CN115976078B

CN115976078B - 一种广谱的腺病毒载体新冠疫苗

Info

Publication number: CN115976078B
Application number: CN202211724517.6A
Authority: CN
Inventors: 陈凌; 杨臣臣; 汪乾; 利恒春; 关素华
Original assignee: Guangzhou N Biomed Ltd
Current assignee: Guangzhou N Biomed Ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115976078A

Abstract

本发明属于病毒免疫学技术领域，公开了一种广谱的腺病毒载体新冠疫苗。将不同突变株的S/RBD抗原进行组合，其免疫机体后产生针对原始株、Beta株、Delta株，OmicronBA1株、OmicronBA2株、OmicronBA2.12.1、OmicronBA4/5株的中和抗体，抵御这些突变株的侵染，实现广谱的抗新冠感染效益。

Description

一种广谱的腺病毒载体新冠疫苗

技术领域

本发明属于病毒免疫学技术领域，具体涉及一种广谱的腺病毒载体新冠疫苗。

背景技术

自2019年SARS-CoV-2大流行开始已经有两年多的时间，疫苗接种最大限度地减少了感染和相关发病率和死亡率。在大流行开始后不到12个月的时间里，许多研究团队迎难而上，在原始毒株的基础上开发了COVID-19疫苗。然而，SARS-CoV-2是一种快速变异的RNA病毒，到目前为止已经产生了Beta、Delta和现在的多种Omicron变体，它们对现有的免疫屏障构成巨大威胁。2021年开始Omicron突变株成为主要流行株，随着Omicron突变株大流行，相继又产生了许多Omicron突变株的变体，如BA.1、BA.2、BA.12.1、BA.4、BA. 4/5，所有这些亚系均都含有多个点突变，具有强烈的免疫逃逸和加速传播的能力。现有疫苗主要是针对原始株的新冠疫苗，其对Omicron变异体的预防效果从80%降到了30%以下。因此，迫切需要开发一种更为广谱的新冠疫苗建立一个更为坚固的免疫屏障，以有效预防Omicron亚系和其他VOCs的感染。

人类腺病毒血清型5（Ad5）是一种与疾病无关的呼吸道病毒，绝大多数人都在不知情的情况下被他感染，无复制能力的Ad5可以作为一种理想的载体，在本发明中我们构建了多个Ad5载体的多价新冠疫苗，其免疫机体后产生针对原始株、Beta株、Delta株，OmicronBA1株、OmicronBA2株、OmicronBA2.12.1、OmicronBA4/5株的中和抗体，抵御这些突变株的侵染，实现广谱的抗新冠感染效益。

目前上市疫苗为SARS-COV-2原始株疫苗，其对Omicron不同变体突变株的保护效果均下降严重，不能做到免疫后对奥密克戎株产生十分理想的免疫效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了基于腺病毒载体的多价新冠疫苗，其免疫机体后产生针对原始株、Beta株、Delta株，OmicronBA1株、OmicronBA2株、OmicronBA2.12.1、OmicronBA4/5株的中和抗体，抵御这些突变株的侵染，实现广谱的抗新冠感染效益。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含选自a)中的至少一种核酸序列，以及选自b）的至少一种核酸序列：

a) SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和/或 SEQ ID NO: 4所示核酸序列或其同源序列；

b) SEQ ID NO: 2所示核酸序列或其同源序列，和/或 SEQ ID NO: 3所示核酸序列或其同源序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子包含选自a)中的一种核酸序列，以及选自b）的一种核酸序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子包括SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 2所示核酸序列或其同源序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子包括SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 3所示核酸序列或其同源序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子包括SEQ ID NO: 4所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 2所示核酸序列或其同源序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子包括SEQ ID NO: 4所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 3所示核酸序列或其同源序列。

在一些实施方式中，所述某序列的同源序列是指与某序列同源性在90%、91%、92%、93%、94%、95％、96％、97％、98％、或99％以上的序列。

在一些实施方式中，选自a)中的至少一种核酸序列，以及选自b）的至少一种核酸序列直接相连。

在一些实施方式中，选自a)中的至少一种核酸序列，以及选自b）的至少一种核酸序列通过连接子相连。

在一些实施方式中，所述连接子包括但不限于常规连接子和高效自剪切肽。

在一些实施方式中，所述常规连接子包括但不限于IRES，以及本领域常用的其他连接子。

在一些实施方式中，所述高效自剪切肽选自P2A (porcine teschovirus-1 2A)、F2A (foot-and-mouth disease virus)、E2A (equine rhinitis A virus)、和 T2A(thosea asigna virus 2A)的至少一种。

在一些实施方式中，选自a)中的至少一种核酸序列，和/或选自b）的至少一种核酸序列在5’端添加信号肽序列。

在一些实施方式中，当选自a)中的至少一种核酸序列，和选自b）的至少一种核酸序列直接相连或通过常规连接子相连时，至少在所述核酸序列中位于5’ 端的核酸序列的5’端添加信号肽序列。

在一些实施方式中，当选自a)中的至少一种核酸序列，和选自b）的至少一种核酸序列直接相连或通过常规连接子相连时，仅在所述核酸序列中位于5’ 端的核酸序列的5’端添加信号肽序列。

在一些实施方式中，当选自a)中的至少一种核酸序列，和选自b）的至少一种核酸序列直接相连或通过常规连接子相连时，在选自a)中的至少一种核酸序列，和选自b）的至少一种核酸序列的5’端均添加信号肽序列。

在一些实施方式中，当采用高效自剪切肽进行连接时，选自a)中的至少一种核酸序列，和选自b）的至少一种核酸序列在其5’端添加均添加信号肽序列。

在一些实施方式中，信号肽序列包括但不限于IgG蛋白的分泌信号肽、组织型纤溶酶原激活因子信号肽TPA、CD33蛋白信号肽。所述信号肽序列的来源包括但不限于人、大鼠、小鼠、猴、鸡、狗、猪、羊、牛、兔、马。

在一些实施方式中，选自a)中的至少一种核酸序列，以及选自b）的至少一种核酸序列的连接顺序是：选自a)中的至少一种核酸序列位于选自b）的至少一种核酸序列的5’端；或者选自b)中的至少一种核酸序列位于选自a）的至少一种核酸序列的5’ 端。

在一些实施方式中，选自a)中的至少一种核酸序列，连接子，以及选自b）的至少一种核酸序列连接顺序是：选自a)中的至少一种核酸序列位于连接子的5’ 端，选自b）的至少一种核酸序列位于连接子的3’ 端；或者选自b)中的至少一种核酸序列位于连接子的5’端，选自a）的至少一种核酸序列位于连接子的3’ 端。

在一些实施方式中，所述核酸分子可在人源细胞或人体内表达蛋白。

在一些实施方式中，所述蛋白可在人体内：

诱导免疫应答；或

产生生物报告分子；或

产生用于检测的分子；或

能调节基因功能；或

成为治疗性分子。

在一些实施方式中，所述诱导免疫应答包括抗体与细胞介导的免疫应答。

在一些实施方式中，所述核酸分子或其表达的多肽用于预防和/或治疗SARS-CoV-2引发的感染。

本发明的第二个方面，在本发明第一方面的基础上，进一步提供一种核酸分子，其中，所述a) 进一步为：SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，SEQ ID NO: 4所示核酸序列或其同源序列，和/或 SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列；所述b) 进一步为：SEQ ID NO: 2所示核酸序列或其同源序列，SEQ ID NO: 3所示核酸序列或其同源序列，SEQID NO: 8所示核酸序列或其同源序列，和/或 SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列。

在一些实施方式中，当所述选自a)中的至少一种核酸序列，以及选自b）的至少一种核酸序列通过高效自剪切肽连接时，所述a)为SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和/或 SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列；所述b)为SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列，和/或 SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ IDNO: 10所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列。

在一些实施方式中，当选自a)中的至少一种核酸序列以及选自b）的至少一种核酸序列直接相连或通过常规连接子相连时，且选自a)中的至少一种核酸序列位于选自b)中的至少一种核酸序列的5’ 端时，所述a)为SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和/或SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列；所述b)为SEQ ID NO: 2所示核酸序列或其同源序列，SEQ ID NO: 3所示核酸序列或其同源序列，SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列，和/或 SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ IDNO: 1所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 2所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 3所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 2所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列，和SEQ IDNO: 3所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列。

在一些实施方式中，当选自a)中的至少一种核酸序列以及选自b）的至少一种核酸序列直接相连或通过常规连接子相连时，且选自b)中的至少一种核酸序列位于选自a)中的至少一种核酸序列的5’ 端时，所述a)为SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列，SEQ IDNO: 4所示核酸序列或其同源序列，和/或SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列；所述b)为SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列，和/或SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列，和SEQ IDNO: 1所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 4所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 8所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 1所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 9所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 4所示核酸序列或其同源序列。优选地，所述核酸分子包含SEQ IDNO: 9所示核酸序列或其同源序列，和SEQ ID NO: 10所示核酸序列或其同源序列。

本发明的第三方面，提供一种表达载体，其特征在于，所述的载体含有本发明第一方面所述的核酸分子。

在一些实施方式中，所述载体为载体为DNA质粒或病毒载体。

在一些实施方式中，所述载体为病毒载体。

在一些实施方式中，所述载体为腺病毒载体。在一些实施方式中，所述腺病毒载体为Ad1载体、Ad2载体、Ad3载体、Ad4载体、Ad5载体、Ad6载体、Ad7载体、Ad8载体、Ad9载体、Ad10载体、Ad11载体、Ad12载体、Ad13载体、Ad14载体、Ad15载体、Ad16载体、Ad17载体、Ad18载体、Ad19载体、Ad20载体、Ad21载体、Ad22载体、Ad23载体、Ad24载体、Ad25载体、Ad26载体、Ad27载体、Ad28载体、Ad29载体、Ad30载体、Ad31载体、Ad32载体、Ad33载体、Ad34载体、Ad35载体、Ad36载体、Ad37载体、Ad38载体、Ad39载体、Ad40载体、Ad41载体、Ad42载体、Ad43载体、Ad44载体、Ad45载体、Ad46载体、Ad47载体、Ad48载体、Ad49载体、Ad50载体、Ad51载体、或Ad52载体中的至少一种。在一些实施方式中，所述载体为Ad5载体。

在一些实施方式中，所述载体为腺病毒空载体，优选为Ad5空载体。

在一些实施方式中，所述载体为复制缺陷型腺病毒载体，优选为复制缺陷型Ad5载体。

在一些实施方式中，所述复制缺陷型腺病毒载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型腺病毒载体，优选为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad5载体。

本发明的第四方面，提供一种表达细胞，其特征在于，所述表达细胞可基于本发明第一方面所述核酸分子表达蛋白。

在一些实施方式中，所述表达细胞是采用本发明第二发明所述表达载体转化或转染的宿主细胞。

在一些实施方式中，所述细胞不包括繁殖材料。

本发明的第五方面，提供一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括本发明第一方面所述核酸分子。

在一些实施方式中，所述疫苗的载体为病毒载体。

在一些实施方式中，所述载体为腺病毒载体。在一些实施方式中，腺病毒载体为前文所述的Ad1-Ad52中至少一种腺病毒载体。在一些实施方式中，所述载体为Ad5载体。

在一些实施方式中，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂和赋形剂中的至少一种。佐剂、载体、稀释剂或赋形剂根据疫苗的具体剂型进行选择。

在一些实施方式中，所述疫苗的剂型包括但不限于注射剂、口服剂、吸入剂等常见的疫苗剂型。

在一些实施方式中，所述疫苗用于预防和/或治疗SARS-CoV-2引发的感染。

在一些实施方式中，所述疫苗还可以与其他用于预防和/或治疗COVID-19的药物联用。

本发明的第六方面，提供一种药物组合物，包含所述疫苗，以及至少一种对COVID-19有预防和/或治疗作用的其他药物。

在一些实施方式中，所述药物组合物用于预防和/或治疗SARS-CoV-2引发的感染。

本发明的第七方面，提供一种本发明第一和第二方面所述核酸分子、第三方面所述表达载体、或第五方面所述疫苗、或第六方面所述药物组合物的应用，所述应用包括：

制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物；

制备COVID-19检测试剂；或

制备基因功能调节剂。

本发明的第八方面，提供，一种预防或治疗SARS-CoV-2株引发的感染的方法，包括给予有需要的受试者有效量或治疗有效量的本发明第五方面所述疫苗或第六方面所述药物组合物。

根据本发明的前述方面，在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2引发的感染包括但不限于原始株、Delta突变株、Alpha突变株、Beta突变株、Gamma突变株、Omicron突变株的一种或多种引发的感染。在一些实施方式中，所述Omicron突变株包括但不限于Omicron BA1突变株、Omicron BA2突变株、Omicron BA2.12.1突变株、Omicron BA2.13突变株、OmicronBA3突变株、Omicron BA4/5突变株（即Omicron BA5突变株）、Omicron BF.7突变株、OmicronBA.2.75突变株、的一种或多种引发的感染。

根据本发明的前述方面，在一些实施方式中，本发明所述SARS-CoV-2原始株的刺突蛋白（Spike protein，S）的氨基酸序列如NCBI登录号YP_009724390.1所示。在一些实施方式中，本发明所述SARS-CoV-2原始株的全基因组序列如NCBI登录号NC_045512.2所示。

根据本发明的前述方面，在一些实施方式中，所述P2A序列包含SEQ ID NO: 5所示序列，或者与其序列同源性在80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列。所述同源性序列具有与SEQ ID NO: 5相同的高效自剪切的功能。

根据本发明的前述方面，在一些实施方式中，所述P2A序列包含：编码SEQ ID NO:6所示序列的核酸序列，或者编码与其SEQ ID NO: 6序列同源性在80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列的核酸序列。所述同源性序列具有与SEQ ID NO: 6相同的高效自剪切的功能。

本发明的有益效果是：

1）奥密克戎突变株其S基因发生至少27个突变之多，现有的疫苗对奥密克戎突变株免疫保护效果极差，极易造成免疫逃逸；而且，SARS-CoV-2奥密克戎株原始的S基因和RBD序列蛋白不能有效在细胞内高效表达，我们采用密码子偏好性进行优化得到新的序列，其能高效在人源细胞内高效表达，产生相应的抗原，诱导产生相应的免疫保护反应。

2）本发明采用腺病毒载体携带两个不同突变株的抗原，其免疫机体后产生针对原始株、Beta株、Delta株、OmicronBA1、OmicronBA2、OmicronBA2.12.1和OmicronBA4/5等多个突变株的中和抗体，可以有效保护机体免受现有不同突变株新冠病毒的侵染。

附图说明

图1是携带双抗原基因的质粒构建的技术流程图。

图2是实施例1-5和对比例的病毒纯化图。

图3是实施例1-5和对比例的WesternBlot检测结果图。

图4是实施例1-5和对比例的中和抗体检测图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。本实施例中所采用的原料，除特殊说明外，均通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。

采用的基因序列

SEQ ID NO.1是密码子优化的Delta株的S基因，去除弗林蛋白酶切割位点，同时增加S2铰链PP突变（文本中命名为S(Delta)），序列如下：

ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGAGCTCCCAGTGTGTGAACCTGAGAACCAGGACACAGCTGCCTCCTGCTTACACCAACTCCTTCACACGGGGCGTCTACTACCCTGACAAGGTCTTCAGGTCCTCTGTGCTGCACTCCACACAAGACCTGTTCCTGCCATTCTTCTCCAACGTGACCTGGTTCCATGCCATCCATGTCTCTGGCACCAATGGCACCAAGAGGTTCGACAACCCTGTGCTGCCATTCAACGACGGCGTCTACTTTGCCTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGGGGCTGGATCTTTGGCACCACCCTGGACTCCAAGACCCAGTCCCTGCTGATTGTGAACAATGCCACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGCGAGTTCCAGTTCTGCAATGACCCATTCCTGGACGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAGTCTGGGGTCTACTCCTCTGCCAACAACTGCACCTTTGAATATGTCTCCCAGCCATTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTCTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACACCCATTAATCTCGTCCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATTGGCATCAACATCACACGCTTTCAGACCCTGCTGGCTCTGCACCGGTCTTACCTGACACCTGGCGACTCCTCCTCTGGCTGGACAGCTGGCGCTGCTGCCTACTATGTCGGCTACCTGCAGCCTAGGACCTTCCTGCTGAAGTACAATGAGAATGGCACCATCACAGATGCTGTGGACTGTGCCCTGGACCCCCTGTCTGAGACCAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACAGTCGAGAAGGGCATCTACCAGACCTCCAACTTCCGGGTGCAGCCCACAGAGTCCATTGTCAGGTTCCCCAACATCACC AACCTGTGCCCATTTGGCGAGGTCTTCAATGCCACACGCTTTGCCTCTGTCTATGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTC CAACTGTGTGGCTGACTACTCTGTGCTGTACAACTCTGCCTCCTTCTCCACATTTAAGTGCTATGGCGTCTCCCCCA CCAAGCTGAATGACCTGTGCTTCACCAATGTCTATGCTGACTCCTTTGTGATCCGGGGCGATGAAGTTAGGCAGATT GCCCCTGGCCAGACAGGCAAGATTGCTGACTACAACTACAAGCTGCCTGATGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTG GAACTCCAACAACCTGGACTCTAAAGTTGGCGGCAACTACAACTACCGGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGA AGCCATTTGAGAGGGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCTGGCTCCAAGCCATGCAATGGCGTGGAGGGCTTCAAC TGCTACTTCCCCCTGCAATCCTATGGCTTCCAACCCACCAATGGCGTGGGCTACCAGCCATACAGGGTGGTGGTGCT GTCCTTTGAGCTGCTGCATGCCCCTGCCACCGTCTGTGGCCCCAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAGAACAAATGTG TGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACAGGCACAGGCGTGCTGACAGAGTCCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAACAGTTTGGCAGGGACATTGCTGACACCACCGATGCTGTCAGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCCATGCTCCTTTGGCGGCGTCTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCTCTAATCAAGTCGCTGTGCTGTACCAGGGCGTGAACTGCACAGAGGTTCCTGTGGCCATCCATGCTGACCAGCTGACCCCCACCTGGAGGGTCTACTCCACCGGCTCCAATGTCTTCCAAACACGGGCTGGCTGCCTGATTGGCGCTGAGCATGTGAACAACTCCTATGAGTGTGACATCCCCATTGGCGCTGGCATCTGTGCCTCCTACCAAACCCAGACCAACTCCCGGGGCAGCGCTAGCTCTGTGGCTTCTCAGTCTATCATTGCCTACACCATGTCCCTGGGCGCTGAGAACTCTGTGGCCTACTCCAACAACTCCATTGCCATCCCCACCAACTTCACCATCTCTGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCTCCATGACCAAGACCTCTGTGGACTGCACCATGTACATCTGTGGCGACTCCACAGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTATGGCTCCTTCTGCACCCAACTGAACAGGGCCCTGACAGGCATTGCTGTGGAGCAGGACAAGAACACCCAGGAGGTCTTTGCCCAAGTCAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGGACTTTGGCGGCTTCAACTTCTCCCAAATCCTGCCTGACCCATCCAAGCCATCCAAGAGGTCCTTCATTGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTTACCCTGGCTGATGCTGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGACTGCCTGGGCGACATTGCTGCCAGGGACCTGATCTGTGCCCAAAAGTTCAATGGCCTGACAGTGCTGCCCCCCCTGCTGACCGATGAGATGATTGCCCAGTACACATCTGCTCTGCTGGCTGGCACAATCACCTCTGGCTGGACCTTTGGCGCTGGCGCTGCCCTGCAAATCCCATTTGCCATGCAAATGGCCTACAGGTTCAATGGCATTGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTATGAGAACCAGAAGCTGATTGCCAACCAGTTCAACTCTGCCATTGGCAAGATCCAGGACTCCCTGTCCTCCACCGCCTCTGCCCTGGGCAAGCTGCAGAATGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGTCCTCCAACTTTGGCGCCATCTCCTCTGTGCTGAATGACATCCTGTCCCGGCTGGACCCTCCCGAGGCTGAGGTGCAGATTGACAGGCTGATCACAGGCAGGCTGCAGTCCCTGCAAACCTATGTGACCCAGCAGCTGATCAGGGCTGCTGAGATCAGGGCCTCTGCCAACCTGGCTGCCACCAAGATGTCTGAATGTGTGCTGGGCCAGTCCAAGAGGGTGGACTTCTGTGGCAAGGGCTACCATCTGATGTCCTTCCCCCAATCTGCCCCCCATGGCGTGGTCTTCCTGCATGTGACCTATGTGCCTGCTCAGGAGAAGAACTTCACCACAGCCCCTGCCATCTGCCATGATGGCAAGGCCCACTTCCCTCGGGAGGGCGTCTTTGTCTCCAATGGCACCCACTGGTTTGTGACCCAGAGGAACTTCTATGAGCCTCAGATCATCACCACAGACAACACCTTTGTCTCTGGCAACTGTGATGTGGTGATTGGCATTGTGAACAACACAGTCTATGACCCCCTGCAGCCTGAGCTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCCCCTGATGTGGACCTGGGCGACATCTCTGGCATCAATGCCTCTGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATTGACAGGCTGAATGAGGTGGCCAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTATATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGACCATCATGCTGTGCTGTATGACAAGCTGCTGTTCCTGCCTGAAGGGCTGCTGTTCTTGTGGCAGCTGCTGTAAGTTTGATGAGGACGATTCCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGCACTACACCTGA

其中，在下划线以及斜体标注的区域设置了突变，分别是将RRAR弗林蛋白酶切割位点突变为GSAS，以及将KV突变为PP。

其中，下划线部分为经过密码子优化的Delta株的RBD序列，命名为RBD（Delta）区域，编号为SEQ ID NO:4，序列如下：

CGGGTGCAGCCCACAGAGTCCATTGTCAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCATTTGGCGAGGTCTTCAATGCCACACGCTTTGCCTCTGTCTATGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGTGTGGCTGACTACTCTGTGCTGTACAACTCTGCCTCCTTCTCCACATTTAAGTGCTATGGCGTCTCCCCCACCAAGCTGAATGACCTGTGCTTCACCAATGTCTATGCTGACTCCTTTGTGATCCGGGGCGATGAAGTTAGGCAGATTGCCCCTGGCCAGACAGGCAAGATTGCTGACTACAACTACAAGCTGCCTGATGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCTAAAGTTGGCGGCAACTACAACTACCGGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCATTTGAGAGGGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCTGGCTCCAAGCCATGCAATGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTATGGCTTCCAACCCACCAATGGCGTGGGCTACCAGCCATACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTTGAGCTGCTGCATGCCCCTGCCACCGTCTGTGGCCCCAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAGAACAAATGTGTGAACTTC

在SEQ ID NO.4 的5 端还可以添加信号肽序列，本发明实施例中选用的示例性的信号肽为人IgG抗体分泌信号肽序列SEQ ID NO.7，序列如下：

ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGCGCT

SEQ ID NO.4 连接信号肽序列之后，得到SEQ ID NO.10。

SEQ ID NO.2是密码子优化的OmicronBA1突变株RBD序列。在SEQ ID NO.2 的5 端还可以添加信号肽序列，本发明实施例中选用的示例性的信号肽为人IgG抗体分泌信号肽序列SEQ ID NO.7，连接信号肽序列之后，得到SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.8是密码子优化的OmicronBA1突变株RBD序列（携带人IgG抗疫分泌信号肽，后续命名为SPRBDOba1），如下所示：

ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGCGCTCGGGTGCAGCCTACCGAATCTATCGTGCGGTTCCCCAACATCACAAACCTGTGCCCTTTCGACGAGGTGTTCAACGCCACCAGATTCGCCAGCGTGTATGCCTGGAACAGAAAGAGAATCTCGAATTGCGTGGCCGATTACTCCGTGCTCTATAACCTCGCCCCTTTCTTCACATTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTCAACGACCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACAGCTTTGTGATCAGAGGTGACGAGGTGCGGCAGATCGCACCAGGACAGACAGGCAACATTGCTGACTACAACTACAAACTGCCTGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAATTCTAACAAGCTGGATAGCAAGGTGTCTGGCAATTACAACTACCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGAGCAACCTGAAGCCTTTCGAGAGAGACATCTCTACCGAGATATACCAGGCCGGCAACAAACCTTGTAACGGCGTTGCGGGATTCAACTGCTACTTCCCTCTGAGAAGCTACAGCTTTCGGCCTACATACGGCGTCGGCCACCAGCCCTACCGGGTGGTGGTACTGAGCTTCGAGTTACTGCACGCTCCTGCGACCGTCTGCGGCCCTAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTCAACTTCTGA

其中，下划线部分为人IgG抗体分泌信号肽。

SEQ ID NO.3是密码子优化的OmicronBA2突变株RBD序列。在SEQ ID NO.3 的5 端还可以添加信号肽序列，本发明实施例中选用的示例性的信号肽为人IgG抗体分泌信号肽序列SEQ ID NO.7，连接信号肽序列之后，得到SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.9是密码子优化的OmicronBA2突变株RBD序列（携带人IgG抗疫分泌信号肽，后续命名为SPRBDOba2），如下所示：

ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGCGCTAGGGTGCAGCCAACAGAGTCCATCGTGCGCTTTCCCAATATCACCAACCTGTGCCCTTTTGACGAGGTGTTCAATGCCACACGCTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAATAGGAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCCGACTATTCTGTGCTGTACAACTTCGCCCCATTCTTCGCTTTTAAGTGTTATGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAATGATCTGTGCTTTACAAACGTGTACGCCGATTCCTTCGTGATCAGGGGCAACGAGGTGTCCCAGATCGCACCAGGACAGACCGGCAACATCGCAGACTACAATTATAAGCTGCCTGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCTAACAAGCTGGATAGCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGTCTAATCTGAAGCCATTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAACAAGCCCTGCAATGGCGTGGCTGGCTTTAACTGTTATTTCCCTCTGCGATCCTACGGCTTCCGGCCAACCTACGGCGTGGGCCACCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCACCTGCAACCGTGTGCGGCCCAAAGAAGAGCACAAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCTGA

其中，下划线部分为人IgG抗体分泌信号肽。

采用的高效自剪切蛋白序列是P2A，核酸序列和氨基酸序列如下：

GGCTCTGGTGCTACCAATTTCTCCCTTCTGAAACAAGCCGGTGACGTCGAGGAAAACCCAGGCCCT（SEQ ID NO.5）；

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（SEQ ID NO.6）。

SEQ ID NO.11是密码子优化的OmicronBA1突变株的S基因，去除弗林蛋白酶切割位点，同时增加S2铰链PP突变（文本中命名为S(OmicronBA1)），序列如下：

ATGTTCGTGTTCCTGGTCCTACTGCCACTGGTCAGCAGCCAGTGCGTGAATCTGACGACTAGGACCCAACTGCCTCCAGCCTATACCAACAGCTTCACCAGAGGAGTCTACTACCCCGACAAGGTGTTTCGGTCTTCTGTGCTGCATTCTACACAGGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCAGCAATGTCACCTGGTTCCACGTGATCTCCGGCACCAACGGAACCAAACGATTTGATAATCCTGTGCTGCCTTTCAACGACGGAGTGTACTTCGCCTCTATCGAGAAGAGCAATATCATCCGGGGCTGGATCTTCGGCACAACGCTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTTAACAATGCTACCAACGTTGTTATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGCAACGACCCTTTCCTGGACCACAAGAACAACAAGAGTTGGATGGAAAGCGAGTTCAGAGTGTACTCTAGCGCTAATAACTGCACATTCGAGTACGTCTCTCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAACAGGGAAATTTCAAAAATCTGAGAGAATTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTTAAGATCTACTCTAAGCACACACCCATCATCGTGCGGGAACCAGAGGACCTGCCCCAGGGCTTCAGCGCTCTGGAGCCACTGGTTGACCTGCCCATCGGCATCAACATTACAAGATTCCAAACTCTGCTTGCACTGCATAGATCCTATCTGACCCCTGGCGATTCCTCAAGCGGATGGACCGCCGGCGCCGCTGCCTACTACGTGGGATACCTGCAACCTCGGACCTTTCTGCTGAAGTATAACGAGAACGGCACCATTACCGACGCCGTGGACTGCGCCCTGGACCCCCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAAAGCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAAACCAGCAACTTTCGGGTGCAGCCTACCGAATCTATCGTGCGGTTCCCCAACATCACAAACCTGTGCCCTTTCGACGAGGTGTTCAACGCCACCAGATTCGCCAGCGTGTATGCCTGGAACAGAAAGAGAATCTCGAATTGCGTGGCCGATTACTCCGTGCTCTATAACCTCGCCCCTTTCTTCACATTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTCAACGACCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACAGCTTTGTGATCAGAGGTGACGAGGTGCGGCAGATCGCACCAGGACAGACAGGCAACATTGCTGACTACAACTACAAACTGCCTGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAATTCTAACAAGCTGGATAGCAAGGTGTCTGGCAATTACAACTACCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGAGCAACCTGAAGCCTTTCGAGAGAGACATCTCTACCGAGATATACCAGGCCGGCAACAAACCTTGTAACGGCGTTGCGGGATTCAACTGCTACTTCCCTCTGAGAAGCTACAGCTTTCGGCCTACATACGGCGTCGGCCACCAGCCCTACCGGGTGGTGGTACTGAGCTTCGAGTTACTGCACGCTCCTGCGACCGTCTGCGGCCCTAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTCAACTTCAACTTTAACGGCCTGAAGGGCACAGGTGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAATTCCTCCCATTCCAACAATTCGGTAGAGATATCGCCGACACCACTGATGCAGTTAGGGACCCCCAGACCCTGGAAATCCTGGATATCACCCCTTGCTCATTCGGCGGTGTGAGCGTCATCACCCCTGGCACCAACACCTCCAACCAGGTGGCCGTCCTGTACCAGGGCGTTAATTGTACCGAGGTGCCTGTGGCCATCCACGCCGACCAGCTCACCCCTACGTGGAGAGTGTACAGCACAGGCAGTAACGTGTTTCAGACTCGGGCCGGCTGCCTCATCGGTGCCGAGTACGTGAATAATAGTTATGAGTGTGACATTCCCATTGGCGCCGGCATCTGCGCCAGCTACCAGACCCAGACAAAGAGTCACGGCAGCGCTAGCTCTGTGGCCAGCCAGAGCATTATCGCCTACACCATGTCTCTGGGCGCTGAAAACAGCGTGGCCTACTCTAACAACTCCATCGCCATCCCTACCAACTTCACAATCTCCGTGACCACAGAGATTCTGCCCGTGTCTATGACCAAGACCTCTGTGGACTGTACAATGTACATCTGCGGCGATAGCACCGAATGCAGCAACCTGCTCCTGCAATACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAAAAGAGCTCTGACCGGTATCGCTGTGGAACAGGACAAGAACACACAGGAGGTGTTCGCCCAGGTTAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCTATCAAATACTTCGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCTGATCCAAGCAAACCTAGCAAGCGCAGCTTCATCGAGGACCTTCTGTTTAATAAAGTTACCCTGGCCGATGCCGGATTTATCAAGCAATACGGAGATTGCTTAGGCGATATCGCTGCCAGAGATCTGATCTGTGCTCAGAAATTCAAGGGCCTGACCGTCCTGCCTCCTCTCCTGACCGACGAGATGATCGCTCAGTACACCTCTGCCCTGCTGGCCGGCACAATCACATCAGGCTGGACCTTCGGAGCCGGAGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTGCAATGCAAATGGCCTACAGATTCAACGGCATTGGCGTCACACAGAACGTGCTGTACGAGAATCAGAAGCTGATAGCCAACCAGTTCAACTCCGCTATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCTCCACCGCCTCCGCCCTCGGAAAACTGCAGGACGTGGTGAACCATAATGCCCAGGCTCTGAACACCCTGGTGAAGCAACTGAGCAGCAAGTTCGGCGCCATCAGCTCTGTCCTGAACGACATCTTCTCAAGATTGGATCCTCCCGAAGCCGAAGTCCAGATCGATAGACTGATAACCGGCAGGCTGCAAAGCCTCCAGACATACGTGACACAGCAACTGATCAGAGCCGCTGAGATCCGAGCCAGCGCTAACCTGGCCGCCACCAAGATGTCAGAGTGCGTCCTGGGGCAGAGCAAAAGAGTGGACTTCTGTGGCAAGGGCTATCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCCCCGCACGGAGTGGTGTTCCTGCACGTGACCTACGTGCCCGCTCAGGAAAAAAACTTCACCACAGCCCCAGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCAAGGGAAGGCGTGTTCGTGAGCAATGGCACACACTGGTTTGTGACCCAGAGAAACTTCTACGAGCCTCAGATCATCACAACCGACAACACCTTTGTGAGCGGCAATTGCGATGTGGTGATCGGCATCGTGAACAACACCGTGTACGACCCCCTGCAGCCTGAACTCGATAGTTTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTACTTCAAAAACCACACGAGCCCTGACGTGGACCTCGGCGACATCAGCGGTATCAACGCCAGCGTCGTCAACATCCAAAAAGAGATCGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAATGAGAGTCTGATCGACCTGCAGGAGCTGGGAAAGTACGAACAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGATTCATCGCCGGCCTGATCGCTATCGTCATGGTTACTATTATGCTGTGCTGTATGACATCATGTTGTAGCTGTCTCAAAGGCTGCTGCAGCTGTGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAAGATGACTCTGAGCCAGTGCTCAAGGGCGTAAAGCTGCACTACACCTGATAAACTAG

实施例1 携带S(Delta)-P2A-RBD(OmicronBA1)双抗原基因的5型腺病毒载体构建

1）构建S(Delta)-P2A-RBD(OmicronBA1)双抗原基因的穿梭质粒pGA1-S(Delta)-P2A- SPRBDOba1

以pcDNA3.1-S(Delta)-P2A-SPRBDOba1（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，包含SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8从5端到3端直接相连的序列）质粒为模板，以S-Delta-F和RBDba1-R为引物，采用Primer Star Mix (TaKaRa) PCR扩增得到目的片段S(Delta)-P2A-SPRBDOba1。

S(Delta)-P2A-SPRBDOba1扩增引物序列：

S-Delta-F：ggtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtg（SEQ ID NO:12）；

RBDba1-R：agaatagggccctctagactagtttatcagaagttgacgcacttgttcttcaccagat（SEQ ID NO:13）。

PCR程序：98℃3min； 98℃10 s，60℃5 s，72℃60 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。

以PGA1-EGFP质粒（携带Ad5E1区同源重组臂质粒，由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以CMV-R和BGH-F为引物，采用Primer Star Mix (TaKaRa) PCR扩增得到目的片段PGA1。

pGA1骨架扩增引物序列：

CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO:14）；

BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO:15）。

PCR程序： 98℃3min； 98℃10 s，60℃5 s，72℃30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。

将目的片段S(Delta)-P2A-SPRBDOba1和载体骨架pGA1采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带S(Delta)-P2A-RBD(OmicronBA1)双抗原基因的穿梭质粒pGA1- S(Delta)-P2A-SPRBDOba1。

2）构建携带S(Delta)-P2A-RBD(OmicronBA1)双抗原基因的pAd5- S(Delta)-P2A-SPRBDOba1

以pGA1-S(Delta)-P2A-SPRBDOba1质粒为模板，PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV-S(Delta)-P2A-SPRBDOba1-BGH目的片段，胶回收。

CMV- S(Delta)-P2A-SPRBDOba1-BGH目的片段扩增引物序列：

Ad5-SB-F：TTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGG（SEQ ID NO:16）;

Ad5-SB-R：GCATCGGTCGAGGACAGGCCTCTCAAGTCTGTATAC（SEQ ID NO:17）。

PCR程序： 98℃3min； 98℃10 s，60℃5 s，72℃50 s， 28个循环；72℃ 5min，采用胶回收试剂盒回收目的片段，4℃保存。

pAd5ΔE1ΔE3以ClaI线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的CMV- S(Delta)-P2A-SPRBDOba1-BGH目的片段和线性化的PAd5ΔE1ΔE3共转化BJ5183，同源重组得到携带S(Delta)-P2A-RBD(OmicronBA1)双抗原基因的pAd5- S(Delta)-P2A-SPRBDOba1质粒，技术流程如图1所示。

实施例2 携带RBD(OmicronBA1) -P2A- S(Delta)双抗原基因的5型腺病毒载体构建

1）构建携带RBD(OmicronBA1)-P2A-S(Delta)双抗原基因的穿梭质粒pGA1-SPRBDOba1-P2A-S(Delta)

以pcDNA3.1-SPRBDOba1-P2A-S(Delta)（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，包含SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:1从5端到3端直接相连的序列）质粒为模板，以SP-F和S(Delta)-R为引物，采用Primer Star Mix (TaKaRa) PCR扩增得到目的片段SPRBDOba1-P2A-S(Delta)。

SPRBDOba1-P2A-S(Delta)扩增引物序列：

SP-F：ggtaccgagctcggatccgccaccatgggctggtccctgattctgctgttcctggtggctg（SEQ ID NO:18）；

S(Delta)-R：agaatagggccctctagactagtttatcaggtgtagtgcagcttcacgcccttcagc（SEQ ID NO:19）。

pGA1骨架扩增引物序列：

CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO:14）；

BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO:15）。

将目的片段SPRBDOba1-P2A-S(Delta)和载体骨架pGA1采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带RBD(OmicronBA1)-P2A-S(Delta)双抗原基因的穿梭质粒pGA1-SPRBDOba1-P2A-S(Delta)。

2）构建携带RBD(OmicronBA1)-P2A-S(Delta)双抗原基因的pAd5- SPRBDOba1-P2A-S(Delta)

以pGA1-SPRBDOba1-P2A-S(Delta)质粒为模板，PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV- SPRBDOba1-P2A-S(Delta)-BGH目的片段，胶回收。

CMV- SPRBDOba1-P2A-S(Delta)-BGH目的片段扩增引物序列：

Ad5-SB-F：TTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGG（SEQ ID NO:16）;

Ad5-SB-R：GCATCGGTCGAGGACAGGCCTCTCAAGTCTGTATAC（SEQ ID NO:17）。

pAd5ΔE1ΔE3以ClaI线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的CMV-SPRBDOba1-P2A-S(Delta)-BGH目的片段和线性化的PAd5ΔE1ΔE3共转化BJ5183，同源重组得到携带RBD(OmicronBA1)-P2A-S(Delta)双抗原基因的pAd5-SPRBDOba1-P2A-S(Delta)质粒，技术流程如图1所示。

实施例3携带RBD(OmicronBA2) -P2A- S(Delta)双抗原基因的5型腺病毒载体构建

1）构建携带RBD(OmicronBA2)-P2A-S(Delta)双抗原基因的穿梭质粒pGA1-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)

以pcDNA3.1-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，包含SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:1从5端到3端直接相连的序列）质粒为模板，以SP-F和S(Delta)-R为引物，采用Primer Star Mix (TaKaRa) PCR扩增得到目的片段SPRBDOba2-P2A-S(Delta)。

SPRBDOba2-P2A-S(Delta)扩增引物序列：

pGA1骨架扩增引物序列：

CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO:14）；

BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO:15）。

将目的片段SPRBDOba2-P2A-S(Delta)和载体骨架pGA1采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带RBD(OmicronBA2)-P2A-S(Delta)双抗原基因的穿梭质粒pGA1-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)。

2）构建携带RBD(OmicronBA2)-P2A-S(Delta)双抗原基因的pAd5- SPRBDOba2-P2A-S(Delta)

以pGA1-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)质粒为模板，PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV- SPRBDOba2-P2A-S(Delta)-BGH目的片段，胶回收。

CMV- SPRBDOba2-P2A-S(Delta)-BGH目的片段扩增引物序列：

Ad5-SB-F：TTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGG（SEQ ID NO:16）;

Ad5-SB-R：GCATCGGTCGAGGACAGGCCTCTCAAGTCTGTATAC（SEQ ID NO:17）。

pAd5ΔE1ΔE3以ClaI线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的CMV-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)-BGH目的片段和线性化的PAd5ΔE1ΔE3共转化BJ5183，同源重组得到携带RBD(OmicronBA2)-P2A-S(Delta)双抗原基因的pAd5-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)质粒，技术流程如图1所示。

实施例4携带RBD(OmicronBA1) -RBD(Delta)双抗原基因的5型腺病毒载体构建

1）构建携带RBD(OmicronBA1)-RBD(Delta)双抗原基因的穿梭质粒pGA1-SPRBDOba1-RBD(Delta)

以pcDNA3.1- SPRBDOba1-RBD(Delta)（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:4从5端到3端直接相连的序列）质粒为模板，以SP-F和RBD(Delta)-R为引物，采用Primer Star Mix (TaKaRa) PCR扩增得到目的片段SPRBDOba1-RBD(Delta)。

SPRBDOba1-RBD(Delta)扩增引物序列：

RBD(Delta)-R：agaatagggccctctagactagtttatcagaagttcacacatttgttcttcacgaggt（SEQ ID NO:20）。

pGA1骨架扩增引物序列：

CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO:14）；

BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO:15）。

将目的片段SPRBDOba1-RBD(Delta)和载体骨架pGA1采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带RBD(OmicronBA1)-RBD(Delta)双抗原基因的穿梭质粒pGA1- SPRBDOba1-RBD(Delta)。

2）构建携带RBD(OmicronBA1)-RBD(Delta)双抗原基因的pAd5- SPRBDOba2-RBD(Delta)

以pGA1- SPRBDOba1-RBD(Delta)质粒为模板，PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV- SPRBDOba1-RBD(Delta)-BGH目的片段，胶回收。

CMV- SPRBDOba1-RBD(Delta)-BGH目的片段扩增引物序列：

Ad5-SB-F：TTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGG（SEQ ID NO:16）;

Ad5-SB-R：GCATCGGTCGAGGACAGGCCTCTCAAGTCTGTATAC（SEQ ID NO:17）。

pAd5ΔE1ΔE3以ClaI线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的CMV-SPRBDOba1-RBD(Delta)-BGH目的片段和线性化的PAd5ΔE1ΔE3共转化BJ5183，同源重组得到携带RBD(OmicronBA1)-RBD(Delta)双抗原基因的pAd5-SPRBDOba1-RBD(Delta)质粒，技术流程如图1所示。

实施例5 携带RBD(OmicronBA2) -RBD(Delta)双抗原基因的5型腺病毒载体构建

1）构建携带RBD(OmicronBA2)-RBD(Delta)双抗原基因的穿梭质粒pGA1-SPRBDOba2-RBD(Delta)

以pcDNA3.1- SPRBDOba2-RBD(Delta)（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:4从5端到3端直接相连的序列）质粒为模板，以SP-F和RBD(Delta)-R为引物，采用Primer Star Mix (TaKaRa) PCR扩增得到目的片段SPRBDOba2-RBD(Delta)。

SPRBDOba2-RBD(Delta)扩增引物序列：

pGA1骨架扩增引物序列：

CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO:14）；

BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO:15）。

将目的片段SPRBDOba2-RBD(Delta)和载体骨架pGA1采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带RBD(OmicronBA2)-RBD(Delta)双抗原基因的穿梭质粒pGA1- SPRBDOba2-RBD(Delta)。

2）构建携带RBD(OmicronBA2)-RBD(Delta)双抗原基因的pAd5- SPRBDOba2-RBD(Delta)

以pGA1- SPRBDOba2-RBD(Delta)质粒为模板，PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV- SPRBDOba2-RBD(Delta)-BGH目的片段，胶回收。

CMV- SPRBDOba2-RBD(Delta)-BGH目的片段扩增引物序列：

Ad5-SB-F：TTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGG（SEQ ID NO:16）;

Ad5-SB-R：GCATCGGTCGAGGACAGGCCTCTCAAGTCTGTATAC（SEQ ID NO:17）。

pAd5ΔE1ΔE3以ClaI线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的CMV-SPRBDOba2-RBD(Delta)-BGH目的片段和线性化的PAd5ΔE1ΔE3共转化BJ5183，同源重组得到携带RBD(OmicronBA2)-RBD(Delta)双抗原基因的pAd5- SPRBDOba2-RBD(Delta)质粒，技术流程如图1所示。

对比例携带S(OmicronBA1) -P2A-RBD(Delta)双抗原基因的5型腺病毒载体构建

1）构建S(Omicron BA1)-P2A-RBD（Delta）双抗原基因的穿梭质粒pGA1-S(OmicronBA1)-P2A- SPRBD(Delta)

以pcDNA3.1-S(Omicron BA1)-P2A-SPRBD(Delta)（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，包含SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10从5端到3端直接相连的序列）质粒为模板，以S- OmicronBA1-F和RBD(Delta)-R为引物，采用Primer Star Mix (TaKaRa)PCR扩增得到目的片段S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)。

S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)扩增引物序列：

S-OmicronBA1-F：ggtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgttcctggtcctactgccactggtcagc（SEQ ID NO:21）；

pGA1骨架扩增引物序列：

CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO:14）；

BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO:15）。

将目的片段S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)和载体骨架pGA1采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带S(OmicronBA1)-P2A-RBD（Delta）双抗原基因的穿梭质粒pGA1- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)。

2）构建携带S(OmicronBA1)-P2A-RBD（Delta）双抗原基因的pAd5- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)

以pGA1- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)质粒为模板，PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta) -BGH目的片段，胶回收。

CMV- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta) -BGH目的片段扩增引物序列：

Ad5-SB-F：TTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGG（SEQ ID NO:16）;

Ad5-SB-R：GCATCGGTCGAGGACAGGCCTCTCAAGTCTGTATAC（SEQ ID NO:17）。

pAd5ΔE1ΔE3以ClaI线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的CMV- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta) -BGH目的片段和线性化的PAd5ΔE1ΔE3共转化BJ5183，同源重组得到携带S(OmicronBA1)-P2A-RBD（Delta）双抗原基因的pAd5- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)质粒，技术流程如图1所示。

效果例1 Ad5双抗原载体的拯救与生产

1）按照常规方法， pAd5-S(Delta)-P2A-SPRBDOba1、pAd5-SPRBDOba1-P2A- S(Delta)、pAd5-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)、pAd5-SPRBDOba1-RBD(Delta)、pAd5-SPRBDOba2-RBD(Delta)、pAd5- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)以PacI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后4小时，加入2毫升含5%胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度=OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。病毒纯化图片如图2所示。

2）检测Spike基因表达：

用Ad5-S(Delta)-P2A-SPRBDOba1、Ad5-SPRBDOba1-P2A- S(Delta)、Ad5-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)、Ad5-SPRBDOba1-RBD(Delta)、Ad5-SPRBDOba2-RBD(Delta)、Ad5-S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)病毒侵染A549细胞，24h后收集细胞。按照常规的WesternBlot方法处理样品，并进行蛋白检测。结果如图3所示，可以看出疫苗候选株Ad5-S(Delta)-P2A-SPRBDOba1、Ad5-SPRBDOba1-P2A- S(Delta)、Ad5-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)、Ad5-SPRBDOba1-RBD(Delta)、Ad5-SPRBDOba2-RBD(Delta)、Ad5- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)样品中能够观察到相应的S蛋白和RBD蛋白的表达，说明上述疫苗候选株构建正确，可以成功表达S 抗原蛋白和RBD抗原蛋白。

效果例2 动物免疫原性评价

6-8周龄Balb/c小鼠分为6组，每组5只；第0天，G1~G5组分别肌注免疫Ad5-S(Delta)-P2A-SPRBDOba1、Ad5-SPRBDOba1-P2A-S(Delta)、Ad5-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)、Ad5- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)、Ad5-SPRBDOba1-RBD(Delta)和Ad5-SPRBDOba2-RBD(Delta)剂量：2×10⁹vp/只，对照组肌注免疫Ad5-empty剂量：2×10⁹vp/只；免疫后6周眼眶取血并分离血清。委托广州市达瑞生物技术股份有限公司进行假病毒中和抗体滴度检测。

结果如图4所示，本发明实施例1-5构建的Ad5-S(Delta)-P2A-SPRBDOba1、Ad5-SPRBDOba1-P2A-S(Delta)、Ad5-SPRBDOba2-P2A-S(Delta)、Ad5-SPRBDOba1-RBD(Delta)和Ad5-SPRBDOba2-RBD(Delta)五种不同突变株的RBD/S双抗原组成形式免疫小鼠后，可以有产生较高滴度的针对原始株、Beta株、Delta株、OmicronBA1、OmicronBA2、OmicronBA2.12.1和OmicronBA4/5等多个突变株的中和抗体，可以有效保护机体免受现有不同突变株新冠病毒的侵染。

但是对比例构建的Ad5- S(OmicronBA1)-P2A-SPRBD(Delta)仅产生针对OmicronBA.1理想的中和抗体水平，但是对于原始株、Beta株、Delta株、OmicronBA2、OmicronBA2.12.1和OmicronBA4/5中和抗体滴度较低。

对比实施例1和实施例2，可以证明，连接顺序对免疫原性并无决定性影响，其免疫效果主要由疫苗中包含的序列所决定；实施例1的效果优于实施例2，原因在于实施例1的主抗原（S）抗原谱宽于实施例2的主抗原（RBD）。对比实施例2和实施例3，发现SPRBDOba2的抗原谱比SPRBDOba1宽。当需要疫苗针对Omicron突变株的中和抗体值更高，可以将Omicron的抗原序列为主抗原，如实施例2-5所示。对比实施例4和5，直接将两个不同突变株的RBD抗原序列连接并没有导致两种抗原的结构相互影响，该疫苗同样可以产生针对原始株、Beta株、Delta株、OmicronBA1、OmicronBA2、OmicronBA2.12.1和OmicronBA4/5等多个突变株的中和活性；采用P2A序列，可以实现两种抗原单独表达，独立存在，不会因融合蛋白构想变化导致的抗原的免疫原性丧失。

本发明构建了多个广谱型新冠疫苗腺病毒疫苗载体，本发明的关键点是将不同突变株的S/RBD抗原进行组合，使其可以在细胞内高效表达S蛋白和RBD蛋白，其免疫机体后可高效表达抗原，产生针对原始株、Beta株、Delta株、OmicronBA1、OmicronBA2、OmicronBA2.12.1和OmicronBA4/5的中和抗体，可以有效保护机体免受新冠病毒的侵染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种核酸分子，所述核酸分子包含选自a)中的至少一种核酸序列，以及选自b）的至少一种核酸序列：

a) SEQ ID NO: 1所示核酸序列；SEQ ID NO: 4所示核酸序列；

b) SEQ ID NO: 2所示核酸序列；SEQ ID NO: 3所示核酸序列。

2.根据权利要求1的一种核酸分子，所述核酸分子包含选自a’) 中的至少一种核酸序列，以及选自b’) 的至少一种核酸序列：

a’) SEQ ID NO: 1所示核酸序列；SEQ ID NO: 4所示核酸序列；SEQ ID NO: 10所示核酸序列；

b’) SEQ ID NO: 2所示核酸序列；SEQ ID NO: 3所示核酸序列； SEQ ID NO: 8所示核酸序列；SEQ ID NO: 9所示核酸序列。

3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料是一种表达载体或一种表达细胞；所述载体含有权利要求1-2任一项所述的核酸分子；所述表达细胞基于权利要求1-2任一项所述核酸分子表达蛋白。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述载体为病毒载体。

5.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述载体为腺病毒载体。

6.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述载体为Ad5载体。

7.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含选自a)中的至少一种核酸序列，以及选自b）的至少一种核酸序列：

a) SEQ ID NO: 1所示核酸序列；SEQ ID NO: 4所示核酸序列；

b)SEQ ID NO: 2所示核酸序列；SEQ ID NO: 3所示核酸序列。

8.根据权利要求7的所述疫苗，所述疫苗包含选自a’) 中的至少一种核酸序列，以及选自b’) 的至少一种核酸序列：

a’)SEQ ID NO: 1所示核酸序列；SEQ ID NO: 4所示核酸序列；SEQ ID NO: 10所示核酸序列；

b’)SEQ ID NO: 2所示核酸序列；SEQ ID NO: 3所示核酸序列； SEQ ID NO: 8所示核酸序列； SEQ ID NO: 9所示核酸序列。

9.根据权利要求7或8所述疫苗，其特征在于，所述疫苗的载体为病毒载体。

10.根据权利要求9所述疫苗，其特征在于，所述疫苗的载体为腺病毒载体。

11.根据权利要求9所述疫苗，其特征在于，所述疫苗的载体为Ad5载体。

12.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂和赋形剂中的至少一种。

13.一种药物组合物，包括权利要求7-12任一项所述疫苗，和至少一种对COVID-19有预防和/或治疗作用的其他药物。

14.权利要求1-2任一项所述核酸分子、权利要求3-6所述生物材料、或权利要求7-12任一项所述疫苗、或权利要求13所述的药物组合物在制备预防SARS-CoV-2感染的药物中的应用。