CN114395569A - 一种腺病毒载体重组新冠病毒b.1.1.529变异株疫苗及其应用 - Google Patents

一种腺病毒载体重组新冠病毒b.1.1.529变异株疫苗及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种以人5型复制缺陷型腺病毒为载体的新型冠状病毒B.1.1.529变异株疫苗。在表达蛋白主体依然为新型冠状病毒B.1.1.529变异株刺突蛋白的前提下，以经验优化后核酸序列制备的重组病毒载体疫苗，免疫后可有效刺激机体产生针对B.1.1.529变异株病毒的结合抗体、中和抗体以及细胞免疫反应，具有良好的免疫原性。

Description

一种腺病毒载体重组新冠病毒B.1.1.529变异株疫苗及其 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种重组新型冠状病毒B.1.1.529变异株疫苗。
背景技术
新冠病毒为RNA病毒，在持续传播过程中极易产生突变，并自然筛选出传播能力增强的优势变异株。2021年11月首次发现奥密克戎（Omicron, B.1.1.529）变异株，11月26日，世界卫生组织将其定义为第五种“关切变异株”。2021年12月以后，该变异株开始在世界范围内广泛流行，至2022年2月底，B.1.1. 529变异株覆盖率接近100%。
与新型冠状病毒原型株相比，B.1.1.529变异株刺突蛋白（Spike, S）中含有超过37个突变位点，其中约有15个突变位点位于受体结合区。刺突蛋白中累积的大量突变使得该该流行株一定程度上能够逃逸新冠原型株疫苗激发的抗体，进而引起新冠原型株疫苗失效或保护力降低，为新冠疫情防控工作带来巨大压力。
本申请人前期参与研发的非复制型5 型腺病毒载体重组新型冠状病毒疫苗（CN111218459A及WO2021184560）的I、II 期临床试验显示，该疫苗在受试者中有良好的安全性，99.5%的受试者产生了特异抗体，90%的受试者产生了特异性细胞免疫反应。同时，III期临床结果显示，单剂接种14 天后预防所有症状新冠肺炎的保护效力为68.8%，预防重症新冠肺炎的保护效力为95.5%，显示了优异的保护效果。然而，该疫苗同样为新冠病毒原型株刺突蛋白为主要保护性抗原构建而成。考虑到B.1.1.529变异株在全球范围内广泛流行，本发明的目的就是提供一种针对新冠病毒B.1.1.529变异株的疫苗，以应对持续蔓延的变异株新冠疫情。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种表达新型冠状病毒变异株刺突蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
第二，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的重组人5型腺病毒。
在一个优选的实施方案中，所述重组人5型腺病毒为重组人5型复制缺陷型腺病毒。
在一个更为优选的实施方案中，所述重组人5型腺病毒为重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。所述多核苷酸以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体新型冠状病毒疫苗。
第四，本发明提供了上述核苷酸及重组腺病毒在制备预防新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒被制备为注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。
最后，本发明提供了一种表达上述新型冠状病毒变异株抗原蛋白的重组人5型腺病毒的制备方法，所述方法包含以下步骤：
（1）构建包含上述的多核苷酸序列的穿梭质粒载体；
（2）将步骤（1）所述穿梭载体与骨架质粒共转宿主细胞，包装重组复制缺陷型腺病毒；
（3）对步骤（2）所述重组腺病毒进行扩大培养，验证重组病毒保护性抗原表达水平。
在一个优选的实施方案中，步骤（2）所述宿主细胞为HEK293细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的核酸序列是发明人针对编码新型冠状病毒B.1.1.529变异株刺突蛋白的氨基酸序列进行优化得到，该优化包括序列的信号肽优化、个别位点优化以及密码子人源优化等，在表达新冠刺突蛋白含有B.1.1.529变异株主要突变位点的前提下，优化得到的核酸序列可以在真核细胞中高效表达刺突蛋白。
以此核酸序列制备复制缺陷型5型腺病毒载体重组新冠疫苗，单次免疫试验动物可有效刺激机体产生体液和细胞免疫应答：对于体液免疫，经肌肉和滴鼻免疫均可刺激实验动物产生高水平B.1.1.529特异性血清IgG结合抗体反应以及中和抗体反应，此外，滴鼻免疫还可以刺激小鼠产生特异性血清IgA抗体反应；对于细胞免疫应答，经肌肉和滴鼻免疫均可有效刺激实验动物产生高水平抗原特异性IFNγ细胞免疫反应。使用Ad5-nCoV疫苗（CN111218459A）作对照，发现疫苗诱导的针对B.1.1.529变异株的结合和中和抗体反应显著高于对照组，在应对以奥密克戎为主要流行株的新冠疫情中，具有一定的应用优势。
附图说明
图1. 新冠B.1.1.529变异株核酸序列优化前GC含量分布图。
图2. 新冠B.1.1.529变异株核酸序列优化后GC含量分布图。
图3. 新冠B.1.1.529变异株核酸序列优化前DNA拟合二级结构信息图。
图4. 新冠B.1.1.529变异株核酸序列优化后DNA拟合二级结构信息图。
图5.新冠B.1.1.529变异株核酸序列优化前密码子分布对比图。
图6.新冠B.1.1.529变异株核酸序列优化后密码子分布对比图。
图7. 质粒pDC316-nCoV-B.1.1.529图谱。
图8. 重组新型冠状病毒B.1.1.529变异株疫苗S蛋白表达水平电泳图。其中，“NC”组为Ad5空载体对照，Ad5-nCoV为5型腺病毒载体重组新型冠状病毒原型株疫苗对照组，Ad5-nCoV-B.1.1.529为本申请所述方案实验组，Ad5-nCoV-B.1.351和Ad5-nCoV-B.1.617.2分别为其它腺病毒载体重组新冠变异株疫苗株，用于指示S蛋白条带位置和表达量。
图9.单次免疫14天诱导产生IgG结合抗体水平。WT为针对新冠原型株S蛋白IgG结合抗体水平；B.1.1.529为针对新冠B.1.1.529变异株S蛋白IgG结合抗体水平。
图10. 单次免疫14天诱导产生IgA结合抗体水平，WT为针对新冠原型株S蛋白IgA结合抗体水平；B.1.1.529为针对新冠B.1.1.529变异株S蛋白IgA结合抗体水平。
图11.单次免疫14天诱导产生B.1.1.529变异株假病毒中和抗体水平。
图12.单次免疫28天诱导产生B.1.1.529变异株真病毒中和抗体水平。
图13.单次免疫14天诱导产生特异性IFNγ分泌型脾部细胞免疫反应。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述 ，但是本领域技术人员将会理解，这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
除非另外指明，下述实施例中所用的出发质粒、酶、相关试剂均可从市售公司购买得到。
本发明提供一种核酸分子，如SEQ ID NO.1所示，编码新型冠状病毒B.1.1.529变异株S蛋白。需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中，提及的基因或核苷酸序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，也包括其对应的转录后的RNA序列及其相应的氨基酸序列。为了方便，本说明书和权利要求书中虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，同时也公开了相应的RNA序列和氨基酸序列。例如SEQ ID NO.1，实际包括其互补的核苷酸序列，也包括其对应的转录后的RNA序列，以及翻译后的氨基酸序列。
实施例1：新冠B.1.1.529变异株抗原核苷酸序列优化前后对比
我们选取B.1.1.529变异株（GISAID Accession ID: EPI_ISL_6640917）为模板，获得变异株S蛋白序列。结合经验优化获得SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
刺突蛋白原始序列长度为3813 bp，其中碱基A为1129个占29.61%、C为716个占18.78%、G为702个占18.41%、T为1266个占33.2%（图1）。经验优化后序列长度3837bp，A为912个，占23.77%、C为1185个，占30.88%、G为1003个，占26.14%、T为737个，占19.21%（图2），GC碱基含量从37.19%提高到57.02%。由于AT配对生成2个氢键，GC配对生成3个氢键，因此，GC碱基含量的提高显著提高了DNA双链配对以及mRNA二级结构的稳定性。此外，优化后的基因，其GC含量的分布更加均匀，明显减少了高GC含量区和高AT含量区。因此，优化显著改善了核酸稳定性。
通过改善DNA二级结构增强核酸稳定性。优化前的DNA拟合二级结构见图3，优化后DNA拟合二级结构见图4。基因优化过程，进一步降低DNA分子中重复序列和发夹结构数量，核酸分子自由能由-1070.50降低至-1322.80。因此，优化显著改善了核酸分子二级结构，稳定性显著增强。
优化过程通过降低稀有密码子使用频率提高基因表达效率。由于优化前序列中含有较多的哺乳动物稀有密码子，很难在哺乳动物细胞中高效表达。优化前、后核酸序列的稀有密码子分析结果分别见图5和图6（图5和图6中A为密码子使用权重分析表，B为密码子使用频率分布表），结果显示，S蛋白核酸序列的稀有密码子含量显著降低，高频密码子使用频率显著提高。提高哺乳动物中高频密码子含量，会增进哺乳动物细胞中对应tRNA的利用效率，进而提高蛋白合成中的原料使用效率，提高相应蛋白在哺乳动物细胞中表达水平，进而增强疫苗的免疫原性。
实施例2：重组病毒疫苗包装与体外表达鉴定
在基因合成过程中，将合成后的产物克隆至pDC316载体（Microbix BiosystemsInc .）中，所得质粒（pDC316-nCoV-B.1.1.529）图谱如图7所示。将pDC316-nCoV-B.1.1.529质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1 ,3Cre（Microbix Biosystems Inc .）共转染HEK293细胞，使用含5% FBS的DMEM培养基维持培养至细胞病变。在维持培养过程中，pDC316载体中含有腺病毒左侧反向重复序列、包装信号序列及抗原基因的部分片段，依赖Cre/Loxp位点特异性重组与病毒骨架序列拼接，形成病毒完整基因组，启动子代病毒合成与组装。随着子代病毒的不断合成，细胞病变逐渐加重，待90%以上细胞完全病变并从皿底脱落后，1000g离心10分钟收集病变细胞，加入适量PBS，-80℃/37℃反复冻融3次后，取上清收集重组腺病毒，随后于-80℃冻存。使用该病毒种子，在HEK293细胞中，连续传3代，收集第三代病毒，对病毒进行测序鉴定。
1. 测定验证后的病毒滴度，以MOI=1感染HEK293细胞，24小时后收集细胞进行Western Blot鉴定，结果如图8所示，其中“NC”组为Ad5空载体对照，1：Ad5-nCoV为新型冠状病毒原型株疫苗对照，2：Ad5-nCoV-B.1.1.529为本申请所述方案B.1.1.529变异株疫苗感染HEK293细胞后的S蛋白表达情况，3：Ad5-nCoV-B.1.351（中国专利申请CN202111585865.5）和4：Ad5-nCoV-B.1.617.2（中国专利申请CN202111585888.6）分别为其它腺病毒载体重组新冠变异株疫苗株，用于指示S蛋白条带位置和表达量。对比显示，Ad5-nCoV-B.1.1.529变异株感染细胞后，S蛋白表达水平与Ad5-nCoV以及其它两种5型腺病毒载体重组变异株病毒相近。
实施例3：新冠B.1.1.529变异株疫苗免疫反应评价
使用肌肉注射和滴鼻免疫两种方式，分别免疫5×108 VP 剂量的Ad5-nCoV-B.1.1.529变异株疫苗，同时以Ad5-nCoV原型株疫苗为对照进行免疫，每组6只小鼠。于免疫后2、4周取血，分离血清，分别用于结合抗体及中和抗体检测。同时，设置相同4个免疫组，于免疫后14天处死，分离小鼠脾淋巴细胞，用于细胞免疫检测。
3.1 新冠B.1.1.529变异株疫苗诱导更高水平的变异株特异性结合抗体反应
分别以新冠原型株（Genebank编号：NC_045512 .2)）和B.1.1.529变异株的S蛋白作为抗原，利用ELISA法检测血清中特异性IgG和IgA抗体滴度，检测结果如图9所示（* ,P<0.05；** ,P<0 .01；*** ,P<0 .001）。
Ad5-nCoV-B.1.1.529疫苗（图9和图10中标记为Ad5-B.1.1.529，下同）经肌肉注射免疫2周后，可有效刺激小鼠产生血清特异性IgG抗体反应（图9），血清IgA抗体反应多为阴性（图10）。另外，与Ad5-nCoV原型株疫苗（图9和图10中标记为Ad5-WT）相比，Ad5-nCoV-B.1.1.529免疫后可以激发同等水平针对原型株S蛋白的结合抗体反应（图9之WT），而针对B.1.1.529变异株S蛋白的结合抗体反应显著高于Ad5-nCoV组（图9之B.1.1.529），约为后者的5.70倍。
Ad5-nCoV-B.1.1.529疫苗经滴鼻免疫2周后，可有效刺激小鼠产生血清特异性IgG和IgA（主要参与粘膜免疫）抗体反应。与Ad5-nCoV相比，B.1.1.529变异株疫苗诱导的针对变异株S蛋白的血清IgG和IgA抗体水平均显著高于Ad5-nCoV（图9之B.1.1.529和图10之B.1.1.529），分别为后者的2.86倍和8.09倍。说明Ad5-nCoV-B.1.1.529对奥密克戎变异株的特异性抗体反应显著优于原型株疫苗。
3.2 新冠B.1.1.529变异株疫苗诱导更高水平的变异株特异性假病毒中和抗体反应
我们合成了B.1.1.529 变异株原始S蛋白基因序列，并将序列嵌入pCAGGS质粒，用于细胞内过表达新冠S蛋白。将表达S蛋白的重组pCAGGS质粒与pNL4-3.Luc-R-E−骨架质粒共转染HEK293细胞系，收集48小时和72小时后培养上清，制得HIV骨架新冠变异株假病毒。使用该假病毒与小鼠血清中和，随后感染ACE2稳转细胞系（HEK293-ACE2），检测萤火虫荧光素酶表达水平，用于定量检测单免14天小鼠血清假病毒中和抗体（Pseudovirusneutralizing antibody, PNAb），结果见图11。
小鼠奥密克戎血清假病毒中和抗体检测结果显示，无论通过肌肉注射还是滴鼻免疫Ad5-nCoV-B.1.1.529，均能有效刺激小鼠产生高滴度针对奥密克戎变异株的血清假病毒中和抗体。另外，虽然原型株新冠疫苗对B.1.1.529变异株S蛋白具有一定的交叉反应，但是单次免疫14天后血清中和能力相对偏低。使用Ad5-nCoV-B.1.1.529疫苗用于预防奥密克戎变异株具有较高的应用潜力。
3.3 新冠B.1.1.529变异株疫苗诱导更高水平的变异株特异性中和抗体反应
我们使用B.1.1.529变异株病毒测定免疫后4周小鼠血清真病毒中和抗体（Neutralizing antibody, NAb），具体方法为：对血清进行初始稀释倍数为32倍的2倍比稀释，共设置9个稀释度，将稀释后的血清与病毒稀释液等体积混合，37℃中和1小时后，使用中和液感染细胞，3天后根据细胞病变情况确定血清中和抗体稀释度。中和抗体检测结果见图12，该结果表明无论通过肌肉免疫还是滴鼻免疫，Ad5-nCoV-B.1.1.529变异株疫苗均能有效刺激小鼠产生高滴度针对奥密克戎变异株的特异性血清真病毒中和抗体反应，显著高于原型株新冠疫苗单次免疫组。该结论与假病毒中和抗体结论相一致，再次印证了使用Ad5-nCoV-B.1.1.529疫苗用于预防奥密克戎变异株具有较高的应用潜力。
3.4 新冠B.1.1.529变异株疫苗单免后可以有效激发小鼠细胞免疫反应。
我们合成了新冠S蛋白重叠肽库，以重叠肽库刺激免疫14天后的小鼠脾细胞，使用ELISpot方法检测特异性分泌IFNγ的细胞免疫反应水平（图13）。结果显示，无论是通过肌肉注射或是滴鼻免疫，Ad5-nCoV-B.1.1.529变异株疫苗均能有效刺激小鼠产生特异性IFNγ分泌型脾部细胞免疫反应，显著高于未免疫组。Ad5-nCoV-B.1.1.529变异株疫苗免疫组细胞免疫反应水平与原型株新冠疫苗组基本相当。该结果提示，Ad5-nCoV-B.1.1.529变异株疫苗在保证细胞免疫反应与原型株疫苗基本一致的情况下，显著提高了针对奥密克戎变异株的特异性结合和中和抗体反应，具有显著的应用优势。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种腺病毒载体重组新冠病毒B.1.1.529变异株疫苗及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3837
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
atggacgcca tgaagcgggg cctctgctgt gttctgctgc tctgcggcgc cgtgttcgtg 60
agtaactcga gccagtgcgt gaacctgacc accaggacac aactgcctcc agcctacacc 120
aacagcttca ccagaggcgt gtactacccc gacaaggtgt tcagatccag cgtgctgcac 180
tctacccagg acctgttcct gcctttcttc agcaacgtga cctggttcca cgtgatcagc 240
ggcaccaatg gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ccttcaacga cggggtgtac 300
tttgccagca tcgagaagtc caacatcatc cgcggctgga tcttcggcac cacactggat 360
agcaagaccc agagcctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtggtcat caaagtgtgc 420
gagttccagt tctgcaacga cccattcctg gaccacaaga acaacaagag ctggatggaa 480
agcgagttcc gggtgtacag cagcgccaac aactgcacct tcgagtacgt gtcccagcct 540
ttcctgatgg acctggaagg caagcagggc aacttcaaga acctgcgcga gttcgtgttc 600
aagaacatcg acggctactt caagatctac agcaagcaca cccctatcat cgtgcgcgag 660
cctgaggatc tgcctcaggg cttttctgcc ctggaacctc tggtggatct gcccatcggc 720
atcaacatca cccggtttca gacactgctg gccctgcaca gaagctacct gacacctggc 780
gatagcagct ctggatggac agctggcgcc gctgcctact atgtgggata cctgcagcct 840
cggaccttcc tgctgaagta caacgagaac ggcaccatca ccgacgccgt ggattgtgct 900
ctggatcccc tgagcgagac aaagtgcacc ctgaagtcct tcaccgtgga aaagggcatc 960
taccagacca gcaacttccg ggtgcagccc accgaatcca tcgtgcggtt ccccaatatc 1020
accaatctgt gccccttcga tgaggtgttc aatgccacca gattcgccag cgtgtacgcc 1080
tggaaccgga agagaatcag caactgcgtg gccgactact ccgtgctgta caatctggcc 1140
ccattcttca ccttcaagtg ctacggcgtg tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc 1200
accaatgtgt acgccgacag cttcgtgatc cggggagatg aagtgcggca gattgcccct 1260
ggacagaccg gcaatatcgc cgactacaac tacaagctgc ccgacgactt caccggctgt 1320
gtgatcgcct ggaatagcaa caagctggac agcaaggtgt ccggcaacta caattacctg 1380
taccggctgt tccggaagtc caatctgaag cccttcgagc gggacatcag caccgagatc 1440
tatcaggccg gcaacaagcc ctgtaatggc gtggccggct tcaactgcta cttcccactg 1500
cggagctaca gcttcagacc cacatacggc gttggccacc agccttacag agtggtggtg 1560
ctgtccttcg agctgctgca tgctcctgcc acagtgtgcg gccctaagaa aagcaccaac 1620
ctcgtgaaga acaaatgcgt gaacttcaac ttcaacggcc tgaaaggcac cggcgtgctg 1680
accgagagca acaagaagtt cctgccattc cagcagttcg gccgggacat tgccgatacc 1740
acagacgccg ttagagatcc ccagacactg gaaatcctgg acatcacccc ttgcagcttc 1800
ggcggagtgt ctgtgatcac ccctggcacc aacaccagca atcaggtggc agtgctgtac 1860
cagggcgtga actgtacaga ggtgccagtg gccattcacg ccgatcagct gacccctact 1920
tggcgggtgt actccacagg cagcaatgtg ttccagacca gagccggctg tctgattggc 1980
gccgagtatg tgaacaacag ctacgagtgc gacatcccca tcggagccgg catctgtgcc 2040
agctaccaga cacagacaaa gtcccatgcc agcgtggcca gccagagcat cattgcctac 2100
acaatgtctc tgggcgccga gaactctgtg gcctacagca acaactctat cgctatcccc 2160
accaacttca ccatcagcgt gaccaccgag attctgcccg tgtccatgac caagaccagc 2220
gtggactgca ccatgtacat ctgcggcgat tccaccgagt gctccaacct gctgctgcag 2280
tacggcagct tctgcaccca gctgaagaga gccctgacag ggattgccgt ggaacaggac 2340
aagaacaccc aagaggtgtt cgcccaagtg aagcagatct acaagacccc tcctatcaag 2400
tacttcggcg ggttcaactt ctcccagatc ctgccagatc ctagcaagcc cagcaagcgg 2460
agcttcatcg aggacctgct gttcaacaaa gtgacactgg ccgacgccgg ctttatcaag 2520
cagtatggcg attgcctggg cgacattgca gccagggatc tgatttgcgc ccagaagttc 2580
aagggcctga cagtgctgcc tcctctgctg acagatgaga tgatcgccca gtacacaagc 2640
gccctgctgg ccggcacaat cacaagcgga tggacatttg gagccggcgc tgccctgcag 2700
atcccatttg ctatgcagat ggcctaccgg ttcaacggca tcggagtgac ccagaatgtg 2760
ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg caagatccag 2820
gacagcctga gcagcacagc aagcgctctg ggaaagctgc aggacgtggt caaccacaat 2880
gcccaggcac tgaacaccct ggtcaagcag ctgtctagca agttcggcgc catctctagc 2940
gtgctgaatg acatcttctc ccggctggac cctcctgagg ccgaggtgca aatcgacaga 3000
ctgatcaccg gcagactgca gagcctccag acatacgtga cccagcagct gattagagcc 3060
gccgagatca gagccagcgc caatctggct gccaccaaga tgtctgagtg tgtgctgggc 3120
cagagcaaga gagtggactt ttgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt ccctcagtct 3180
gctcctcacg gcgtggtgtt tctgcacgtg acctacgtgc ccgctcaaga gaagaatttc 3240
accaccgctc cagccatctg ccacgacggc aaagcccact ttcctagaga aggcgtgttc 3300
gtcagcaacg gcacccattg gttcgtgaca cagcggaact tctacgagcc ccagatcatc 3360
accaccgaca acaccttcgt gtctggcaac tgcgacgtcg tgatcggcat tgtgaacaat 3420
accgtgtacg accctctgca gcccgagctg gactccttca aagaggaact ggataagtac 3480
tttaagaacc acacaagccc cgacgtggac ctgggcgata tcagcggaat caatgcctcc 3540
gtcgtgaaca tccagaaaga gatcgaccgg ctgaacgagg tggccaagaa tctgaacgag 3600
agcctgatcg acctgcaaga actggggaag tacgagcagt acatcaagtg gccttggtac 3660
atctggctgg gctttatcgc cggactgatt gccatcgtga tggtcacaat catgctgtgt 3720
tgcatgacca gctgctgtag ctgcctgaag ggctgttgta gctgtggctc ctgctgcaag 3780
ttcgacgagg acgattctga gcccgtgctg aaaggcgtga agctgcacta cacctga 3837

Claims (8)

1.一种编码新型冠状病毒B.1.1.529变异株刺突蛋白的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有权利要求1所述多核苷酸的重组人5型腺病毒，所述重组人5型腺病毒表达权利要求1所述多核苷酸分子编码的新型冠状病毒B.1.1.529变异株刺突蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组人5型腺病毒，其特征在于，所述重组人5型腺病毒为重组人5型复制缺陷型腺病毒。
4.根据权利要求3所述的重组人5型腺病毒，其特征在于，所述重组人5型腺病毒为E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。
5.权利要求2-4任一所述的重组人5型腺病毒在制备预防新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组人5型腺病毒被制备为注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。
7.一种制备权利要求2-4任一所述的重组人5型腺病毒的制备方法，所述方法包含以下步骤：
（1）构建包含权利要求1所述编码新型冠状病毒B.1.1.529变异株刺突蛋白的多核苷酸分子的穿梭质粒载体；
（2）将步骤（1）所述穿梭载体与骨架质粒共转宿主细胞，包装重组复制缺陷型腺病毒。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤（2）所述宿主细胞为HEK293细胞。
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