kseg2-F、opti GPC-R-infu为引物PCR扩增I532K seg1和I532K seg2，然后与经EcoR I和KpnI双酶切后的pCAGGS-X-myc载体连接，构建获得单突变质粒pCAGGS-HTNV M(I532K)；
所述质粒pUC-opti GPC中opti GPC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2，pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)质粒的构建：
以pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒为模板，设计opti GPC-S1094L seg1-R引物和optiGPC-S1094L seg2-F引物，将1094位点丝氨酸处点突变为亮氨酸，获得pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)质粒；分别以opti GPC-F-infu、opti GPC-S1094L seg1-R；opti GPC-S1094L seg2-F、opti GPC-R-infu为引物PCR扩增I532K/S1094L seg1和I532K/S1094Lseg2，然后与经EcoR I和Kpn I双酶切后的pCAGGS-X-myc载体连接，构建获得双突变质粒pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)；
S3，重组质粒rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP的构建：
以pCAGGS-HTNV M(I532K/S1094L)质粒为模板，设计引物rVSV-Sph I-M-F和Sph I-GPC-C6-R引物，扩增目的片段HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)，然后与经Sph I单酶切后的质粒pVSVΔG-GFP连接，连接产物转化Stbl 3感受态细胞，培养提取质粒，获得重组质粒rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP；
S4，rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗的的制备：
BHK-21细胞培养至细胞汇合度约90％时，VV-T7以MOI＝5感染BHK-21 2h，转染rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP质粒及辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-G和pBS-L，制备得到rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP疫苗。
2.根据权利要求1所述的基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，其特征在于，S1中，所述引物opti GPC-F-infu基因序列如SEQ ID NO.2所示；
所述引物GPC-R-infu基因序列如SEQ ID NO.3所示；
所述引物opti GPC-I532K seg1-R基因序列如SEQ ID NO.4所示；
所述引物opti GPC-I532K seg2-F基因序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求2所述的基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，其特征在于，S1中，所述点突变过程为：先扩增得到扩增I532K seg1和I532K seg2，然后与双酶切后的pCASSG载体连接，构建HTNV GPC单突变体pCAGGS-HTNV M(I532K)，然后将连接产物转化DH5α感受态细菌，，双酶切验证，获得pCAGGS-HTNV M(I532K)质粒。
4.根据权利要求3所述的基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，其特征在于，S1中，I532K seg1和I532K seg2与pCASSG载体连接体系为：pCAGGS载体50ng，I532K seg1 36ng，I532K seg2 32ng，5×In-Fusion Enzyme Premix 0.8μL，加余量ddH2O使得总体积为30μL。
5.根据权利要求4所述的基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，其特征在于，S2中，所述opti GPC-S1094L seg1-R引物的基因序列如SEQ ID NO.6所示，所述opti GPC-S1094Lseg2-F引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
6.根据权利要求5所述的基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，其特征在于，S3中，所述rVSV-Sph I-M-F引物的基因序列如SEQ ID NO.8所示，所述Sph I-GPC-C6-R引物的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
7.根据权利要求6所述的基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法，其特征在于，S4中，所述rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP质粒和VSV辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L的用量比为5:3:5:8:1。
8.一种由权利要求7所述的基于VSV载体的HTNV疫苗的制备方法制备得到的HTNV疫苗。
9.一种包含权利要求8所述的HTNV疫苗的疫苗注射剂。
10.一种权利要求8所述的HTNV疫苗、或权利要求9所述的疫苗注射剂在制备预防肾综合征出血热药物中的应用。
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