CN114106116A

CN114106116A - 一种腺病毒载体重组新冠病毒b.1.617.2变异株疫苗及其应用

Info

Publication number: CN114106116A
Application number: CN202111585888.6A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 王步森; 侯利华; 徐婧含; 吴诗坡; 张哲�; 赵拯浩; 张金龙; 宋小红; 王玉东; 付玲; 陈旖
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114106116B

Abstract

本发明公开了一种以人5型复制缺陷型腺病毒为载体的新冠变异株疫苗。所述疫苗以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，基因组中整合有经优化设计的新型冠状病毒B.1.617.2变异株刺突蛋白突变体编码基因（Ad5‑nCoV‑B.1.617.2）。该疫苗在宿主细胞中可以有效表达保护性抗原蛋白。使用该疫苗单次免疫即可激发针对B.1.617.2变异株的特异性抗体反应。与2019野生型新型冠状病毒疫苗联用，疫苗加强免疫后可以激发强烈且广谱的新冠病毒变异株中和抗体反应，具有显著的应用优势，尤其在异型加强免疫以及应对新冠B.1.617.2变异株疫情中优势尤为突出，可作为疫苗候选株，用于应对持续蔓延的新冠变异株疫情。

Description

一种腺病毒载体重组新冠病毒B.1.617.2变异株疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种重组新型冠状病毒B.1.617.2变异株疫苗。

背景技术

新冠病毒为RNA病毒，在持续传播过程中极易产生突变，并自然筛选出传播能力增强的优势变异株。B.1.617.2（Delta, 德尔塔）变异株样本最早于2020年3月采集自美国，随后在南非、印度尼西亚、英国等地相继采集到的该类型变异株样本，2020年10月份以后突变株在印度大量出现，该变体被确定为印度第二波疫情的驱动因素之一。2021年5月，B.1.617.2变异株开始在全球迅速蔓延；7月初，B.1.617.2变异株已在至少98个国家和地区出现；8月以后，全球范围内采集的新冠病毒株中，95%以上为B.1.617.2变异株；至2021年10月，B.1.617.2变异株覆盖率接近100%。

B.1.617.2变异株含有L452R、T478K、P681R等重要突变位点，导致该流行株一定程度上能够逃逸新冠原型株（记为“新冠病毒野生株”，下同）疫苗激发的抗体，进而引起新冠疫苗失效或保护力降低，为新冠疫情防控工作带来巨大压力。以新冠病毒野生株刺突蛋白为靶标抗原研制的疫苗mRNA-1273经两剂免疫，对新冠病毒野生株感染的保护率超过90%，然而针对德尔塔变异株保护率下降至约73%。同时，在卡塔尔开展的临床试验显示，另一款以新冠病毒野生株刺突蛋白为靶抗原的疫苗BNT162b2，两剂接种后有效率为51.9%，然而在相同地区该疫苗对Alpha型和Beta型突变株有效率超过75%。

本申请人前期研发的非复制型5 型腺病毒载体重组新型冠状病毒疫苗（CN111218459A）的I、II 期临床试验显示，该疫苗在受试者中有良好的安全性，99.5%的受试者产生了特异抗体，90%的受试者产生了特异性细胞免疫反应。同时，III期临床结果显示，单剂接种14 天后预防所有症状新冠肺炎的保护效力为68.8%，预防重症新冠肺炎的保护效力为95.5%，显示了优异的保护效果。然而，该疫苗同样为新冠病毒野生株刺突蛋白为主要保护性抗原构建而成。考虑到B.1.617.2在全球范围内广泛流行，同时新冠野生株疫苗对B.1.617.2病毒感染的保护率显著下降，本发明的目的就是提供一种针对新冠病毒B.1.617.2变异株的疫苗，以应对持续蔓延的变异株新冠疫情。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种应对新型冠状病毒B.1.617.2变异株的刺突蛋白突变体，所述刺突蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。。

其次，本发明提供了编码上述新型冠状病毒B.1.617.2变异株刺突蛋白突变体的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。

第三，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。所述多核苷酸以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体新型冠状病毒。

第四，本发明提供了上述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒在制备预防新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒被制备为注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。

在一个更为优选的实施方案中，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒被制备为肌肉注射剂。

最后，本发明提供了一种表达上述新型冠状病毒B.1.617.2变异株抗原蛋白的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒的方法，所述方法包含以下步骤：

（1）构建包含上述编码新型冠状病毒B.1.617.2变异株刺突蛋白突变体的多核苷酸的穿梭质粒载体；

（2）将步骤（1）获得的穿梭质粒载体与骨架质粒共转宿主细胞，包装重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒；

（3）培养步骤（2）获得的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒。

在一个优选的实施方案中，步骤（1）所述载体为pDC316。

在另一个优选的实施方案中，步骤（2）所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre。

在又一个优选的实施方案中，步骤（2）所述宿主细胞为HEK293细胞。

本发明提供的可表达新型冠状病毒B.1.617.2变异株抗原蛋白的重组腺病毒作为新型冠状病毒疫苗，其在免疫小鼠后具有良好的免疫原性。与已经上市的5型腺病毒载体新冠野生株疫苗（Ad5-nCoV）相比，单剂免疫4周后，针对野生株S蛋白的结合抗体基本相当，真病毒中和抗体下降约3.4倍；然而，针对新冠B.1.617.2变异株S蛋白的结合抗体增强约1.7倍，真病毒中和抗体增强约7.4倍。在联合免疫研究中，使用Ad5-nCoV初免，4周后以B.1.617.2变异株疫苗进行加强免疫，加强免疫2周后，针对新冠野生株中和抗体增强约84.07倍，针对新冠B.1.617.2变异株的真病毒中和抗体增强约173.65倍，针对新冠B.1.351变异株的真病毒中和抗体增强约149.18倍。使用Ad5- nCoV-B.1.617.2变异株疫苗同Ad5-nCoV野生株疫苗联用进行异型加强免疫，与使用Ad5-nCoV同型加强免疫相比，针对新冠野生株以及B.1.617.2、B.1.351（Beta）变异株的结合抗体、中和抗体、假病毒中和抗体均显著增强，对B.1.1.7（Alpha）、P.1（Gamma）、B.1.617.1（Kappa）变异株的假病毒中和抗体同样显著提高。结果表明，本发明方案可以用作单独免疫以应对新冠B.1.617.2变异株疫情，也可与Ad5-nCoV联合使用以诱导更加强烈且广谱的中和抗体反应，为应对新冠疫情提供重要疫苗候选株参考。

附图说明

图1 新冠B.1.617.2变异株核酸序列优化前、后GC含量分布图。

图2. 新冠B.1.617.2变异株核酸序列优化前、后DNA拟合二级结构信息对比图。

图3. 新冠B.1.617.2变异株核酸序列优化前、后密码子分布对比图。

图4. 质粒pDC316-nCoV-B.1.617.2图谱，片段nCoV-B.1.617.2-S制备完成后，克隆至pDC316穿梭质粒中获得。

图5. 重组新型冠状病毒B.1.617.2变异株疫苗S蛋白表达水平电泳图。其中，“NC”组和“Ad5-Null”组分别为细胞对照和Ad5空载体对照，Ad5-nCoV为5型腺病毒载体重组新型冠状病毒野生株疫苗对照组，Ad5-nCoV-B.1.617.2为本申请所述方案实验组。

图6. Ad5-nCoV-B.1.617.2诱导产生结合抗体和中和抗体水平。A, 针对新冠野生株S蛋白结合抗体水平；B，针对新冠B.1.617.2变异株S蛋白结合抗体水平；C，针对新冠野生株真病毒中和抗体水平；D，针对新冠B.1.617.2变异株真病毒中和抗体水平；E针对新冠野生株的抗体质量；F，针对新冠B.1.617.2变异株的抗体质量。

图7. Ad5-nCoV初免，并使用Ad5-nCoV-B.1.617.2加强免疫后中和抗体水平对比结果。A~C分别为加强前与加强免疫2周后针对野生株和B.1.351、B.1.617.2变异株中和抗体反应。

图8.与Ad5-nCoV同型加强免疫对比，使用Ad5-nCoV和Ad5-nCoV-B.1.617.2异型加强免疫4周后结合抗体、中和抗体水平。A~B分别为针对野生株的结合抗体和中和抗体水平，C~D分别为针对B.1.617.2变异株的结合抗体和中和抗体水平，E~F分别为针对B.1.351变异株的结合抗体和中和抗体水平。

图9. 与Ad5-nCoV同型加强免疫对比，使用Ad5-nCoV和Ad5-nCoV-B.1.617.2异型加强免疫4周后假病毒中和抗体水平。A~F分别为针对野生株、B.1.617.2、B.1.1.7、B.1.351、P.1和B.1.617.1变异株的假病毒中和抗体水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

除非另外指明，下述实施例中所用的出发质粒、酶、相关试剂均可从市售公司购买得到。

实施例1：以人复制缺陷型5型腺病毒为载体的重组新型冠状病毒B.1.617.2变异株疫苗的制备

1.1 新冠B.1.617.2变异株抗原蛋白筛选与设计

2021年1月，新冠B.1.617.2变异株在印度大规模爆发之前，曾在印度尼西亚出现小规模流行。我们选取1月采集自印度尼西亚的样本（GISAID Accession ID: EPI_ISL_1969244）为模板，获得变异株刺突（Spike, S）蛋白序列。在此基础上，为保证蛋白的稳定性、完整性以及提高表达水平的前提下，对蛋白结构进行了突变。首先，将其原始信号肽替换为组织纤溶酶原激活物信号肽（tPA），同时将986位赖氨酸替换为脯氨酸，将987位缬氨酸替换为脯氨酸，以提高S蛋白稳定性以及表达水平。此外，将第682位、683位和685位精氨酸进行缺失，以此敲除蛋白序列中弗林蛋白酶切位点，防止S蛋白被水解为S1和S2两条肽段，保证抗原表达后的完整性。相应优化设计突变分别位于蛋白S1区N端和C端以及S2区，均位于受体结合区之外，可有效保持S蛋白免疫原性。优化设计后的变异株抗原蛋白序列见SEQID NO：1。

1.2 新冠B.1.617.2变异株抗原蛋白基因优化与合成

根据筛选设计后的变异株抗原蛋白序列，依据密码子偏好性，将刺突蛋白基因中的稀有密码子更改为哺乳动物细胞最佳密码子，同时剔除用于克隆的的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，提高GC碱基含量，降低mRNA中AU富集区数量，进一步稳定核酸结构，结果如图1-3所示。

优化过程通过提高GC含量增强核酸稳定性。优化前序列长度3816bp，碱基A为1125个，占29.48%、C为718个，占18.82%、G为704个占18.45%、T为1269个，占33.25%（图1之 A）。序列优化后序列长度3840bp，A为913个，占23.78%、C为1189个，占30.96%、G为1003个，占26.12%、T为735个，占19.14%（图1之 B），GC碱基含量从37.27%提高到57.08%。由于AT配对需要2个氢键，GC配对需要3个氢键，因此，GC碱基含量的提高显著提高了DNA双链配对以及mRNA二级结构的稳定性。此外，优化后的基因，其GC含量的分布更加均匀，明显减少了高GC含量区和高AT含量区。因此，优化显著改善了刺突蛋白核酸稳定性。

优化过程通过改善DNA二级结构增强核酸稳定性。优化前的DNA拟合二级结构见图2之A，优化后DNA拟合二级结构见图2之B。基因优化过程，进一步降低DNA分子中重复序列和发夹结构数量，核酸分子自由能显著降低。因此，优化显著改善了核酸分子二级结构，稳定性显著增强。

优化过程通过降低稀有密码子使用频率提高基因表达效率。由于优化前序列中含有较多的哺乳动物稀有密码子，很难在哺乳动物细胞中高效表达。优化前、后核酸序列的稀有密码子分析结果见图3之A和图3之B，结果显示，刺突蛋白核酸序列的稀有密码子含量显著降低，高频密码子使用频率显著提高。提高哺乳动物中高频密码子含量，会增进哺乳动物细胞中对应tRNA的利用效率，进而提高蛋白合成中的原料使用效率，提高相应蛋白在哺乳动物细胞中表达水平。

其次，在起始密码子前添加Kozak序列（GCCGCCACC），以提高抗原蛋白表达水平。合成或制备优化设计后的变异株抗原蛋白基因序列见SEQ ID NO:2。

1.3 重组病毒疫苗包装与体外表达鉴定

在基因合成过程中，将合成后的产物克隆至pDC316载体（加拿大MicrobixBiosystems Inc .）中，所得质粒（pDC316-nCoV-B.1.617.2）图谱如图4所示。将pDC316-nCoV-B.1.617.2质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1 ,3Cre（加拿大Microbix BiosystemsInc .）共转染HEK293细胞，使用含5% FBS的DMEM培养基维持培养至细胞病变。在维持培养过程中，pDC316载体中含有腺病毒左侧反向重复序列、包装信号序列及抗原基因的部分片段，依赖Cre/Loxp位点特异性重组与病毒骨架序列拼接，形成病毒完整基因组，启动子代病毒合成与组装。随着子代病毒的不断合成，细胞病变逐渐加重，待90%以上细胞完全病变并从皿底脱落后，1000g离心10分钟收集病变细胞，加入适量PBS，-80℃/37℃反复冻融3次后，取上清收集重组腺病毒，随后于-80℃冻存。使用该病毒种子，在HEK293细胞中，连续传3代，收集第三代病毒，对病毒进行测序鉴定。

测定验证后的病毒滴度，以MOI=1感染HEK293细胞，24小时后收集细胞进行Western Blot鉴定，结果如图5所示，“NC”组和“Ad5-Null”组分别为细胞对照和Ad5空载体对照，Ad5-nCoV（CN111218459A）为新型冠状病毒野生株疫苗对照，Ad5-nCoV-B.1.617.2为本申请所述方案B.1.617.2变异株疫苗感染HEK293细胞后的S蛋白表达情况。对比显示，Ad5-nCoV-B.1.617.2变异株感染细胞后，S蛋白表达水平与Ad5-nCoV相近。另外，由于变异株疫苗S蛋白敲除了弗林蛋白酶位点，所以S蛋白均以全长形式出现，而Ad5-nCoV的S蛋白会部分水解，出现S1条带。

实施例2：新冠B.1.617.2变异株疫苗免疫反应评价

使用肌肉注射方式，经大腿内侧注射100 μl含5×10⁸ VP疫苗样品，小鼠于免后4周取血，分离血清，分别用于结合抗体、中和抗体和假病毒中和抗体检测。

2.1 新冠B.1.617.2变异株疫苗诱导更高水平的结合抗体反应

分别以新冠野生株（Genebank编号：NC_045512.2）和B.1.617.2变异株的S蛋白作为抗原，利用ELISA法检测血清中特异性IgG抗体滴度，检测结果如图6之A和图6之B所示（*,P<0 .05；** ,P<0 .01；*** ,P<0 .001）。

腺病毒载体重组疫苗经肌肉注射免疫4周后，抗体滴度接近峰值水平，因此我们将免后4周作为体液免疫评价的主要检测点。与Ad5-nCoV相比，B.1.617.2变异株疫苗免疫后可以激发同等或略高水平针对野生型S蛋白的结合抗体反应（图6之A），而针对B.1.617.2变异株S蛋白的结合抗体反应显著高于Ad5-nCoV组（t检验，P<0.001），其几何均值约为后的1.7倍（图6之B）。

2.2 新冠B.1.617.2变异株疫苗诱导更高水平的中和抗体反应

使用新冠野生株和B.1.617.2变异株病毒，利用微孔板病变法分别检测针对两种真病毒的中和抗体滴度，检测结果如图6之C和图6之D所示（* ,P<0 .05；** ,P<0 .01；***,P<0 .001）。

使用Ad5-nCoV野生株疫苗与Ad5-nCoV-B.1.617.2变异株疫苗免疫4周后，小鼠血清中针对新冠野生株的中和抗体几何均值分别为92和27， B.1.617.2变异株疫苗诱导的针对野生株的中和抗体降低3.4倍（t检验，P<0.001）；然而，二者针对新冠B.1.617.2变异株的中和抗体几何均值分别为22和171，Ad5-nCoV-B.1.617.2变异株疫苗诱导的针对B.1.617.2变异株的中和抗体几何均值比Ad5-nCoV高约7.4倍（t检验，P<0.001）。另外，该结果印证了以野生型S蛋白为免疫原制备的新冠疫苗，激发的针对B.1.617.2变异株中和抗体水平下降。与此同时，Ad5-nCoV-B.1.617.2疫苗激发的针对野生株的中和抗体水平也相应下降，但是针对B.1.617.2中和抗体增强程度高于针对野生株抗体下降程度。考虑到B.1.617.2变异株的高传播性及广覆盖率，该变异株疫苗仍然具有一定的应用优势。

此外，我们将中和抗体与对应的结合抗体滴度作比，记作“抗体质量”，以此表征中和抗体在结合抗体中的比重，见图6之E和6之F。Ad5-nCoV激发的针对新冠病毒野生株的抗体质量显著高于Ad5-nCoV-B.1.617.2（图6之E，t检验，P<0.001），而Ad5-nCoV-B.1.617.2对新冠B.1.617.2变异株的抗体质量则显著高于Ad5-nCoV（t检验，P<0.01），该结果表明变异株和野生型毒株存在明显的抗原性差异，二者的中和抗体表位可能具有显著变化，提示新型特异性针对变异株的疫苗和抗体研发势在必行。

2.3 新冠B.1.617.2变异株疫苗与Ad5-nCoV联合加强免疫，中和抗体水平显著提高

我们进一步评价了，使用Ad5-nCoV初免4周后，再以Ad5-nCoV-B.1.617.2变异株疫苗进行加强免疫的效果（图7）。结果显示，变异株疫苗加强免疫2周后，中和抗体反应显著增强。其中，针对野生株中和抗体几何均值约增强84.07倍（图7之A，t检验，P<0.001），针对B.1.617.2变异株中和抗体均值约增强173.65倍（图7之C，t检验，P<0.001），针对免疫原性变化较大的B.1.351变异株中和抗体均值提高了149.18倍（图7之B，t检验，P<0.001）。该结果表明，使用Ad5-nCoV-B.1.617.2变异株疫苗与当前上市的Ad5-nCoV野生株疫苗联用，可以有效提高针对野生型、Delta型和Beta型新冠病毒广谱中和抗体水平。

2.4 新冠B.1.617.2变异株疫苗与Ad5-nCoV异型加强免疫后，抗体水平显著高于同型加强

为了进一步验证B.1.617.2变异株疫苗与野生株疫苗联用的优势，我们比较了同型加强（Ad5-nCoV + Ad5-nCoV）和异型加强（Ad5-nCoV + Ad5-B.1.617.2）免疫后抗体水平差异，使用Ad5-nCoV免疫20只小鼠，4周后，使用Ad5-nCoV和Ad5-B.1.617.2分别免疫10只小鼠进行同型和异型加强免疫。

加强免疫4周后，结合抗体和中和抗体水平见图8。其中，异型免疫针对新冠野生株的结合抗体和中和抗体，较同型免疫分别增强4.19倍（图8之A，t检验，P<0.001）和2.83倍（图8之B，t检验，P<0.01）；针对新冠B.1.617.2变异株的结合抗体和中和抗体，较同型免疫分别增强5.52倍（图8之C，t检验，P<0.001）和4.78倍（图8之D，t检验，P<0.001）；针对新冠B.1.351变异株的结合抗体和中和抗体，较同型免疫分别增强4.30倍（图8之E，t检验，P<0.001）和3.40倍（图8之F，t检验，P<0.05）。

2.5 新冠B.1.617.2变异株疫苗与Ad5-nCoV异型加强免疫可激发新冠多型别变异株广谱中和抗体反应

我们分别合成了野生株和B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.1和B.1.617.2 S蛋白基因序列，并将序列嵌入pCAGGS质粒，用于细胞内过表达新冠S蛋白。将pCAGGS质粒与pNL4-3.Luc-R-E−骨架质粒共转染HEK293细胞系，收集48小时和72小时后培养上清，制得HIV骨架新冠变异株假病毒。使用该假病毒与小鼠血清中和，随后感染ACE2稳转细胞系（HEK293-ACE2），检测萤火虫荧光素酶表达水平，用于定量检测加强免疫4周后小鼠血清假病毒中和抗体，结果见图9。

与真病毒中和抗体结果一致，Ad5-nCoV-B.1.617.2异型加强免疫4周后，小鼠体内激发更高水平的新冠野生株和B.1.617.2变异株假病毒中和抗体水平，与同型免疫相比，分别增强2.98倍（图9之A，t检验，P<0.01）和4.72倍（图9之B，t检验，P<0.05）。而针对免疫原性变化较大的B.1.351变异株，假病毒中和抗体水平增强3.54倍（图9之D，t检验，P<0.05）。此外，对于曾在欧洲大范围流行的B.1.1.7株、在巴西大规模爆发的P.1株以及同样在印度出现的B.1.617.1变异株，异型免疫比同型免疫分别提高了3.74倍（图9之C，t检验，P<0.001），2.40倍（图9之E，t检验，P<0.05）和3.77倍（图9之F，t检验，P<0.001）。结果表明，与野生株疫苗同型加强免疫相比，Ad5-nCoV-B.1.617.2变异株疫苗与Ad5-nCoV野生株疫苗异型加强免疫可以诱导更加强烈且广谱的针对野生株或多种变异株型的中和抗体反应。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种腺病毒载体重组新冠病毒B.1.617.2变异株疫苗及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1279

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Asn Ser Ser Gln Cys Val Asn Leu Arg Thr Arg

20 25 30

Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr

35 40 45

Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp

50 55 60

Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His

65 70 75 80

Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro

85 90 95

Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile

100 105 110

Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu

115 120 125

Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe

130 135 140

Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Asp Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn

145 150 155 160

Lys Ser Trp Met Glu Ser Gly Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr

165 170 175

Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln

180 185 190

Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly

195 200 205

Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp

210 215 220

Leu Pro Gln Gly Phe Ser Val Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile

225 230 235 240

Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser

245 250 255

Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala

260 265 270

Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr

275 280 285

Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro

290 295 300

Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly

305 310 315 320

Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

325 330 335

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

340 345 350

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

355 360 365

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

370 375 380

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

385 390 395 400

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

405 410 415

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

420 425 430

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

435 440 445

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu

450 455 460

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

465 470 475 480

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

485 490 495

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

500 505 510

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

515 520 525

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

530 535 540

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val

545 550 555 560

Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg

565 570 575

Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu

580 585 590

Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr

595 600 605

Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val

610 615 620

Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro

625 630 635 640

Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala

645 650 655

Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp

660 665 670

Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn

675 680 685

Ser Arg Ala Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser

690 695 700

Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile

705 710 715 720

Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser

725 730 735

Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser

740 745 750

Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln

755 760 765

Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr

770 775 780

Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile

785 790 795 800

Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser

805 810 815

Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val

820 825 830

Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly

835 840 845

Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu

850 855 860

Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr

865 870 875 880

Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala

885 890 895

Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe

900 905 910

Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu

915 920 925

Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu

930 935 940

Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asn Val Val Asn Gln

945 950 955 960

Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe

965 970 975

Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro

980 985 990

Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln

995 1000 1005

Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile

1010 1015 1020

Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu

1025 1030 1035 1040

Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met

1045 1050 1055

Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr

1060 1065 1070

Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys

1075 1080 1085

His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1090 1095 1100

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile

1105 1110 1115 1120

Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile

1125 1130 1135

Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp

1140 1145 1150

Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro

1155 1160 1165

Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn

1170 1175 1180

Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn

1185 1190 1195 1200

Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile

1205 1210 1215

Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala

1220 1225 1230

Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser

1235 1240 1245

Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu

1250 1255 1260

Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270 1275

<210> 2

<211> 3840

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggacgcca tgaagcgggg cctctgctgt gttctgctgc tctgcggcgc cgtgttcgtg 60

agtaactcga gccagtgcgt gaacctgaga accagaacac agctgcctcc agcctacacc 120

aacagcttca ccagaggcgt gtactacccc gacaaggtgt tcagatccag cgtgctgcac 180

tctacccagg acctgttcct gcctttcttc agcaacgtga cctggttcca cgccatccac 240

gtgagcggca ccaatggcac caagagattc gacaaccccg tgctgccctt caacgacggg 300

gtgtactttg ccagcaccga gaagtccaac atcatcagag gctggatctt cggcaccaca 360

ctggacagca agacccagag cctgctgatc gtgaacaacg ccaccaacgt ggtcatcaaa 420

gtgtgcgagt tccagttctg caacgacccc ttcctggacg tgtactacca caagaacaac 480

aagagctgga tggaaagcgg cgtgtacagc agcgccaaca actgcacctt cgagtacgtg 540

tcccagcctt tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca acttcaagaa cctgcgcgag 600

ttcgtgttca agaacatcga cggctacttc aagatctaca gcaagcacac ccctatcaac 660

ctcgtgcggg atctgcctca gggcttctct gtgctggaac ccctggtgga tctgcccatc 720

ggcatcaaca tcacccggtt tcagacactg ctggccctgc acagaagcta cctgacacct 780

ggcgatagca gctctggatg gacagctggc gccgctgcct actatgtggg atacctgcag 840

cctcggacct tcctgctgaa gtacaacgag aacggcacca tcaccgacgc cgtggattgt 900

gctctggatc ctctgagcga gacaaagtgc accctgaagt ccttcaccgt ggaaaagggc 960

atctaccaga ccagcaactt ccgggtgcag cccaccgaat ccatcgtgcg gttccccaat 1020

atcaccaatc tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaatgcca ccagattcgc ctctgtgtac 1080

gcctggaacc ggaagcggat cagcaattgc gtggccgact actccgtgct gtacaactcc 1140

gccagcttca gcaccttcaa gtgctacggc gtgtccccta ccaagctgaa cgacctgtgc 1200

ttcacaaacg tgtacgccga cagcttcgtg atccggggag atgaagtgcg gcagattgcc 1260

cctggacaga caggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgacga cttcaccggc 1320

tgtgtgattg cctggaacag caacaacctg gactccaaag tcggcggcaa ctacaattac 1380

agataccggc tgttccggaa gtccaatctg aagcccttcg agcgggacat ctccaccgag 1440

atctatcagg ccggcagcaa gccttgtaac ggcgtggagg gcttcaactg ctacttccca 1500

ctgcagtcct acggcttcca gccaacaaac ggcgtgggct accagcctta cagagtggtg 1560

gtgctgagct tcgagctgct gcatgctcct gccacagtgt gcggccctaa gaaaagcacc 1620

aatctcgtga agaacaaatg cgtgaacttc aacttcaacg gcctgaccgg caccggcgtg 1680

ctgacagaga gcaacaagaa gttcctgcca ttccagcagt tcggccggga catcgccgat 1740

accacagatg ccgtcagaga tccccagaca ctggaaatcc tggacatcac cccttgcagc 1800

ttcggcggag tgtctgtgat cacccctggc accaacacca gcaatcaggt ggcagtgctg 1860

taccagggcg tgaactgtac agaggtgcca gtggccattc acgccgatca gctgacccct 1920

acttggcggg tgtactccac aggcagcaat gtgtttcaga ccagagccgg ctgtctgatc 1980

ggagccgagc acgtgaacaa tagctacgag tgcgacatcc ccatcggcgc tggcatctgc 2040

gcctcttacc agacacagac caatagcaga gccagcgtgg ccagccagag catcattgcc 2100

tacacaatgt ctctgggcgc cgagaactct gtggcctact ccaacaactc tatcgctatc 2160

cccaccaact tcaccatcag cgtgaccaca gagatcctgc ctgtgtccat gaccaagacc 2220

agcgtggact gcaccatgta catctgcggc gattccaccg agtgctccaa cctgctgctg 2280

cagtacggca gcttctgcac ccagctgaat agagccctga cagggatcgc cgtggaacag 2340

gacaagaaca cccaagaggt gttcgcccaa gtgaagcaga tctacaagac ccctcctatc 2400

aaggacttcg gcggcttcaa tttcagccag attctgcccg atcctagcaa gcccagcaag 2460

cggagcttca tcgaggacct gctgttcaac aaagtgacac tggccgacgc cggcttcatc 2520

aagcagtatg gcgattgtct gggcgacatt gccgccaggg atctgatttg cgcccagaag 2580

tttaacggac tgacagtgct gcctcctctg ctgaccgatg agatgatcgc ccagtacaca 2640

tctgccctgc tggccggcac aatcacaagc ggctggacat ttggagctgg cgctgccctg 2700

cagatcccct ttgctatgca gatggcctac cggttcaacg gcatcggagt gacccagaat 2760

gtgctgtacg agaaccagaa gctgatcgcc aaccagttca acagcgccat cggcaagatc 2820

caggacagcc tgagcagcac agcaagcgcc ctgggaaagc tgcagaacgt ggtcaaccag 2880

aatgcccagg cactgaacac cctggtcaag cagctgtcta gcaacttcgg cgccatctct 2940

agcgtgctga acgatatcct gagcagactg gaccctcctg aagccgaggt gcagatcgac 3000

agactgatca ccggaaggct gcagtccctg cagacctacg ttacccagca gctgatcaga 3060

gccgccgaga ttagagcctc tgccaatctg gccgccacca agatgtctga gtgtgtgctg 3120

ggccagagca agagagtgga cttttgcggc aagggctacc acctgatgag cttccctcag 3180

tctgctcctc acggcgtggt gtttctgcac gtgacatacg tgcccgctca agagaagaat 3240

ttcaccaccg ctccagccat ctgccacgac ggcaaagccc actttcctag agaaggcgtg 3300

ttcgtgtcca acggcaccca ttggttcgtg acccagcgga acttctacga gccccagatc 3360

atcaccacag acaacacctt cgtgtccggc aactgcgacg tcgtgatcgg cattgtgaac 3420

aataccgtgt acgaccctct gcagcccgag ctggacagct tcaaagagga actggataag 3480

tactttaaga accacacaag ccccgacgtg gacctgggcg atatcagcgg aatcaatgcc 3540

tccgtcgtga acatccagaa agagatcgac cggctgaacg aggtggccaa gaatctgaac 3600

gagagcctga tcgacctgca agaactgggg aagtacgagc agtacatcaa gtggccttgg 3660

tacatctggc tgggctttat cgccggactg attgccatcg tgatggtcac aatcatgctg 3720

tgttgcatga ccagctgctg tagctgcctg aagggctgtt gtagctgtgg ctcctgctgc 3780

aagttcgacg aggacgattc tgagcccgtg ctgaaaggcg tgaagctgca ctacacctga 3840

Claims

1.一种新型冠状病毒B.1.617.2变异株刺突蛋白突变体，其特征在于，所述刺突蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码权利要求1所述新型冠状病毒B.1.617.2变异株刺突蛋白突变体的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种含有权利要求2所述多核苷酸的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒，其特征在于，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒表达权利要求1所述新型冠状病毒B.1.617.2变异株刺突蛋白突变体。

4.根据权利要求3所述的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒在制备预防新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒被制备为注射剂、滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒被制备为肌肉注射剂。

7.一种制备权利要求3所述的重组E1、E3联合缺失的人5型复制缺陷型腺病毒的方法，所述方法包含以下步骤：

（1）构建包含权利要求2所述多核苷酸的穿梭质粒载体；

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤（1）所述载体为pDC316。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤（2）所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre。

10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤（2）所述宿主细胞为HEK293细胞。