CN117986378A - 融合蛋白、核酸分子、重组表达载体以及药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种融合蛋白、核酸分子、重组表达载体以及药物组合物,所述融合蛋白包括串联的至少两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域,所述融合蛋白、所述核酸分子、所述重组表达载体、所述重组病毒以及所述药物组合物均能应用于制备治疗或预防SARS‑CoV‑2病毒感染的疫苗和/或药物,具有免疫效果理想和免疫持久性长的优点。
Description
技术领域
本申请涉及生物制药领域,具体涉及一种融合蛋白、核酸分子、重组表达载体以及药物组合物。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2,简称新冠病毒)是一种呼吸道病原体,SARS-CoV-2属于冠状病毒科β冠状病毒属,具有囊膜,SARS-CoV-2为正链RNA病毒。SARS-CoV-2具有较强的传染性、较长的潜伏期以及高隐蔽性特点。
SARS-CoV-2包括刺突蛋白(Spike,S蛋白)、包膜蛋白(Envelope,E蛋白)、膜蛋白(Membrane/matrix,M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋白)四个结构蛋白,其中,S蛋白包括S1亚基,所述S1亚基上具有RBD结构域(Receptor binding domain,RBD),通过RBD结构域与人体细胞上的ACE2受体蛋白相结合,使得SARS-CoV-2感染人体细胞。
目前,虽然已有一些COVID-19疫苗问世,但是现有COVID-19疫苗的研发主要基于SARS-CoV-2原型的S蛋白,存在免疫原性不足的问题,导致现有的COVID-19疫苗诱导机体产生中和抗体的水平有限,并且对SARS-CoV-2变异株的保护效果不佳。因此,提供一种免疫原性理想的融合蛋白对COVID-19疫苗的应用与发展具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足之处,本申请提供了一种融合蛋白、核酸分子、重组表达载体以及药物组合物。
本申请的技术方案如下:
第一方面,本申请提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白包括串联的至少两种SARSCoV 2病毒株的RBD受体结构域,所述至少两种SARS CoV 2病毒株中任意两种SARS CoV 2病毒株彼此不相同;
其中,所述任意两种SARS CoV 2病毒株为下述任意一种情况:
(Ⅰ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株分别为SARS CoV 2的不同变异株;
(Ⅱ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的原型株,另一者为SARS CoV 2的变异株;
(Ⅲ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的第一种变异株,另一者为SARS CoV 2的第二种变异株的亚变异株;
(Ⅳ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株分别为SARS CoV 2的同一变异株的不同亚变异株;
(Ⅴ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的第一种变异株的亚变异株,另一者为SARS CoV 2的第二种变异株的亚变异株。
可选地,所述融合蛋白包括串联的两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域,所述两种SARS CoV 2病毒株为下述任意一种情况:
(a)SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2和SARS CoV 2的Lambda变异株C.37;
(b)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2;
(c)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.2.75和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2;
(d)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5和SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.2.75;
(e)SARS CoV 2的Omicron亚变异株XBB和SARS CoV 2的Omicron亚变异株BQ.1.1。
可选地,所述融合蛋白包括串联的三种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域。进一步可选地,所述三种SARS CoV 2病毒株为:SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5、SARS CoV2的Omicron亚变异株BA.2.75和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2。
可选地,所述Delta变异株B.1.617.2的RBD区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,或者为与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,所述Lambda变异株C.37的RBD区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,或者为与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,所述Omicron亚变异株BA.5的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,或者为与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,所述Omicron亚变异株BA.2.75的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,或者为与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列。
可选地,所述融合蛋白还包括免疫球蛋白Fc片段,所述免疫球蛋白Fc片段位于任意两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间;或者,所述免疫球蛋白Fc片段与最靠近所述融合蛋白的C端的SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域的C端连接;
和/或,所述融合蛋白还包括信号肽,所述信号肽位于所述融合蛋白的N端;
和/或,所述融合蛋白还包括T4纤维蛋白三聚体,所述T4纤维蛋白三聚体位于所述融合蛋白的C端。
可选地,所述融合蛋白还包括一个或多个连接臂,所述连接臂位于任意两种SARSCoV 2病毒株的RBD受体结构域之间,和/或所述连接臂位于所述免疫球蛋白Fc片段与任意一种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间;
和/或,所述免疫球蛋白Fc片段选自lgG1-Fc片段或lgA1-Fc片段,所述lgG1-Fc片段为人类免疫球蛋白lgG1的Fc片段,所述lgA1-Fc片段为人类免疫球蛋白lgA1的Fc片段。
可选地,所述融合蛋白为下述任意一种情况:
(1)所述融合蛋白包括依序串联的所述Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂、所述Lambda变异株C.37的RBD受体结构域以及所述lgA1-Fc片段;
(2)所述融合蛋白包括依序串联的所述Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂、所述Lambda变异株C.37的RBD受体结构域以及所述lgG1-Fc片段;
(3)所述融合蛋白包括依序串联的所述Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂以及所述Lambda变异株C.37的RBD受体结构域;
(4)所述融合蛋白包括依序串联的所述Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、所述Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及所述免疫球蛋白Fc片段;
(5)所述融合蛋白包括依序串联的所述Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、连接臂、所述Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及所述免疫球蛋白Fc片段;
(6)所述融合蛋白包括依序串联的所述Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂以及所述Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域;
(7)所述融合蛋白包括依序串联的所述Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、所述Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域以及所述免疫球蛋白Fc片段;
(8)所述融合蛋白包括依序串联的所述Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、所述Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域以及所述T4纤维蛋白三聚体;
(9)所述融合蛋白包括依序串联的所述Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、第一连接子臂、所述Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、第二连接子臂、所述Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域;
(10)所述融合蛋白包括依序串联的所述Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、第一连接子臂、所述Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、第二连接子臂、所述Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及所述T4纤维蛋白三聚体;
(11)所述融合蛋白包括依序串联的所述Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、所述免疫球蛋白Fc片段以及所述Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域;
(12)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株XBB的RBD受体结构域、连接臂、Omicron亚变异株BQ.1.1的RBD受体结构域以及lgG1-Fc片段。
可选地,所述连接臂、所述第一连接子臂以及所述第二连接子臂的核苷酸序列如(GGGGS)n所示,其中,n表示GGGGS的重复次数,n为1至10之间的整数,优选n为1至5之间的整数,更优选n为3或4;
和/或,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,或者为与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,或者为与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,或者为与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示,或者为与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列。
第二方面,本申请提供了一种核酸分子,所述核酸分子包括:编码如第一方面中任意一种所述的融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
可选地,所述核酸分子包括:
第一核苷酸序列,用于编码所述(1)中融合蛋白的氨基酸序列,具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列,或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列至少具有80%相似性的核苷酸序列;
和/或,第二核苷酸序列,用于编码所述(2)中融合蛋白的氨基酸序列,具有如SEQID NO:9所示的核苷酸序列,或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列至少具有80%相似性的核苷酸序列;
和/或,第三核苷酸序列,用于编码所述(3)中融合蛋白的氨基酸序列,具有如SEQID NO:10所示的核苷酸序列,或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列至少具有80%相似性的核苷酸序列;
和/或,第四核苷酸序列,用于编码所述(12)中融合蛋白的氨基酸序列,具有如SEQID NO:20所示的核苷酸序列,或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列至少具有80%相似性的核苷酸序列。
第三方面,本申请还提供了一种重组表达载体,包括载体,以及装载于载体上的如第二方面中任意一种所述的核酸分子。
可选地,所述载体为腺病毒、安卡拉牛痘病毒或水泡性口炎病毒;
优选地,所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒;
更优选地,所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒;
和/或,所述重组表达载体还包括至少一个表达调控元件,所述表达调控元件与所述核酸分子可操作地连接。
第四方面,本申请还提供了一种重组病毒,所述重组病毒是将如第三方面中任意一种所述的重组表达载体转染病毒包装细胞,然后经细胞培养制备而成。
第五方面,本申请还提供了一种药物组合物,包括如第一方面中任意一种所述的融合蛋白、或如第二方面中任意一种所述的核酸分子、或如第三方面中任意一种所述的重组表达载体、或如第四方面中任意一种所述的重组病毒。
可选地,所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料;
和/或,所述药物组合物的剂型为雾化药剂、滴鼻剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂;
和/或,所述药物组合物为重组蛋白疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、重组病毒载体疫苗或抗SARS-CoV-2药物制剂。
可选地,所述药物组合物为重组蛋白疫苗,所述药物组合物包括如第一方面中任意一种所述的融合蛋白;
或者,所述药物组合物为DNA疫苗,所述药物组合物包括如第二方面中任意一种所述的核酸分子;
或者,所述药物组合物为mRNA疫苗,所述药物组合物包括编码如第一方面中任意一种所述的融合蛋白的mRNA序列;
或者,所述药物组合物为重组病毒载体疫苗,所述药物组合物包括如第三方面中任意一种所述的重组表达载体、或如第四方面中任意一种所述的重组病毒。
或者,所述药物组合物为抗SARS CoV 2药物制剂,所述药物组合物包括如第一方面中任意一种所述的融合蛋白、或如第二方面中任意一种所述的核酸分子、或如第三方面中任意一种所述的重组表达载体、或如第四方面中任意一种所述的重组病毒。
本申请提供了一种融合蛋白、核酸分子、重组表达载体以及药物组合物,具有如下技术效果:
所述融合蛋白包括串联的至少两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域,所述至少两种SARS CoV 2病毒株分别为SARS CoV 2的不同变异株,或者一者为SARS CoV 2的原型株且另一者为SARS CoV 2的变异株,或者一者为SARSCoV 2的第一种变异株且另一者为SARS CoV 2的第二种变异株的亚变异株,或者分别为SARS CoV 2的同一变异株的不同亚变异株,或者一者为SARS CoV 2的第一种变异株的亚变异株且另一者为SARS CoV 2的第二种变异株的亚变异株,所述融合蛋白能够诱导机体产生强效的免疫应答反应,并且针对SARSCoV 2的原型以及不同变异株均能产生较高水平的结合抗体滴度和中和抗体滴度,能够应用于制备治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物。
所述核酸分子、所述重组表达载体、所述重组病毒以及所述药物组合物均能应用于制备治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物,具有免疫效果理想和免疫持久性长的优点,所述疫苗和/或药物可以采用成熟的生产工艺进行规模化生产,以快速满足市场需求。
附图说明
下面结合附图,通过对本申请的具体实施方式详细描述,将使本申请的技术方案及其有益效果显而易见。
图1为本申请实施例中提供的Delta RBD-Lambda RBD-hIgA Fc融合蛋白(简称:DLA融合蛋白)的结构示意图;
图2为本申请实施例中提供的Delta RBD-Lambda RBD-hIgG1 Fc融合蛋白(简称:DLG融合蛋白)的结构示意图;
图3为本申请实施例中提供的Delta RBD-Lambda RBD融合蛋白(简称:DLO融合蛋白)的结构示意图;
图4为本申请实施例中提供的pAdC68XY3-DLA的结构示意图;
图5为本申请实施例中提供的pAdC68XY3-DLG的结构示意图;
图6为本申请实施例中提供的pAdC68XY3-DLO的结构示意图;
图7为本申请实施例中rAdC68XY3-DLA重组腺病毒基因组中的DLA基因片段、rAdC68XY3-DLG重组腺病毒基因组中的DLG基因片段以及rAdC68XY3-DLO重组腺病毒基因组中的DLO基因片段的鉴定电泳图谱,其中,泳道M代表DL10000 DNA maker,泳道1代表DLA基因片段,泳道2代表DLG基因片段,泳道3代表DLO基因片段;
图8为本申请实施例中纯化的rAdC68XY3-DLA重组腺病毒的电镜图;
图9为本申请实施例中rAdC68XY3-DLA重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱、rAdC68XY3-DLG重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品的WB图谱,以及rAdC68XY3-DLO重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品的WB图谱,其中,泳道M表示预染蛋白双色Maker,泳道C1表示HK293细胞上清液(阴性对照),泳道C2表示rAdC68XY3-GFP重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞培养上清液待检样品,泳道C3表示HK293细胞裂解液(阴性对照),泳道C4表示rAdC68XY3-GFP重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞裂解液待检样品,泳道1表示rAdC68XY3-DLA重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞培养上清液待检样品,泳道2表示rAdC68XY3-DLG重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞培养上清液待检样品,泳道3表示rAdC68XY3-DLO重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞培养上清液待检样品,泳道4表示rAdC68XY3-DLA重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞裂解液待检样品,泳道5表示rAdC68XY3-DLG重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞裂解液待检样品,泳道6表示rAdC68XY3-DLO重组腺病毒感染HK293细胞后获得的细胞裂解液待检样品;
图10为本申请实施例中纯化的rAdC68XY3-DLG重组腺病毒的电镜图;
图11为本申请实施例中纯化的rAdC68XY3-DLO重组腺病毒的电镜图;
图12为本申请实验例1中实验组1的试验小鼠血清中Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度、Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度以及lgA-Fc(免疫球蛋白lgA的Fc片段)结合抗体滴度水平图;
图13为本申请实验例1中实验组2的试验小鼠血清中Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度、Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度以及lgG-Fc(免疫球蛋白lgA的Fc片段)结合抗体滴度水平图;
图14为本申请实验例1中实验组3的试验小鼠血清中Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度以及Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度水平图;
图15为本申请实验例1中实验组4和实验组5的试验小鼠血清中SARS CoV 2原型株的RBD特异性IgG抗体滴度水平图;
图16为本申请实验例2中实验组1至实验组5的试验小鼠血清中SARS CoV 2的原型、Beta变异株B.1.351、Delta变异株B.1.617.2、Lambda变异株C.37、Omicron变异株BA.1、Omicron变异株BA.2.12.1和Omicron变异株BA.4的中和抗体滴度水平图。
具体实施方式
本申请研究了一种融合蛋白、核酸分子、重组表达载体、重组病毒以及药物组合物,所述融合蛋白包括串联的至少两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域,至少两种SARSCoV 2病毒株中任意两种SARS CoV 2病毒株彼此不相同。
其中,所述任意两种SARS CoV 2病毒株为下述任意一种情况:
(Ⅰ)任意两种SARS CoV 2病毒株分别为SARS CoV 2的不同变异株;
(Ⅱ)任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的原型株,另一种为SARSCoV 2的变异株;
(Ⅲ)任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的第一种变异株,另一者为SARS CoV 2的第二种变异株的亚变异株;
(Ⅳ)任意两种SARS CoV 2病毒株分别为SARS CoV 2的同一变异株的不同亚变异株;
(Ⅴ)任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的第一种变异株的亚变异株,另一者为SARS CoV 2的第二种变异株的亚变异株。
如本申请所用,“融合蛋白”是指通过重组DNA技术将不同的基因片段融合在一起,经表达后可以得到由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多结构域的人工蛋白。
如本申请所用,“至少两种”是指两种或两种以上。例如,“a、b或c中的至少两种”可表示为:a-b(即a和b)、b-c(即b和c)、a-c(即a和c)、或a-b-c(即a、b和c)。又如,“a、b、c或d中的至少两种”可表示为:a-b、a-c、a-d、b-c、b-d、c-d、a-b-c、a-b-d、a-c-d、或b-c-d。
如本申请所用,“SARS CoV 2的原型”是指代号为wuhan-hu-1、GenBank编号为MN908947的毒株。
如本申请所用,“SARSCoV 2的变异株”包括但不限于是SARS CoV 2的Alpha变异株B.1.1.7、SARS CoV 2的Beta变异株B.1.351、SARSCoV 2的Gamma变异株P.1、SARS CoV 2的SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2、SARS CoV 2的Omicron变异株B.1.1.529、SARS CoV2的Eta变异株B.1.525、SARS CoV 2的Lota变异株B.1.526、SARS CoV 2的Kappa变异株B.1.617.1或SARS CoV 2的Lambda变异株C.37。
如本申请所用,“亚变异株”是指单种SARS CoV 2的变异株的亚型株,亚型株可以为多个。例如,SARS CoV 2的Omicron变异株有多种亚型株,包括但不限于是BA.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、BA.2.75、BA.2.12.1、BA5.1.3、XBB和BQ.1.1。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白包括串联的两种病毒株的RBD受体结构域,两种SARS CoV 2病毒株为下述任意一种情况:
(a)SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2和SARS CoV 2的Lambda变异株C.37;
(b)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2;
(c)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.2.75和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2;
(d)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5和SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.2.75;
(e)SARS CoV 2的Omicron亚变异株XBB和SARS CoV 2的Omicron亚变异株BQ.1.1。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白包括串联的三种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域,三种SARS CoV 2病毒株为:SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5、SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.2.75和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2。
在本申请的一些实施例中,Delta变异株B.1.617.2的RBD区域的氨基酸序列如SEQID NO:1所示,或者为与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,Lambda变异株C.37的RBD区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,或者为与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,Omicron亚变异株BA.5的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,或者为与SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列;
和/或,Omicron亚变异株BA.2.75的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,或者为与SEQID NO:4所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列。
如本申请所用,“和/或”用于描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,“A和/或B”可以表示三种情况:第一种情况是单独存在A;第二种情况是同时存在A和B;第三种情况是单独存在B的情况,其中,A和B分别可以是单数或者复数。
如本申请所用,“相似性”是指两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的相关性,例如:Delta变异株B.1.617.2的RBD区域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列之间的相关性。在本申请实施例中,至少具有不低于90%相似性可以理解为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性,对应相似性的数值为整数;也可以进一步理解为90.1%、90.2%、90.3%、90.5%、91.2%、91.7%、92.2%、92.3%、92.8%、93.2%、93.5%、94.8%、94.5%、95.6%、95.9%、96.6%、96.7%、97.5%、97.8%、98.4%、98.9%、99.8%、或99.9%,但小于100%的序列相似性,对应相似性的数值为小数。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白还包括免疫球蛋白Fc片段,免疫球蛋白Fc片段位于两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间;或者,免疫球蛋白Fc片段与最靠近融合蛋白的C端的SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域的C端连接。
如本申请所用,“免疫球蛋白Fc片段”是指免疫球蛋白的可结晶片段(Fragmentcrystallizable,Fc),相当于免疫球蛋白恒定区的CH2和CH3结构域,Fc片段是免疫球蛋白与效应分子(细胞)相互作用的部位,Fc片段例如可以是免疫球蛋白IgG的Fc片段、免疫球蛋白IgA的Fc片段、免疫球蛋白IgE的Fc片段、免疫球蛋白IgD的Fc片段或免疫球蛋白IgM的Fc片段,免疫球蛋白的Fc片段例如来源于哺乳动物。
如本申请所用,“免疫球蛋白Fc片段位于任意两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间”应作广义理解,当融合蛋白仅包含两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域时,免疫球蛋白Fc片段可以位于这两种RBD受体结构域之间;当融合蛋白包含两种以上SARSCoV 2病毒株的RBD受体结构域时,可以任意相邻的两种RBD受体结构域之间均设置免疫球蛋白Fc片段,也可以是部分相邻的两种RBD受体结构域之间设置免疫球蛋白Fc片段。例如,融合蛋白包含依次串联的A-B-C,A、B和C分别为不同种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域,可以是A与B之间设有第一免疫球蛋白Fc片段且B与C之间设有第二免疫球蛋白Fc片段,也可以是A与B之间设有第一免疫球蛋白Fc片段且B与C之间直接串联,还可以是A与B之间直接串联且B与C之间设有第二免疫球蛋白Fc片段。
在本申请的一些实施例中,免疫球蛋白的Fc片段选自lgG1-Fc片段或lgA1-Fc片段,lgG1-Fc片段为人类免疫球蛋白lgG1的Fc片段,lgA1-Fc片段为人类免疫球蛋白lgA1的Fc片段。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白还包括一个或多个连接臂,连接臂位于任意两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间,和/或连接臂位于免疫球蛋白Fc片段与任意一种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间。
如本申请所用,“连接臂位于任意两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间”应作广义理解,当融合蛋白仅包含两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域时,连接臂可以位于这两种RBD受体结构域之间;当融合蛋白包含两种以上SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域时,可以任意相邻的两种RBD受体结构域之间均设置连接臂,也可以是部分相邻的两种RBD受体结构域之间设置连接臂。例如,融合蛋白包含依次串联的A-B-C,A、B和C分别为不同种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域,可以是A与B之间通过第一连接子臂连接且B与C之间通过第二连接子臂连接,也可以是A与B之间通过第一连接子臂连接且B与C之间直接串联,还可以是A与B之间直接串联且且B与C之间通过第二连接子臂连接。
同理,“连接臂位于免疫球蛋白Fc片段与任意一种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间”也应作广义理解,可以是任意相邻的Fc片段与RBD受体结构域之间均设置连接臂,也可以是部分相邻的Fc片段与RBD受体结构域之间设置连接臂。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白还包括信号肽,信号肽位于融合蛋白的N端。
如本申请所用,“信号肽”是指一类引导表达蛋白由细胞内分泌到细胞外的多肽,信号肽包括但不限于是Js信号肽(JEV signal peptide)、催乳素前导序列多肽(ProlactinLeader sequence,PL)以及IL-2信号肽中的一种或多种。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白还包括T4纤维蛋白三聚体,T4纤维蛋白三聚体位于融合蛋白的C端。
如本申请所用,“T4纤维蛋白三聚体”是指通过T4纤维蛋白折叠体(T4 fibritinfoldon,来源于噬菌体)形成的一个稳定的类似三角形的3价受体结构域。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白为下述任意一种情况:
(1)所述融合蛋白包括依序串联的Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂、Lambda变异株C.37的RBD受体结构域以及lgA1-Fc片段;
(2)所述融合蛋白包括依序串联的Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂、Lambda变异株C.37的RBD受体结构域以及lgG1-Fc片段;
(3)所述融合蛋白包括依序串联的Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂以及Lambda变异株C.37的RBD受体结构域;
(4)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及免疫球蛋白Fc片段;
(5)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、连接臂、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及免疫球蛋白Fc片段;
(6)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂以及Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域;
(7)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域以及免疫球蛋白Fc片段;
(8)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域以及T4纤维蛋白三聚体;
(9)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、第一连接子臂、Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、第二连接子臂、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域;
(10)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、第一连接子臂、Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、第二连接子臂、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及T4纤维蛋白三聚体;
(11)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、免疫球蛋白Fc片段以及Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域;
(12)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株XBB的RBD受体结构域、连接臂、Omicron亚变异株BQ.1.1的RBD受体结构域以及lgG1-Fc片段。
在本社区你的一些实施例中,连接臂、第一连接子臂以及第二连接子臂的氨基酸序列如(GGGGS)n所示,其中,n表示GGGGS的重复次数,n为1至10之间的整数,优选n为1至5之间的整数,更优选n为3或4。可以理解的是,G表示甘氨酸(Gly),S表示丝氨酸(Ser)。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,或者为与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,或者为与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列。
在本申请的一些实施例中,融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,或者为与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有不低于90%相似性的氨基酸序列。
如本申请所用,“核酸分子”是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,例如可以是通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)片段、核糖核酸(RNA)片段以及寡核苷酸片段中的任意一种,以及通过连接、切割、内切核酸酶作用或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段,可以是单链的或双链的。在本申请实施例中,核酸分子包括编码上述任意一种所述的融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。可以理解的是,本申请实施例的核酸分子可以包括编码区和非编码区,非编码区例如包括启动子、内含子、外显子以及终止子中的一种或多种,非编码区还可以任选地包括增强子或其他表达调控元件。
在本申请的一些实施例中,核酸分子包括:
第一核苷酸序列,用于编码上述(1)中融合蛋白的核苷酸序列,具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列,或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列至少具有80%相似性的核苷酸序列;
和/或,第二核苷酸序列,用于编码上述(2)中融合蛋白的核苷酸序列,具有如SEQID NO:9所示的核苷酸序列,或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列至少具有80%相似性的核苷酸序列;
和/或,第三核苷酸序列,用于编码上述(3)中融合蛋白的核苷酸序列,具有如SEQID NO:10所示的核苷酸序列,或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列至少具有80%相似性的核苷酸序列;
和/或,第四核苷酸序列,用于编码上述(12)中融合蛋白的核苷酸序列,具有如SEQID NO:20所示的核苷酸序列,或者所述第一核苷酸序列为与SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列至少具有80%相似性的核苷酸序列。
本申请实施例的重组表达载体包括载体以及装载于载体上的核酸分子,核酸分子参照前文描述。
如本申请所用,“重组表达载体”是指一种核酸分子构建体,其含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子,控制序列能够实现核酸分子在合适的表达系统中表达。在本申请的一些实施例中,重组表达载体为pAdC68XY3-DLA、pAdC68XY3-DLG或pAdC68XY3-DLO。
如本申请所用,“载体”是指利用基因工程重组技术将目标核酸分子转移至受体细胞进行扩增和表达的工具,例如可以是质粒、病毒、粘粒等,病毒例如可以是腺病毒、安卡拉牛痘病毒(MVA)、水泡性口炎病毒(VSV)等,腺病毒例如可以是Ad5型人腺病毒、Ad26型人腺病毒、AdC3型黑猩猩腺病毒、AdC7型黑猩猩腺病毒、AdC68型黑猩猩腺病毒等。
在本申请的一些实施例中,载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒,例如载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒。
在本申请的一些实施例中,重组表达载体还包括至少一个表达调控元件,表达调控元件与核酸分子可操作地连接。表达调控元件包括但不限于是启动子、增强子、SD序列和终止子。
本申请实施例的重组病毒是将上述任意一种重组表达载体转染病毒包装细胞,然后经细胞培养制备而成,其中,细胞例如可以是昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等,哺乳动物细胞例如可以是COS(绿猴细胞系)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、小鼠细胞、人类细胞等。在本申请的一些实施例中,重组病毒为重组腺病毒,对应的病毒包装细胞为HEK293细胞。
本申请的药物组合物包括上述任意一种融合蛋白、或上述任意一种核酸分子、或上述任意一种重组表达载体、或上述任意一种重组病毒。
如本申请所用,“药物组合物”包括治疗目的的组合物和免疫/预防目的的组合物,其中,“治疗目的”是指改善或减轻SARS CoV 2感染的至少一种症状,可以延迟SARS CoV 2的恶化或进展,或可以延迟或阻止因SARS CoV 2感染而引起的其他疾病或并发症的发作。所述免疫/预防目的是指可以刺激或引起生物体产生免疫应答以达到预防SARS CoV 2感染目的。
在本申请的一些实施例中,药物组合物包括rAdC68XY3-DLA重组腺病毒、rAdC68XY3-DLG重组腺病毒、或rAdC68XY3-DLO重组腺病毒。
如本申请所用,“免疫”是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排出抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能,包括天然免疫和获得性免疫。在本申请的一些实施例中,通过对受试者注射有效量的rAdC68XY3-DLA重组腺病毒、rAdC68XY3-DLG重组腺病毒、或rAdC68XY3-DLO重组腺病毒,而引起机体免疫系统针对免疫原(融合蛋白DLA、融合蛋白或融合蛋白DLO)的免疫应答反应。
如本申请所用,“受试者”是指能够发生细胞免疫应答的任何生物体,包括人类和其他哺乳类动物,还包括已被SARS-CoV-2感染且尚未治愈、曾被SARS-CoV-2感染且已治愈或具有SARS-CoV-2感染风险的任何个体。落入本申请范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于:灵长类、家畜(例如羊、牛、马、猴、猪等)、实验室试验动物(例如兔、鼠等)、宠物(例如猫、狗等)和圈养野生动物(例如狼、狐狸、鹿等)。在本申请实施例中,受试者为试验小鼠。
如本申请所用,“有效量”是指足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种症状改善的给药剂量,或是能够刺激细胞免疫应答以达到预防疾病目的的给药剂量。有效量取决于众多因素,例如:药物的活性、采用的递送方式等,且可以由本领域技术人员根据对象的个体情况容易地确定。
在本申请的一些实施例中,药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料。
如本申请所用,“佐剂”是指通过增强巨噬细胞活性促进机体T细胞或B细胞的反应,参与半抗原或抗原免疫应答的天然的或合成的物质,佐剂能增强药物组合物的特异性免疫反应,从而提升药物组合物的免疫效果。可与本申请实施例的药物组合物共同施用的佐剂包括但不限于是铝佐剂、MF59佐剂、类MF59佐剂、干扰素、趋化因子、肿瘤坏死因子、颗粒溶素、乳铁蛋白、卵白蛋白和白细胞介素。
如本申请所用,“辅料”是指生产药物组合物和调配处方时所用的附加剂,附加剂包括但不限于是赋形剂、媒介物和稀释剂,具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能,以使药物组合物达到一定的保质期和生物利用度,从而提高药物组合物的安全性和有效性。可与本申请实施例的药物组合物共同施用的辅料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。
在本申请的一些实施例中,药物组合物的剂型为雾化药剂、滴鼻剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂。
在本申请的一些实施例中,滴鼻剂选自自气雾剂、喷雾剂或粉雾剂。
在本申请的一些实施例中,口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片或膏剂。
在本申请的一些实施例中,胃肠外制剂选自经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
在本申请的一些实施例中,药物组合物为重组蛋白疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、重组病毒载体疫苗或抗SARS-CoV-2药物制剂。
在本申请的一些实施例中,药物组合物为重组蛋白疫苗,药物组合物包括上述任意一种所述的融合蛋白。
在本申请的一些实施例中,药物组合物为DNA疫苗,药物组合物包括上述任意一种所述的核酸分子。
在本申请的一些实施例中,药物组合物为mRNA疫苗,药物组合物包括编码上述任意一种所述的融合蛋白的mRNA序列。
在本申请的一些实施例中,药物组合物为重组病毒载体疫苗,药物组合物包括上述任意一种所述的重组表达载体、或上述任意一种所述的重组病毒。
在本申请的一些实施例中,药物组合物为抗SARS CoV 2药物制剂,药物组合物包括上述任意一种所述的融合蛋白、或上述任意一种核酸分子、或上述任意一种重组表达载体、或上述任意一种重组病毒。
本申请实施例还提供了一种免疫方法,具体为:将有效量的上述药物组合物以滴鼻给药、气溶胶吸入式给药、直肠给药、肌肉注射、皮下注射或口服给药的方式中的至少一种给药于受试者。
下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中涉及的动物实验在GLP(Good Laboratory Practice)实验室条件下开展,并按照“动物福利伦理审查实验室动物指南”处理动物。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本申请的内容。术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”、“第六”以及“第七”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性,也并非指示或暗示先后顺序。
Ⅰ、本申请实施例中涉及细胞、质粒以及病毒的说明详见下表1:
表1本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒及动物的说明
Ⅱ、本申请实施例中涉及的基因片段、蛋白、试剂、溶液以及培养基的说明:
本申请实施例中涉及的除引物之外的基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本申请实施例中涉及的所有引物是由武汉擎科生物技术有限公司合成。
本申请实施例中涉及的限制性内切酶(如:(如:NotI、KpnI、XmaI、BamHI和PacI))、归位内切酶(如:PI-SceI和I-CeuI)、连接酶(如:T4连接酶)、酶切缓冲液(10×NEBCutSmart buffer)、PCR反应混合液(2×PrimerSTAR mix)以及双蒸水(ddH2O)均购自宝生物工程(大连)有限公司。
本申请实施例中涉及的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒以及病毒RNA/DNA提取试剂盒均购自美国的Axygen公司。
本申请实施例中涉及的LipofectamineTM2000试剂盒和ECL显色液购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。
本申请实施例中涉及的PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜购自美国默克(Merck)公司。
本申请实施例中涉及的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司。
本申请实施例中涉及的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)购自美国的KPL公司。
本申请实施例中涉及的MEM培养基和DMEM培养基均购自美国的Hyclone实验室,LB培养基为自行配制,每100mL的LB液体培养基中包括:1.0g的蛋白胨,0.5g的酵母粉,以及1.0g的NaCl,对于LB固体培养基是在LB液体培养基配方的基础上添加20g/L的琼脂。
本申请实验例中涉及的Elispot板购自深圳市达科为生物技术股份有限公司。
本申请实验例中涉及的碳酸钠缓冲液(pH为9.6)配方为:1000mL的碳酸钠缓冲液中,包括8.4g的碳酸氢钠(NaHCO3)和3.5g的碳酸钠(Na2CO3),余量为去离子水。
本申请实验例中涉及的PBST缓冲液为含有0.1%(质量百分数)吐温-20的PBS缓冲液。
本申请实验例中涉及的封闭液为含有10%(质量百分数)脱脂奶粉的PBS缓冲液。本申请实验例中涉及的RPMI-1640培养基购自SIGMA公司(货号为R6504)。
Ⅲ、重组腺病毒的纯化及检定的实验过程说明
以rAdC68XY3-DLA的纯化及检定为例进行说明,具体包括如下步骤:
(一)rAdC68XY3-DLA重组腺病毒的纯化及检定
(1)、小规模扩增rAdC68XY3-DLA
S1、提供汇合度为90%的HEK293细胞,将rAdC68XY3-DLA按照MOI 2接种于所述HEK293细胞中,并置于37℃、5%(体积百分比)CO2的培养箱内静置培养;
S2、待培养至70%以上的HEK293变圆和脱落时,使用细胞刮将粘臂细胞刮下,然后将细胞培养液2265×g离心10min,并分别收集上清液和细胞沉淀;
S3、将步骤S2收集的细胞沉淀重悬于PBS缓冲液中,并在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融3次,2265×g离心10min以收集上清液,并将收集的上清液与步骤S2收集的上清液合并,获得rAdC68XY3-DLA保存液。
(2)、纯化rAdC68XY3-DLA
S10、在生物安全柜中,向一50mL的离心管中缓慢加入12mL密度为1.4g/mL的氯化铯溶液,然后加入9mL密度为1.2g/mL的氯化铯溶液,接着在不连续梯度的顶部加入13mL的rAdC68XY3-DLA保存液,获得待纯化的rAdC68XY3-DLA样品;
S20、将步骤S10中待纯化的rAdC68XY3-DLA样品置于4℃、100000×g离心120min,离心后抽吸病毒带,获得包含rAdC68XY3-DLA的溶液;
S30、将步骤S20中包含rAdC68XY3-DLA的溶液转移至无菌的离心管内,向其中加入等体积的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH为7.9),获得稀释的rAdC68XY3-DLA悬液;
S40、另取一离心管,向其中加入20mL密度为1.35g/mL的氯化铯溶液,然后在氯化铯溶液的顶部加入15mL的步骤S30中稀释的rAdC68XY3-DLA悬液,平衡所述离心管后,置于4℃、100000×g离心18h,离心后收集蓝白色病毒带;
S50、将步骤S40获得的蓝白色病毒带置于10000道尔顿的纤维素酯膜中,然后在4℃下透析至PBS溶液中以去除氯化铯,获得纯化的rAdC68XY3-DLA溶液,加入10%(体积百分数)甘油后分装存于-80℃冰箱中以备用。
本申请实施例中其他重组腺病毒的纯化及检定参照上述实验过程。
(3)、rAdC68XY3-DLA的滴度检定
采用腺病毒滴度-TCID50法检测纯化的rAdC68XY3-DLA,腺病毒滴度-TCID50法参考文献( G.,Archiv f experiment Pathol u Pharmakol,162:480-483,1931)进行。
Ⅵ、重组病毒表达目标蛋白的实验过程说明
以rAdC68XY3-DLA的表达为例进行说明,具体包括如下步骤:
S100、将HEK293细胞按5×105个/孔的接种量接种于六孔板,选用MEM培养基培养HEK293细胞,以使HEK293细胞在六孔板的孔内增殖;
S200、当单孔内HEK293细胞的汇合率达到90%时,将rAdC68XY3-DLA接种于对应孔内,rAdC68XY3-DLA按照感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)0.2进行接种,并设置未接种有rAdC68XY3-DLA的HEK293细胞作为阴性对照,在37℃的条件下静置培养48h,培养结束后先将粘臂细胞刮于细胞培养液中,再将细胞培养液离心,并分别收集上清液和沉淀,将该上清液标记为细胞培养上清液;向沉淀中加入100μL的哺乳动物细胞裂解液并置于冰上裂解,裂解充分后3500×g离心5min,取上清标记为细胞裂解液;
S300、制备细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品:分别取80μL的细胞培养上清液和80μL的细胞裂解液,然后分别加入20μL五倍浓缩的SDS-PAGE上样缓冲液(5×SDS-PAGE Loading Buffer),并分别在100℃下煮沸5min,分别获得细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品;
S400、结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)技术检测步骤S300获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中DLA融合蛋白的表达。
其中,结合SDS-PAGE和WB技术检测步骤S3获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中DLA融合蛋白表达的方法包括如下步骤:
S401、将步骤S300的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品分别进行8%SDS-PAGE电泳,电泳条件为:(ⅰ)保持电压100V的电压条件20min;(ⅱ)保持电压160V的电压条件80min;
S402、电泳结束后用湿转法将目标蛋白(DLA融合蛋白)转印至PVDF膜,然后将附着有目标蛋白的PVDF膜浸泡于含5%(质量百分比)脱脂奶粉的PBST溶液中,在4℃下封闭过夜;
S403、采用PBST溶液清洗封闭后的PVDF膜两次,然后将PVDF膜浸泡于鼠抗D25单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:5000)中,在37℃下孵育1h;
S404、采用PBST溶液清洗完成步骤S403的PVDF膜两次,然后将PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)中,在37℃下孵育1h;
S405、采用PBST溶液清洗完成步骤S404的PVDF膜两次,然后将ECL显色液加至于PVDF膜的附着有目的蛋白的一面上,化学发光法显色。
本申请实施例中其他重组病毒的表达参照上述实验过程。
Ⅴ、中和抗体滴度检测方法
中和抗体滴度的检测方法包括如下步骤:
S501、配制病毒稀释液,病毒稀释液中病毒的浓度为2×103pfu/mL,按照质量百分比计算,病毒稀释液的溶液包括5%的蔗糖、1%的谷氨酸和10%的胎牛血清,余量为PBS缓冲液,病毒稀释液的pH为7.1;
S502、取150μL的病毒稀释液、150μL的热灭活血清(将稀释后的待测小鼠血清经热灭活处理后而获得)以及5μL的豚鼠补体相混合,然后置于37℃孵育1h,获得病毒血清混合物;
S503、提供每孔内长满MRC-5单层细胞的24孔板,每孔内加入100μL的病毒血清混合物,每种病毒血清混合物做两个复孔,然后置于37℃孵育2h,孵育2h后每孔加入2mL的病毒维持液(含2%(质量百分数)胎牛血清的MEM液体培养基),继续置于37℃孵育7天;
S504、孵育结束后,去除培养基,固定细胞,并用考马斯蓝溶液(按照质量百分比计算,0.5%的考马斯蓝、45%的甲醇以及10%的乙酸,余量为去离子水)染色10min,然后用蒸馏水洗涤平板,对斑点计数,取使空斑数减少50%的血清稀释度的倒数作为病毒中和抗体滴度。
下面结合实施例、对比例和实验例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
本实施例提供了rAdC68XY3-DLA及其制备方法,具体如下文所述。
1.1、制备pShuttle-DLA重组质粒
本实施例选择未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒作为pShuttle-DLA的载体,pShuttle-CMV质粒为穿梭型质粒,其上含有CMV增强子、CMV启动子、T7启动子、嵌合内含子、bGH poly(A)加尾信号以及NotI和KpnI双酶切位点,并且具有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性。
将DLA基因片段插入至pShuttle-CMV质粒的多克隆位点以获得pShuttle-DLA重组质粒,DLA基因片段包括依次串联的信号肽的编码基因、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域的编码基因、连接臂的编码基因、Lambda变异株C.37的RBD受体结构域的编码基因以及lgA1-Fc的编码基因。
pShuttle-DLA重组质粒的制备方法包括如下步骤:
S1.1.1、提供人工合成的DNA2021-315002基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示),采用NotI和KpnI限制性内切酶对DNA2021-315002基因片段进行双酶切,酶切完全后采用胶回收试剂盒回收获得DLA基因片段;
S1.1.2、采用NotI和KpnI限制性内切酶对未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒进行双酶切,酶切完全后采用胶回收试剂盒回收质粒骨架;
S1.1.3、在T4连接酶的作用下,将DLA基因片段以及步骤S1.1.3获得的质粒骨架置于16℃连接过夜,获得连接产物;
S1.1.4、采用热激转化方式将步骤S1.1.4的连接产物导入至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,然后涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上,37℃静置培养过夜后挑取单菌落依次进行LB液态培养、提取质粒和质粒测序操作,测序结果正确的质粒即为pShuttle-DLA重组质粒。
1.2、制备pAdC68XY3-DLA重组表达载体
选择自行构建的pShuttle-DLA重组质粒和商购的pAdC68XY3-GFP重组质粒制备pAdC68XY3-DLA重组表达载体,pAdC68XY3-DLA重组表达载体的制备方法包括如下步骤:
S1.2.1、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pShuttle-DLA进行双酶切,酶切完全后采用胶回收试剂盒回收长度约为3.6kb的目的基因片段,目的基因片段包括DLA基因片段以及用于表达DLA融合蛋白的表达框;
S1.2.2、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pAdC68XY3-GFP进行双酶切,酶切完全后采用胶回收试剂盒回收长度约为33062bp的载体骨架;
S1.2.3、在T4连接酶的作用下,将步骤1.2.1的目的基因片段与步骤1.2.2的载体骨架置于16℃连接过夜,获得pAdC68XY3-DLA连接产物;
S1.2.4、采用热激转化方式将pAdC68XY3-DLA连接产物导入至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,然后涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上,37℃静置培养过夜后挑取单菌落依次进行LB液态培养、提取质粒和质粒测序操作,测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3-DLA重组表达载体;
S1.2.5、采用PacI限制性内切酶酶切pAdC68XY3-DLA重组表达载体,以使pAdC68XY3-DLA重组表达载体线性化,其中,酶切体系为50μL,酶切体系包括:5μL的酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer),5μL的PacI限制性内切酶,10μg的pAdC68XY3-DLA,余量为双蒸水(ddH2O),酶切温度为37℃,酶切时间为3h,采用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后,采用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物,并采用微量核酸定量仪对回收的酶切基因片段进行定量分析。
1.3、制备rAdC68XY3-DLA重组腺病毒以及鉴定rAdC68XY3-DLA重组腺病毒基因组中的DLA基因片段
对步骤S1.2.5回收的酶切基因片段进行转染操作,采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染操作,并选择HEK293细胞作为表达系统。根据LipofectamineTM2000试剂盒的操作说明,将酶切基因片段转染于汇合度为60~70%的HEK293细胞内。
在LipofectamineTM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中,用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基,并在转染前2h将MEM培养基更换为DMEM培养基。转染5h后,更换培养基为含10%(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基。
转染隔日,在倒置显微镜下观察细胞病变,直至60%的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融3次,然后在1200×g的转速下离心5min,收集上清液,获得的上清液中包含rAdC68XY3-DLA,并将上清液分装后置于-80℃超低温冰箱保存备用。
采用病毒RNA/DNA提取试剂盒对上述保存的上清液进行全基因组提取操作,然后以提取的rAdC68XY3-DLA重组腺病毒基因组DNA为模板,采用上游引物DLA-F(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)和下游引物DLA-R(核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)对模板进行PCR扩增,其中,PCR反应体系为20μL,PCR反应体系由10μL的PCR反应混合液(2×PrimerSTARmix)、1μL的上游引物DLA-F、1μL的下游引物DLA-R、1μL的模板以及7μL的ddH2O组成,PCR反应程序为:(ⅰ)95℃预变性3min;(ⅱ)95℃变性25s;(ⅲ)55℃退火25s;(ⅳ)72℃延伸60s;(ⅴ)重复②~④30个循环;(ⅵ)72℃,3min。
PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,并将以正常HEK293细胞的全基因组DNA作为模板进行PCR获得的PCR产物作为阴性对照,1%琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。采用胶回收试剂盒切胶回收目的条带并测序,测序结果正确代表目的条带即为DLA基因片段。
1.4rAdC68XY3-DLA的纯化及检定
纯化的rAdC68XY3-DLA溶液中rAdC68XY3-DLA的滴度为8.5×108TCID50/mL,纯化的rAdC68XY3-DLA如图8所示。
1.5采用SDS-PAGE和WB技术鉴定rAdC68XY3-DLA表达DLA融合蛋白
如图9所示,rAdC68XY3-DLA感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中均能检测DLA融合蛋白,说明rAdC68XY3-DLA在HEK293细胞中成功地表达了DLA融合蛋白。
实施例2
本实施例提供了rAdC68XY3-DLG及其制备方法,具体如下文所述。
2.1、制备pShuttle-DLG重组质粒
本实施例选择未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒(与实施例1相同)作为pShuttle-DLG的载体,将DLG基因片段插入至pShuttle-CMV质粒的多克隆位点以获得pShuttle-DLG重组质粒,其中,DLG基因片段包括依次串联的信号肽的编码基因、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域的编码基因、连接臂的编码基因、Lambda变异株C.37的RBD受体结构域的编码基因以及lgG1-Fc的编码基因,DLG基因片段具有如SEQ ID NO:9所示的基因片段。
pShuttle-DLG重组质粒的制备方法包括如下步骤:
S2.1.1、以人工合成的DNA2021-315002基因片段作为模板,使用NotI和NcoI双酶切获得第一基因片段和第二基因片段,第一基因片段用于编码信号肽-连接臂-Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域的氨基酸序列,第二基因片段用于编码Lambda变异株C.37的RBD受体结构域的氨基酸序列;
S2.1.2、以pFUSE-hIgG1-Fc2载体为模板,采用上游引物hIgG1-F(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)和下游引物hIgG1-Fc-R(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)扩增hIgG1-Fc区域,PCR结束之后,采用NotI和KpnI对PCR产物进行双酶切,获得hIgG1-Fc基因片段;
S2.1.3、采用NotI和KpnI限制性内切酶对未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒进行双酶切,酶切完全后采用胶回收试剂盒回收质粒骨架;
S2.1.4、在T4连接酶的作用下,将第一基因片段、第二基因片段、hIgG1-Fc基因片段以及步骤S2.1.3获得的质粒骨架置于16℃连接过夜,获得连接产物;
S2.1.5、采用热激转化方式将步骤S2.1.4的连接产物导入至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,然后涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上,37℃静置培养过夜后挑取单菌落依次进行LB液态培养、提取质粒和质粒测序操作,测序结果正确的质粒即为pShuttle-DLG重组质粒。
2.2、制备pAdC68XY3-DLG重组表达载体
选择自行构建的pShuttle-DLG重组质粒和商购的pAdC68XY3-GFP重组质粒制备pAdC68XY3-DLG重组表达载体,pAdC68XY3-DLG重组表达载体的制备方法包括如下步骤:
S2.2.1、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pShuttle-DLG进行双酶切,酶切完全后采用胶回收试剂盒回收长度约为3.6kb的目的基因片段,目的基因片段包括DLG基因片段以及用于表达DLG融合蛋白的表达框;
S2.2.2、参照步骤S1.2.2;
S2.2.3、在T4连接酶的作用下,将步骤2.2.1的目的基因片段与步骤2.2.2的载体骨架置于16℃连接过夜,获得pAdC68XY3-DLG连接产物;
S2.2.4、采用热激转化方式将pAdC68XY3-DLG连接产物导入至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,然后涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上,37℃静置培养过夜后挑取单菌落依次进行LB液态培养、提取质粒和质粒测序操作,测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3-DLG重组表达载体;
S2.2.5、参照步骤S1.2.5。
2.3、制备rAdC68XY3-DLG重组腺病毒以及鉴定rAdC68XY3-DLG重组腺病毒基因组中的DLG基因片段
对步骤S2.2.5回收的酶切基因片段进行转染操作,采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染操作,并选择HEK293细胞作为表达系统。根据LipofectamineTM2000试剂盒的操作说明,将酶切基因片段转染于汇合度为60~70%的HEK293细胞内。
在LipofectamineTM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中,用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基,并在转染前2h将MEM培养基更换为DMEM培养基。转染5h后,更换培养基为含10%(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基。
转染隔日,在倒置显微镜下观察细胞病变,直至60%的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融3次,然后在1200×g的转速下离心5min,收集上清液,获得的上清液中包含rAdC68XY3-DLG重组腺病毒,并将上清液分装后置于-80℃超低温冰箱保存备用。
采用病毒RNA/DNA提取试剂盒对上述保存的上清液进行全基因组提取操作,然后以提取的rAdC68XY3-DLG重组腺病毒基因组DNA为模板,采用上游引物DLG-F(核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示)和下游引物DLG-R(核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示)对模板进行PCR扩增,其中,PCR反应体系为20μL,PCR反应体系由10μL的PCR反应混合液(2×PrimerSTARmix)、1μL的上游引物DLA-F、1μL的下游引物DLA-R、1μL的模板以及7μL的ddH2O组成,PCR反应程序为:(ⅰ)95℃预变性3min;(ⅱ)95℃变性25s;(ⅲ)55℃退火25s;(ⅳ)72℃延伸60s;(ⅴ)重复②~④30个循环;(ⅵ)72℃,3min。
PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,并将以正常HEK293细胞的全基因组DNA作为模板进行PCR获得的PCR产物作为阴性对照,1%琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。采用胶回收试剂盒切胶回收目的条带并测序,测序结果正确代表目的条带即为DLG基因片段。
2.4rAdC68XY3-DLG的纯化及检定
纯化的rAdC68XY3-DLG溶液中rAdC68XY3-DLG的滴度为8.6×108TCID50/mL,纯化的rAdC68XY3-DLG如图10所示。
2.5采用SDS-PAGE和WB技术鉴定rAdC68XY3-DLG表达DLG融合蛋白
如图9所示,rAdC68XY3-DLG感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中均能检测DLG融合蛋白,说明rAdC68XY3-DLG在HEK293细胞中成功地表达了DLG融合蛋白。
实施例3
本实施例提供了rAdC68XY3-DLO及其制备方法,具体如下文所述。
3.1、制备pShuttle-DLO重组质粒
本实施例选择未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒(与实施例1相同)作为pShuttle-DLO的载体,将DLO基因片段插入至pShuttle-CMV质粒的多克隆位点以获得pShuttle-DLO重组质粒,其中,DLO基因片段包括依次串联的信号肽的编码基因、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域的编码基因、连接臂的编码基因以及Lambda变异株C.37的RBD受体结构域的编码基因,DLO基因片段具有如SEQ ID NO:10所示的基因片段。
pShuttle-DLO重组质粒的制备方法包括如下步骤:
S3.1.1、参照步骤S2.1.1,获得第一基因片段和第二基因片段;
S3.1.2、采用NotI和KpnI限制性内切酶对未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒进行双酶切,酶切完全后采用胶回收试剂盒回收质粒骨架;
S3.1.3、在T4连接酶的作用下,将第一基因片段、第二基因片段以及步骤S3.1.2获得的质粒骨架置于16℃连接过夜,获得连接产物;
S3.1.4、采用热激转化方式将步骤S3.1.4的连接产物导入至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,然后涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上,37℃静置培养过夜后挑取单菌落依次进行LB液态培养、提取质粒和质粒测序操作,测序结果正确的质粒即为pShuttle-DLO重组质粒。
3.2、制备pAdC68XY3-DLO重组表达载体
选择自行构建的pShuttle-DLO重组质粒和商购的pAdC68XY3-GFP重组质粒制备pAdC68XY3-DLO重组表达载体,pAdC68XY3-DLO重组表达载体的制备方法包括如下步骤:
S3.2.1、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pShuttle-DLO进行双酶切,酶切完全后采用胶回收试剂盒回收长度约为2.8kb的目的基因片段,目的基因片段包括DLO基因片段以及用于表达DLO融合蛋白的表达框;
S3.2.2、参照步骤S1.2.2;
S3.2.3、在T4连接酶的作用下,将步骤3.2.1的目的基因片段与步骤3.2.2的载体骨架置于16℃连接过夜,获得pAdC68XY3-DLO连接产物;
S3.2.4、采用热激转化方式将pAdC68XY3-DLO连接产物导入至大肠杆菌TOP10感受态细胞中,然后涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上,37℃静置培养过夜后挑取单菌落依次进行LB液态培养、提取质粒和质粒测序操作,测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3-DLO重组表达载体;
S3.2.5、参照步骤S1.2.5。
3.3、制备rAdC68XY3-DLO重组腺病毒以及鉴定rAdC68XY3-DLO重组腺病毒基因组中的DLO基因片段
对步骤S3.2.5回收的酶切基因片段进行转染操作,采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染操作,并选择HEK293细胞作为表达系统。根据LipofectamineTM2000试剂盒的操作说明,将酶切基因片段转染于汇合度为60~70%的HEK293细胞内。
在LipofectamineTM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中,用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基,并在转染前2h将MEM培养基更换为DMEM培养基。转染5h后,更换培养基为含10%(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基。
转染隔日,在倒置显微镜下观察细胞病变,直至60%的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融3次,然后在1200×g的转速下离心5min,收集上清液,获得的上清液中包含rAdC68XY3-DLO重组腺病毒,并将上清液分装后置于-80℃超低温冰箱保存备用。
采用病毒RNA/DNA提取试剂盒对上述保存的上清液进行全基因组提取操作,然后以提取的rAdC68XY3-DLO重组腺病毒基因组DNA为模板,采用上游引物DLO-F(核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示)和下游引物DLO-R(核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示)对模板进行PCR扩增,其中,PCR反应体系为20μL,PCR反应体系由10μL的PCR反应混合液(2×PrimerSTARmix)、1μL的上游引物DLO-F、1μL的下游引物DLO-R、1μL的模板以及7μL的ddH2O组成,PCR反应程序为:(ⅰ)95℃预变性3min;(ⅱ)95℃变性25s;(ⅲ)55℃退火25s;(ⅳ)72℃延伸45s;(ⅴ)重复②~④30个循环;(ⅵ)72℃,3min。
PCR反应结束后,将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,并将以正常HEK293细胞的全基因组DNA作为模板进行PCR获得的PCR产物作为阴性对照,1%琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。采用胶回收试剂盒切胶回收目的条带并测序,测序结果正确代表目的条带即为DLO基因片段。
3.4rAdC68XY3-DLO的纯化及检定
纯化的rAdC68XY3-DLO溶液中rAdC68XY3-DLO的滴度为8.5×108TCID50/mL,纯化的rAdC68XY3-DLO如图11所示。
3.5采用SDS-PAGE和WB技术鉴定rAdC68XY3-DLO表达DLO融合蛋白
如图9所示,rAdC68XY3-DLO感染HK293细胞48h后获得的细胞培养上清液待检样品和细胞裂解液待检样品中均能检测DLO融合蛋白,说明rAdC68XY3-DLO在HEK293细胞中成功地表达了DLO融合蛋白。
对比例1
本对比例提供了rAdC68XY3-GFP重组腺病毒及其制备方法,制备方法包括如下步骤:
S1’、采用PacI限制性内切酶酶切pAdC68XY3-GFP重组病毒质粒,以使pAdC68XY3-GFP重组病毒质粒线性化,其中,酶切体系为50μL,酶切体系包括:5μL的酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer),5μL的PacI限制性内切酶,10μg的pAdC68XY3-GFP重组腺病毒质粒,余量为双蒸水(ddH2O),酶切温度为37℃,酶切时间为3h;
S2’、步骤S1’中酶切完全后,采用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物,并采用微量核酸定量仪对回收的酶切基因片段进行定量分析;
S3’、将步骤S2’回收的酶切基因片段进行转染操作,采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染操作,并选择HEK293细胞作为表达系统,根据LipofectamineTM2000试剂盒的操作说明,将酶切基因片段转染于汇合度约为70%的HEK293细胞内,其中,在LipofectamineTM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中,用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基,并在转染前2h将MEM培养基更换为DMEM培养基,转染5h后,更换培养基为含10%(质量百分比)胎牛血清的DMEM培养基;
S4’、在步骤S3’的转染隔日,在倒置显微镜下观察细胞病变,直至60%的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞,将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融三次,然后在1200×g的转速下离心5min,收集上清液,获得的上清液中包含rAdC68XY3-GFP重组腺病毒;
S5’、将步骤S4’的上清液按照(Ⅲ)依次进行小规模扩增和纯化操作,获得纯化的rAdC68XY3-GFP溶液,纯化的rAdC68XY3-GFP溶液中rAdC68XY3-GFP的滴度为1.0×1010TCID50/mL。
对比例2
本对比例提供了一种rAdC68XY3-preS重组腺病毒,rAdC68XY3-preS的制备方法按照专利ZL202011454044.3进行。
实验例1
本实验例对实施例1至实施例3、对比例1以及对比例2的重组腺病毒分别进行免疫试验,检测分析各种重组腺病毒诱导机体产生结合抗体的能力。本实验例的试验动物为6周龄至8周龄的C57BL/6雌鼠,试验小鼠经检验检疫后随机分为五组,每组的具体情况详见下表7:
表2为实验例1中分组情况一览表
按照表2中的给药剂量和给药方式对各个实验组的试验小鼠进行免疫,在第一剂免疫的当天(D0)、第一剂免疫之后的第20天(D20)以及第一剂免疫之后的第62天(D62),分别对各个组的试验小鼠进行采血,并检测血清中结合抗体滴度。
对于实验组1来说,检测实验组1中试验小鼠的血清中Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度、Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度以及lgA-Fc(免疫球蛋白lgA的Fc片段)结合抗体滴度。检测结果如图12所示,rAdC68XY3-DLA能够诱导机体产生较高水平的抗体滴度,Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度GMT可达325100,Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度GMT可达325100,lgA-Fc结合抗体滴度GMT为57470。在第一剂免疫之后的第62天,机体经诱导产生的结合抗体滴度水平仍保持在较高水平。
对于实验组2来说,检测实验组2中试验小鼠的血清中Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度、Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度以及lgG-Fc(免疫球蛋白lgG的Fc片段)结合抗体滴度。检测结果如图13所示,rAdC68XY3-DLG能够诱导机体产生较高水平的抗体滴度,Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度GMT可达650199,Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度GMT可达516064,lgG-Fc结合抗体滴度GMT达40637。相较于第一剂免疫之后的第20天,第一剂免疫之后的第62天机体经诱导产生的抗体滴度水平更高。
对于实验组3来说,检测实验组3中试验小鼠的血清中Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度和Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度。检测结果如图14所示,rAdC68XY3-DLO能够诱导机体产生较高水平的抗体滴度,Delta变异株B.1.617.2的RBD结合抗体滴度GMT可达325100,Lambda变异株C.37的RBD结合抗体滴度GMT可达325100。在第一剂免疫之后的第62天,机体经诱导产生的结合抗体滴度水平仍保持在较高水平,并且与第一剂免疫之后的第20天机体经诱导产生的结合抗体滴度水平相当。
对于实验组4和实验组5来说,分别检测两组中试验小鼠的血清中SARS CoV 2原型株的RBD特异性IgG抗体滴度。检测结构如图15所示,实验组4为阴性对照组,未能诱导机体产生结合抗体;对于实验组5来说,在第一剂免疫之后的第20天,机体经诱导产生的RBD特异性IgG抗体滴度较高,但是在第一剂免疫之后的第62天,机体经诱导产生的RBD特异性IgG抗体滴度明显降低。
综上所述,在第一剂免疫之后的第20天,实验组1至实验组3以及实验组5中试验小鼠的血清中结合抗体滴度水平相当。在第一剂免疫之后的第62天,相较于实验组5,实验组1至实验组3中试验小鼠的血清中结合抗体滴度水平更高。由此说明,相较于rAdC68XY3-preS,rAdC68XY3-DLA、rAdC68XY3-DLG和rAdC68XY3-DLO具有更加理想的免疫持久性。
实验例2
本实验例对实施例1至实施例3、对比例1以及对比例2的重组腺病毒分别进行免疫试验,检测分析各种重组腺病毒诱导机体产生中和抗体的能力。本实验例的试验动物为6周龄至8周龄的C57BL/6雌鼠,试验小鼠经检验检疫后随机分为五组,分组情况与实验例1相同。
按照表2中的给药剂量和给药方式对各个实验组的试验小鼠进行免疫,第二剂免疫之后的第21天眼眶取血,采用中和法分别检测试验小鼠血清中对SARS CoV 2的原型(wt)、Beta变异株B.1.351、Delta变异株B.1.617.2、Lambda变异株C.37、Omicron变异株BA.1、Omicron变异株BA.2.12.1和Omicron变异株BA.4的中和抗体滴度。
检测结果如下表3和图16所示:
表3实验组1至实验组5的试验小鼠血清中抗SARS CoV 2中和抗体的几何平均滴度一览表
备注:GMT1表示试验小鼠血清中抗SARS CoV 2的原型中和抗体的几何平均滴度,GMT2表示试验小鼠血清中抗Beta变异株B.1.351中和抗体的几何平均滴度,GMT3表示试验小鼠血清中抗Delta变异株B.1.617.2中和抗体的几何平均滴度,GMT4表示试验小鼠血清中抗Lambda变异株C.37中和抗体的几何平均滴度,GMT5表示试验小鼠血清中抗Omicron变异株BA.1中和抗体的几何平均滴度,GMT6表示试验小鼠血清中抗Omicron变异株BA.2.12.1中和抗体的几何平均滴度,GMT6表示试验小鼠血清中抗Omicron变异株BA.4/5中和抗体的几何平均滴度,
由表3和图16可知,经有效量rAdC68XY3-DLA免疫的试验小鼠、经有效量rAdC68XY3-DLG免疫的试验小鼠、经有效量rAdC68XY3-DLO免疫的试验小鼠以及经有效量rAdC68XY3-preS免疫的试验小鼠体内均产生了针对不同SARS CoV 2毒株的高效价中和抗体,其中,rAdC68XY3-DLA、rAdC68XY3-DLG、rAdC68XY3-DLO和rAdC68XY3-preS诱导机体产生针对SARS CoV 2的原型的中和抗体滴度水平相当,但相较于rAdC68XY3-preS,rAdC68XY3-DLA、rAdC68XY3-DLG和rAdC68XY3-DLO诱导机体产生针对SARS CoV 2变异株的中和抗体滴度更高,尤其是诱导机体产生针对Omicron变异株BA.1和Omicron变异株BA.2.12.1的中和抗体滴度显著提高。
以上对本发明所提供的一种融合蛋白、核酸分子、重组表达载体以及药物组合物进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想;本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包括串联的至少两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域,所述至少两种SARS CoV 2病毒株中任意两种SARS CoV 2病毒株彼此不相同;
其中,所述任意两种SARS CoV 2病毒株为下述任意一种情况:
(Ⅰ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株分别为SARS CoV 2的不同变异株;
(Ⅱ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的原型株,另一者为SARSCoV 2的变异株;
(Ⅲ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的第一种变异株,另一者为SARS CoV 2的第二种变异株的亚变异株;
(Ⅳ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株分别为SARS CoV 2的同一变异株的不同亚变异株;
(Ⅴ)所述任意两种SARS CoV 2病毒株中的一者为SARS CoV 2的第一种变异株的亚变异株,另一者为SARS CoV 2的第二种变异株的亚变异株。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包括串联的两种SARSCoV 2病毒株的RBD受体结构域,所述两种SARS CoV 2病毒株为下述任意一种情况:
(a)SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2和SARS CoV 2的Lambda变异株C.37;
(b)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2;
(c)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.2.75和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2;
(d)SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5和SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.2.75;
(e)SARS CoV 2的Omicron亚变异株XBB和SARS CoV 2的Omicron亚变异株BQ.1.1。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包括串联的三种SARSCoV 2病毒株的RBD受体结构域,所述三种SARS CoV 2病毒株为:SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.5、SARS CoV 2的Omicron亚变异株BA.2.75和SARS CoV 2的Delta变异株B.1.617.2。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白还包括免疫球蛋白Fc片段,所述免疫球蛋白Fc片段位于任意两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间;或者,所述免疫球蛋白Fc片段与最靠近所述融合蛋白的C端的SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域的C端连接;
和/或,所述融合蛋白还包括信号肽,所述信号肽位于所述融合蛋白的N端;
和/或,所述融合蛋白还包括T4纤维蛋白三聚体,所述T4纤维蛋白三聚体位于所述融合蛋白的C端。
5.根据权利要求1至4任一项中所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白还包括一个或多个连接臂,所述连接臂位于任意两种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间,和/或所述连接臂位于所述免疫球蛋白Fc片段与任意一种SARS CoV 2病毒株的RBD受体结构域之间;
和/或,所述免疫球蛋白Fc片段选自lgG1-Fc片段或lgA1-Fc片段,所述lgG1-Fc片段为人类免疫球蛋白lgG1的Fc片段,所述lgA1-Fc片段为人类免疫球蛋白lgA1的Fc片段。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白为下述任意一种情况:
(1)所述融合蛋白包括依序串联的Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂、Lambda变异株C.37的RBD受体结构域以及lgA1-Fc片段;
(2)所述融合蛋白包括依序串联的Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂、Lambda变异株C.37的RBD受体结构域以及lgG1-Fc片段;
(3)所述融合蛋白包括依序串联的Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域、连接臂以及Lambda变异株C.37的RBD受体结构域;
(4)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及免疫球蛋白Fc片段;
(5)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、连接臂、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及免疫球蛋白Fc片段;
(6)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂以及Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域;
(7)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域以及免疫球蛋白Fc片段;
(8)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、连接臂、Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域以及T4纤维蛋白三聚体;
(9)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、第一连接子臂、Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、第二连接子臂、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域;
(10)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、第一连接子臂、Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域、第二连接子臂、Delta变异株B.1.617.2的RBD受体结构域以及T4纤维蛋白三聚体;
(11)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株BA.5的RBD受体结构域、免疫球蛋白Fc片段以及Omicron亚变异株BA.2.75的RBD受体结构域;
(12)所述融合蛋白包括依序串联的Omicron亚变异株XBB的RBD受体结构域、连接臂、Omicron亚变异株BQ.1.1的RBD受体结构域以及lgG1-Fc片段。
7.一种核酸分子,其特征在于,包括:编码如权利要求1至6任一项中所述的融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.一种重组表达载体,其特征在于,包括载体,以及装载于所述载体上的如权利要求7所述的核酸分子;
优选地,所述载体为腺病毒、安卡拉牛痘病毒或水泡性口炎病毒;
优选地,所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒;
更优选地,所述载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4-orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4-orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒;
和/或,所述重组表达载体还包括至少一个表达调控元件,所述表达调控元件与所述核酸分子可操作地连接。
9.一种药物组合物,其特征在于,包括如权利要求1至6任一项中所述的融合蛋白、或如权利要求7中所述的核酸分子、或如权利要求8所述的重组表达载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料;
和/或,所述药物组合物的剂型为雾化药剂、滴鼻剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂;
和/或,所述药物组合物为重组蛋白疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、重组病毒载体疫苗或抗SARS-CoV-2药物制剂。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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